JPH01102352A

JPH01102352A - バイオセンサー

Info

Publication number: JPH01102352A
Application number: JP62261181A
Authority: JP
Inventors: Nanao Nakamura; 中村　七男; Masao Koyama; 小山　昌夫
Original assignee: Toshiba Corp
Current assignee: Toshiba Corp
Priority date: 1987-10-16
Filing date: 1987-10-16
Publication date: 1989-04-20

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［発明の目的］（産業上の利用分野）本発明はＰＨセンサーの感応面に酵素固定化膜を有する
バイオセンサーに関する。

（従来の技術）グルコースオキシダーゼ、ウレアーゼなどの酵素はそれ
ぞれの基質、すなわちこの場合それぞれβ−Ｄ−グルコ
ース、尿素などの水溶液中でそれぞれ反応■、反応■を
選択的に触媒してｐＨを変化させる作用を有する。

グルコースオキシダーゼ β−Ｄ−グルコース＋０２＋）１２０−一一一一一一一
一−−→０−グルコン酸＋Ｈ２Ｏ２１０，（リウレアーゼ尿素子Ｈ２０＋　　２Ｎ）ｌ　３＋　ＣＯ２・・・（０
これらの反応を利用した基質濃度の定量は広く行なわれ
ている。そして、ガラス電極型やＦＥＴ型のｐＨセンサ
ーの感応面に酵素を固定化したバイオセンサーの開発が
進められている。

従来、ｐＨセンサーの感応面に固定化酵素膜を形成した
バイオセンサーとしては以下のようなものが知られてい
る。

そもそもバイオセンサーは、Ｃｒａ■ｅｒによるガラス
電極型ｐＨセンサーの発明（１９０１３年）　、　Ｎｅ
１ｓｏｎらによる骨炭微粉末に吸着されたインベルター
ゼの酵素活性の発見（Ｊ、Ｍ、Ｎｅ１ｓｏｎ、Ｅ、Ｇ、
Ｇｒｉｆｆ　ｉｎ；Ｊ、Ａｍ。

Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、３８．１１０９（１９１Ｂ））、
Ｓｕｍｎｅｔによる不溶化したナタ豆のウレアーゼの酵
素活性の発見（Ｊ、Ｂ。

Ｓｕｍｎｅｒ；５ｃｉｅｎｃｅ、　　１０８　．４１０
（１９４Ｂ））　　、　　Ｍｉｃｈｅｅｌ　　らによる
ゼラチン及びグロブリンのオキシセルロースアジドによ
る固定化（Ｆ、Ｍｉｃｈｅｅｌ、Ｊ、Ｅｗｅｒｓ　；Ｍ
ａｃｒｏｍｏｌ、Ｃｈｅ＋ｓ、、　３．２００（１９４
９））　、　Ｃａｍｐｂｅｌｌらによる固定化抗原の調
製（Ｄ、Ｈ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ　、　Ｅ、　Ｌｕｅ　−
５ｃｈｅｒ、Ｌ、Ｓ、Ｌｅｒｍａｎ；Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
、１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、　３７，５７５（１９５１
））　、　Ｇｒｕｂｈｏｆｅｒらによるカルボキシペプ
チダーゼ、ジアスターゼ、ペプシン、リボヌクレアーゼ
などを使用した最初の酵素固定化の試み　（Ｎ。

Ｇｒｕｂｈｏ　ｆｅｒ　、Ｌ、Ｓｃｈ　ｌｅ　ｉ　ｔｈ
　；Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｈａ　ｒ　ｔｅｎ　、４
０　。

５０８（１９５３））、Ｃ１ａｒｋによる酸素電極の発
明（Ｌ、Ｃ。

Ｃ１ａｒｋ；Ｔｒａｎｓ、Ａｍｅｒ、Ａｒ１ｔｉｆ　　
Ｉｎｔｅｒｎ、Ｏｒｇａｎｓ、　　２　．４１（１９５
Ｂ））などを背景として、Ｃ１ａｒｋらによるグルコー
スオキシダーゼの水溶液をセロファン紙で〈、るんだ酸
素電極によるグルコースの測定に端を発する（Ｌ、Ｃ，
Ｃ１ａｒｋ、Ｃ，Ｌｙｏｎｓ；Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃａ
ｄ、Ｓｃｉ、。

１）、２９（１９８２））。

固定化酵素を分析化学に最初にとり入れたのはＧｕｉｌ
ｂａｕｌｔらであり、コリンエステラーゼを包括したデ
ンプンゲルをポリウレタンパッドに支持させたものを使
ってアンチコリンエステラーゼの蛍光分析を行なったも
のである（Ｇ、Ｇ、Ｇｕｉｌｂａｕｌｔ、Ｄ。

Ｎ、Ｋｒａｍｅｒ；Ａｎａｌ、Ｃｈｅｍ、　、３９．１
８７５（１９８５））、折しも子細らによる固定化酵素
を用いた批界最初のバイオリアクター、Ｄ−、Ｌ−アミ
ノ酸の光学分割のプラントの基礎データ第１報が日本農
芸化学会大会で発表された年である０次いで、ｕｐｄｉ
ｋｅらはアクリルアミドとＮ、Ｎ−メチレンビスアミド
をリボフラビンと過硫酸カリウムを触媒として室温で光
重合させて得られるゲルマトリックス中にグルコースオ
キシダーゼ（１３５ｕ　／　ｍｇ）を固定化したものを
２０〜４０メツシユに粉砕して　１．５＋ｓ層径Ｘ　４
ｈｍのカラムに充填し、この方ラムにｐＨ７，４０のリ
ン酸バッファに溶解したグルコースを流し、出口に酸素
電極（ベックマンＮｏ、３２５８１２）をおいてグルコ
ース濃度の測定を行なった（Ｓ、Ｊ、　Ｕｐｄｉｋｅ、
Ｇ、Ｈｉｃｋｓ；５ｃｉｅｎｃｅ、　１５８ユ２７０（
Ｉｎ２））、また、Ｕｐｄｉｋｅらはこのポリアクリル
アミドゲル中に固定化された酵素を白金電極にはりつけ
てグルコース濃度の測定を行なった（Ｓ、Ｊ。

Ｕｐｄｉｋｅ、Ｇ、Ｈｉｃｋｓ；Ｎａｔｕｒｅ、　２１
４．９８８（１９６７））、これは酵素電極という名称
が与えられ、現在のバイオセンサーの基本的な構造を示
すものとなった。更に、　ＷｉｌｌｉａｍｓらはＨ２０
２電極と固定化グルコースオキシダーゼによるグルコー
スの測定を行なった（Ｄ、Ｌ、Ｗｉｌｌｉａｓｓ、Ａ、
Ｄｏｉｇ　Ｊｒ、、Ａ、Ｋａｒａｓｉ；　Ａｎａｌ。

Ｃｈｅｍ、、４２，１１８（１９７０））　、そして、
Ｎｉ１ｌｓｏｎらはｐＨセンサーの感応面に固定化酵素
１１５１（グルコースオキシダーゼ、ペニシリナーゼ、
ウレアーゼ）を密着して形成すると対応する基質に選択
的に感応するバイオセンサーとなることを実験的に明ら
かにした（Ｈ，旧１１ｓｏｎ、Ａ、Ａｋｅｒｌａｎｄ、
に、Ｎｏ５ｂａｃｈ；Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｇ、Ａｃｔａ、　３２０　（１９７３））
　。

ただし、ガラス電極型ＰＨセンサーは比較的大型で使用
上の制約があった。これに対し、ＢｅｒｇｖｅｌｄはＭ
ＯＳＦＥＴ（金属−酸化物−半導体型電界効果トランジ
スタ）の金属をとり去って酸化物を露出させたものは溶
液中でイオン濃度に関係して酸化物と溶液との間に発生
する起電力ΔＶによる電界に応答してゲート抵抗が変化
することを利用してΔＶを測定できることを見出し、　
ｌ５ＦＥＴ（イオン感応性ＦＥＴ）と命名した（Ｐ、Ｂ
ｅｒｇｖｅｌｄ；ｒＥＥＥ　Ｔｒａｎｓ、ｏｎ　Ｂｉｏ
−ｍｅｄ、Ｅｎｇ、　、ｐ、７０（Ｊａｎ、　１９７０
））、また、松尾らは比較電極を用いる測定方法、ドレ
イン−ソース電波を一定にしてソース−比較電極間の電
位差を測定する方法を提案し、更に酸化物の上＜Ｓｉ３
　　Ｎ４膜を重ねて安定なｐＨ応答を示すｌ５ＦＥＴを
提供した　（Ｔ。

Ｍａｔｓｕｏ、に、Ｄ、Ｗｉｓｅ；ＩＥＥＥ　Ｔｒａｎ
ｓ、　ｏｎ　　Ｂｉｏｍｅｄ、Ｅｎｇ、。

ｐ、４８Ｂ（Ｎｏｖ、１９７４））、また、Ｊａｎａｔ
ａらは　ｌ５ＦＥＴと固定化酵素を組み合わせたセンサ
ーを提案しく特開昭５１−１３９２８９又は［ＩＳＰ　
４，０２０，８３０）、ペニシリンニ関する実験でこれ
を検証した（Ｓ、Ｃａｒａｓ、Ｊ、Ｊａｎａｔａ；Ａｎ
ａｌ、Ｃｈｅｍ、、５２．１９３５（１９８０））　　
。

以下、　ｐＨセンサーの測定原理及び従来のバイオセン
サーの酵素固定化方法について説明する。

まず、ガラス電極型ｐＨセンサーについて第６図（ａ）
〜（ｃ）を参照して説明する。第６図（ａ）において、
ガラス電極型ｐＨセンサー３０は、ガラス膜３１／標準
電解質水溶液３２／ＡｇＣ１／Ａｇ電極３３／出力端子
３４という構成からなっている。ここで、ガラス１１１
１としては例えば５ｉ０２７２％、Ｎａ２０２２％、Ｇ
ａ０８％の組成のものが用いられる。このガラス電極型
ｐＨセンサー３０はＨ＋に選択的にいわゆるネルンスト
応答を示すことが知られている。一方。

比較電極２０は液絡用多孔部２１／標準電解質水溶液２
２／電極２３／出力端子２４という構成からなっている
。これらガラス電極型ｐＨセンサー３０及び比較電極２
０が被測定溶液！０に浸漬されて測定が行なわれる。な
お、最近実用化されているものは、第６図（ｂ）に示す
ようにガラス電極型ｐＨセンサー３０と比較電極２０と
が一体化されているのが一般的である。

第６図（ａ）において、ガラス電極型ｐ）Ｉセンサー３
０の出力端子３４の電位をＥＡ、比較電極２０の出力端
子２４の電位をＥ８、被測定溶液１０の電位をＥいガラ
ス１１ａ３１の電位を１とすると、第６５４　（ｃ）に
示す関係となり、これらの電位差は次式のように定義さ
れる。

ＶＡ　＝　　ＥＡ　−Ｅ、　　　　　　　−・・■ＶＬ
　＝　　Ｅ、−Ｅ、　　　　　　　・・・■Ｖｘ＝　　
旺　−ＥＬ　　　　　・・・■Ｖエ　＝　　ＥＡ　−Ｅ
、　　　　　　・・・００〜０式から０式が得られる。

ＶＡ　　＝　　　ＶＬ　＋　　　ＶＸ　＋　　ｖｌ　　
−・・■ここで、ｖＬとｖＩとは被測定溶液にかかわら
ず一定値となるように調整されている。したがって、被
測定液の変化にともなうｖＡの変化は、ガラス膜の起電
力ｖ８の変化に等しく１次式％式％次に、　ＦＥＴ　Ｊ！！！ＰＨセンサーについて、第７
図（ａ）及び（ｂ）を参照して説明する。　　ＦＥＴＪ
Ｉ！！　ｐ）Ｉセンサー４０は、シリコン基板４１の表
面にソース４２、ドレイン４３を形成し、ソース、ドレ
イン間のゲートを覆うように感応ｌ１ｌ（例えばミｉ０
２膜及びＳｉ３　　Ｎ４膜の積層１９）４４を形成した
構造を有している。そして、ソース４２とドレイン４３
とは定電圧電源４６に接続されている。また、　ＦＥＴ
型ＰＨセンサー４０と比較電極２０とはコントロール回
路４７に接続されている。このコントロール回路４７と
しては、例えば第８図（ａ）〜（Ｃ）に示すようなもの
が用いられる。

これら　ＦＥＴ型ｐＨセンサー４０及び比較電極２０（
第６図と同様な構成）が被測定溶液ｌＯに浸漬されて測
定が行なわれる。

第７図（ａ）において、ソース４２の電位をＥｓ、比較
電極２０の出力端子２４の電位をＥｇ、被測定溶液１０
の電位をＥい感応膜４４の電位をＥｆとすると、第７図
（ｂ）に示す関係となり、これらの電位差は次式のよう
に定義される。

ｖＡ＝Ｅ＾−Ｅｓ　　　　　　・・・■ＶＬ、　＝ＥＬ
−Ｅ、　　　　　　　　・・・■Ｖｘ＝ＥＦ−Ｅ、　　
　　　・・・■ ＶＧ＝Ｅ、−Ｅ、　　　　　・・・００〜０式から０式が得られる。

ｖＧ　＝ＶＡ　”　ＶＬ　”　Ｖｘ　・・・＠ここで、
ＦＥＴ　４Ｇのドレイン４３からソース４２へ流れる電
流ｉとｖ４との間には、次式の関係がある。

ｉ　＝　β（ｖｔｒ　　−ＶＴ）　２／　２　　　　、
・、　（ｎ）ただし、ＶＧ−ｖＴ＜　Ｖ、Ｓ−・・■ ここで、ｖｌはスレッシュホールド電圧、ＶＤ、はドレ
イン４３−ソース４２間に印加すべき電圧である。

ｖＴとβとは温度が一定ならばＦＥＴに固有の一定値と
なる。

なお、ＦＥＴ型ｐＨセンサーではＶ（、は直接測定でき
ないので次のようにして測定を行なっている。ここで、
［相］式及び０式から。

１−１（ＶＡ＋ＶＬ＋Ｖ、−Ｖ、）２／２　　　・（２
を誘導する。

第８図（ａ）又は（ｂ）のようなｉを常に一定にするコ
ントロール回路４７を使用すると、ｖＬ及びＶ７は定数
であるから次式が成立する。

ΔＶｘ＝−ＡＶＡ＝　Ａ　（Ｅ、−Ｅ、）　　　　　・
＠そして、第８図（ａ）のコントロール回路４７を使用
するとＥ、は一定となるから、 Δｖ８＝−ΔＥ尺　　　　　　・・・■また、第８図（
ｂ）のコントロール回路４７を使用すると販が一定とな
るから、 ΔＶ、＝　　ΔＥ５　　　　　　　・・・■一方、０式
を変形して、次式を誘導する。

Ｊ２　　’ｉ−フγフＷ　　＝　ＶＡ　＋　　Ｖ、＋　
Ｖ＊　−ＶＴ　　　　　　　＝・■第８図（Ｃ）のコン
トロール回路４７を使用するとｖ９は一定となるから電
流ｉを次式によってΔＶつに変換することができる。

ΔＶＫ＝　　Ｊ２／β　ΔＪｉ　　　　　・・・＠ただ
し、Ｖ、の変化範囲に従って、ｖＡ＋　　ＶＬ、＋　　Ｖｘ　−ＶＴ＜　　　Ｖ、、　
　　　　　　　　−・・　■を満足するようにＶＡを決
定する必要がある。

以１のようにＦＥＴ型ｐＨセンサーでは被測定溶液中で
の感応膜の起電力の変化Δｖ１は０式、０式、０式に従
って、それぞれ鴫、Ｅ８、ｉを測定することにより検出
することができる。

さて、ガラス電極ｆｆ１ｐｌ（センサー、ＦＥＴ型ｐＨ
センサーともに、被測定溶液中での感応膜の起電力ｖｘ
は、１８８８年Ｎｅｒｎｓｔによって示された０式に従
う。

％式％ここで、Ｒは気体定数（８，３１４４１Ｊ／ｍａｔ　Ｋ
）、Ｆは７７ラデ一定ｔｌ　（９，８４８４５７Ｘ　１
０’　Ｊ／Ｖ　ｍａｌ）、Ｔ　ハ絶対温度（Ｋ）、αは
補正係数、　　ａ、＋＋は水素イオンの活量である。い
ま、水素イオン濃度が籟４．からＣＨ−、に変化したと
き、水素イオンの活量がａｌ、、からａＨ’ｔに変化し
たとすると、再溶液中での感応膜の起電力の差ΔｖＫは
次式で示される。

したがって、α及びｃＨ・／　ａＨ”とＣＨ・との関係
が予め決定されていれば、既知のｃＨ”＋を基準として
Ｃｓ１ｚを測定することができる。このような目的に用
いられるｐＨ標準溶液としてＪＩＳの規定によって調合
されたものが市販されている。

次いで、従来の酵素固定化方法について説明する。酵素
固定化方法はｐＨセンサーの場合と他のセンサーの場合
とで特別に異なるものではなく、どのような酵素を使用
するかを除けば共通に適用できるものである。

当初、　Ｃ１ａｒｋらは半透膜（セロファン紙）で作っ
た袋にグルコースオキシダーゼ溶液を入れ、その中の酸
素電極をさし込み、酵素溶液がもれないように０リング
で固定する方法を採用した。これと同様に、酵素溶液を
ゼラチンなどのゲルにしみこませる方法も用いられた。

しかし、この場合応答速度が極めて遅いという問題があ
った。

また、Ｕｐｄｉｋｅらはアクリルアミドとに、Ｎ−メチ
レンビスアクリルアミドとを光重合して得られるゲルマ
トリックス中にグルコースオキシダーゼを固定化したも
のを酸素電極にはりつける方法を採用した。この方法で
は、アクリルアミドとＮ、Ｎ−メチレンビスアクリルア
ミドとの割合を最適に選ぶことにより、分子量の大きい
酵素をマトリックス内にとじこめ、かつ基質の拡散を許
容することができるため、酵素の流亡を防止するための
半透膜が不要となった。しかし、長期的には酵素が流亡
するため、感度が低下することは避けられなかった。

そこで、Ｂｒａｕｎらは８％の血清アルブミン及び０．
７％のグルタルアルデヒドを含む０．０２Ｍのリン酸塩
緩衝液（ｐＨｆｌ、８）　２．５ｍｌにＩＩＩＩｇのカ
タラーゼを加え、この溶液をガラス上に流し、４℃で２
４時間放置してカタラーゼを固定化した固定化酵素膜を
用いた（Ｇ、Ｂｒａｕｎ　ｅｔ　ａｌ、；Ｂｉｏｔｅｃ
ｈ、Ｂｉｏｅｎｇ、、　１０５゜３５９（１９７３））
、この方法では、タンパク質かもなる酵素をタンパク質
であるアルブミンとともにグルタルアルデヒドと共重合
反応させて一体にゲル化しているので、酵素の流亡が抑
制される。

また、南条らはＬ−アミノ酸オキシダーゼ　１００ｍｇ
と牛血清アルブミン１００＋ｓｇを０．１Ｍリン酸緩衝
溶液（ｐＨ７，３）　５ｍｌに溶解し、これに５０％グ
ルタルアルデヒド水溶液５滴を加えてドライアイスアセ
トン寒剤で凍結し、冷蔵庫中で１日放置した後解凍して
得られるスポンジ状酵素アルブミン三次元共重合体をナ
イロン布を用いて電極に支持させる方法を採用した（Ｍ
、Ｎａｎｊｏ　ａｎｄ　Ｇ、Ｇ、Ｇｕｉｌｂａｕｌｔ；
Ａｎａｌ。

Ｃｈｉｍ、Ａｃｔａ、７３，３８７（１９７４））　、
これによって基質の拡散が速やかになり、応答速度が改
善された。

また、Ｍａｓｃｉｎｉ　らはウレアーゼとアルブミンの
混合溶液を電極に塗布する直前にグルタルアルデヒトを
添加し、素早く電極表面に塗布する方法によって尿素セ
ンサーを試作した。すなわち、５　ｍｇの酵素を５０１
Ｌ＋の牛血清アルブミン水溶液の溶解したもの５鉢１と
、グルタルアルデヒド３ＪＬ＋　とをＮＨ，電極のテフ
ロン膜上に滴下し数秒間でよくかきまぜて展延して塗膜
とした。この塗膜は数秒間で流動性を失い１５分間で充
分な架橋反応を完了する（Ｍ、Ｍａｓｃｉｎｉ　ａｎｄ
　Ｇ、Ｇ、Ｇｕｉｌｂａｕｌｔ；Ａｎａｌ、Ｃｈｅｍ、
。

４９．７９５（１９７７））　、　Ｍａｓｃｉｎｉらの
この方法は、１９８０年Ｊａｎａ　ｔａらが最初の酵素
ＦＥＴセンサーでペニシリンの測定を行なった際に応用
している。

しかし、これらの方法では、グルタルアルデヒドを添加
してから数十秒で流動性を失うような高反応性の液体を
素早く塗布しなければならないため、操作が著しく困難
であるだけでなく、均一なｇ膜を歩留りよく形成するこ
とは不可能であり、工業的な製造には不適当である。

特開昭８０−２９１３５７号公報には、ＰＶＡ（７）Ｏ
Ｈ基にトメチル−ｐ−ホルミルスチリルピリジニウムメ
トサルフェートを付加した感光性樹脂の５％水溶液０．
２１にグルコースオキシダーゼ５１を溶解して均一な溶
液としたものをｐＨＦＥＴセンサーに塗布して光硬化す
る方法が記載されている。

同公報の実施例２には、酵素とアルブミンの混合溶液を
塗布した後、グルタルアルデヒド水溶液に浸漬する方法
が記載されている。しかし、この方法で得られたセンサ
ーは他の方法によって得られたものよりも感度が小さく
なってしまう、これは酵素が固定化されるよりも前にグ
ルタルアルデヒド水、溶液中に溶出することを示してい
る。また、得られる膜は非常に破れやすいものである。

特開昭８１−８８８４４号公報には酵素とアルブミンの
混合溶液を塗布した後、この上に必要量だけのグルタル
アルデヒド水溶液をのせて固定化する方法が記載されて
いる。この方法によれば酵素の流口はさけられるが、出
力が不安定となるだけでなく、寿命にも制約がある。

特開昭８１−３５７８１１１号公報には、ウェハ表面を
シラン化剤で処理した後、ジクロルメタン中に１，８−
ジアミノ−４−７ミノメチルオクタンとグルタルアルデ
ヒド、トリアセチルセルロースを含有する溶液を塗布し
て４０℃で一昼夜放置したものを、ウレアーゼ溶液に浸
漬して固定化する方法が記載されている。同様に特開昭
８１−１７８８４５号公報には、シランカップリング剤
、グルタルアルデヒドをこの順に真空薄着して得られる
生理活性物質固定化用蒸着膜を利用する方法が記載され
ている。

特開昭５９−１１８８９０号公報には、酵素を包括固定
化した酵素包括固定化膜をグルタルアルデヒドなどの架
橋化試薬の気相中で架橋化させる方法が記載されている
。これは膜形成に関するものではなく、単に測定中の酵
素の溶出を抑制してセンサーの寿命を延長するという効
果が得られるだけであり、それ以外の効果を期待したも
のではない。

なお、固定化酵素膜が基質を含む被測定溶液と直接接し
ていると基質を共存する有害成分の影響を受けて応答が
不安定となる場合があるため、以下のような特殊な構造
を採用したものも知られている。

特開昭５８−１８５８９号公報には、固定化酵素膜の外
側に、界面活性剤を含有するセルロースアセテート膜を
一体化して積層し保護する方法が記載されている。また
、特開昭５８−２７６４３号公報、特開昭５８−７３３
４２号公報、特開昭５８−１２８７５７号公報では、固
定化酵素膜の外側に、血液中に多量の存在するアルブミ
ンなどの妨害分子の透過を防ぎ、基質分子のみを選択的
に透過する多孔質膜を形成している。

しかし、以上のような従来の酵素センサー、特にグルコ
ースセンサーでは、基質濃度が高濃度になると串力値が
飽和し、可測濃度の上限が１００ｍｇ／ｄｌ程度であっ
た。ここで、血液や尿中のグルコース濃度は平均１００
ｍｇ／ｄｌであるが、医用検査では異常値の検出を目的
としており、この異常値は従来のグルコースセンサーの
回訓上限１００ｍｇ／ｄｌを超えることになるため、医
用分野への応用に制約があった。

この可測濃度を向上するために、池田らはナイロンフィ
ルターにグルタルアルデヒドで共有結合的にグルコース
オキシダーゼを固定化し、その上にグルコースの透過を
部分的に制限するが酸素の透過は妨げない特殊な選択透
過Ｍ（ポリプロピレン酸）を形成し、７００　ｍｇ／ｄ
ｌまでのグルコース濃度に直接応答するセンサーを作製
した（池田ら；８化、　１１３８０．１５５４））　、
　Ｌかし、このセンサーでは感度が著しく低下するとい
う問題があった。

（発明が解決しようとする問題点）本発明は上記問題点を解決するためになされたものであ
り、高濃度の基質溶液に対しても高感度の測定が可能な
バイオセンサーを提供することを目的とする。

［発明の構成］（問題点を解決するための手段と作用）本発明のバイオ
センサーは、ＰＨセンサーと、該ｐＨセンサーのＰＨ感
応面を覆う酵素固定化膜と、該酵素固定化膜を覆う基質
透過性の酵素非固定化膜とを具備したことを特徴とする
ものである。

本発明において、ｐＨセンサーとしてはガラス電極型ｐ
）Ｉセンサー又はＦＥＴ型ｐＨセンサーが用いられる。

上記ＦＥＴ型ＰＨセンサーの変形として延長ゲー）　Ｆ
ＥＴ型ｐＨセンサーを用いてもよい。

本発明において、酵素固定化膜は酵素を固定化母材（マ
トリックス）に包括固定化、化学結合固定化したもので
ある。ここに適用される酵素としてはグルコースオキシ
ダーゼ、ウレアーゼ、ウリカーゼ、リパーゼ、ペニシリ
ナーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、パーオキシダー
ゼなどが挙げられる。この他に水溶液のｐＨを変化させ
る反応を選択的に触媒する酵素ならば何でもよい。ただ
し、トリプシン（タンパク質分解酵素）は用いることが
できない、上記酵素を固定化するための固定化母材とし
ては、基質の透過を抑制しないものが選択され１例えば
アルブミンとグルタルアルデヒドとの共重合反応によっ
て得られる膜、アクリルアミドとＮ、Ｎ−メチレンビス
アクリルアミドとの共重合反応によって得られる膜、ト
リアセチルセルロースに均一に溶解した１、８−ジアミ
ノ−４−７ミノメチルオクタンをグルタルアルデヒドで
架橋して得られる膜、　ＰＶＡのＯＨ基の一部を感光性
の官能基を有するスチレン誘導体例えばＮ−メチル−ｐ
−ホルミルスチリルピリジニウムメトサルフェートで置
換した感光性樹脂などが用いられる。

本発明において、酵素非固定化膜としては水溶性のタン
パク質（牛血清アルブミン、他の起源のアルブミン、グ
ロブリン等）を含むもの、例えばアルブミンとグルタル
アルデヒドとの共重合反応によって得られる膜が挙げら
れる０本発明に係るバイオセンサーにおいて、安定した
出力を得るためには、基質を含む被測定溶液を攪拌する
ことが不可欠となる。この場合、バイオセンサーの外側
の被測定溶液中では、自然拡散層と攪拌によって生じる
強制拡散層とが存在し、両者の拡散層は明確に区別され
る０本発明における酵素非固定化膜は、上記自然拡散層
の厚さを希望する任意の厚さにコントロールできる作用
を有するものである。

以下、この作用について、より詳細に説明する。

第２図にグルコースセンサーにより、グルコース水溶液
を測定した場合の攪拌時及び静止時の出力の経時変化を
示す、なお、それぞれ同図（ａ）はＦＥＴの感応面に酵
素固定化膜のみを形成したグルコースセンサーによる、
同図（ｂ）はＦＥＴの感応面に酵素固定化膜及び酵素非
固定化膜を積層したグルコースセンサーによる測定例で
ある。

第２図（ａ）及び（ｂ）から明らかなように、静止時に
は平衡出力は酵素非固定化膜の有無に無関係である。た
だし、静止時の平衡出力値は不安定である。これに対し
て、水溶液を攪拌すると、平衡出力値は酵素非固定化膜
を設けたグルコースセンサーの方が大きくなっている。

これらの現象の生じる機構を第３図を参照して説明する
。第３図はセンサーの感応面近傍の平衡水素イオン濃度
を示すものである。なお、それぞれ同図（ａ）はＦＥＴ
の感応面に酵素固定化膜のみを形成したグルコースセン
サーの場合、同図（ｂ）はＦＥＴの感応面に酵素固定化
膜及び酵素非固定化膜を積層したグルコースセンサーの
場合である。

ここで、水素イオンは酵素反応によって生成するから感
応面に密着している酵素固定化膜上において最も高濃度
になっている。そして、平衡時においては、水素イオン
の濃度分布などは被測定溶液と感応面との相対的な流速
の影響を受ける。いま、被測定溶液が感応面に対して相
対的に静止している場合には第３図（ａ）　、　（ｂ）
の破線で示すような自然拡散層が形成される。ただし、
このような拡散層は不安定であり、被測定溶液のわずか
の振動、対流、ゆらぎなどによって大幅に変化すること
があるから出力は前述の如く不安定であることをまぬが
れない、また、静止時には感応面への異物（微小固形物
）の沈着も進行しやすいから出力の変動はさらに大きく
なる。

第２図（ａ）　、　（ｂ）のように、静止時の平衡出力
は酵素非固定化膜の有無に無関係であるから、第３図（
ａ）　、　（ｂ）の破線の形は同一となる。なお。

感応面に酵素非固定化膜がある場合とない場合では基質
及び反応生成物の透過速度が影響を受けることは当然で
ある。にもかかわらず静止時の平衡出力が酵素非固定化
膜の有無に無関係ということは、感応面上における平衡
時の水素イオン濃度は基質及び反応生成物の透過速度に
無関係ということにほかならない、すなわち、第３図（
ｂ）において破線の（イ）の部分（非固定化膜内の水素
イオン濃度を示す）の形は透過速度の異なる膜ととりか
えても変化させることはできない、ただし、平衡に達す
る時間は変化する。

一方、感応面に対して被測定溶液が相対的に有限の流速
をもっている場合にはその流速に応じて拡散層が削り取
られる。この様子は第３図（ａ）。

（ｂ）に実線で示されている。第３図（ａ）　、　（ｂ
）の実線はともに自然拡散層における濃度分布（ロ）と
強制拡散層における濃度分布（ハ）を示す２木の異なる
曲線からなっている。この２本の曲線の交点と固体膜と
の間の層が自然拡散層であり、その厚さはＸで示される
。静止時のＸは一般的に１００μｍ前後である（Ｊａｃ
ｏｂ　Ｊｏｒｎｅ；Ｊ、ＥＩｅｃｔｒｏｃｈｅｍＳａｃ
、、　！２’ｌ　、［４］７２２（１９８２））、そし
て、攪拌強度が強くなるとともにＸは小さくなり、第２
図（ａ）。

（ｂ）の測定時の攪拌強度では１μｍ程度となる。

この場合、第３図（ｂ）の曲線（ロ）を酵素非固定化膜
内に延長した曲線（ニ）によって酵素固定化膜上の水素
イオン濃度が定まることになる。第３図（ｂ）かられか
るように酵素非固定化膜の厚さｙが大きいほど平衡時に
高い出力が得られるという効果は大きい、しかし、ｙが
５終諺を超えると応答時間が長ずごて実用的ではない、
一方、ｙが０、Ｉ　ＩＬｍ未満では自然拡散層の増加に
対する寄与が小さいので意味がない。

本発明に係るバイオセンサーは種々の方法により製造す
ることができるが１例えば酵素及び水溶性タンパク質と
グルタルアルデヒドとを共重合反応させた酵素固定化膜
と、水溶性タンパク質とグルタルアルデヒドとを共重合
反応させた酵素非固定化膜とを有するものは以下のよう
な方法で製造することが望ましい。

すなわち、　ｐＨセンサーのＰＨ感応面に酵素と水溶性
タンパク質とを含有する水溶液を塗布し乾燥した後、グ
ルタルアルデヒド溶液中で３０秒以上処理して架橋反応
を起させる第１工程と、更に水溶性タンパク質を含有す
る水溶液を塗布し乾燥した後、グルタルアルデヒド溶液
中で３０秒以上処理して架橋反応を起させる第２工程と
により製造することができる。なお、酵素非固定化膜を
形成するための第２の工程で用いる酵素を含有しないタ
ンパク賀水溶液は、基本的には第１工程で用いる溶液か
ら酵素のみを除去した組成のものでよいが、全く別の組
成でもよい、また、これらの水溶液には、　ｐＨ緩衝用
電解質及びその他必要な添加物を含有させてもよい。

上記方法において、ｐ）感応面はアセトンやアルコール
で油脂分を除去し、更に界面活性剤などで親木処理した
後、充分に水洗し風乾する。この洗沙は塗布工程の直前
に行なうことが望ましい、−方、溶液中には固形物が混
入していることがあるので、遠心分離、又はろ過によっ
て固形物を除去しておくことが望ましい。

また、　ｐｌ（感応面に酵素及び水溶性タンパク質を含
有する水溶液、又は水溶性タンパク質を含有する水溶液
を塗布する方法としてはデイツプコート法、ドリップコ
ート法、スピンコード法、ブラシコート法、ナイフコー
ト法、スクリーンプリント法、スタンプ法、インクジェ
ットプリント法などが挙げられる。

また、グルタルアルデヒド蒸気はグルタルアルデヒド水
溶液から発生する蒸気を用いることができる。グルタル
アルデヒドは通常５０％水溶液として入手でき、これを
そのまま用いてもよいし、５％程度まで希釈してもよい
、グルタルアルデヒド水溶液上に安定したグルタルアル
デヒド蒸気浴を形成する最も簡単な方法は、シリンダの
底部にグルタルアルデヒド水溶液を入れることである。

この場合、水溶液上のシリンダ内の空間の高さに対して
直径が充分小さくなるようにしておけば対流が起りにく
く、かつグルタルアルデヒド蒸気は空気よりも比重が大
きいのでシリンダの上部を開放しておいても流出するこ
とがない、したがって。

この上部開放部から感応面に塗膜を形成したセンサーを
挿入して処理することができる。

このような方法によれば、塗膜を乾燥した後グルタルア
ルデヒド蒸気に曝すだけで架橋しているため、酵素及び
タンパク質の最初の組成を保ったまま均一で透明な不溶
性の酵素固定化膜とすることができる。この酵素固定化
膜は水につけても安定であるため、この上にほぼ同様な
操作で酵素非固定化膜を形成することができる。また、
乾燥前の塗布液は流動性が一定に保たれるので厚さの制
御が可能である。この際、１回の塗布工程で消費される
酵素溶液の量は塗膜として有効に利用される分量だけで
あり、酵素溶液を節約することができる。また、架橋反
応は風乾状態で行なわれるため、ｗ＆密な膜を形成する
ことができる。これらのことは、　ＦＥＴ型センサーの
ように超薄膜が要求される場合に有利であり、しかも寿
命からみた歩留りの高いセンサーを得ることができる。

なお、本発明において、酵素固定化膜を複数層の積層構
造とすれば生体膜モデルを形成することができる０例え
ば、第１層にグルコースオキシダーゼ、第２層にムタロ
ターゼ、第３層にインベルターゼを固定化した膜を形成
することにより、スクロースセンサーを製造することが
できる。

（実施例）以下、本発明を実施例基づいて更に詳細に説明する。

最初に１本発明に係るグルコースセンサーの製造方法を
第１図（ａ）及び（ｂ）を参照して説明する０本実施例
ではＦＥＴ型ｐＨセンサーの感応面に酵素固定化膜及び
酵素非固定化膜を形成した。第１図（ａ）及び（ｂ）に
示すようにＦＥＴ型ｐＨセンサーは概略的には、ｐ型シ
リコン基板１表面にｎ÷ソース、ドレイン領域２．３が
形成され、ゲート部に５ｉ０２膜及びＳｉ３　　Ｎ４膜
を順次積層したゲート感応ｓ４が形成され、更にゲート
感応膜４以外の部分が被覆体５で覆われた構造を有して
いる。

コノＦＥＴ型ＰＨ（！７？−はＶｐ５　＝３．００Ｖ　
テ、２５℃ニオｌｔルβカ９００ｐＡ　／Ｖ２、ＰＨ感
度カ５８ｍＶ／ＰＨ１ｐＨ４，０１におけるＥｓが＋１
．０００Ｖ　ｗｓ、　ＳＣＥテある。このＦＥＴ型ＰＨ
センサーのゲート感応Ｗ１４の表面をアセトンで脱脂し
、石けん液で親木処理した後、充分に水洗した。

一方、グルコースオキシダーゼ（ベーリンガーマンハイ
ム山之内社製、グレード■、３３０　ｍｇ／１００００
０　ｕ、凍結乾燥品）　　０．３ｇ及び牛血清アルブミ
ン（アルモア製薬社製、フラクションＶ、粉末）　　０
．１ｇをｐＨ８，５の０．１Ｍ　トリス塩酸緩衝溶液２
１に溶解した。また、　２００　ｍｌの円筒状メスシリ
ンダーに２０１の５０％グルタルアルデヒド水溶液を入
れ、グルタルアルデヒド蒸気浴を用意した。

まず、上記ＦＥＴ型ｐＨセンサーの感応面が液面と垂直
になるように、グルコースオキシダーゼ溶液に浸清し、
静かに引上げて風乾し、緩衝績を呈する酵素含有薄膜を
形成した０次に、　ＦＥＴ型ｐＨセンサーをグルタルア
ルデヒド蒸気浴中に装入し、約２時間反応させた。この
結果、酵素及びアルブミンはグルタルアルデヒドと架橋
反応して不溶性となり、ＦＥＴ型ｐＨセンサーの感応面
に酵素固定化膜６が形成された（第１図（ａ）図示）、
このようにして製造されたセンサーは従来のグルコース
センサーに対応するものである。

次いで、牛血清アルブミン１ｇをｐＨ８，５（７）　０
．１に　トリス塩酸緩衝溶液４１に溶解した。つづいて
、第１図（ａ）図示のグルコースセンサーを、少なくと
も酵素固定化ＩＩＩ！６がフルブミン溶液中に沈むよう
に、感応面を液面に垂直にして浸清し、静かに引上げて
風乾した後、グルタルアルデヒド蒸気浴中で約２時間反
応させて不溶化し、酵素固定化膜６上に酵素非固定化膜
７を形成した（第１図（ｂ）図示）、このようにして、
本発明に係るグルコースセンサーが製造された。

第１図（ａ）図示の従来のグルコースセンサー（比較例
）及び第１図（ｂ）図示の本発明に係るグルコースセン
サー（実施例）を用い、以下のようにして２５℃におけ
るグルコース水溶液の濃度Ｃとソース電位の変化ΔＥ５
との関係を調べた。

ここで、測定系の装置構成は第７図（ａ）と同様とし、
コントロール回路として第８図（ａ）図示のものを用い
、０式に従って測定を行なった。

まず、１Ｏ−３ＨのＫＣＩ水溶液５０１をブランク溶液
としてセンサーを挿入し、出力電圧が一定になった時点
でゼロ点を設定した０次に、溶液を攪拌しながら、　１
Ｍグルコース水溶液（１８ｇ／ｄｉ）　ｔｏｏ。

終１をマイクロピペッタ−を用いて徐々に注入し、出力
（Ｅ、の変化ΔＥ、）を記録した結果を第４図に示す、
また、グルコース濃度と出力との関係を第５図に示す。

第５図から明らかなように、比較例ではグルコース濃度
が約　１００ｍｇ／ｄ＋で出力が飽和するのに対し、実
施例ではグルコース濃度が１０００腸ｇ／ｄｌでも出力
は飽和せず、可０濃度が大幅に拡大していることがわか
る。また、グルコース濃度１００■ｇ／ｄ１以下の濃度
における感度は比較例と実施例とでほぼ同程度であると
いえる。

なお、上記実施例のグルコースセンサーをｌＯ本作製し
、１日数回の割合で測定を繰返し、純水中で室温保管し
て寿命を調査したところ、このうち８木については３ケ
月後でも９０％以上の感度を保持していた。

［発明の効果］以上詳述したように本発明によれば、高濃度の基質溶液
に対しても高感度の測定が可能な／（イオセンサーを提
供できる。

【図面の簡単な説明】

第１図（ａ）及び（ｂ）は本発明に係るグルコースセン
サーの製造方法を工程順に示す断面図、第２図（ａ）は
ＦＥＴの感応面に酵素固定化膜単層を形成したグルコー
スセンサーによる攪拌時及び静止時の出力の経時変化を
示す特性図、同図（ｂ）はＦＥＴの感応面に酵素固定化
膜及び酵素非固定化膜を形成したグルコースセンサーに
よる攪拌時及び静止時の出力の経時変化を示す特性図、
第３図（ａ）はＦＥＴの感応面に酵素固定化膜単層を形
成したグルコースセンサー近傍の水素イオン濃度分布を
示す説明図、同図（ｂ）はＦＥＴの感応面に酵素固定化
膜及び酵素非固定化膜を形成したグルコ−、スセンサー
近傍の水素イオン濃度分布を示す説明図、第４図は従来
及び本発明の実施例のグルコースセンサーにおける時間
と出力変化との関係を示す特性図、第５図は従来及び本
発明の実施例のグルコースセンサーにおけるグルコース
濃度と出力変化との関係を示す特性図、第６図（ａ）は
ガラス電極型ＰＨセンサーによる測定系の構成図、同図
（ｂ）は比較電極を一体化したガラス電極型ｐＨセンサ
ーの構成図、同図（Ｃ）は同図（ａ）の測定系における
電位差を示す図、第７図（ａ）はＦＥＴ型ｐＨセンサー
による測定系の構成図、同図（ｂ）は同図（ａ）の測定
系における電位差を示す図、第８図（ａ）〜（Ｃ）はそ
れぞれ第７図（ａ）で用いられるコントロール回路の構
成図である。ｌ・・・ｐ型シリコン基板、２．３・・・ｎ十型ソース
、ドレイン、４・・・感応膜、５・・・被覆体、６・・
・酵素固定化膜、７・・・酵素非固定化膜。出願人代理人　弁理士　鈴江武彦１’Ｆ　ＦＪ’！　（ｍｉｎ）り゛ｌシコース５農演　Ｃ第５図（ａ）　　　　　　　　　　（ｂ）　　　　　　　　（
ｃ）第６図（ａ）（ｂ）第７図（ａ）＼（ｂ）＼（Ｃ）第８ｔ！１丘Ｐ糸売ネ１り正置昭和　６♀”１゛″禍８　日特許庁長官　　小　　川　　　邦　　夫　殿１．４バ件
の表示特願昭６２−２６１１８１号２、発明の名称バイオセンサー３、補正をする者事件との関係　　　特許出願人（３０７）株式会社　東芝４、代理人６、補正の対象明細書、図面７、補正の内容（１）特許請求の範囲を別紙の通り訂正する。（２）第９図及び第１Ｏ図を別紙の通り追加する。（３）明細書第２１頁第３行目のｒ本発明において、」
から同頁第７行目の「挙げられる。」までの文を下記の
通り訂正する。記本発明において、酵素非固定化膜としては、例えば水溶
性のタンパク賀（牛血清アルブミン、他の起源のアルブ
ミン、グロブリン等）を含むもの例えばアルブミンとグ
ルタルアルデヒドとの共重合反応によって得られる膜、
ビスアジド系の増感剤を含むポリケイ皮酸ビニルやポリ
イソプレン等のネガ型フォトレジスト、ナフトキノンジ
アジドスルホン酸エステル化合物を含むノボラック樹脂
等のポジ型フォトレジスト、ポリ塩化ビニル、ポリアミ
ド、ポリメチルメタクリル、ポリスチレン、ポリ酢酸ビ
ニル、アセチルセルロース類、エポキシ樹脂、シリコー
ン樹脂など、薄膜化によって２Ｊｉ質を透過することの
できる膜が挙げられる。（４）明細書第２９頁第１行目と同頁第２行目との間に
、「実施例１」という文を加入する。（５）明細書第３２頁第１４行目の後に、改行して下記
の文を加入する。記実施例２以下のようにしてＦＥＴスクロースセンサーヲ試作した
。インベルターゼ（ベーリンガーマンハイム山之内社（以
下、ＢＭＹ社と略記）製、２．３１　ｇ　７７５０００
０Ｕ、凍結乾燥品）　１５ｍｇ、ムタロターゼ（ＢＭＹ
社製、５０００ｕ／■ｇ、３．５Ｍ硫酸アンモニウム水
溶液に５ｍｇ／ｍｌの濃度でコロイド状に分散されてい
るものを透析して塩分を除去し、５ａ＋ｇ／ｍｌの濃度
調整して再分散させた懸濁液２００ｇ１を使用）　１　
ｒａｇ、グルコースオキシダーゼ（ＢＭＹ社製、グレー
ドエ、３３０　ｔａｇ／　１０００００　ｕ　、凍結乾
燥品）　１５ｍｇ、牛血清アルブミン（アルモア製薬社
製、フラクションＶ、凍結乾燥品）　３　ｍｇｔ−ｐＨ
８，５ｃ７）０．ＩＮ）　！Ｊ　ス塩ｍ緩衝溶液に溶解
し、全体を５００ｇ＋とした。この溶液はいずれも約５
０００　ｕの量に相当する３種類の酵素を含んでいる。この溶液をＦＥＴ型ｐＨセンサーの感応面を覆うように
塗布して乾燥した後、グルタルアルデヒド蒸気中で架橋
し、酵素固定化膜とした。このようにして得られたＦＥ
Ｔセンサーを用い、スクロースを含まないブランク溶液
中で平衡させた後、０．０２　Ｍ濃度となるようにスク
ロースを添加したときの応答曲線を調べた。第９図中（
ａ）で示すように酵素固定化膜だけを形成したＦＥＴセ
ンサーは実用的な感度を有さないものであった０次に、
上記ＦＥＴセンサーを１％ポリ塩化ビニル丁ＨＦ溶液に
ディッピングして、酵素固定化膜上にポリ塩化ビニルの
薄膜（酵素非固定化膜）を形成し、上記と同様にスクロ
ースに対する応答を調べた。その結果、第９図中（ｂ）
〜（ｆ）に示すように、ポリ塩化ビニル薄１１！２の塗
布回数が増加するとともに、感度が著しく上昇した。また、このようにして得られたＦＥＴスクロースセンサ
ーの濃度と出力との関係を第１Ｏ図に示す。実施例２のＦＥＴスクロースセンサーの場合、実施例１
のＦＥＴグルコースセンサーの場合と異なり、０゜００
２Ｍから　２Ｍまで濃度の対数に対して直線的に応答す
ることがわかった。なお、酵素非固定化膜として、ポリ塩化ビニルの代りに
アルコール可溶性ナイロンを使用した場合にも上記と同
様な効果が得られた。このようにして得られたＦＥＴバ
イオセンサーは、ポリ塩化ビニルやナイロンのような強
度の高い薄膜で酵素固定化膜が保護されているので、１
か月後でも外観上の変化がみられなかった。また、ノボ
ラック系のフォトレジストを希釈して用いても同様の効
果が得られた。このことはＦＥＴバイオセンサーの製造
上の利点となる。（６）明細書第３４頁第５行目の「構成図」の後に、「
、第９図はＦＥＴの感応面に酵素固定化膜単層又は酵素
固定化膜とポリ塩化ビニルからなる酵素非固定化膜とを
形成したスクロースセンサーによる出力の経時変化を示
す特性図、第１Ｏ図は本発明の実施例２のスクロースセ
ンサーにおけるスクロース濃度と出力変化との関係を示
す特性図」という文を加入する。２、特許請求の範囲（１）　ｐＨセンサーと、該ＰＨセンサーのｐＨ感応面
を覆う酵素固定化膜と、該酵素固定化膜を覆う基質透過
性の酵素非固定化膜とを具備したことを特徴とするバイ
オセンサー。（２）酵素固定化膜が酵素及び牛血清アルブミンをグル
タルアルデヒドで架橋したものからなることを特徴とす
る特許請求の範囲第１項記載のバイオセンサー。出願人代理人　弁理士　鈴江武彦Ｍ　　間　（ノヌ３〕第９図スクロース＝ｉ＆　　　　（Ｍ）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ｐＨセンサーと、該ｐＨセンサーのｐＨ感応面を
覆う酵素固定化膜と、該酵素固定化膜を覆う基質透過性
の酵素非固定化膜とを具備したことを特徴とするバイオ
センサー。
（２）酵素固定化膜が酵素及び牛血清アルブミンをグル
タルアルデヒドで架橋したものからなることを特徴をす
る特許請求の範囲第１項記載のバイオセンサー。
（３）基質透過性の酵素非固定化膜が牛血清アルブミン
をグルタルアルデヒドで架橋したものからなることを特
徴とする特許請求の範囲第１項記載のバイオセンサー。