KR102142701B1 - 중성 제제로 표면 개질된 바이오센서 및 이를 이용한 검출방법 - Google Patents

Abstract

중성 제제로 표면 개질된 바이오센서 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것으로, 일 양상에 따른 센서에 의하면 센서의 표면상에서 시료내의 미지의 물질이 비특이적 결합을 형성하는 것을 보다 효과적으로 차단하는 것이 가능하여 검출효율을 극대화시킬 수 있으며, 또한 세척 단계를 수반하지 않을 수 있어 검정 절차를 보다 간이 신속하게 할 수 있는 효과가 있다.

Description

중성 제제로 표면 개질된 바이오센서 및 이를 이용한 검출방법 {Biosensor surface-modified with neutral agent and detecting method using the same}

중성 제제로 표면 개질된 바이오센서 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것이다.

바이오센서란 특정한 생물학적 물질의 존재 유무 및 그 양을 측정하기 위한 것으로, 생물학적 요소와 분석 대상 물질 간의 선택적인 상호작용으로 유발된 물리적 또는 화학적 변화를 인식 가능한 광학적 또는 전기적 신호로 변환시켜주는 장치를 말한다. 이러한 바이오 센서의 적용 분야는 환경 분야에서의 오염 물질의 분석을 위한 사용, 군사 분야에서의 대량 살상용 생화학 무기의 감지를 위한 사용, 및 식품분야에서 유해물질 또는 부패 촉진 물질의 검출을 위한 사용 등이 있으나, 특히 임상진단 및 의료분야에서 질병의 조기진단 또는 생체 물질의 분석 목적으로 각광을 받고 있다.

그러나 바이오센서의 한계로서, 분석 대상 물질과 특이적 결합을 하는 생물학적 요소 예컨대, 항체가 고정화된 영역 이외의 영역에서 시료에 포함된 미지의 물질이 센서 표면과 비특이적 상호작용을 할 수 있고, 이로 인해 노이즈 신호가 발생할 수 있다.

일 구체예에 따른 전계 효과 트랜지스터(field-effect transistor) 기반 바이오센서는 고감도 센서이기 때문에 외부 환경에 영향을 많이 받는다. 특히, 표면 전하에 매우 민감하므로 안정적인 신호 검출을 위한 표면 처리가 중요하다. 기존 블로킹(blocking) 방법인 소혈청알부민(BSA) 코팅은 음전하를 많이 띠고 있기 때문에 혈청 안에 포함되어 있는 다양한 단백질과 비특이적인 결합을 유도할 수 있고 이는 검출 신호에 노이즈를 발생 시킬 수 있다 (한국공개특허 10-2018-0043916). 따라서 새로운 블로킹 방법을 도입하여 표면 전하를 조절하는 방법이 요구된다.

일 양상은 시료 내의 표적물질과 물리적 또는 화학적 상호작용이 일어나는 반응부; 및 상기 상호작용을 인식하여 전기적 신호로 변환하는 신호 변환부를 포함하고, 상기 반응부는 기판; 상기 기판상에 형성된 전극; 상기 전극상에 형성된 전기적으로 중성인 제제를 포함하는 블로킹층을 포함하는 바이오센서를 제공하는 것이다.

다른 양상은 상기 바이오센서에 시료를 접촉시키는 단계; 및 상기 바이오센서의 전기 전도도 변화를 관찰하는 단계를 포함하는 표적 물질 검출방법을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 기판; 전극; 테스트 셀을 포함하는 반응부를 제공하는 단계; 링커를 사용하여 상기 전극 표면을 처리하는 단계; 생물학적 탐침을 상기 링커에 고정화하는 단계; 및 전기적으로 중성인 제제로 상기 전극 상에 블로킹 층을 형성하는 단계를 포함하는 바이오센서의 제조방법을 제공하는 것이다.

일 양상은 시료 내의 표적물질과 물리적 또는 화학적 상호작용이 일어나는 반응부; 및 상기 상호작용을 인식하여 전기적 신호로 변환하는 신호 변환부를 포함하는 바이오센서를 제공한다.

상기 시료는 개체, 예를 들면, 인간을 포함한 포유류 등으로부터 유래된 생물학적 시료일 수 있다. 또한, 상기 생물학적 시료는 혈액, 전혈, 혈청, 혈장, 림프액, 소변, 분변, 조직, 세포, 기관, 골수, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 그들의 조합일 수 있다.

상기 표적물질과 물리적 또는 화학적 상호작용은 특별히 한정되지 않지만, 통상은 공유 결합, 소수결합, 수소 결합, 반데르 발스 결합 및 정전력에 의한 결합 중 적어도 하나로부터 생기는 분자 간에 작용하는 힘에 의한 작용을 나타낸다. 공유 결합으로는, 배위 결합, 쌍극자 결합을 포함한다. 또, 정전력에 의한 결합이란, 정전 결합 외에, 전기적 반발도 포함한다. 또, 상기 작용의 결과 생기는 결합 반응, 합성 반응, 분해 반응도 상호작용에 함유된다. 상호작용의 구체예로는, 항원과 항체간의 결합 및 해리, 단백질 리셉터와 리간드간의 결합 및 해리, 접착 분자와 상대방 분자간의 결합 및 해리, 효소와 기질간의 결합 및 해리, 아포 효소와 보효소간의 결합 및 해리, 핵산과 그에 결합하는 단백질 간의 결합 및 해리, 핵산과 핵산간의 결합 및 해리, 정보 전달계에 있어서의 단백질 사이의 결합과 해리, 당 단백질과 단백질간의 결합 및 해리, 또는 당쇄와 단백질간의 결합 및 해리, 세포 및 생체 조직과 단백질간의 결합 및 해리, 세포 및 생체 조직과 저분자 화합물간의 결합 및 해리, 이온과 이온 감응성 물질간의 상호작용 등일 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 반응부는 기판; 상기 기판상에 형성된 전극; 상기 전극상에 형성된 전기적으로 중성인 제제를 포함하는 블로킹층을 포함 할 수 있다. 상기 반응부는 일회용으로 사용하도록 구성된 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 기판은 실리콘, 유리, 금속, 플라스틱, 및 세라믹으로 구성되는 군으로부터 선택되는 물질일 수 있다. 구체적으로, 상기 기판은 실리콘, 유리, 폴리스티렌, 폴리메틸아크릴레이트, 폴리카르보네이트 및 세라믹으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 전극의 예는 타이타늄 나이트라이드, 은, 은에폭시, 팔라듐, 구리, 금, 백금, 은/염화은, 은/은이온, 또는 수은/산화수은일 수 있다. 또한, 상기 반응부는 상기 기판 또는 상기 전극 상에 형성된 절연 전극을 포함할 수 있다. 상기 절연 전극은 천연 또는 인공적으로 형성된 산화막을 포함하는 것일 수 있다. 상기 산화막의 예는 SixOy, HxfOy, AlxOy, TaxOy, 또는 TixOy (여기서, x 또는 y는 1 내지 5의 정수)를 포함할 수 있다. 상기 산화막을 형성하는 것은 알려진 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 산화물을 기판 상에 액상침적 (liquid phase deposition), 증발, 및 스퍼터링에 의하여 침적함으로써 이루어질 수 있다. 상기 절연 전극 상에 시료를 수용하기 위한 테스트 셀을 부착할 수 있다. 상기 테스트 셀은 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS), 폴리에테르설폰(polyethersulfone, PES), 폴리(3,4-에틸렌디옥시티오펜)(poly(3,4-ethylenedioxythiophene)), 폴리(스티렌설포네이트)(poly(styrenesulfonate)), 폴리이미드(polyimide), 폴리우레탄(polyurethane),　폴리에스테르(polyester), 퍼플루오로폴리에테르(Perfluoropolyether, PFPE), 폴리카보네이트(polycarbonate), 또는 상기 고분자의 조합으로부터 제조된 것일 수 있다. 본 명세서에서 용어 “블로킹층”은 상기 전극의 표면을 1 이상의 블로킹 제제(blocking agent)를 사용하여 도포한 층을 의미할 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 전기적으로 중성인 제제는 중성 단백질 또는 중성 펩타이드일 수 있다. 상기 전기적으로 중성인 제제는 물질의 고유한 등전점(pI)이 6.3 내지 7.5에 해당하여 용매의 pH가 6.3 내지 7.5일 때에, 분자의 알짜 전하량이 0 이 되는 물질을 의미할 수 있고, 상기 전극의 표면 전하를 중성으로 만드는 물질은 무엇이든 가능하다. 예를 들어, 단백질, 펩타이드 등과 같이 음이온단과 양이온단을 동시에 함유하는 양쪽성 전해질에서 분자의 알짜 전하량(net charge)이 0 이 되는 경우를 의미할 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 중성 펩타이드는 임의의 아미노산 조합으로 구성된 중합체로, 펩타이드 전체의 pI 값이 6.3 내지 7.5 를 갖는 물질일 수 있다. 따라서, 상기 아미노산은 pI 값이 6.3 내지 7.5 에 해당하지 않아 음전하 또는 양전하를 띠는 아미노산일 수 있다. 또한, 상기 펩타이드는 10개 내지 100개의 아미노산으로 구성될 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 중성 단백질은 예를 들어, 미오겐(myogen, pI=6.3), 글리아딘(gliadin, pI=6.5), 헤모글로빈(hemoglobin, pI=6.8), 및 미오글로빈(mioglobin, pI=7.0) 또는 그의 조합일 수 있다. 상기 단백질의 알짜 전하는 단백질 전체의 아미노산보다는 단백질 표면의 아미노산에 의해 결정될 수 있다.

상기 바이오센서는 생물학적 요소와 분석 대상 물질 간의 상호작용을 인식함에 있어 표면 전하에 의한 영향을 많이 받는 전기 화학적 센서는 무엇이든 가능하며, 일 실시예에 따른 전계 효과 트랜지스터(field-effect transistor: FET) 기반의 바이오센서 일 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 신호변환부는 전계 효과 트랜지스터를 포함할 수 있다. 상기 신호변환부는 상기 반응부로부터 분리가능한 것일 수 있고, 반응부의 전극과 트랜지스터의 상부 게이트 전극 사이의 연결로 이루어진 것일 수 있다. 상기 연결은 예를 들면, 플러그 형태를 가질 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 반응부는 표적물질과 특이적으로 결합하는 생물학적 탐침을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 용어 “생물학적 탐침”은 반응부에 기능화를 부여할 수 있는 물질 또는 표적물질에 특이적으로 결합하는 물질을 의미할 수 있다. 상기 생물학적 탐침은 DNA, RNA, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 아미노산, 탄수화물, 효소, 항체, 항원, 수용체, 바이러스, 기질, 리간드 및 멤브레인 또는 그의 조합일 수 있다. 예를 들면, ANXA 3 항원과 특이적으로 결합하는 ANXA 3 항체일 수 있다. 또한, 상기 생물학적 탐침은 산화 환원 효소(redox enzyme)를 포함할 수 있다. 상기 산화 환원 효소는 기질을 산화 또는 환원시키는 효소를 의미할 수 있으며, 예를 들면, 옥시다아제, 퍼옥시다아제, 리덕타아제, 카탈라아제 또는 디히드로게나아제를 포함할 수 있다. 상기 산화 환원 효소의 예는 혈당 옥시다아제, 락테이트 옥시다아제, 콜레스테롤 옥시다아제, 글루타메이트 옥시다아제, HRP(horseradish peroxidase), 알코올 옥시다아제, 글루코오스 옥시다아제(glucose oxidase; GOx), 글루코오스 디히드로게나아제(glucose dehydrogenase; GDH), 콜레스테롤 에스테르게나아제, 아스코르브산 옥시다아제(ascorbic acid oxidase), 알코올 디히드로게나아제, 락카아제(laccase), 티로시나아제(tyrosinase), 갈락토오스 옥시다아제(galactose oxidase) 또는 빌리루빈 옥시다아제(bilirubin oxidase)를 포함할 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 반응부는 상기 생물학적 탐침을 상기 전극의 표면에 고정화하기 위한 링커를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 용어 “고정화(immobilization)”는 생물학적 탐침이 기판 또는 전극에 화학적 또는 물리적으로 결합을 형성하는 것을 의미할 수 있다. 상기 링커는 비오틴, 아비딘, 스트렙트아비딘, 탄수화물, 폴리 L-리신, 수산화기, 티올기, 아민기, 알코올기, 카르복실기, 아미노기, 설퍼기, 알데히드기, 카르보닐기, 숙신이미드기, 말레이미드기, 에폭시기, 및 이소티오시아네이트기를 갖는 화합물 또는 그의 조합일 수 있다. 구체적인 예로서, APTES 및 glutaraldehyde의 조합일 수 있다.

본 명세서에서 용어 “표적물질”은 시료 중에 존재할 수 있는 검출 대상 물질로서, 생물학적 탐침과 특이적으로 결합하는 물질을 의미할 수 있다. 검출할 수 있는 표적물질은 샌드위치, 경쟁 또는 치환 분석법 배치(configuration)에 참여할 수 있는 하나 이상의 생물학적 탐침과의 특이적 결합 상호 작용에 관련될 수 있는 것들을 포함할 수 있다. 상기 표적물질의 예는, 펩티드(예를 들어, 호르몬)와 같은 항원, 햅텐, 탄수화물, 단백질(예를 들어, 효소), 약물, 농약, 미생물, 항체, 및 상보적인 서열과 서열 특이적 혼성화 반응에 참여할 수 있는 핵산 또는 그의 조합일 수 있다. 구체적인 예로서, ANXA 3 단백질일 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 전기적으로 중성인 제제는 상기 표적물질이 상기 생물학적 탐침과 특이적 결합을 형성하는 영역 이외의 영역에서 비특이적 결합을 형성하는 것을 차단하는 것일 수 있다.

본 명세서에서 용어 “비특이적 결합”은 시료에 포함된 미지의 물질이 센서 표면과 비특이적 상호작용 예컨대, 소수성 상호작용 및/또는 전하 상호작용 등을 하여 노이즈 신호를 야기하는 것을 의미할 수 있다.

상기 반응부에 있어서, 상기 전극, 생물학적 탐침 및 표적물질을 수용하기 위한 테스트 셀을 통해 시료가 들어오게 되고, 시료 내 존재하는 표적물질은 생물학적 탐침과 결합하여 테스트 셀 내에 화학적 전위 기울기를 일으킨다. 용어 "화학적 전위 기울기(chemical potential gradient)"는 활성종의 농도 기울기를 의미할 수 있다. 그러한 기울기가 2개의 전극 사이에 존재할 때, 전위차는 회로가 열리면 검출될 수 있을 것이고, 상기 회로가 닫히는 경우 기울기가 없어질 때까지 전류는 흐를 것이다. 화학적 전위 기울기는 상기 전극 사이의 전위차 또는 전류 흐름의 인가로부터 생겨나는 어떠한 전위 기울기를 의미할 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 전계 효과 트랜지스터는 기판; 절연층; 서로 이격되어 있는 소스 전극 및 드레인 전극; 게이트 전극; 상기 소스 전극과 상기 드레인 전극 사이에 배치된 채널층을 포함하는 것일 수 있다. 일 실시예에 따른 전계 효과 트랜지스터는, 하부 게이트 전극; 상기 하부 게이트 전극 상에 형성된 하부 절연막; 상기 하부 절연막 상에 형성되고 서로 이격되어 있는 소스 및 드레인; 상기 하부 절연막 상에 형성되고 상기 소스와 상기 드레인 사이에 배치된 채널층; 상기 소스, 상기 드레인, 및 상기 채널층 상에 형성된 상부 절연막, 및 상기 상부 절연막 상에 형성된 상부 게이트 전극을 포함하는 이중 게이트 전계 효과 트랜지스터(dual-gate FET) 일 수 있다.

상기 반응부에서 발생하는 작은 표면 전위전압 차이는, 채널층을 포함하는 이중 게이트 이온 감지 전계 효과 트랜지스터(ISFET)에서 발생하는 초정전결합으로 인해, 하부 전계 트랜지스터의 문턱전압변화를 크게 증폭시킨다. 여기서 증폭인자는 하부 절연막의 두께, 채널층의 두께, 상부 게이트의 절연막 두께에 의해 결정될 수 있다. 하부 절연막의 두께가 두꺼울수록, 상부 절연막 및 채널층의 두께가 얇을수록 증폭인자의 크기는 커질 수 있다.

채널층은 초박막층일 수 있고, 예를 들면, 두께가 10 nm 이하, 9 nm 이하, 8 nm 이하, 7 nm 이하, 6 nm 이하, 5 nm 이하, 또는 4 nm 이하일 수 있다.

상기 채널층의 두께의 범위 내에서, 초박막체에 유기되는 하부 게이트 전극의 강한 전기장으로 인해, 상부 계면까지 모든 조건에서 제어할 수 있는 초정전결합이 발생한다. 이를 통해, 상부 게이트 계면에 유기되는 전자 및 정공 또한 제어하고, 누설 전류를 차단할 수 있다. 또한, 안정된 증폭인자를 허용하여, 표면 전위에 따른 선형적 반응, 히스테리시스, 및 드리프트 현상을 개선시키고, 상하부 게이트의 정전 결합을 지속시킬 수 있다. 또한, 상기 채널층의 두께의 범위 내에서, 초박막 채널층을 포함하는 트랜지스터는 기존 트랜지스터에 비하여 큰 증폭인자를 허용하면서, 이온 감지력도 증대될 수 있다. 또한, 상기 채널층의 두께의 범위 내에서 초박막 채널층을 포함하는 트랜지스터는 기존 트랜지스터에 비하여 안정성도 향상시킬 수 있다. 두꺼운 채널층에서 보여지는 변화하는 증폭인자는, 상부 계면에 유기되는 누설전류 요소와 결합하여, 이온 데미지로 인한 소자의 열화 현상을 일으킬 수 있다. 반면에 일정한 증폭인자를 허용하면서 누설 전류가 제어되는 일 구체예에 따른 트랜지스터는 이온 데미지 효과를 최소화할 수 있다. 또한, 기존 트랜지스터에서 하부 절연막이 과다하게 두꺼워질 경우, 하부 전장이 채널 영역을 모두 제어하지 못하는 현상이 일어나면서, 상하부 게이트의 정전 결합이 약해지게 되는데, 일 구체예에 따른 초박막 채널층을 포함하는 트랜지스터는 정전 결합을 유지하면서 큰 증폭인자를 얻을 수 있다. 상하부 게이트의 정전 결합 현상은 상부 채널 계면이 완전 공핍이될 경우에 발생하게 되는데, 기존 트랜지스터에서는 하부 게이트의 전장이 상부 채널을 제어하지 못하기 때문에 증폭현상이 발생하지 않는다.

상기 채널층은 산화물 반도체, 유기물 반도체, 다결정 실리콘, 및 단결정 실리콘으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 포함할 수 있다. 채널층이 반도체, 유기물 반도체, 다결정 실리콘, 및 단결정 실리콘으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 포함하는 경우, 상하부 게이트 정전 결합이 발생하고 고감도 센서의 제작이 가능하며, 투명하고, 유연한 센서를 제공할 수 있다. 상기 채널층은 넓이 또는 길이에 제한받지 않으며, 이중 게이트 구조에서 상하부 게이트 전극을 사용하여 정전결합 현상을 활용할 수 있다.

또한, 상기 센서에 있어서, 상기 상부 절연막의 등가 산화막 두께(Equivalent oxide thickness)는 상기 하부 절연막의 등가 산화막 두께보다 얇은 것일 수 있다. 예를 들면, 상부 절연막의 두께는 약 25 nm 이하일 수 있고, 하부 절연막의 두께는 약 50 nm 이상일 수 있다. 상기 상부 절연막의 등가 산화막 두께가 상기 하부 절연막의 등가 산화막 두께보다 얇은 경우, 신호의 감도 증폭 현상을 유발할 수 있다.

상기 상부 절연막, 하부 절연막은 천연 또는 인공적으로 형성된 산화막을 포함하는 것일 수 있다. 상기 산화막의 예는 Si_xO_y, H_xfO_y, Al_xO_y, Ta_xO_y, 또는 Ti_xO_y (여기서, x 또는 y는 1 내지 5의 정수)를 포함할 수 있다. 상기 산화막은 단일, 이중, 또는 삼중 적층 구조를 가질 수 있다. 이를 통해, 물리적 두께를 증가시키고, 상부 절연막의 등가 산화막 두께는 감소시킴으로써, 센서의 감도를 증폭시키고, 누설 전류에 의한 열화 현상을 방지할 수 있다.

일 구체예에 따른 이중 게이트 이온 감지 전계 효과 트랜지스터는, 한 소자 내에 상부 절연막을 포함하는 전계 트랜지스터와 하부 절연막을 포함하는 하부 전계 트랜지스터를 동시에 포함하는 구조일 수 있다. 각각의 동작 모드에 따라서, 상부와 하부의 게이트로 독립적으로 동작할 수 있다. 소자의 상하부의 게이트를 동시에 사용하였을 때, 이중 게이트의 구조의 구조적 특수성으로 인하여 정전 결합 현상이 관찰되면서, 상하부 전계 트랜지스터의 상호연관성이 수립될 수 있다. 이중 동작 모드는 하부 게이트를 주 게이트로 사용하는 것일 수 있다. 따라서, 일 구체예에 따른 트랜지스터는 이중 게이트 모드로 동작하는 것일 수 있다.

상기 센서는 복수의 표적물질을 검출하기 위해 복수의 반응부, 및 복수의 트랜지스터를 포함하는 것일 수 있다. 상기 센서는 복수의 상기 반응부, 및 복수의 상기 이온 감지 전계 효과 트랜지스터를 포함하고, 상기 복수의 반응부와 복수의 이온 감지 전계 효과 트랜지스터는 각각 전기적으로 연결된 것일 수 있다. 상기 복수의 트랜지스터 내의 복수의 소스는 공통으로 접지되어 있고, 복수의 상부 게이트 전극은 공통으로 접지되어 있고, 및 복수의 하부 게이트 전극은 공통 전압이 인가되는 것일 수 있다. 예를 들면, 제1 트랜지스터와 제2 트랜지스터의 소스, 및 제1 반응부와 제2 반응부의 기준 전극은 공통으로 접지된 것일 수 있다. 예를 들면, 제1 트랜지스터와 제2 트랜지스터의 하부 전극에는 일정한 공통 전압이 인가되는 것일 수 있다. 또한, 상기 복수의 트랜지스터의 내의 복수의 드레인은 병렬 구조일 수 있다. 예를 들면, 제1 트랜지스터와 제2 트랜지스터의 드레인은 병렬 구조일 수 있다. 또한, 상기 복수의 반응부는 독립적으로 상이한 생물학적 탐침이 고정화된 것일 수 있다. 상기 복수의 트랜지스터는 상기 복수의 반응부로부터 동일한 또는 상이한 표적물질 신호를 감지하고, 이를 증폭하여 반도체 파라미터 분석기(semiconductor parameter analyzer)를 통해 신호를 출력할 수 있다.

상기 신호 변환부는 상기 트랜지스터와 전기적으로 연결되고, 상기 트랜지스터로부터 측정된 전위차로부터 시료 내 표적물질의 양을 결정하기 위한 연산 모듈을 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 연산 모듈은 표적물질의 결정을 위한 것일 수 있다. 본 명세서에서 용어 "표적물질의 결정"은 시료를 평가하기 위한 정성적, 반-정량적 및 정량적 과정을 의미할 수 있다. 정성적 평가에서, 결과는 시료 중에 표적물질이 검출되는지 여부를 나타낸다. 반-정량적 평가에서, 결과는 표적물질이 미리 정의된 어떤 경계 값 이상 존재하는지 여부를 나타낸다. 정량적 평가에서, 결과는 존재하는 표적물질의 양의 수치적 표시이다. 또한 측정된 수치의 변환은 전류 또는 전위의 특이적 수치를 특이적 장치 구조 및 표적물질에 대한 보정 수치에 의존한 표적물질의 수치로 변환시키는 룩업 테이블(look-up table)을 사용할 수 있다. 상기 연산 모듈은 표적물질의 알려진 농도에 따른 전위차를 측정함으로써 결정될 수 있다. 예를 들면, 상기 연산 모듈은 정상 대조군 대비 시료 내 표적물질의 양을 결정하는 것일 수 있다.

또 다른 양상은 (a) 상기 바이오센서에 시료를 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 바이오센서의 전기 전도도 변화를 관찰하는 단계를 포함하는 표적 물질 검출방법을 제공한다.

본 명세서에서 용어 “검출”은 표적 물질의 출현 또는 존재를 발견 또는 확인하는 것을 의미할 수 있고, 예를 들어, 표적 물질을 동정하는 것 또는 시료에서 표적물질을 정량화하는 것을 포함할 수 있다.

상기 검출방법은 표적물질이 생물학적 탐침과 상호작용을 통해 발생한 전류 또는 전위를 측정하는 전기 화학적 방법일 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 (a) 단계 이후에 세척 단계를 수반하지 않고 상기 (b) 단계를 수행할 수 있다. 예를 들어, 통상적으로 혈청 시료를 통과 시킴에 따라 발생한 비특이적 결합으로 인한 노이즈 신호를 제거하기 위하여 PBS로 세척하는 단계를 거치게 되는데, 이러한 단계를 생략하고 바로 혈청 상태에서 상기 바이오센서의 전기 전도도 변화를 관찰 할 수 있다.

일 양상에 따른 센서에 의하면 센서의 표면상에서 시료내의 미지의 물질이 비특이적 결합을 형성하는 것을 보다 효과적으로 차단하는 것이 가능하여 검출효율을 극대화시킬 수 있으며, 또한 세척 단계를 수반하지 않을 수 있어 검정 절차를 보다 간이 신속하게 할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 세척 이전에 혈청 상태에서의 I-V 곡선의 Vg 이동 값 (voltage shift)을 측정한 것이다.
도 2는 PBS로 세척한 후 I -V 곡선의 Vg 이동 값을 재측정 한 것이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 표면 개질된 FET 기반 바이오 센서의 제작

실시예 1-1. 이중 게이트 이온 감지 전계 효과 트랜지스터의 제작

기판은 약 10 내지 20 Ωcm의 비저항을 갖는 SOI(silicon-on-insulator)로 제작하고, 하부 게이트 전극인 실리콘의 두께는 약 107 nm로, 하부 절연막인 매몰된 SiO2 산화막의 두께는 약 224nm로 제조하였다. 표준 RCA cleaning을 수행한 후, 초박막 형성을 위하여 약 2.38 중량%의 테트라메틸암모늄 히드록옥시드(TMAH) 용액으로 상부 실리콘을 식각하고, 포토리소그래프를 이용하여 채널영역을 형성하였다. 형성된 채널의 길이와 폭은 각각 약 20 um, 및 20um 이었고, 두께는 약 4.3 nm이었다. 이어서, sputtering system을 사용하여 타이타늄 나이트라이드 (TiN) 전극을 형성하였다. 이후, 소스와 드레인 상에 약 23 nm 두께의 실리콘 다이옥시드를 산화를 통해 상부 절연막을 형성시켰다. 상부 게이트 전극은 약 150 nm 두께의 TiN 박막층을 sputtering system을 사용하여 증착 시켰다. 다음으로, 결함을 없애고 그들 사이의 계면 상태를 향상시키기 위해 약 450 ℃의 온도에서 N2, 및 H2를 포함하는 가스 조건에서 열처리를 수행하여 이중 게이트 이온 감지 전계 효과 트랜지스터를 제조하였다.

실시예 1-2. 반응부의 제작

반응부를 제작하기 위하여 기판은 약 300 nm의 glass를 사용하였다. 표준 RCA cleaning을 실시한 후, E-beam evaporator를 사용하여 기판 표면에 전기적 전위차를 측정하기 위한 작업 전극 ITO 를 약 100 nm 두께로 증착하였다. 다음에, 절연 전극으로, 산화막인 SnO2 막을 RF 스퍼터를 사용하여 상기 ITO 층 위에 약 45 nm 두께로 증착하였다. 이 때 RF power는 약 50 W이었다. 이후에, 약 20 sccm의 유동 속도(flow rate)를 갖는 Ar 가스 조건 및 약 3 mtorr 압력 조건에서 스퍼터링 공정을 수행하였다. 이어서, 시료를 수용하기 위한 테스트 셀을 폴리디메틸실록세인(PDMS)로 제작하고 상기 절연 전극 상에 부착하여 반응부를 제작하였다. 상기 테스트 셀은 6개의 웰을 가지는 연장된 게이트(extended gate: EG)로 제작하였다. 아울러, 기준 전극으로는 은/염화은 전극을 사용하였다. 5 % APTES, 2.5% glutaraldehyde를 사용하여 표면 처리 한 후 ANXA3 항체를 1시간 상온에서 반응시켜 표면에 고정화하였다. PBS에 용해시킨 1%의 BSA(-), 헤모글로빈(중성), 라이소자임(+) 버퍼를 1시간 동안 상온에서 반응시킨 후 PBS로 3번 세척하였다. 상기 6개의 웰은 항체를 표면에 부착하지 않은 3개의 웰과 항체를 표면에 부착한 나머지 3개의 웰로 구성하였다. 상기 BSA(-), 헤모글로빈(중성), 라이소자임(+) 버퍼는 항체를 표면에 부착하지 않은 웰과 항체를 표면에 부착한 웰에서 각각 반응 시켰다. 상기 블로킹 단백질인 BSA, 헤모글로빈, 라이소자임과 표적 단백질인 ANXA3의 분자량, 등전점, 및 pH 7.4인 용매에서의 전하는 다음의 표1과 같다.

Blocking 및 Target protein	M.W. (kDa)	pI	Charge (at pH 7.4)
Bovine serum albumin (BSA)	66.3	4.8	Anionic (-)
Hemoglobin (Hemo)	64.5	6.8	Neutral
Lysozyme (Lyso)	14.3	11	Cationic (+)
ANXA3 (target protein)	36	5.6	Anionic (-)

실시예 1-3. 센서의 제작

상기 (1-1)에서 제작한 트랜지스터의 상부 게이트 전극과 상기 (1-2)에서 제작한 반응부의 작업 전극을 플러그인의 형태로 연결하여 센서를 제작하였다.

실험예 1. 블로킹 단백질에 따른 세척 전후의 검출효율 비교

블로킹 단백질의 종류에 따른 검출 효율을 확인하기 위하여, ANXA3 단백질을 모델 표적물질로 하여 I-V 곡선의 Vg 이동 값 (voltage shift)을 측정하였다. 6개의 웰에서 100 % 혈청에 1ng/ml의 ANXA3 항원을 분주시킨 용액을 20분 동안 상온에서 반응시켰다. 혈청 시료를 통과시킨 후 initial I-V 곡선(I: 전류, Vg: 게이트전압)에서의 표면에 바이오 물질이 흡착될 때 발생하는 전하이동에 의한 게이트전압의 문턱전압 변화를 측정하였다. 먼저, 세척 이전의 혈청 상태에서 신호를 바로 측정하고, PBS로 세척한 이후에 재 측정하여 검출효율을 분석하였다.

도 1은 세척 이전에 혈청 상태에서의 I-V 곡선의 Vg 이동 값을 측정한 것이다. 도 2는 PBS로 세척한 후 I -V 곡선의 Vg 이동 값을 재측정한 것이다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 중성 블로킹 단백질인 헤모글로빈을 사용한 경우 항체가 부착되지 않은 웰(no Ab)과 항체가 부착된 웰(Pair) 간의 전압 이동 값의 차이가 가장 크게 나타남을 확인하였다. 이는 중성 단백질로 표면을 블로킹한 경우, 항체가 고정된 영역 이외의 영역에서 혈청 내의 음전하를 갖는 다른 단백질과의 비특이적인 결합을 최소화 시킬 수 있음을 나타내는 것이다. 특히, 1차 항체를 고정화 시킨 후 2차 항체를 발광인자와 결합하여 광학적 신호로 전환하는 기존의 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)과 달리, 항체의 항원과의 결합 여부에 따른 전기적 차이를 이용하여 전기적 신호로 전환하는 전계 효과 트랜지스터 기반의 바이오센서의 경우, charge-charge interaction이 검출 효율에 있어 더욱 중요한 요소인 점에서 블로킹 단백질의 전하가 중요하게 작용한다. 따라서, 중성으로 표면 개질한 경우, 전계 효과 트랜지스터 기반 바이오센서에서의 검출 효율 및 블로킹 효율을 극대화 할 수 있음을 알 수 있다.

또한, 도1 및 도 2에 나타난 바와 같이, 중성 단백질인 헤모글로빈으로 블로킹된 경우, PBS로 세척한 이후와 마찬가지로, 세척 이전의 혈청 상태에서도 항체가 부착되지 않은 웰(no Ab)보다 항체가 부착된 웰(Pair)에서 전압 이동 값이 더 크게 나타나는 것을 확인하였다. 반면, BSA나 라이소자임의 경우, PBS로 세척한 이후와 달리, 세척 이전의 혈청 상태에서는 오히려 항체가 부착되지 않은 웰(no Ab)에서의 전압 이동 값이 항체가 부착된 웰(Pair)보다 더 크게 나타나는 점을 확인하였다. 이는 BSA 또는 라이소자임에서는 세척 단계가 반드시 필요하나, 헤모글로빈과 같은 중성 단백질로 블로킹한 경우 세척 단계를 수반하지 않을 수 있음을 의미한다. 따라서, 중성으로 표면 개질한 경우 검정 절차를 보다 간이 신속하게 할 수 있음을 알 수 있다.

Claims (14)

1. 시료 내의 표적물질과 물리적 또는 화학적 상호작용이 일어나는 반응부; 및 상기 상호작용을 인식하여 전기적 신호로 변환하는 신호 변환부를 포함하고,
   상기 반응부는 기판; 상기 기판상에 형성된 전극; 상기 전극상에 형성된 블로킹 제제를 포함하는 블로킹층을 포함하고,
   상기 블로킹 제제는 전기적으로 중성인 제제인 것인 바이오센서.
   
2. 청구항 1에 있어서, 상기 전기적으로 중성인 제제는 중성 펩타이드 또는 중성 단백질인 것인, 바이오센서.
   
3. 청구항 2에 있어서, 상기 중성 펩타이드는 pI(isoelectric point) 값이 6 내지 8 인 것인, 바이오센서.
   
4. 청구항 2에 있어서, 상기 중성 단백질은 헤모글로빈(hemoglobin), 미오겐(myogen), 글리아딘(gliadin), 및 미오글로빈(mioglobin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상인 것인, 바이오센서.
   
5. 청구항 1에 있어서, 상기 신호 변환부는 전계 효과 트랜지스터를 포함하는 것인, 바이오센서.
   
6. 청구항 1에 있어서, 상기 반응부는 상기 표적물질과 특이적으로 결합하는 생물학적 탐침을 포함하는 것인, 바이오센서.
   
7. 청구항 6에 있어서, 상기 생물학적 탐침은 DNA, RNA, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 아미노산, 탄수화물, 효소, 항체, 항원, 수용체, 바이러스, 기질, 리간드 및 멤브레인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상인 것인, 바이오센서.
   
8. 청구항 6에 있어서, 상기 반응부는 상기 생물학적 탐침을 상기 전극의 표면에 고정화 하기 위한 링커를 포함하는 것인, 바이오센서.
   
9. 청구항 8에 있어서, 상기 링커는 비오틴, 아비딘, 스트렙트아비딘, 탄수화물, 폴리 L-리신, 수산화기, 티올기, 아민기, 알코올기, 카르복실기, 아미노기, 설퍼기, 알데히드기, 카르보닐기, 숙신이미드기, 말레이미드기, 에폭시기, 및 이소티오시아네이트기를 갖는 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상인 것인, 바이오센서.
   
10. 청구항 1에 있어서, 상기 표적물질은 항원, 햅텐, 탄수화물, 단백질, 약물, 농약, 미생물, 항체, 및 상보적인 서열과 서열 특이적 혼성화 반응에 참여할 수 있는 핵산으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상인 것인, 바이오센서.
    
11. 청구항 1에 있어서, 상기 전기적으로 중성인 제제는 상기 표적물질이 생물학적 탐침과 특이적 결합을 형성하는 영역 이외의 영역에서 비특이적 결합을 형성하는 것을 차단하는 것인, 바이오센서.
    
12. 청구항 5에 있어서, 상기 전계 효과 트랜지스터는 기판; 절연층; 서로 이격되어 있는 소스 전극 및 드레인 전극; 게이트 전극; 상기 소스 전극과 상기 드레인 전극 사이에 배치된 채널층을 포함하는 것인, 바이오센서.
    
13. (a) 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 따른 바이오센서에 시료를 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 바이오센서의 전기 전도도 변화를 관찰하는 단계를 포함하는 표적 물질 검출방법.
    
14. 청구항 13에 있어서, 상기 (a) 단계 이후에 세척 단계를 수반하지 않고 (b) 단계를 수행하는, 표적 물질 검출 방법.

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