JP2000131302A

JP2000131302A - 液体クロマトグラフィー用フィルター、液体クロマトグラフィー用カラム及びヘモグロビン類の測定方法

Info

Publication number: JP2000131302A
Application number: JP10302565A
Authority: JP
Inventors: Yuji Setoguchi; 雄二瀬戸口; Kazuyuki Oishi; 和之大石; Kazuhiko Shimada; 一彦嶋田; Masaaki Minamoto; 政明源; Toshiki Kawabe; 俊樹川辺
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 1998-10-23
Filing date: 1998-10-23
Publication date: 2000-05-12
Anticipated expiration: 2018-10-23
Also published as: JP3857439B2

Abstract

(57)【要約】【課題】生体試料の吸着が少なく、寿命が長く、分離
性能に悪影響を与えない液体クロマトグラフィー用フィ
ルター、該フィルターを用いることにより寿命が長く、
分離性能に悪影響を与えない液体クロマトグラフィー用
カラム及び該フィルター又はカラムを用いるヘモグロビ
ン類の測定方法を提供する。【解決手段】シリコーン被膜でコーティングされてい
ることを特徴とする液体クロマトグラフィー用フィルタ
ー１。上記の液体クロマトグラフィー用フィルターが、
更に、ブロッキング試薬でブロッキング処理されている
ことを特徴とする液体クロマトグラフィー用フィルタ
ー。上記の液体クロマトグラフィー用フィルターが装着
されたことを特徴とする液体クロマトグラフィー用カラ
ム。上記液体クロマトグラフィー用フィルター又はカラ
ムを用いることを特徴とするヘモグロビン類の測定方
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、液体クロマトグラ
フィー用フィルター、液体クロマトグラフィー用カラム
及び該フィルター又はカラムを用いるヘモグロビン類の
測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】有機化学、生化学、医学などの分野にお
ける試料中の成分の分離や分取に液体クロマトグラフが
汎用されている。この液体クロマトグラフは、通常、図
７のようなシステムに構成されている。溶離液などの移
動相１１が電磁弁１２を通り、送液ポンプ１３により試
料導入装置１４を経由して、フィルタ−装置１５を通り
分離カラム１６に入り、この分離カラム１６により試料
中の各成分が分離される。分離された各成分は検出器１
７によって、例えば、吸光度を測定する等によって検出
され、その結果がデーター処理装置１８により処理され
てクロマトグラム１９として表される。

【０００３】上記、分離カラム１６の上流のフィルタ−
装置１５はラインフィルタ−（例えば、後述の図４）と
呼ばれ、フィルターとそれを収容するホルダーで構成さ
れており、該フィルターによって、試料中の固形物や送
液ポンプのシール部品の摩耗物などの不溶物が濾過され
る。また、液体クロマトグラフにおいて使用されるフィ
ルタ−には、上記のラインフィルタ−の他に、分離カラ
ムの試料導入側及び試料導出側に取り付けられるフィル
ターもある。このようなフィルターが装着された液体ク
ロマトグラフィー用カラムを図８に示した。図８におい
て、符号４０は分離カラム本体、符号４１はフィルタ
ー、符号４２はエンドフィッティングである。なお、図
８は試料導入側のみを示したものであり、試料導出側を
省略しているが、試料導出側も同様に構成される。この
カラムにおいては、エンドフィッティング４２の中にフ
ィルター４１が装着され、フィルター４１とエンドフィ
ッティング４２との間隙はシール部材４３で密閉されて
いる。そして、エンドフィッティング４２と分離カラム
本体４０が螺合されることにより、分離カラム本体４０
の端部にフィルター４１が密着されている。

【０００４】このようなフィルタ−装置に用いられるフ
ィルタ−は、一般に、円板状であり、材質はステンレス
製焼結体などが用いられている。

【０００５】特開平７−２６０７６３号公報には、充填
剤が収納されたカラム本体のエンドフィティングフィル
ターとして、ステンレス鋼繊維を積層し、それを焼結し
た繊維焼結フィルターを用いた高速液体クロマトグラフ
ィーカラムが提案されている。このフィルターが装着さ
れた液体クロマトグラフィーカラムを、生体試料の測定
に用いると、フィルターに生体試料が吸着し、圧力が上
昇し、連続して多数の試料を測定できないという問題が
あった。

【０００６】また、クロマトグラフィー用カラムの製造
方法の一つとして、管の内壁に、珪素化合物の溶液を通
流し、ＣＬＤ（ＣｈｅｍｉｃａｌＬｉｑｕｉｄＤｅ
ｐｏｓｉｔｉｏｎ）法により、不活性な二酸化珪素被膜
を形成させ、この管内部に充填剤を充填する方法がある
（特公平２−１３２６８号公報）。

【０００７】液体クロマトグラフィーによる測定の一つ
として、血液中の糖化ヘモグロビン、特にヘモグロビン
Ａ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃという）が糖尿病診断の指標
となるため広く測定されている。糖化ヘモグロビンとは
血液中の糖がヘモグロビンと結合して生成したものであ
る。溶血液試料中の糖化ヘモグロビンは、過去１〜２カ
月間の血液中の平均的な糖濃度を反映するので溶血液中
の糖化ヘモグロビンは、糖尿病の診断の指標となる。

【０００８】このＨｂＡ１ｃの液体クロマトグラフィー
法による測定は、主にカチオン交換液体クロマトグラフ
ィー法により行われている（特公平８−７１９８号公報
など）。溶血液試料をカチオン交換液体クロマトグラフ
ィーにより分離すると、通常、ヘモグロビンＡ１ａ（以
下、ＨｂＡ１ａという）及びヘモグロビンＡ１ｂ（以
下、ＨｂＡ１ｂという）、ヘモグロビンＦ（以下、Ｈｂ
Ｆという）、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ並
びにヘモグロビンＡ０（以下、ＨｂＡ０という）などの
ピークに分画できる。なお、糖尿病の診断の指標として
使用されているＨｂＡ１ｃは、上記のうちの安定型Ｈｂ
Ａ１ｃであり、全ヘモグロビンピークの面積に対する安
定型ＨｂＡ１ｃピークの面積の比率（％）として求めら
れている。

【０００９】このＨｂＡ１ｃの液体クロマトグラフィー
法による測定は、カラムとしてカチオン交換液体クロマ
トグラフィー用充填剤（例えば、カルボキシル基やスル
ホン酸基を官能基として有する充填剤）が充填されたも
のを用い、ｐＨ５．０〜９．０の溶離液を用いて行われ
ている。

【００１０】この測定において、ステンレス焼結体から
なるフィルターを用いると、該フィルターに生体試料が
吸着し、圧力が上昇し、連続して多数の試料を測定でき
ない、及び、分離性能に悪影響がでるという問題があっ
た。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記問題点
に鑑みてなされたものであり、その目的は、生体試料の
吸着が少なく、寿命が長く、分離性能に悪影響を与えな
い液体クロマトグラフィー用フィルター、該フィルター
を用いることにより寿命が長く、分離性能に悪影響を与
えない液体クロマトグラフィー用カラム及び該フィルタ
ー又はカラムを用いるヘモグロビン類の測定方法を提供
することにある。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明の液体クロマトグ
ラフィー用フィルターは、シリコーン被膜でコーティン
グされていることを特徴とする。

【００１３】本発明で用いるシリコーン被膜でコーティ
ングされる前のフィルターは、フィルターとしての強度
と、孔を持つものであれば良く、特に限定されない。上
記フィルターの材質としては、例えば、ステンレス、ア
ルミニウム、銅、チタン、ニッケル、鉄、クロム、スズ
等の金属；ナイロン、フッ素樹脂、セルロース、ポリス
ルホン、ポリエーテルスルホン、ポリプロピレン、ポリ
エチレン、アクリル樹脂、ポリエステル、ビニロン、ポ
リカーボネート、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリ
エーテルエーテルケトン、エポキシ樹脂、フェノール樹
脂、ノリル樹脂等のプラスチック；セラミック；ガラス
などが挙げられる。

【００１４】上記フィルターの材質として、好ましく
は、シリコーン被膜との接着性が良い材質であり、例え
ば、ステンレス、アルミニウム、銅、ニッケル、鉄、ク
ロム、スズ等の金属；ナイロン、アクリル樹脂、ポリエ
ステル、ビニロン、ポリカーボネート、ポリウレタン、
ポリ塩化ビニル、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、ノリ
ル樹脂等のプラスチック；セラミック；ガラスなどが挙
げられる。

【００１５】フィルターの形態は、メンブレンフィルタ
ー、繊維を積層し焼結したもの、濾紙状のもの、不織布
など特に限定されない。

【００１６】本発明で用いられるシリコーン被膜とは、
シリコーンから得られる被膜であれば特に限定されな
い。上記シリコーンとしては、被膜を形成できるもので
あれば特に限定されず、例えば、オイル、ワニス、ゴ
ム、シランなどの種類がある。好ましくは、硬化型シリ
コーンゴムである。シリコーン被膜を形成させる方法に
は、室温又は加熱して、図１１に示すようなベースポリ
マーと架橋剤（図１１におけるＸは、例えば、メトキシ
基、ケトオキシム基、アセトキシ基のような加水分解性
の有機基）を縮合、又は、付加反応、又は、ＵＶ硬化反
応などさせる方法があり、いずれも用いることができ
る。好ましくは、縮合、又は、付加反応が良い。

【００１７】シリコーン被膜の厚さは、好ましくは、
０．１ｎｍ〜１００μｍ、より好ましくは、０．５ｎｍ
〜１０μｍ、最も好ましくは、０．７ｎｍ〜２μｍであ
る。シリコーン被膜でフィルターをコーティングする場
合、フィルター全体をコーティングする必要はなく、少
なくともフィルターの孔部分がコーティングされていれ
ばよい。フィルターの孔部分のコーティングの割合は、
孔部分の全表面積に対して、好ましくは、１０％以上、
より好ましくは、３０％以上、最も好ましくは、６０％
以上である。

【００１８】本発明のフィルターは、上記の液体クロマ
トグラフィー用フィルターが、更に、ブロッキング試薬
でブロッキング処理されていることが好ましい。上記ブ
ロッキング試薬としては、例えば、ウシ血清アルブミ
ン、カゼイン、ゼラチン、ヘモグロビン、ミオグロビン
などの蛋白質；例えば、リン脂質等の極性脂質；例え
ば、ＳＤＳ、ポリエチレングリコールモノ−４−オクチ
ルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００）などの界面
活性剤などが挙げられる。

【００１９】本発明のフィルターの形状は、液体の流れ
を乱さない構造であれば、特に限定されない。例えば、
図１に示すような、（イ）円柱状、（ロ）円錐状、
（ハ）円錐台状の凸部を有するもの、（ニ）円錐状の凸
部と円柱部分を組み合わせた形状、（ホ）円錐台状の凸
部と円柱部分を組み合わせた形状、（ヘ）２つの円錐
の、底面同士を接触したような形状が挙げられる。図１
において、符号１は本発明の液体クロマトグラフィー用
フィルター、符号２は必要に応じて使用されるシール部
材である。上記凸部の位置は、液体流入側又は液体流出
側のどちらでもよく、また上記の両側でもよい。

【００２０】本発明のフィルターのサイズは、直径は１
〜１０００ｍｍが好ましく、２〜５０ｍｍがより好まし
い。厚さは０．１〜１００ｍｍが好ましく、０．２〜１
０ｍｍがより好ましい。濾過孔径は、公知の孔径でよ
く、０．１〜２０μｍが好ましく、０．２〜１０μｍが
より好ましい。

【００２１】本発明のフィルターを製造するには、上記
記載の金属フィルター、プラスチックフィルターなどに
硬化型シリコーンを塗布、又はコーティングし、室温、
又は、加温して硬化させる方法が挙げられる。金属フィ
ルター、プラスチックフィルターなどの製造方法は、公
知の方法でよく、例えば、繊維状のもの、粉体状のもの
を積層し、焼結処理する方法やメンブレン状、濾紙状に
加工する方法などが挙げられる。また、特開平２−２６
２０５４号公報に記載あるような濾過孔径の異なるフィ
ルターを組み合わせてもよい。すなわち、溶液の流入側
に濾過孔径の大きなものを使用し、溶液の流出側に濾過
孔径の小さなものを使用して組み合わせる。このよう
に、濾過孔径の異なるフィルターを組み合わせたものを
製造するには、それぞれのフィルターを製造後、貼り合
わせてもよいが、直径の太い繊維を液体の流入側に用
い、直径の細い繊維を液体の流出側に用いて、積層した
状態で型に入れて焼結するのが好ましい。積層数は、特
に限定されないが、通常、２〜３層で必要に応じて増や
してもよい。

【００２２】また、本発明のブロッキング試薬でブロッ
キング処理されているフィルターを製造するには、シリ
コーン被膜でコーティングされているフィルターに、濃
度０．０１〜５重量％程度のブロッキング試薬溶液を通
液すればよい。

【００２３】本発明のフィルターの用途としては、液体
クロマトグラフィーのラインフィルター、カラムの試料
導入側及び試料導出側のフィルターなどがある。

【００２４】本発明のフィルターをラインフィルターと
して用いる場合について以下説明する。ラインフィルタ
ーは、フィルターがホルダー内に装着されて構成されて
いる。本発明のフィルターがラインフィルター中に装着
される態様は、従来の態様と同様である。

【００２５】図２は、本発明のフィルターが装着される
ホルダーの一例を示す断面図である。ホルダー３は半体
３ａ及び３ｂからなり（図２に矢印で示したように、半
体３ａ側を液体流入側とし、半体３ｂ側を液体流出側と
する）、半体３ａには内面の一部に雌ねじが設けられて
おり、半体３ｂにはその外周面に上記雌ねじに螺合する
雄ねじが設けられている。各半体３ａ及び３ｂは、液体
の通流方向に並設されている。半体３ａの内部には、そ
れぞれ開口部が相互に対向するように形成された円柱状
の空間部３１ａと円錐状の空間部３２ａが設けられ、更
に、該空間部３２ａの先端には薄い円板状の空間部３３
ａが設けられており、また、円柱状の空間部３１ａを形
成している部分の半体３ａの内面には雌ねじが設けら
れ、この雌ねじに溶離液などの液体が通流するための配
管がネジ止めされ得るようにされている。また、半体３
ｂの内部にも、それぞれ開口部が相互に対向するように
形成された円柱状の空間部３１ｂと円錐状の空間部３２
ｂが設けられ、円柱状の空間部３１ｂを形成している部
分の半体３ｂの内面には雌ねじが設けられ、この雌ねじ
に液体が通流するための配管がネジ止めされ得るように
されている。

【００２６】上記円錐状の空間部３２ａ及び３２ｂの円
錐の頂角Ａは、試料をフィルター全体に導くことにより
フィルター全体で濾過されるようにし、しかも、試料の
拡散を最小に抑える大きさであることが好ましい。上記
頂角Ａは、９０度よりも小さくなると、空間部が大きく
なり、試料の拡散が起こり易くなり、１７９度よりも大
きくなると、更に、空間部が大きくなり、試料の拡散が
起こり易くなるので、９０〜１７９度が好ましく、１０
０〜１７０度がより好ましい。

【００２７】ホルダー３の形状は、例えば、円柱状、立
方体状など特に限定されない。

【００２８】また、ホルダー３は、フィルター交換時に
工具を使う必要がないように、図３に示すように、半体
３ａと３ｂの外周面を、それぞれ円筒形の被覆部３４ａ
と３４ｂで被覆することにより、ホルダーの大きさを大
きくして、手で十分締められるようにしてもよい。

【００２９】ホルダーの材質としてはステンレス等の金
属；ポリエチレン、ポリエーテルエーテルケトン、フッ
素樹脂、ポリエーテルエーテルケトンとフッ素樹脂の混
合物等のプラスチックなどが挙げられるが、生体試料の
吸着が少ないポリエーテルエーテルケトンやフッ素樹脂
が好ましい。また、生体試料の吸着が起こり易い材質の
もの、例えば、ステンレスのようなものは、シリコーン
被膜でコーティングしてもよい。

【００３０】図４は、本発明のフィルター１がホルダー
３内に装着されて構成されているラインフィルター５の
断面図である。ラインフィルター５においては、ホルダ
ー３の半体３ａの薄い円板状の空間部３３ａに本発明の
フィルター１が収められている。

【００３１】ホルダー３とフィルター１との間の気密性
を十分保てない場合は、ホルダー３とフィルター１の間
にシール部材２を設ける必要がある。具体的には、ホル
ダー３とフィルター１の間に隙間ができないように、図
５（イ）、（ロ）に示すように、フィルター１をシール
部材２で囲む方法がある。

【００３２】上記シール部材の材質は、フィルターを保
持できる強度を有するものであれば特に限定されず、例
えば、ポリエーテルエーテルケトン、フッ素樹脂、ポリ
エーテルエーテルケトンとフッ素樹脂の混合物、ステン
レスなどが挙げられる。シール部材の大きさ及び形状に
ついては、フィルターの形状にフィットした形状が好ま
しく、しかも、試料の拡散を起こさない大きさ及び形状
が好ましい。

【００３３】本発明の液体クロマトグラフィー用カラム
は、本発明の液体クロマトグラフィー用フィルターが装
着されたことを特徴とする。以下、本発明の液体クロマ
トグラフィー用カラムについて説明する。

【００３４】本発明の液体クロマトグラフィー用カラム
は、本発明のフィルターがカラムの試料導入側及び試料
導出側のフィルターとして装着されている。すなわち、
本発明の液体クロマトグラフィー用カラムは、図６に示
すように、フィルター１として本発明のフィルターが装
着されている他は、図８に示した従来の液体クロマトグ
ラフィー用カラムと同様である。

【００３５】本発明のフィルター及びカラムは、生体試
料の吸着が特に少ない。従って、本発明のフィルター又
はカラムを用いた液体クロマトグラフィーは、生体試料
の分離に特に適している。上記生体試料とは、血液、血
清、血漿、尿などの生体由来の試料を指し、その中に
は、蛋白質や脂質などが含まれているものである。

【００３６】本発明のフィルターを用いた液体クロマト
グラフィー用カラムにおいて、カラム本体（カラムの管
部分）の材質は、カラム本体としての強度を有するもの
であれば特に限定されず、例えば、ステンレス、チタン
等の金属；ポリエーテルエーテルケトン等のプラスチッ
ク；ガラス；ステンレス等の金属の内面をフッ素樹脂又
はポリエーテルエーテルケトン等で被覆したものなどが
挙げられる。

【００３７】上記カラム本体は、必要に応じて、シリコ
ーン被膜でコーティングされてもよい。この場合に用い
られるシリコーン被膜、およびシリコーン被膜の厚さ
は、フィルターに用いられるシリコーン被膜として前述
したものと同様である。

【００３８】上記シリコーン被膜でカラム本体をコーテ
ィングする場合、カラム本体全体をコーティングする必
要はなく、少なくとも分析試料が接触する部分（すなわ
ち、カラム本体内側）がコーティングされていればよ
い。カラム本体内側のコーティングの割合は、内側部の
全表面積に対して、好ましくは、１０％以上、より好ま
しくは、３０％以上、最も好ましくは、６０％以上であ
る。

【００３９】上記のシリコーン被膜でコーティングされ
たカラム本体を製造するには、上記記載のカラム本体に
硬化型シリコーンを塗布、又はコーティングし、室温、
又は、加温して硬化させる方法が挙げられる。

【００４０】また、上記カラム本体は、必要に応じて、
ブロッキング試薬でブロッキングされてもよい。上記ブ
ロッキング試薬及びブロッキング方法としては、フィル
ターに用いられるブロッキングとして前述したものと同
様である。

【００４１】本発明のフィルターを用いた液体クロマト
グラフィーにおいて、溶離液などの移動相は、公知のも
のでよい。また、液体クロマトグラフ装置も公知のもの
でよい。

【００４２】本発明のカラムを用いた液体クロマトグラ
フィーにおいて、溶離液などの移動相は、公知のもので
よく、また、液体クロマトグラフ装置も公知のものでよ
い。

【００４３】本発明の請求項６記載のヘモグロビン類の
測定方法は、本発明の液体クロマトグラフィー用フィル
ターを用いることを特徴とする。

【００４４】本発明の請求項７記載のヘモグロビン類の
測定方法は、本発明の液体クロマトグラフィー用カラム
を用いることを特徴とする。

【００４５】

【作用】本発明のフィルターは、シリコーン被膜でコー
ティングされているので、生体試料の吸着が起こりにく
いため、フィルター寿命が長く、また、同様に、試料の
吸着が少ないので、フィルター中で試料の拡散が起こり
にくいため、分離性能に悪影響を与えない。更に、ブロ
ッキング試薬でブロッキング処理されているフィルター
においては、上記の作用の全てを奏すると共に、更に、
より一層、生体試料の吸着が起こりにくいため、生体試
料の液体クロマトグラフ測定に使用すると、測定の最初
から正確な測定値を得ることができる。

【００４６】本発明のカラムは、本発明のフィルターを
装着しているので、寿命が長く、分離性能に悪影響を与
えない。

【００４７】本発明の請求項６記載のヘモグロビン類の
測定方法は、本発明の液体クロマトグラフィー用フィル
ターを用いているため、ヘモグロビン類がフィルターに
吸着しにくいので、フィルター寿命が長い。また、同様
に、ヘモグロビン類がフィルターに吸着しにくいので、
フィルター中でのヘモグロビン類の拡散が少なくヘモグ
ロビン類の分離性能に悪影響を与えない。また、ヘモグ
ロビン類の分離に適したｐＨ範囲において、ヘモグロビ
ン類の吸着が非常に起こりにくいので、ヘモグロビン類
の分離性能に悪影響を与えない。

【００４８】本発明の請求項７記載のヘモグロビン類の
測定方法は、本発明の液体クロマトグラフィー用フィル
ターを用いたカラムを用いるので、ヘモグロビン類が吸
着しにくいため、カラム寿命が長い。また、同様に、フ
ィルターにヘモグロビン類が吸着しにくいので、カラム
中でヘモグロビン類の拡散が少なく、ヘモグロビン類を
効果的に分離できる。また、ヘモグロビン類の分離に適
したｐＨ範囲において、ヘモグロビン類の吸着が非常に
起こりにくいので、ヘモグロビン類が効果的に分離でき
る。

【００４９】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施例及び比較例
を挙げることにより、本発明を詳細に説明する。

【００５０】（実施例１）図１（イ）に示した形状のフ
ィルターをステンレス焼結体の一体成形品として製造し
た。その構造の詳細は、直径５ｍｍ、厚さが１．５ｍｍ
の円柱体からなり、濾過孔径は２μｍとした。次に、コ
ーティング剤として、２液型硬化型シリコーンを用い、
上記ステンレス製フィルター全体をシリコーンコーティ
ングした（濾過孔の中は、コーティング剤を通液し
た）。その後、１００℃で３０分間加熱して乾燥・硬化
させ、均一なコーティング層を形成させ、本発明のフィ
ルター１を得た。次に、このフィルター１をフッ素樹脂
（テフロン）製のシール部材２に挿入した後、図４に示
すように、ステンレス製ホルダー３（頂角Ａ＝９０度）
に嵌め込み、半体３ａ及び３ｂ同士をネジ結合して、ラ
インフィルター５を作製した。

【００５１】（実施例２）実施例１と同様にして得られ
た本発明のフィルター１をフッ素樹脂（テフロン）製の
シール部材２に挿入した後、ポリエーテルエーテルケト
ン製のホルダー３（頂角Ａ＝１５０度）に嵌め込み、半
体３ａ及び３ｂ同士をネジ結合して、ラインフィルター
５を作製した。

【００５２】（比較例１）図１（イ）に示したフィルタ
ーを、ステンレス焼結体の一体成形品として製造した。
その構造の詳細は、直径５ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円
柱体からなり、濾過孔径は２μｍとした。次に、このフ
ィルターをフッ素樹脂（テフロン）製のシール部材２に
挿入した後、ステンレス製ホルダー３（頂角Ａ＝９０
度）に嵌め込み、半体３ａ及び３ｂ同士をネジ結合し
て、ラインフィルター５を作製した。

【００５３】（比較例２）図１（イ）に示した形状のフ
ィルターをステンレス焼結体の一体成形品として製造し
た。その構造の詳細は、直径５ｍｍ、厚さが１．５ｍｍ
の円柱体からなり、濾過孔径は２μｍとした。次に、従
来の技術の項に記載したＣＬＤ法により、二酸化珪素被
膜をフィルターに形成させる処理をした。具体的には、
日本曹達社製アトロンをＨＰＬＣ用ポンプ（島津製作所
社製）を用いて、上記フィルターの内部まで通液した
後、余剰の液をフィルター内部から除去した。その後、
２００℃で３０分間乾燥し、次に、５００℃で３０分間
加熱し、二酸化珪素被膜を形成させた。次に、このフィ
ルターをフッ素樹脂（テフロン）製のシール部材２に挿
入した後、ポリエーテルエーテルケトン製ホルダー３
（頂角Ａ＝１５０度）に嵌め込み、半体３ａ及び３ｂ同
士をネジ結合して、ラインフィルター５を作製した。

【００５４】実施例１、２及び比較例１、２で得られた
ラインフィルターを用いて以下のようにして、（１）吸
着性の評価、及び（２）生体試料の吸着性とｐＨ（ｐＨ
５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０）の関係の評価を行っ
た。

【００５５】（１）吸着性の評価以下に示した測定条件を用い、実施例１、２又は比較例
１、２で作製したラインフィルターのみを用いて（すな
わち、カラムは使用せず）、ヘモグロビン類の測定をす
ることにより、生体試料の吸着性について検討した。測定条件システム：送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学社製）検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）溶離液：溶離液Ａ：１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）溶離液Ｂ：３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）測定開始より０〜３分の間は溶離液Ａを流し、３〜５分
の間は溶離液Ｂを流し、５〜１０分の間は溶離液Ａを流
した。流速：２．０ｍｌ／分検出波長：４１５ｎｍ試料注入量：１０μｌ

【００５６】測定試料以下のようにして調製した糖負荷血液を用いた。血液抗
凝固剤としてフッ化ナトリウムを用いて採血した健常人
血に、５００ｍｇ／ｄｌとなるようグルコース水溶液を
添加し、３７℃で３時間反応させた後、溶血希釈液Ｘ
（０．１重量％トリトンＸ−１００のリン酸緩衝液溶
液、ｐＨ７．０）で溶血し、１５０倍に希釈して測定試
料とした。

【００５７】測定結果上記測定条件により、測定試料を測定して得られた代表
的なクロマトグラムを図９（イ）（ラインフィルター使
用せず）、図９（ロ）（実施例１又は２のラインフィル
ター使用）、図９（ハ）（比較例１又は２のラインフィ
ルター使用）に示した。ピーク６１はヘモグロビン類の
ピークを示す（なお、カラムで分離されていないので単
一のピークとなっている）。ピーク６２は、溶離液Ａで
はフィルタに吸着したヘモグロビン類が溶離液Ｂによっ
て脱着したために表れたピークと思われる。

【００５８】評価方法ラインフィルターを装着せずに、測定試料を測定したと
きのヘモグロビン類のピーク面積を１００％として、実
施例１、実施例２、比較例１、比較例２のラインフィル
ターを用いて測定（ｎ＝５）したときのヘモグロビン類
のピーク面積（ピーク６１の面積）から、以下の式によ
り溶離液Ａによる回収率を求め、結果を表１に示した。回収率（％）＝（ラインフィルター装着時のヘモグロビ
ン類のピーク面積）÷（ラインフィルター装着なし時の
ヘモグロビン類のピーク面積）×１００

【００５９】

【表１】

【００６０】比較例１、２では、回収率の平均値がそれ
ぞれ５６．４０％、５８．８０％であったのが、実施例
１及び２では、回収率の平均値がそれぞれ９７．８４
％、９８．１２％であった。以上より、実施例１及び２
のラインフィルターを用いたものでは、比較例１及び２
のラインフィルターを用いたものに比べてヘモグロビン
類の吸着が少なかったことがわかる。

【００６１】また、表１（及び後述の表２）における、
ＣＶ（％）とは変動係数（すなわち、ＣＶ（％）＝標準
偏差÷平均値×１００）のことであるが、比較例１、２
のラインフィルターを用いたものは、実施例１又は２の
ラインフィルターを用いたものに比較してＣＶがはるか
に大きく、ヘモグロビン類の吸着量のばらつきが大きい
ことが分かる。

【００６２】（２）生体試料の吸着性とｐＨの関係の評
価以下に示した測定条件を用い、実施例１、２又は比較例
１、２で作製したラインフィルターのみを用いて（すな
わち、カラムは使用せず）、ヘモグロビン類の測定をす
ることにより、生体試料の吸着性とｐＨ（ｐＨ５．０、
ｐＨ６．０、ｐＨ７．０）の関係を評価した。

【００６３】測定条件システム：送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学社製）検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）溶離液：溶離液Ａ：１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０）溶離液Ｂ：３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）測定開始より０〜３分の間は溶離液Ａを流し、３〜５分
の間は溶離液Ｂを流し、５〜１０分の間は溶離液Ａを流
した。流速：２．０ｍｌ／分検出波長：４１５ｎｍ試料注入量：１０μｌ

【００６４】測定試料血液抗凝固剤としてフッ化ナトリウムを用いて採血した
健常人血を、溶血希釈液Ｘ（０．１重量％トリトンＸ−
１００のリン酸緩衝液溶液、ｐＨ７．０）で溶血し、１
５０倍に希釈して測定試料とした。

【００６５】評価方法ラインフィルターを装着せずに、測定試料を測定したと
きのヘモグロビン類のピーク面積を１００％として、実
施例１、実施例２、比較例１又は比較例２で得られたラ
インフィルターを用いて測定（ｎ＝５）したときのヘモ
グロビン類のピーク面積から、以下の式により溶離液Ａ
による回収率を求め、結果を表２及び表３に示した。回収率（％）＝（ラインフィルター装着時のヘモグロビ
ン類のピーク面積）÷（ラインフィルター装着なし時の
ヘモグロビン類のピーク面積）×１００

【００６６】

【表２】

【００６７】

【表３】

【００６８】比較例１では、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、
ｐＨ７．０での回収率がそれぞれ平均１３．５６％、７
６．５２％、９１．９８％であった。比較例２では、ｐ
Ｈ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０での回収率がそれぞ
れ平均２４．６６％、７７．０４％、９１．７０％であ
った。また、ＣＶ％は、比較例１、２でｐＨが低くなる
ほど悪くなり、ｐＨ５．０で、それぞれ３７．２７％、
１２．２１％であった。実施例１では、ｐＨ５．０、ｐ
Ｈ６．０、ｐＨ７．０での回収率がそれぞれ平均９７．
２４％、９７．８８％、９７．８４％であった。実施例
２では、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０での回収
率がそれぞれ平均９８．０２％、９８．４２％、９８．
５６％であった。また、実施例１及び実施例２でのＣＶ
％は、いずれのｐＨにおいても、１％以下であった。

【００６９】以上より、比較例１のシリコーンコーティ
ングしていないステンレス製フィルターではヘモグロビ
ン類の吸着性は、ｐＨの影響を非常に強く受けることが
明らかになった。また、ヘモグロビン類の定量には、通
常、ｐＨ５〜９程度の溶離液を用いるのが一般的である
ので、シリコーンコーティングしていないステンレス製
フィルターではヘモグロビン類の吸着が極めて大きくな
り、吸着率も大きくばらつくので、シリコーンコーティ
ングしていないステンレス製フィルターをヘモグロビン
類の測定に用いるとフィルター寿命が短くなり、データ
ーのばらつく原因になると考えられる。また、比較例２
のように、ステンレス製フィルターを二酸化珪素膜で被
覆してもヘモグロビン類の吸着性は改善されなかった。
実施例１及び実施例２のシリコーンコーティングしたス
テンレス製フィルターでのヘモグロビン類の吸着性は、
ｐＨ９．０から酸性側５．０付近までのｐＨの影響を受
けず、回収率もほぼ１００％であった。以上より、ヘモ
グロビン類の測定に用いるフィルターとしては、広いｐ
Ｈの範囲でヘモグロビン類の吸着が殆どないシリコーン
コーティングしたフィルターを用いた方がよいことが明
らかである。

【００７０】（実施例３）図１（イ）に示したフィルタ
ーを、ステンレス焼結体の一体成形品として製造した。
その構造の詳細は、直径４．６ｍｍ、厚さが１．５ｍｍ
の円柱体からなり、濾過孔径は２μｍとした。次に、コ
ーティング剤として、２液型硬化型シリコーンを用い、
上記ステンレス製フィルター全体をシリコーンコーティ
ングした（濾過孔の中は、コーティング剤を通液し
た）。その後、１００℃で３０分間加熱して乾燥・硬化
させ、均一なコーティング層を形成させ、本発明のフィ
ルター１を得た。次に、このフィルター１をフッ素樹脂
（テフロン）製のシール部材２（外径６．３ｍｍ、内径
４．６ｍｍ、厚さ１．５ｍｍ）に挿入した後、これを図
６に示したステンレス製カラム本体４０（内径４．６ｍ
ｍ、長さ３５ｍｍ）のカラム両端に取り付けるためのエ
ンドフィッティング４２に装着した。

【００７１】上記のカラム本体４０に、以下のようにし
て調製した充填剤を、以下に示すカラムの作製の項で述
べるようにして充填して、本発明の液体クロマトグラフ
ィー用カラムを製造した。・充填剤の調製テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化
学社製）４００ｇ及び２−アクリルアミド−２−メチル
スルホン酸（和光純薬社製）１５０ｇの混合物にベンゾ
イルパーオキサイド（重合開始剤、和光純薬社製）１．
５ｇを溶解した。これを、４重量％ポリビニルアルコー
ル（日本合成化学社製）水溶液２５００ｍｌに分散さ
せ、攪拌しながら窒素雰囲気下で７５℃に昇温し、８時
間重合した。重合後、洗浄し、乾燥した後、分級して平
均粒径６μｍの粒子を得た。・カラムの作製カラム１本あたり、上記充填剤１．０ｇを、５０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ６．０）３０ｍｌに分散し、５分間超
音波処理した後、よく攪拌した。全量を上記のステンレ
ス製カラム本体４０（内径４．６φ×３５ｍｍ）を接続
したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカー
（梅谷精機社製）に送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接
続し、上記充填剤を上記ステンレス製カラム本体４０に
圧力３００ｋｇ／ｃｍ²で定圧充填した後、エンドフィ
ッティング４２とカラム本体４０を螺合して本発明の液
体クロマトグラフィー用カラムを製造した。

【００７２】（実施例４）実施例３と同様にして本発明
のフィルター１を得た。一方、図６に示したステンレス
製カラム本体４０（内径４．６ｍｍ、長さ３５ｍｍ）
に、上記実施例３においてフィルターにコーティングし
た方法と同様の方法で、シリコーンコーティングした。
次に、上記のフィルター１をフッ素樹脂（テフロン）製
のシール部材２（外径６．３ｍｍ、内径４．６ｍｍ、厚
さ１．５ｍｍ）に挿入した後、これを上記のシリコーン
コーティングしたカラム本体４０（内径４．６ｍｍ、長
さ３５ｍｍ）のカラム両端に取り付けるためのエンドフ
ィッティング４２に装着した。

【００７３】上記のシリコーンコーティングしたカラム
本体に、実施例３と同様にして調製した充填剤を、実施
例３と同様にして充填して、本発明の液体クロマトグラ
フィー用カラムを製造した。

【００７４】（比較例３）実施例３における、ステンレ
ス焼結体の一体成形品として製造したフィルターを、シ
リコーンコーティングしなかったことの他は、実施例３
と全く同様にして液体クロマトグラフィー用カラムを製
造した。

【００７５】（比較例４）図１（イ）に示したフィルタ
ーを、ステンレス焼結体の一体成形品として製造した。
その構造の詳細は、直径４．６ｍｍ、厚さが１．５ｍｍ
の円柱体からなり、濾過孔径は２μｍとした。次に、従
来の技術の項に記載したＣＬＤ法により、二酸化珪素被
膜をフィルター及びカラム本体に形成させる処理をし
た。具体的には、日本曹達社製アトロンをＨＰＬＣ用ポ
ンプ（島津製作所社製）を用いて、上記フィルターの内
部まで通液した後、余剰の液をフィルター内部から除去
した。その後、２００℃で３０分間乾燥し、次に、５０
０℃で３０分間加熱し、二酸化珪素被膜を形成させた。
また、カラム本体は、上記アトロンに浸し、その後、２
００℃で３０分間乾燥し、次に、５００℃で３０分間加
熱し、二酸化珪素被膜を形成させた。次に、このフィル
ター１をフッ素樹脂（テフロン）製のシール部材２（外
径６．３ｍｍ、内径４．６ｍｍ、厚さ１．５ｍｍ）に挿
入した後、これを上記の二酸化珪素被膜を形成させたス
テンレス製カラム本体（内径４．６ｍｍ、長さ３５ｍ
ｍ）のカラム両端に取り付けるためのエンドフィッティ
ング４２に装着した。

【００７６】上記の二酸化珪素被膜を形成させたカラム
本体に、実施例３と同様にして調製した充填剤を、実施
例３と同様にして充填して（フィルターは、上記の二酸
化珪素被膜を形成させたフィルターを用いた）、液体ク
ロマトグラフィー用カラムを製造した。

【００７７】実施例３、４及び比較例３、４で得られた
液体クロマトグラフィー用カラムを用いて以下のように
して、ヘモグロビン類の測定を行うことにより、該カラ
ムの分離性能に与える評価を行った（なお、ラインフィ
ルターは用いなかった）。測定条件得られたカラムを以下の液体クロマトグラフに取り付け
た後、以下の測定を行った。システム：送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学社製）検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）溶離液：溶離液Ａ：１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）溶離液Ｂ：３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）測定開始より０〜５分の間は溶離液Ａを流し、５〜６分
の間は溶離液Ｂを流し、６〜１０分の間は溶離液Ａを流
した。流速：１．６ｍｌ／分検出波長：４１５ｎｍ試料注入量：１０μｌ

【００７８】測定試料実施例１の（１）吸着性の評価の項で用いた測定試料と
同様の方法で調製したもの。

【００７９】測定結果上記測定条件により、試料を測定して得られたクロマト
グラムを図１０（イ）（実施例３又は４の液体クロマト
グラフィー用カラムを用いたもの）、図１０（ロ）（比
較例３又は４の液体クロマトグラフィー用カラムを用い
たもの）に示した。ピーク５１はＨｂＡ１ａ及びＨｂＡ
１ｂ、ピーク５２はＨｂＦ、ピーク５３は不安定型Ｈｂ
Ａ１ｃ、ピーク５４は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク５５は
ＨｂＡ０を示す。この結果、実施例３又は４の液体クロ
マトグラフィー用カラムを用いたものでは、比較例３又
は４の液体クロマトグラフィー用カラムを用いたものに
比較して分離性能に優れていることが分かる。

【００８０】（実施例５）実施例３で得られたシリコー
ンコーティングしたフィルター１に、０．１重量％ヘモ
グロビン水溶液を通液し、ブロッキング処理した。この
フィルターを用いたこと以外は、実施例３と同様にして
本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。

【００８１】（実施例６）実施例３で得られたシリコー
ンコーティングしたフィルター１に、０．１重量％ウシ
血清アルブミン水溶液を通液し、ブロッキング処理し
た。一方、図６に示したステンレス製カラム本体４０
（内径４．６ｍｍ、長さ３５ｍｍ）に、上記実施例３に
おいてフィルターにコーティングした方法と同様の方法
で、シリコーンコーティングした。このフィルター及び
カラム本体を用いたこと以外は、実施例３と同様にして
本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。

【００８２】（比較例５）図１（イ）に示したフィルタ
ーを、ポリエーテルエーテルケトンの一体成形品として
製造した。その構造の詳細は、直径４．６ｍｍ、厚さが
１．５ｍｍの円柱体からなり、濾過孔径は２μｍとし
た。このフィルターを用いたこと以外は、実施例３と同
様にして液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。

【００８３】実施例３、５、６及び比較例３、５で得ら
れた液体クロマトグラフィー用カラムを用いて、実施例
３と同様にして、ヘモグロビン類の測定を行うことによ
り、該カラムの分離性能に与える評価を行った。

【００８４】測定試料健常人血液を溶血したものであって、後述の定義による
安定型ＨｂＡ１ｃ濃度が４．５％であるものを用いた。

【００８５】測定結果試料を５回連続して測定し、得られたクロマトグラムか
ら、以下の式で定義される安定型ＨｂＡ１ｃ濃度を求
め、測定回数と安定型ＨｂＡ１ｃ濃度の関係を表４に示
した。安定型ＨｂＡ１ｃ濃度（％）＝（安定型ＨｂＡ１ｃピー
クの面積）÷（全ヘモグロビンピークの面積の和）×１
００

【００８６】

【表４】

【００８７】比較例３のカラムでは、安定型ＨｂＡ１ｃ
濃度は、測定１回目から５回目にかけて、３．５％から
３．９％に上昇した。比較例５のカラムでは、安定型Ｈ
ｂＡ１ｃ濃度は、測定１回目から５回目にかけて、３．
９％から４．３％に上昇した。すなわち、これらのカラ
ムでは、測定初期では正確な値が得られないことがわか
る。一方、実施例３のカラムでは、測定１回目〜３回目
までは安定型ＨｂＡ１ｃ濃度は４．４％であったが、測
定４回目と５回目では、４．５％となり、正確な値が得
られた。更に、ブロッキングしたフィルターを用いた実
施例５及び６のカラムでは、測定１回目から安定型Ｈｂ
Ａ１ｃ濃度は４．５％と正確な値が得られた。

【００８８】

【発明の効果】本発明の液体クロマトグラフィー用フィ
ルターの構成は、上記の通りであり、生体試料の吸着が
おこりにくいシリコーン被膜でコーティングされている
ので、フィルター性能の寿命が長く、しかも、試料の吸
着が少ないので、フィルター中で試料拡散が起こりにく
いため、分離性能に悪影響を与えない。

【００８９】本発明の請求項２記載の液体クロマトグラ
フィー用フィルターの構成は、上記の通りであり、生体
試料の吸着がおこりにくいシリコーン被膜でコーティン
グされており、更に、ブロッキング試薬でブロッキング
処理されているので、上記の効果の全てを奏すると共
に、更に、より一層、生体試料の吸着が起こりにくいた
め、生体試料の液体クロマトグラフ測定に使用すると、
測定の最初から正確な測定値を得ることができる。

【００９０】本発明の請求項３記載の液体クロマトグラ
フィー用カラムの構成は、上記の通りであり、生体試料
の吸着がおこりにくいシリコーン被膜でコーティングさ
れているフィルターを用いているので、寿命が長く、分
離性能に悪影響を与えない。

【００９１】本発明の請求項４記載の液体クロマトグラ
フィー用カラムの構成は、上記の通りであり、生体試料
の吸着がおこりにくいシリコーン被膜でコーティングさ
れているフィルター及びカラム本体を用いているので、
より寿命が長く、より分離性能に悪影響を与えない。

【００９２】本発明の請求項５記載の液体クロマトグラ
フィー用カラムの構成は、上記の通りであり、更に、カ
ラム本体がブロッキング試薬でブロッキング処理されて
いるので、請求項３又は４記載のカラムの効果に加え
て、測定の最初からより正確な測定値を得ることができ
る。

【００９３】本発明の液体クロマトグラフィー用フィル
ターを用いるヘモグロビン類の測定方法は、広いｐＨの
範囲でヘモグロビン類の吸着が少ないシリコーン被膜で
コーティングされたフィルターを用いているので、フィ
ルターの寿命が長い。そのため、フィルターの交換頻度
がきわめて少なくなる。また、ヘモグロビン類の吸着が
少ないフィルターを用いているので、ヘモグロビン類分
析の分離性能に悪影響を与えない。

【００９４】本発明の液体クロマトグラフィー用カラム
を用いるヘモグロビン類の測定方法は、広いｐＨの範囲
でヘモグロビン類の吸着が少ないシリコーン被膜でコー
ティングされたフィルターを用いたカラムを用いている
ので、カラムーの寿命が長い。また、ヘモグロビン類の
吸着が少ないフィルターを用いているので、カラム中で
のヘモグロビン類の拡散が起こりにくいためヘモグロビ
ン類分析の分離性能に悪影響を与えない。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の液体クロマトグラフィー用フィルター
の例を示す断面図。

【図２】本発明のフィルターが装着されるホルダーの一
例を示す断面図。

【図３】本発明のフィルターが装着されるホルダーの他
の例を示す断面図。

【図４】本発明のフィルターがホルダー内に装着されて
構成されているラインフィルターの断面図。

【図５】本発明の液体クロマトグラフィー用フィルター
を示す図であり、図５（イ）はその断面図。図５（ロ）
は平面図。

【図６】本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを示
す断面図。

【図７】液体クロマトグラフのシステムの構成を示す説
明図。

【図８】従来の液体クロマトグラフィー用カラムを示す
断面図。

【図９】測定試料を測定して得られたクロマトグラム。

【図１０】測定試料を測定して得られたクロマトグラ
ム。

【図１１】シリコーン被膜を形成させるための反応の例
を示す図。

【符号の説明】

１液体クロマトグラフィー用フィルター２シール部材３ホルダー３ａ、３ｂ半体３１ａ、３１ｂ円柱状の空間部３２ａ、３２ｂ円錐状の空間部３３ａ円板状の空間部３４ａ、３４ｂ被覆部５ラインフィルター

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/72 Ｇ０１Ｎ 33/72 Ａ (72)発明者源政明山口県新南陽市開成町4560 積水化学工業株式会社内 (72)発明者川辺俊樹山口県新南陽市開成町4560 積水化学工業株式会社内Ｆターム(参考） 2G045 AA13 BB06 BB60 CA25 DA45 DA51 FB06 4J038 DL031 NA02 NA04 PB06 PC02 PC03 PC08

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】シリコーン被膜でコーティングされてい
ることを特徴とする液体クロマトグラフィー用フィルタ
ー。
【請求項２】請求項１記載の液体クロマトグラフィー
用フィルターが、更に、ブロッキング試薬でブロッキン
グ処理されていることを特徴とする液体クロマトグラフ
ィー用フィルター。
【請求項３】請求項１又は２記載の液体クロマトグラ
フィー用フィルターが装着されたことを特徴とする液体
クロマトグラフィー用カラム。
【請求項４】更に、カラム本体がシリコーン被膜でコ
ーティングされていることを特徴とする請求項３記載の
液体クロマトグラフィー用カラム。
【請求項５】更に、カラム本体がブロッキング試薬で
ブロッキング処理されていることを特徴とする請求項４
記載の液体クロマトグラフィー用カラム。
【請求項６】請求項１又は２記載の液体クロマトグラ
フィー用フィルターを用いることを特徴とするヘモグロ
ビン類の測定方法。
【請求項７】請求項３〜５のいずれかに記載の液体ク
ロマトグラフィー用カラムを用いることを特徴とするヘ
モグロビン類の測定方法。