CN1166874A - 带有以共价键固定在信号活性表面上的生物物质的生物传感器 - Google Patents
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Abstract
将生物活性物质,特别是酶,成功键合至生物传感器的信号活性的表面上可以借助杂双官能交联剂来实现,交联剂一方面具有对信号活性表面为反应性的基团A-如与-OH,-SH或NHx反应的基团,另一方面具有可光活化的、生物物质反应性的基团B。已知的基团B为叠氮基苯基和叠氮基邻羟苯基。这种一方面带有基团B,另一方面又带有琥珀酰亚胺酯基的交联剂可购得,因此颇具吸引力。带有反应活性NHx基团的Si3N4表面可用作信号活性表面,例如它可在气相中由SiH4/NH3反应沉积在新鲜的SiO2表面上制得,然后用稀氢氟酸除去氧化物。
Description
本发明涉及生物传感器,尤其是基于场效应的生物传感器,它带有任选硅烷化的信号活性表面,传感性生物物质借助交联剂与之连结。
生物传感器利用酶反应来选择性指示某分析物,长期以来,已经有了长足的发展。
这种传感器基本上包括含有生物物质如酶的表面层,该表面层接触待测介质,尤其是流体。受分析物影响,由生物物质产生的信息通过磁放大器元件转化,并由任选集成化的电信号处理过程而成为可记录的形式。作为磁放大器特别是有电势测定式及电流测定式的电极,如场效应结构等。
这种含生物物质的传感器的一个具体问题是,在尽可能避免因固定方式带来的活性损失的情况下,将生物物质充分地,即特别稳定地固定到具有高表面特异性活性(flachenspezifischer Aktivitat)的传感器表面上。
作为传感性生物物质可有不同的形式,如酶、微生物、细胞、抗体、抗原、细胞器或组织切片。但有关文献中,工作主要围绕含酶的生物传感器,因此下面介绍简化的含酶生物传感器。
已知的固定技术有纯吸收累积、结合至聚合物层、酶分子间交联及酶共价键合至传感器上。为使酶共价键合至占优势的氧化的传感器表面,该表面常进行硅烷化(大多使用氨基烷基烷氧基硅烷),然后用戊二醛将酶键合在硅烷化的表面上(见Anal.Chim.Acta 245(1991)89-99页)。此外,也已介绍对具有使用不同的交联剂而成的邻近的共价键的Si3N4表面进行硅烷化的过程(见R.A.Williams等,生物传感器及生物电子学,9(1994)159-67)。
此外,还推荐使用巯基封端的硅烷,然后利用杂双官能团(heterobifunctionellen)交联剂进行蛋白质固定,例如采用N-羟基-琥珀酰亚胺酯,如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶二硫基)-丙酸酯(SPDS)、N-琥珀酰亚氨基-P-碘代乙酰氨基-苯甲酸酯(SIAB)、N-琥珀酰亚氨基-4-(P-马来酰亚氨基苯基)丁酸酯(SMPB)或N-琥珀酰亚氨基-m-马来酰亚氨基苯甲酸酯衍生物(MBS-衍生物)(见S.K.Bathia等.Anal.Biochem178(1989)408-13)。
1986年的JP61087699介绍了直接将酶和微生物键合在通过等离子聚合形成的Si3N4-表面上,为此需采用戊二醛或二异氰酸酯。
单或双官能团交联剂及相关的键合对象的官能团的反应活性导致形成低聚物及键合多样化,因此似乎难以保证生物分子通过交联剂分子同信号活性表面的准确共价键合。
故又开发一种新的将生物物质固定在传感器表面上的方法,用它可制得具有更高灵敏度和稳定性的明确产物。
前述的本发明的生物传感器的特征基本如下:交联剂由这样一种杂双官能交联剂组成,该交联剂一方面带有对于信号活性表面具有特异反应活性的基团(A),另一方面带有可光活化的生物物质反应性基团(B)。
采用此种杂双官能交联剂,其中生物物质反应性的基团首先经光活化而进行反应,可实现生物物质明确的偶联至表面上,其中首先在避免光活化作用的情况下,使交联剂与表面通过相应的反应性基团反应。在除去多余的(未键合的)交联剂部分后,再在相应的光照条件下进行与生物物质的反应。
作为表面,可选用特别是半导体材料,如锗或硅,以及氧化物,如氧化硅、氧化铝、氧化钽等反应活性状态或硅烷化的物质,其中特别是将带有巯基或氨基的硅烷化层例如沉积在二氧化硅上。有利的还有带有反应活性基团,特别是NHx-基团的Si3N4-表面层,这种活性基团尤适于与醛基、酯基或亚氨基酯基偶联。
作为可光活化并可与生物物质反应的基团,特别适用的有脂环族或芳香族键合的硝基或叠氮基,它们在光照下与蛋白质物质反应。已知有与此相关的含有叠氮基苯基或叠氮基邻羟苯基作为B基团并带有N-羟基-琥珀酰亚氨基酯基作为A基团的交联剂。这种交联剂可购得(见例如,“免疫技术目录及手册”,Fa.Pierce1992/3;34-46)。
在波长265-275nm光照射下,叠氮基苯基化合物与蛋白质的光活化反应例如按下式进行:作为R根据其作用适用的特别是带有N-羟基-琥珀酰亚氨基酯基作为末端的A基团的一类基团,它可接着与NHx-基团反应。
作为交联剂中与SH-基团反应的官能团A,已知有二硫化物基团。
氮化硅表面的形成可特别利用CVD技术由SiH4/NH3混合物沉积制得。(见A.Garde等,ESSDERC 1994-11.-15.Sept.1994 Ed.C.Hill&P.Ashburn)。该表面在空气中吸收氧,并在湿气作用下易水解形成Si-OH、Si-NH和Si-NH2基团。这些对于交联剂的A基团为反应活性的基团可用于将生物物质偶联至氮化物表面。
在制备本发明的传感器时,特别有利的是使用经用稀的氢氟酸处理而脱氧化物的Si3N4表面,交联剂与Si3N4表面的NH2-基团或NH-基团反应,交联剂的可光活化的B官能团然后再与蛋白质反应。
作为交联剂的NH2-基反应活性的基团A,除了上面提到的外,还可使用卤素基团、环氧基、酰亚氨基或异氰酸酯基。许多可与氨基反应的基团见US-PS5234820。
下面详细介绍的氨基特异性反应于室温在中性至弱碱性pH值进行。升高温度或pH值可使反应速度提高,但也使交联剂水解速度提高。所用缓冲液应不含有交联剂的官能团能与之发生反应的胺或其他化合物。
N-羟基琥珀酰亚胺酯特别是与伯胺发生特异性反应。在裂解N-羟基琥珀酰亚胺的情况下,在伯胺与所用的酯的残基之间形成酰胺键。若不使用水溶性类似物,则带有此类官能团的交联剂必须先溶于少量有机溶剂(如DMSO)中,然后再用含水缓冲液稀释至最终浓度。缓冲液的离子强度不应过高,以免出现盐析效应。弱碱性pH值(7-9)确保伯胺处于非质子化状态。
醛具有强还原性的羰基。它与伯胺反应脱水。
伯胺与亚氨基酯的反应在pH8-9范围进行。此时酯分解,伯胺与亚氨基形成胍基化合物。
若交联剂具有巯基特异性基团,如马来酰亚胺、活化的卤化物或吡啶基二硫化物基团作为官能团末端A,则待键合的表面必须有自由的硫羟基(一般是烷氧基硅烷的巯基烷基)。为避免该基团氧化,所用的缓冲液必须脱气。
马来酰亚胺在弱酸至中性(pH6.5-7.5)介质中反应,而对卤化物和吡啶基硫化物来说,则推荐等于7或大于7的pH值。
本发明可用于连接生物物质,特别是蛋白质性生物物质,特别是各种酶,例如水解酶、氧化还原酶、转移酶、裂解酶、异构酶和连接酶或合成酶,尤其是青霉素酶、脲酶、葡糖氧化酶、尿激酶、乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶或乳酸氧化酶,适用于生物传感器。下面以青霉素传感器实验来具体验证本发明,以下叙述介绍这一实验。这里涉及到几个图。它们表示:
图1:传感器原理(测定装置)图2:浓度范围为10-4至10-1M青霉素的典型测量曲线;和图3:本发明传感器的校正曲线。
实施例
在P-或P+掺杂的硅片(1mOhm.cm-30Ohm.cm)上,首先通过热干燥氧化法在700至1200℃(此处1000℃)在扩散炉中制得厚度5-100nm的不导电SiO2层。然后通过在气相化学沉积(PECVD)制得同样不导电的氮化硅层,厚度10-100nm。反应气体中SiH4/NH3比例为2∶1,基物(Substrat)温度200-500℃(此处300℃),沉积时压力为1-3Torr(此处为1.5Torr)。在N2中退火(700-1000℃中5-60分钟)。最后在基物(Substrat)未经打磨的一面设欧姆接触(如10-1000nmAl,Au)。所使用的物质在基准压<10-3毫巴进行真空热蒸镀而涂上。沉积速度在0.1~10nm秒/之间。接着将硅片在RTA-炉中于150-500℃(此处400℃)在N2气氛中退火。
在酶固定过程即将开始之前,将硅片在丙酮、2-丙醇和蒸馏水中在超声浴中清洗,用稀氢氟酸(1-10%HF)浸蚀10-60秒(此处30s)。
使用杂双官能团交联剂ANB-NOS(N-5-叠氮基-2-硝基苯甲酰氧基琥珀酰亚胺)时,先将其溶于少量DMSO中,然后用0.2M三乙醇胺缓冲液(pH5~9)稀释至终浓度0.5~10mM。将溶液涂至Si3N4表面上,并在室温保持5-40分钟。在更低温度时则必须保持更长时间。未键合在氮化硅表面的分子用三乙醇胺缓冲液(TEA)冲洗掉。然后将酶(青霉素酶I型,Bacillus Cereus,Sigma P0389)溶于不含氨基的缓冲液(如TEA,特别是不是TRIS-或甘氨酸缓冲液)中,(1000-5000单位/ml),然后置于已用交联剂处理过的氮化硅表面上。在4-60℃温度,特别是室温保持1-240分钟(此处15分钟)后,用波长320-350nm的光引发酶分子键合到交联剂中仍自由的官能团上。固定操作结束后,将适用的青霉素传感器用0.1M TRIS一缓冲液(pH7-8)及蒸馏水冲洗,并在空气或N2或惰性气体中干燥至少10分钟。
随后用按此法制得的场效应传感器在水溶液中进行青霉素浓度测定。
图1示出测定装置图解。本发明所制得的场效应传感器由硅基物(Substrat)1,绝缘层2(SiO2和氮化硅)、交联剂层3和酶层(青霉素层)4组成,并合至一个测试元件中。测试元件充满含水的测试溶液,所含青霉素G的浓度为10-5至1M。在测试溶液6中加入参比电极(如Ag/AgCl)7。在参比电极7和硅基物(Substrat)上的接触电极8之间测电势。
图2为典型测定曲线图,它以CONCAP(恒容)方式给出青霉素浓度范围10-4-10-1M的情况。青霉素G钠盐(Sigma P3032)为此溶于10mMTRIS-HCl缓冲液,pH为7。随着青霉素浓度增加,所产生的青霉烯酸(Penicilloinsaure)的浓度也在增加,由此紧靠起pH-传导器作用的氮化硅面的氢离子浓度亦随之增加。这会导致氮化硅/电解质边界层电势变化,电压值变正或变负。随着时间变化可观察到酶反应中浓度依赖性的电势变化。在所标明的时间内测试液发生变化。
图3是由图2得到的化学转换特性曲线。它给出本发明方法制备的场效应传感器的校正曲线。此曲线线性范围部分符合能斯特方程,即在此范围内,青霉素浓度与其相应的电位存在对数关系,这样得出测量电位式的化学或生物传感器的灵敏度。本发明所制传感器的该范围为p[青霉素G]2.3~3.3,对应于0.5至5mM。灵敏度为每10个单位50mV。
线性测量范围的准确位置及绝对灵敏度基本上取决于缓冲液组成、浓度,即缓冲能力和pH值。通过适当选择这些参数可以按需要调整测量所需的测量范围。例如,在使用咪唑缓冲液(pH7)时,线性测量范围在2至20mM青霉素,而对于HEPES-缓冲液,线性范围为约1-10mM。增加pH值则校正曲线线性范围的位置向青霉素高浓度区移动,而降低pH值则线性范围相应下降。
按本发明制得的传感器显示出高于250天的高稳定性。其灵敏度为50mV每10个青霉素单位。
也可制造场效晶体管(Feldeffekttransistor),它在栅区具有与本发明所述的电容层结构相同的构造。
Claims (9)
1.生物传感器,尤其是建立在场效应基础上的生物传感器,带有任选硅烷化的信号活性的表面,传感性的生物物质借助交联剂与所述表面键合,其特征在于,交联剂由杂双官能(heterobifunktionell)交联剂组成,所述交联剂一方面具有对信号活性表面为特异反应性的基团(A);另一方面具有可光活化的、生物物质反应性的基团(B)。
2.按权利要求1的生物传感器,其特征在于,所述交联剂通过其基团(A)与信号活性表面的-OH、-SH或-NHx基团间的键合反应而与信号活性表面键合。
3.按权利要求2的生物传感器,其特征在于,所述交联剂通过其基团(A)的键合反应而与带有反应活性的NHx-基团的硅烷化表面或Si3N4表面键合。
4.按权利要求1-3之一的生物传感器,其特征在于,所述交联剂通过交联剂的叠氮基或硝基(B)的光活化键合反应而与生物物质的蛋白质键合。
5.按权利要求4的生物传感器,其特征在于,进行与芳香性键合的硝基-或叠氮基-(B)的光活化键合反应。
6.按权利要求5的生物传感器,其特征在于,键合反应借助于具有叠氮基苯基的交联剂进行。
7.按权利要求2的生物传感器,其特征在于,交联剂借助醛基、酯基或亚氨基酯基(A)的键合反应而与表面键合。
8.按权利要求7的生物传感器,其特征在于,交联剂借助于N-羟基-琥珀酰亚胺酯基团(A)的键合反应而与表面键合。
9.按上述权利要求之一的生物传感器,其特征在于,有厚度为10-1000nm的信号活性表面,即经CVD法由SiH4/NH3混合物沉积在SiO2面上的Si3N4-表面层。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |