JP3990503B2 - 液体クロマトグラフィー用カラム及びヘモグロビン類の測定方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体クロマトグラフィー用カラム及び該カラムを用いるヘモグロビン類の測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
有機化学、生化学、医学などの分野における試料中の成分の分離や分取に液体クロマトグラフが汎用されている。この液体クロマトグラフは、通常、図７のようなシステムに構成されている。溶離液などの移動相１１が電磁弁１２を通り、送液ポンプ１３により試料導入装置１４を経由して、フィルタ−装置１５を通り分離カラム１６に入り、この分離カラム１６により試料中の各成分が分離される。分離された各成分は検出器１７によって、例えば、吸光度を測定する等によって検出され、その結果がデーター処理装置１８により処理されてクロマトグラム１９として表される。
【０００３】
上記、分離カラム１６の上流のフィルタ−装置１５はラインフィルタ−（例えば、後述の図４）と呼ばれ、フィルターとそれを収容するホルダーで構成されており、該フィルターによって、試料中の固形物や送液ポンプのシール部品の摩耗物などの不溶物が濾過される。また、液体クロマトグラフにおいて使用されるフィルタ−には、上記のラインフィルタ−の他に、分離カラムの試料導入側及び試料導出側に取り付けられるフィルターもある。このようなフィルターが装着された液体クロマトグラフィー用カラムを図８に示した。図８において、符号４０は分離カラム本体、符号４１はフィルター、符号４２はエンドフィッティングである。なお、図８は試料導入側のみを示したものであり、試料導出側を省略しているが、試料導出側も同様に構成される。このカラムにおいては、エンドフィッティング４２の中にフィルター４１が装着され、フィルター４１とエンドフィッティング４２との間隙はシール部材４３で密閉されている。そして、エンドフィッティング４２と分離カラム本体４０が螺合されることにより、分離カラム本体４０の端部にフィルター４１が密着されている。
【０００４】
このようなフィルタ−装置に用いられるフィルタ−は、一般に、円板状であり、材質はステンレス製焼結体などが用いられている。
【０００５】
特開平７−２６０７６３号公報には、充填剤が収納されたカラム本体のエンドフィティングフィルターとして、ステンレス鋼繊維を積層し、それを焼結した繊維焼結フィルターを用いた高速液体クロマトグラフィーカラムが提案されている。このフィルターが装着された液体クロマトグラフィーカラムを、生体試料の測定に用いると、フィルターに生体試料が吸着し、圧力が上昇し、連続して多数の試料を測定できないという問題があった。
【０００６】
また、クロマトグラフィー用カラムの製造方法の一つとして、管の内壁に、珪素化合物の溶液を通流し、ＣＬＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｑｕｉｄ Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）法により、不活性な二酸化珪素被膜を形成させ、この管内部に充填剤を充填する方法がある（特公平２−１３２６８号公報）。
【０００７】
液体クロマトグラフィーによる測定の一つとして、血液中の糖化ヘモグロビン、特にヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃという）が糖尿病診断の指標となるため広く測定されている。糖化ヘモグロビンとは血液中の糖がヘモグロビンと結合して生成したものである。溶血液試料中の糖化ヘモグロビンは、過去１〜２カ月間の血液中の平均的な糖濃度を反映するので溶血液中の糖化ヘモグロビンは、糖尿病の診断の指標となる。
【０００８】
このＨｂＡ１ｃの液体クロマトグラフィー法による測定は、主にカチオン交換液体クロマトグラフィー法により行われている（特公平８−７１９８号公報など）。溶血液試料をカチオン交換液体クロマトグラフィーにより分離すると、通常、ヘモグロビンＡ１ａ（以下、ＨｂＡ１ａという）及びヘモグロビンＡ１ｂ（以下、ＨｂＡ１ｂという）、ヘモグロビンＦ（以下、ＨｂＦという）、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ並びにヘモグロビンＡ０（以下、ＨｂＡ０という）などのピークに分画できる。なお、糖尿病の診断の指標として使用されているＨｂＡ１ｃは、上記のうちの安定型ＨｂＡ１ｃであり、全ヘモグロビンピークの面積に対する安定型ＨｂＡ１ｃピークの面積の比率（％）として求められている。
【０００９】
このＨｂＡ１ｃの液体クロマトグラフィー法による測定は、カラムとしてカチオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤（例えば、カルボキシル基やスルホン酸基を官能基として有する充填剤）が充填されたものを用い、ｐＨ５．０〜９．０の溶離液を用いて行われている。
【００１０】
この測定において、ステンレス焼結体からなるフィルターを用いると、該フィルターに生体試料が吸着し、圧力が上昇し、連続して多数の試料を測定できない、及び、分離性能に悪影響がでるという問題があった。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、生体試料の吸着が少なく、寿命が長く、分離性能に悪影響を与えない液体クロマトグラフィー用フィルターを用いることにより寿命が長く、分離性能に悪影響を与えない液体クロマトグラフィー用カラム及び該カラムを用いるヘモグロビン類の測定方法を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の発明は、少なくとも表面素材が、セルロース系樹脂、フッ素系樹脂、スルホン系樹脂、ポリエチレン、エチレンのアルキル誘導体の重合体、アクリル系樹脂、ナイロン、炭化物セラミック、窒化物セラミック、珪化物セラミック、硼化物セラミック、表面がシリル化処理された二酸化珪素、ガラス及びチタンからなる群より選ばれる少なくとも一種よりなる、又は、これらを複数組み合わせてなることを特徴とする液体クロマトグラフィー用フィルターを用いる。
【００１３】
請求項３記載の発明は、請求項１に記載の液体クロマトグラフィー用フィルターが、更に、ブロッキング試薬でブロッキング処理されていることを特徴とする。
【００１４】
請求項１記載の発明は、上記の液体クロマトグラフィー用フィルターが装着されたことを特徴とする液体クロマトグラフィー用カラムであり、更に、カラム本体がシリコーン被膜でコーティングされていることを特徴とする。
請求項２記載の発明は、更に、カラム本体がブロッキング試薬でブロッキング処理されていることを特徴とする請求項１記載の液体クロマトグラフィー用カラムである。
【００１６】
請求項４記載の発明は、請求項１〜３のいずれかに記載の液体クロマトグラフィー用カラムを用いることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法である。
【００１７】
以下、本発明の液体クロマトグラフィー用フィルターについて詳述する。
本発明の液体クロマトグラフィー用フィルターは、少なくとも表面素材が、セルロース系樹脂、フッ素系樹脂、スルホン系樹脂、ポリエチレン、エチレンのアルキル誘導体の重合体、アクリル系樹脂、ナイロン、炭化物セラミック、窒化物セラミック、珪化物セラミック、硼化物セラミック、表面がシリル化処理された二酸化珪素、ガラス及びチタンからなる群より選ばれる少なくとも一種よりなる、又は、これらを複数組み合わせてなることを特徴とする。
【００１８】
上記セルロース系樹脂には、例えば、酢酸セルロース、三酢酸セルロース、セルロース、硝酸セルロースなどが挙げられる。
上記フッ素系樹脂には、例えば、ポリ四フッ化エチレン、四フッ化エチレン−パーフルオロアルキルビニルエーテル共重合体、四フッ化エチレン−六フッ化プロピレン共重合体、ポリ三フッ化塩化エチレン、ポリフッ化ビニリデン、四フッ化エチレン−エチレン共重合体、三フッ化塩化エチレン−エチレン共重合体などが挙げられる。
【００１９】
上記スルホン系樹脂には、例えば、ポリスルホン、ポリエーテルスルホンが挙げられる。
上記エチレンのアルキル誘導体の重合体としては、例えば、ポリプロピレン、ポリブチレンが挙げられる。
上記アクリル系樹脂には、例えば、アクリル共重合体が挙げられる。
【００２０】
上記「表面がシリル化処理された二酸化珪素」におけるシリル化処理とは、二酸化珪素の表面のシラノール基の水酸基をトリアルキルシリル化（例えば、トリメチルシリル化）、ジアルキルシリル化（例えば、ジメチルシリル化）などのシリル化する処理のことをいう。シリル化に使用される薬剤としては、例えば、ヘキサメチルジシラザン、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド、ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド、ジメチルジクロロシラン、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−Ｎ−メチルトリフロロアセトアミド、ｔ−ブチルジメチルクロロシラン、トリメチルクロロシラン、トリメチルシリルジエチルアミン、トリメチルシリルイミダゾールなどが挙げられる。
【００２１】
本発明のフィルターの形態は、メンブレンフィルター、繊維を積層し焼結したもの、微粒子を焼結成形したもの等が挙げられる。
【００２２】
本発明でいうフィルター表面とは、測定試料が接触する孔表面などの部位である。本発明においては、上記フィルター表面に、上記の素材が、好ましくは３０％以上、より好ましくは６０％以上、最も好ましくは８０％以上存在するのがよい。
【００２３】
本発明のフィルターは、必要に応じて、シリコーンコーティングされてもよい。
【００２４】
本発明のフィルターは、上記の液体クロマトグラフィー用フィルターが、更に、ブロッキング試薬でブロッキング処理されていることが好ましい。上記ブロッキング試薬としては、例えば、ウシ血清アルブミン、カゼイン、ゼラチン、ヘモグロビン、ミオグロビンなどの蛋白質；例えば、リン脂質等の極性脂質；例えば、ＳＤＳ、ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００）などの界面活性剤などが挙げられる。
【００２５】
本発明のフィルターの形状は、液体の流れを乱さない構造であれば、特に限定されない。例えば、図１に示すような、（イ）円柱状、（ロ）円錐状、（ハ）円錐台状の凸部を有するもの、（ニ）円錐状の凸部と円柱部分を組み合わせた形状、（ホ）円錐台状の凸部と円柱部分を組み合わせた形状、（ヘ）２つの円錐の、底面同士を接触したような形状が挙げられる。図１において、符号１は本発明の液体クロマトグラフィー用フィルター、符号２は必要に応じて使用されるシール部材である。上記凸部の位置は、液体流入側又は液体流出側のどちらでもよく、また上記の両側でもよい。
【００２６】
本発明のフィルターのサイズは、直径は１〜１０００ｍｍが好ましく、２〜５０ｍｍがより好ましい。厚さは０．１〜１００ｍｍが好ましく、０．２〜１０ｍｍがより好ましい。濾過孔径は、公知の孔径でよく、０．１〜２０μｍが好ましく、０．２〜１０μｍがより好ましい。
【００２７】
本発明のフィルターを製造するには、上記記載の素材を用いる以外は、公知の方法でよく、例えば、上記記載の素材の繊維状のもの、粉体状のものを積層し、焼結処理する方法や上記記載の素材をメンブレン状、濾紙状に加工する方法などが挙げられる。また、上記記載の素材を通常のフィルターの表面に被覆する方法でもよい。
【００２８】
また、表面素材がシリル化処理された二酸化珪素よりなる液体クロマトグラフィー用フィルターを製造するには、例えば、ステンレス焼結体からなるフィルターを製造し、その表面に二酸化珪素を被覆した後、例えば、ヘキサメチルジシラザン、トリメチルクロロシランなどのシリル化処理剤と反応させる方法が挙げられる。
【００２９】
また、本発明のフィルターを製造するには、特開平２−２６２０５４号公報に記載あるような濾過孔径の異なるフィルターを組み合わせてもよい。すなわち、溶液の流入側に濾過孔径の大きなものを使用し、溶液の流出側に濾過孔径の小さなものを使用して組み合わせる。このように、濾過孔径の異なるフィルターを組み合わせたものを製造するには、それぞれのフィルターを製造後、貼り合わせてもよいが、直径の太い繊維を液体の流入側に用い、直径の細い繊維を液体の流出側に用いて、積層した状態で型に入れて焼結するのが好ましい。積層数は、特に限定されないが、通常、２〜３層で必要に応じて増やしてもよい。
【００３０】
また、本発明のブロッキング試薬でブロッキング処理されているフィルターを製造するには、請求項１に記載の液体クロマトグラフィー用フィルターを、濃度０．０１〜５重量％程度のブロッキング試薬溶液と接触させればよい。上記接触方法としては、上記フィルターに上記ブロッキング試薬溶液を通液する方法が挙げられる。
【００３１】
本発明のフィルターの用途としては、液体クロマトグラフィーのラインフィルター、カラムの試料導入側及び試料導出側のフィルターなどがある。
【００３２】
本発明のフィルターをラインフィルターとして用いる場合について以下説明する。ラインフィルターは、フィルターがホルダー内に装着されて構成されている。本発明のフィルターがラインフィルター中に装着される態様は、従来の態様と同様である。
【００３３】
図２は、本発明のフィルターが装着されるホルダーの一例を示す断面図である。ホルダー３は半体３ａ及び３ｂからなり（図２に矢印で示したように、半体３ａ側を液体流入側とし、半体３ｂ側を液体流出側とする）、半体３ａには内面の一部に雌ねじが設けられており、半体３ｂにはその外周面に上記雌ねじに螺合する雄ねじが設けられている。各半体３ａ及び３ｂは、液体の通流方向に並設されている。半体３ａの内部には、それぞれ開口部が相互に対向するように形成された円柱状の空間部３１ａと円錐状の空間部３２ａが設けられ、更に、該空間部３２ａの先端には薄い円板状の空間部３３ａが設けられており、また、円柱状の空間部３１ａを形成している部分の半体３ａの内面には雌ねじが設けられ、この雌ねじに溶離液などの液体が通流するための配管がネジ止めされ得るようにされている。また、半体３ｂの内部にも、それぞれ開口部が相互に対向するように形成された円柱状の空間部３１ｂと円錐状の空間部３２ｂが設けられ、円柱状の空間部３１ｂを形成している部分の半体３ｂの内面には雌ねじが設けられ、この雌ねじに液体が通流するための配管がネジ止めされ得るようにされている。
【００３４】
上記円錐状の空間部３２ａ及び３２ｂの円錐の頂角Ａは、試料をフィルター全体に導くことによりフィルター全体で濾過されるようにし、しかも、試料の拡散を最小に抑える大きさであることが好ましい。上記頂角Ａは、９０度よりも小さくなると、空間部が大きくなり、試料の拡散が起こり易くなり、１７９度よりも大きくなると、更に、空間部が大きくなり、試料の拡散が起こり易くなるので、９０〜１７９度が好ましく、１００〜１７０度がより好ましい。
【００３５】
ホルダー３の形状は、例えば、円柱状、立方体状など特に限定されない。
【００３６】
また、ホルダー３は、フィルター交換時に工具を使う必要がないように、図３に示すように、半体３ａと３ｂの外周面を、それぞれ円筒形の被覆部３４ａと３４ｂで被覆することにより、ホルダーの大きさを大きくして、手で十分締められるようにしてもよい。
【００３７】
ホルダーの材質としてはステンレス等の金属；ポリエチレン、ポリエーテルエーテルケトン、フッ素樹脂、ポリエーテルエーテルケトンとフッ素樹脂の混合物等のプラスチックなどが挙げられるが、生体試料の吸着が少ないポリエーテルエーテルケトンやフッ素樹脂が好ましい。また、本発明のフィルターの素材に用いられるものも必要に応じて用いられる。また、生体試料の吸着が起こり易い材質のもの、例えば、ステンレスのようなものは、シリコーン被膜でコーティングしてもよい。
【００３８】
図４は、本発明のフィルター１がホルダー３内に装着されて構成されているラインフィルター５の断面図である。ラインフィルター５においては、ホルダー３の半体３ａの薄い円板状の空間部３３ａに本発明のフィルター１が収められている。
【００３９】
ホルダー３とフィルター１との間の気密性を十分保てない場合は、ホルダー３とフィルター１の間にシール部材２を設ける必要がある。具体的には、ホルダー３とフィルター１の間に隙間ができないように、図５（イ）、（ロ）に示すように、フィルター１をシール部材２で囲む方法がある。
【００４０】
上記シール部材の材質は、フィルターを保持できる強度を有するものであれば特に限定されず、例えば、ポリエーテルエーテルケトン、フッ素樹脂、ポリエーテルエーテルケトンとフッ素樹脂の混合物、ステンレスなどが挙げられる。シール部材の大きさ及び形状については、フィルターの形状にフィットした形状が好ましく、しかも、試料の拡散を起こさない大きさ及び形状が好ましい。
【００４１】
本発明の液体クロマトグラフィー用カラムは、本発明の液体クロマトグラフィー用フィルターが装着されたことを特徴とする。以下、本発明の液体クロマトグラフィー用カラムについて説明する。
【００４２】
本発明の液体クロマトグラフィー用カラムは、本発明のフィルターがカラムの試料導入側及び試料導出側のフィルターとして装着されている。すなわち、本発明の液体クロマトグラフィー用カラムは、図６に示すように、フィルター１として本発明のフィルターが装着されている他は、図８に示した従来の液体クロマトグラフィー用カラムと同様である。
【００４３】
本発明のフィルター及びカラムは、生体試料の吸着が特に少ない。従って、本発明のフィルター又はカラムを用いた液体クロマトグラフィーは、生体試料の分離に特に適している。上記生体試料とは、血液、血清、血漿、尿などの生体由来の試料を指し、その中には、蛋白質や脂質などが含まれているものである。
【００４４】
本発明のフィルターを用いた液体クロマトグラフィー用カラムにおいて、カラム本体（カラムの管部分）の材質は、カラム本体としての強度を有するものであれば特に限定されず、例えば、ステンレス、チタン等の金属；ポリエーテルエーテルケトン等のプラスチック；ガラス；ステンレス等の金属の内面をフッ素樹脂又はポリエーテルエーテルケトン等で被覆したものなどが挙げられる。
【００４５】
上記カラム本体の試料が接する部位は、本発明のフィルターの表面素材として用いる素材で被覆されてもよい。
【００４６】
上記カラム本体は、必要に応じて、シリコーン被膜でコーティングされてもよい。上記シリコーン被膜とは、シリコーンから得られる被膜であれば特に限定されない。上記シリコーンとしては、被膜を形成できるものであれば特に限定されず、例えば、オイル、ワニス、ゴム、シランなどの種類がある。好ましくは、硬化型シリコーンゴムである。シリコーン被膜を形成させる方法には、室温又は加熱して、図１１に示すようなベースポリマーと架橋剤（図１１におけるＸは、例えば、メトキシ基、ケトオキシム基、アセトキシ基のような加水分解性の有機基）を縮合、又は、付加反応、又は、ＵＶ硬化反応などさせる方法があり、いずれも用いることができる。好ましくは、縮合、又は、付加反応が良い。
【００４７】
シリコーン被膜の厚さは、好ましくは、０．１ｎｍ〜１００μｍ、より好ましくは、０．５ｎｍ〜１０μｍ、最も好ましくは、０．７ｎｍ〜２μｍである。
【００４８】
上記シリコーン被膜でカラム本体をコーティングする場合、カラム本体全体をコーティングする必要はなく、少なくとも分析試料が接触する部分（すなわち、カラム本体内側）がコーティングされていればよい。
カラム本体内側のコーティングの割合は、内側部の全表面積に対して、好ましくは、１０％以上、より好ましくは、３０％以上、最も好ましくは、６０％以上である。
【００４９】
上記のシリコーン被膜でコーティングされたカラム本体を製造するには、上記記載のカラム本体に硬化型シリコーンを塗布、又はコーティングし、室温、又は、加温して硬化させる方法が挙げられる。
【００５０】
また、上記カラム本体は、必要に応じて、二酸化珪素膜が形成され、次いでシリル化処理がなされていてもよい。このような処理をカラム本体に施す方法としては、前述のフィルターをこのように処理する方法と同様である。
【００５１】
また、上記カラム本体は、必要に応じて、ブロッキング試薬でブロッキングされてもよい。上記ブロッキング試薬及びブロッキング方法としては、フィルターに用いられるブロッキングとして前述したものと同様である。
【００５２】
本発明のフィルターを用いた液体クロマトグラフィーにおいて、溶離液などの移動相は、公知のものでよい。また、液体クロマトグラフ装置も公知のものでよい。
【００５３】
本発明のカラムを用いた液体クロマトグラフィーにおいて、溶離液などの移動相は、公知のものでよく、また、液体クロマトグラフ装置も公知のものでよい。
【００５５】
本発明の請求項４記載のヘモグロビン類の測定方法は、本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを用いることを特徴とする。
【００５６】
【作用】
本発明のフィルターは、その表面が生体試料の吸着が起こりにくい材質で構成されているので、フィルター寿命が長く、また、同様に、試料の吸着が少ないので、フィルター中で試料の拡散が起こりにくいため、分離性能に悪影響を与えない。
更に、ブロッキング試薬でブロッキング処理されているフィルターにおいては、上記の作用の全てを奏すると共に、更に、より一層、生体試料の吸着が起こりにくいため、生体試料の液体クロマトグラフ測定に使用すると、測定の最初から正確な測定値を得ることができる。
【００５７】
本発明のカラムは、本発明のフィルターを装着しているので、寿命が長く、分離性能に悪影響を与えない。
【００５９】
本発明の請求項４記載のヘモグロビン類の測定方法は、本発明の液体クロマトグラフィー用フィルターを用いたカラムを用いるので、ヘモグロビン類が吸着しにくいため、カラム寿命が長い。また、同様に、フィルターにヘモグロビン類が吸着しにくいので、カラム中でヘモグロビン類の拡散が少なく、ヘモグロビン類を効果的に分離できる。また、ヘモグロビン類の分離に適したｐＨ範囲において、ヘモグロビン類の吸着が非常に起こりにくいので、ヘモグロビン類が効果的に分離できる。
【００６０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施例及び比較例を挙げることにより、本発明を詳細に説明する。
【００６１】
（実施例１）
図１（イ）に示した形状のフィルター１をポリエチレン樹脂の一体成形品として製造した。その構造の詳細は、直径５ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱体からなり、濾過孔径は２μｍとした。
次に、このフィルター１をポリエーテルエーテルケトン製のシール部材２に挿入した後、図４に示すように、ステンレス製ホルダー３（頂角Ａ＝９０度）に嵌め込み、半体３ａ及び３ｂ同士をネジ結合して、ラインフィルター５を作製した。
【００６２】
（実施例２）
実施例１と同様にして得られた本発明のフィルター１をポリエーテルエーテルケトン製のシール部材２に挿入した後、ポリエーテルエーテルケトン製のホルダー３（頂角Ａ＝１５０度）に嵌め込み、半体３ａ及び３ｂ同士をネジ結合して、ラインフィルター５を作製した。
【００６３】
（実施例３）
図１（イ）に示した形状のフィルター１をチタンの一体成形品として製造した。その構造の詳細は、直径５ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱体からなり、濾過孔径は２μｍとした。
次に、このフィルター１をフッ素樹脂（テフロン）製のシール部材２に挿入した後、ポリエーテルエーテルケトン製のホルダー３（頂角Ａ＝１５０度）に嵌め込み、半体３ａ及び３ｂ同士をネジ結合して、ラインフィルター５を作製した。
【００６４】
（実施例４）
図１（イ）に示した形状のフィルター１をポリプロピレン樹脂の一体成形品として製造した。その構造の詳細は、直径５ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱体からなり、濾過孔径は２μｍとした。
次に、このフィルター１をポリエーテルエーテルケトン製のシール部材２に挿入した後、ポリエーテルエーテルケトン製のホルダー３（頂角Ａ＝１５０度）に嵌め込み、半体３ａ及び３ｂ同士をネジ結合して、ラインフィルター５を作製した。
【００６５】
（実施例５）
図１（イ）に示した形状のフィルター１をステンレス焼結体の一体成形品として製造した。その構造の詳細は、直径５ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱体からなり、濾過孔径は２μｍとした。
次に、従来の技術の項に記載したＣＬＤ法により、二酸化珪素被膜をフィルターに形成させる処理をした。具体的には、日本曹達社製アトロンをＨＰＬＣ用ポンプ（島津製作所社製）を用いて、上記フィルターの内部まで通液した後、余剰の液をフィルター内部から除去した。その後、２００℃で３０分間乾燥し、次に、５００℃で３０分間加熱し、二酸化珪素被膜を形成させた。
次に、このフィルターをヘキサメチルジシラザンでシリル化処理した。
次に、このフィルターをフッ素樹脂（テフロン）製のシール部材２に挿入した後、ポリエーテルエーテルケトン製ホルダー３（頂角Ａ＝１５０度）に嵌め込み、半体３ａ及び３ｂ同士をネジ結合して、ラインフィルター５を作製した。
【００６６】
（比較例１）
図１（イ）に示した形状のフィルターを、ステンレス焼結体の一体成形品として製造した。その構造の詳細は、直径５ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱体からなり、濾過孔径は２μｍとした。
次に、このフィルターをフッ素樹脂（テフロン）製のシール部材２に挿入した後、ステンレス製ホルダー３（頂角Ａ＝９０度）に嵌め込み、半体３ａ及び３ｂ同士をネジ結合して、ラインフィルター５を作製した。
【００６７】
（比較例２）
実施例５と同様のステンレス焼結体の一体成形品として製造したフィルターに、実施例５と同様にして二酸化珪素被膜を形成させた後、このフィルターをヘキサメチルジシラザンでシリル化処理することなく、フッ素樹脂（テフロン）製のシール部材２に挿入した後、ポリエーテルエーテルケトン製ホルダー３（頂角Ａ＝１５０度）に嵌め込み、半体３ａ及び３ｂ同士をネジ結合して、ラインフィルター５を作製した。
【００６８】
実施例１〜５及び比較例１、２で得られたラインフィルターを用いて以下のようにして、（１）吸着性の評価、及び（２）生体試料の吸着性とｐＨ（ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０）の関係の評価を行った。
【００６９】
（１）吸着性の評価
以下に示した測定条件を用い、実施例１〜５又は比較例１、２で作製したラインフィルターのみを用いて（すなわち、カラムは使用せず）、ヘモグロビン類の測定をすることにより、生体試料の吸着性について検討した。
測定条件
測定開始より０〜３分の間は溶離液Ａを流し、３〜５分の間は溶離液Ｂを流し、５〜１０分の間は溶離液Ａを流した。
流速：２．０ｍｌ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μｌ
【００７０】
測定試料
以下のようにして調製した糖負荷血液を用いた。
血液抗凝固剤としてフッ化ナトリウムを用いて採血した健常人血に、５００ｍｇ／ｄｌとなるようグルコース水溶液を添加し、３７℃で３時間反応させた後、溶血希釈液Ｘ（０．１重量％トリトンＸ−１００のリン酸緩衝液溶液、ｐＨ７．０）で溶血し、１５０倍に希釈して測定試料とした。
【００７１】
測定結果
上記測定条件により、測定試料を測定して得られた代表的なクロマトグラムを図９（イ）（ラインフィルター使用せず）、図９（ロ）（実施例１〜５のラインフィルター使用）、図９（ハ）（比較例１又は２のラインフィルター使用）に示した。ピーク６１はヘモグロビン類のピークを示す（なお、カラムで分離されていないので単一のピークとなっている）。ピーク６２は、溶離液Ａではフィルタに吸着したヘモグロビン類が溶離液Ｂによって脱着したために表れたピークと思われる。
【００７２】
評価方法
ラインフィルターを装着せずに、測定試料を測定したときのヘモグロビン類のピーク面積を１００％として、実施例１〜５、比較例１、２のラインフィルターを用いて測定（ｎ＝５）したときのヘモグロビン類のピーク面積（ピーク６１の面積）から、以下の式により溶離液Ａによる回収率を求め、結果を表１に示した。
回収率（％）＝（ラインフィルター装着時のヘモグロビン類のピーク面積）÷（ラインフィルター装着なし時のヘモグロビン類のピーク面積）×１００
【００７３】
【表１】
【００７４】
比較例１、２では、回収率の平均値が、それぞれ５６．４０％、５８．８０％であったのが、実施例１〜５では、回収率の平均値がそれぞれ９７．７０％、９７．９８％、９７．４０％、９６．０８％、９７．８６％であった。以上より、実施例１〜５のラインフィルターを用いたものでは、比較例１、２のラインフィルターを用いたものに比べてヘモグロビン類の吸着が少なかったことがわかる。
【００７５】
また、表１（及び後述の表２〜４）における、ＣＶ（％）とは変動係数（すなわち、ＣＶ（％）＝標準偏差÷平均値×１００）のことであるが、比較例１、２のラインフィルターを用いたものは、実施例１〜５のラインフィルターを用いたものに比較してＣＶがはるかに大きく、ヘモグロビン類の吸着量のばらつきが大きいことが分かる。
【００７６】
（２）生体試料の吸着性とｐＨの関係の評価
以下に示した測定条件を用い、実施例１〜５又は比較例１、２で作製したラインフィルターのみを用いて（すなわち、カラムは使用せず）、ヘモグロビン類の測定をすることにより、生体試料の吸着性とｐＨ（ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０）の関係を評価した。
【００７７】
測定条件
測定開始より０〜３分の間は溶離液Ａを流し、３〜５分の間は溶離液Ｂを流し、５〜１０分の間は溶離液Ａを流した。
流速：２．０ｍｌ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μｌ
【００７８】
測定試料
血液抗凝固剤としてフッ化ナトリウムを用いて採血した健常人血を、溶血希釈液Ｘ（０．１重量％トリトンＸ−１００のリン酸緩衝液溶液、ｐＨ７．０）で溶血し、１５０倍に希釈して測定試料とした。
【００７９】
評価方法
ラインフィルターを装着せずに、測定試料を測定したときのヘモグロビン類のピーク面積を１００％として、実施例１〜５又は比較例１、２で得られたラインフィルターを用いて測定（ｎ＝５）したときのヘモグロビン類のピーク面積から、以下の式により溶離液Ａによる回収率を求め、結果を表２〜４に示した。
回収率（％）＝（ラインフィルター装着時のヘモグロビン類のピーク面積）÷（ラインフィルター装着なし時のヘモグロビン類のピーク面積）×１００
【００８０】
【表２】
【００８１】
【表３】
【００８２】
【表４】
【００８３】
比較例１では、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０での回収率がそれぞれ平均１３．５６％、７６．５２％、９１．９８％であった。また、ＣＶ％は、ｐＨが低くなるほど悪くなり、ｐＨ５．０で、３７．２７％であった。
比較例２では、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０での回収率がそれぞれ平均２４．６６％、７７．０４％、９１．７０％であった。また、ＣＶ％は、ｐＨが低くなるほど悪くなり、ｐＨ５．０で、１２．２１％であった。
実施例１では、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０での回収率がそれぞれ平均９６．６４％、９７．８６％、９７．９４％であった。
実施例２では、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０での回収率がそれぞれ平均９７．７２％、９８．２２％、９８．４６％であった。
実施例３では、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０での回収率がそれぞれ平均９７．６４％、９８．１６％、９８．４８％であった。
実施例４では、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０での回収率がそれぞれ平均９６．２６％、９７．２０％、９７．２８％であった。
実施例５では、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０での回収率がそれぞれ平均９７．９８％、９８．２８％、９８．４２％であった。
また、実施例１〜５でのＣＶ％は、いずれのｐＨにおいても、１％以下であった。
【００８４】
以上より、比較例１のステンレス製フィルター；比較例２のステンレス製フィルターに二酸化珪素膜を被覆したもののいずれにおいても、ヘモグロビン類の吸着性は、ｐＨの影響を非常に強く受けることが明らかになった。また、ヘモグロビン類の定量には、通常、ｐＨ５〜９程度の溶離液を用いるのが一般的であるので、ステンレス製フィルターではヘモグロビン類の吸着が極めて大きくなり、吸着率も大きくばらつくので、ステンレス製フィルターをヘモグロビン類の測定に用いるとフィルター寿命が短くなり、データーのばらつく原因になると考えられる。
実施例１〜５の本発明のフィルターでのヘモグロビン類の吸着性は、ｐＨ９．０から酸性側５．０付近までのｐＨの影響を受けず、回収率もほぼ１００％であった。
以上より、ヘモグロビン類の測定に用いるフィルターとしては、広いｐＨの範囲でヘモグロビン類の吸着が殆どない本発明のフィルターを用いた方がよいことが明らかである。
【００８５】
（実施例６）
図１（イ）に示したフィルター１を、ポリエチレン樹脂の一体成形品として製造した。その構造の詳細は、直径４．６ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱体からなり、濾過孔径は２μｍとした。
次に、このフィルター１をポリエーテルエーテルケトン製のシール部材２（外径６．３ｍｍ、内径４．６ｍｍ、厚さ１．５ｍｍ）に挿入した後、これを図６に示したステンレス製カラム本体４０（内径４．６ｍｍ、長さ３５ｍｍ）のカラム両端に取り付けるためのエンドフィッティング４２に装着した。
【００８６】
上記のカラム本体４０に、以下のようにして調製した充填剤を、以下に示すカラムの作製の項で述べるようにして充填して、本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
・充填剤の調製
テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）４００ｇ及び２−アクリルアミド−２−メチルスルホン酸（和光純薬社製）１５０ｇの混合物にベンゾイルパーオキサイド（重合開始剤、和光純薬社製）１．５ｇを溶解した。これを、４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液２５００ｍｌに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で７５℃に昇温し、８時間重合した。重合後、洗浄し、乾燥した後、分級して平均粒径６μｍの粒子を得た。
・カラムの作製
カラム１本あたり、上記充填剤１．０ｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）３０ｍｌに分散し、５分間超音波処理した後、よく攪拌した。全量を上記のステンレス製カラム本体４０（内径４．６φ×３５ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカー（梅谷精機社製）に送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、上記充填剤を上記ステンレス製カラム本体４０に圧力３００ｋｇ／ｃｍ2 で定圧充填した後、エンドフィッティング４２とカラム本体４０を螺合して本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
【００８７】
（実施例７）
図１（イ）に示したフィルター１を、チタンの一体成形品として製造した。その構造の詳細は、直径４．６ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱体からなり、濾過孔径は２μｍとした。
次に、このフィルター１をフッ素樹脂（テフロン）製のシール部材２（外径６．３ｍｍ、内径４．６ｍｍ、厚さ１．５ｍｍ）に挿入した後、これを図６に示したステンレス製カラム本体４０（内径４．６ｍｍ、長さ３５ｍｍ）のカラム両端に取り付けるためのエンドフィッティング４２に装着した。
【００８８】
上記のカラム本体４０に、実施例６と同様の充填剤を、実施例６と同様にして充填して、本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
【００８９】
（実施例８）
図１（イ）に示したフィルター１を、ポリプロピレン樹脂の一体成形品として製造した。その構造の詳細は、直径４．６ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱体からなり、濾過孔径は２μｍとした。
次に、このフィルター１をポリエーテルエーテルケトン製のシール部材２（外径６．３ｍｍ、内径４．６ｍｍ、厚さ１．５ｍｍ）に挿入した後、これをシリコーン処理したステンレス製カラム本体４０（直径４．６ｍｍ、長さ３５ｍｍ）のカラム両端に取り付けるためのエンドフィッティング４２に装着した。
【００９０】
なお、上記のシリコーン処理したステンレス製カラム本体は、以下のようにして作製した。２液型硬化型シリコーンを用い、上記カラム本体をシリコーンコーティングした後、１００℃で３０分間加熱して、乾燥・硬化させ、均一なコーティング層を形成させた。
【００９１】
上記のカラム本体４０に、実施例６と同様の充填剤を実施例６と同様にして充填して、本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
【００９２】
（実施例９）
図１（イ）に示したフィルター１を、ステンレス焼結体の一体成形品として製造した。その構造の詳細は、直径４．６ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱体からなり、濾過孔径は２μｍとした。
次に、従来の技術の項に記載したＣＬＤ法により、二酸化珪素被膜をフィルターに形成させる処理をした。具体的には、日本曹達社製アトロンをＨＰＬＣ用ポンプ（島津製作所社製）を用いて、上記フィルター１の内部まで通液した後、余剰の液をフィルター内部から除去した。その後、２００℃で３０分間乾燥し、次に、５００℃で３０分間加熱し、二酸化珪素被膜を形成させた。
次に、このフィルター１をヘキサメチルジシラザンでシリル化処理した。
次に、このフィルター１をフッ素樹脂（テフロン）製のシール部材２（外径６．３ｍｍ、内径４．６ｍｍ、厚さ１．５ｍｍ）に挿入した後、これをシリコーン処理したステンレス製カラム本体４０（直径４．６ｍｍ、長さ３５ｍｍ）のカラム両端に取り付けるためのエンドフィッティング４２に装着した。
【００９３】
なお、上記のシリコーン処理したステンレス製カラム本体の作製方法は、実施例８と同様である。
【００９４】
上記のカラム本体４０に、実施例６と同様の充填剤を実施例６と同様にして充填して、本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
【００９５】
（比較例３）
ステンレス焼結体の一体成形品として製造したフィルターを用いたことの他は、実施例６と全く同様にして液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
【００９６】
（比較例４）
ステンレス焼結体の一体成形品として製造したフィルターを、実施例９と同様にして二酸化珪素被膜を形成させて製造したフィルター（シリル化処理はせず）を用いたことの他は、実施例６と全く同様にして液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
【００９７】
実施例６〜９及び比較例３、４で得られた液体クロマトグラフィー用カラムを用いて以下のようにして、ヘモグロビン類の測定を行うことにより、該カラムの分離性能に与える評価を行った（なお、ラインフィルターは用いなかった）。
測定条件
得られたカラムを以下の液体クロマトグラフに取り付けた後、以下の測定を行った。
測定開始より０〜５分の間は溶離液Ａを流し、５〜６分の間は溶離液Ｂを流し、６〜１０分の間は溶離液Ａを流した。
流速：１．６ｍｌ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μｌ
【００９８】
測定試料
実施例１の（１）吸着性の評価の項で用いた測定試料と同様の方法で調製したもの。
【００９９】
測定結果
上記測定条件により、試料を測定して得られたクロマトグラムを図１０（イ）（実施例６〜９の液体クロマトグラフィー用カラムを用いたもの）、図１０（ロ）（比較例３又は４の液体クロマトグラフィー用カラムを用いたもの）に示した。ピーク５１はＨｂＡ１ａ及びＨｂＡ１ｂ、ピーク５２はＨｂＦ、ピーク５３は不安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク５４は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク５５はＨｂＡ０を示す。この結果、実施例６〜９の液体クロマトグラフィー用カラムを用いたものでは、比較例３又は４の液体クロマトグラフィー用カラムを用いたものに比較して分離性能に優れていることが分かる。
【０１００】
（実施例１０）
実施例６で得られたポリエチレンフィルター１に、０．１重量％ヘモグロビン水溶液を通液し、ブロッキング処理した。また、カラム本体は、実施例８と同様にシリコーンコーティングした。上記フィルター及びカラム本体を用いた以外は、実施例６と同様にして本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
【０１０１】
（実施例１１）
実施例７で得られたチタンフィルター１に、０．１重量％ウシ血清アルブミン水溶液を通液し、ブロッキング処理した。また、カラム本体は、実施例８と同様にシリコーンコーティングした。上記フィルター及びカラム本体を用いた以外は、実施例６と同様にして本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
【０１０２】
（実施例１２）
実施例８で得られたポリプロピレンフィルター１に、０．１重量％ウシ血清アルブミン水溶液を通液し、ブロッキング処理した。また、カラム本体は、実施例８と同様にシリコーンコーティングした。上記フィルター及びカラム本体を用いた以外は、実施例６と同様にして本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
【０１０３】
（実施例１３）
実施例９で得られたフィルター１（シリル化処理二酸化珪素被覆ステンレス焼結体フィルター）に、０．１重量％カゼイン水溶液を通液し、ブロッキング処理した。また、カラム本体は、実施例９のフィルター処理と同様にして、二酸化珪素膜を形成させた後、ヘキサメチルジシラザンでシリル化処理した。上記フィルター及びカラム本体を用いた以外は、実施例６と同様にして本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
【０１０４】
（比較例５）
図１（イ）に示したフィルターをポリエーテルエーテルケトンの一体成形品として製造した。その構造の詳細は、直径４．６ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱体からなり、濾過孔径は２μｍとした。このフィルターを用いたこと以外は、実施例６と同様にして液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
【０１０５】
実施例６、７、１０〜１３及び比較例３〜５で得られた液体クロマトグラフィー用カラムを用いて、実施例６と同様にして、ヘモグロビン類の測定を行うことにより、該カラムの分離性能に与える評価を行った。
【０１０６】
測定試料
健常人血液を溶血したものであって、後述の定義による安定型ＨｂＡ１ｃ濃度が４．５％であるものを用いた。
【０１０７】
測定結果
試料を５回連続して測定し、得られたクロマトグラムから、以下の式で定義される安定型ＨｂＡ１ｃ濃度を求め、測定回数と安定型ＨｂＡ１ｃ濃度の関係を表５に示した。
安定型ＨｂＡ１ｃ濃度（％）＝（安定型ＨｂＡ１ｃピークの面積）÷（全ヘモグロビンピークの面積の和）×１００
【０１０８】
【表５】
【０１０９】
比較例３のカラムでは、安定型ＨｂＡ１ｃ濃度は、測定１回目から５回目にかけて、３．５％から３．９％に上昇した。
比較例４のカラムでは、安定型ＨｂＡ１ｃ濃度は、測定１回目から５回目にかけて、３．６％から４．１％に上昇した。
比較例５のカラムでは、安定型ＨｂＡ１ｃ濃度は、測定１回目から５回目にかけて、３．９％から４．３％に上昇した。すなわち、これらのカラムでは、測定初期では正確な値が得られないことがわかる。
一方、実施例６又は７のカラムでは、測定１回目〜３回目までは安定型ＨｂＡ１ｃ濃度は４．４％であったが、測定４回目と５回目では、４．５％となり、正確な値が得られた。更に、ブロッキングしたフィルター及びシリコーンコーティング（又は二酸化珪素膜被覆をシリル化処理）したカラム本体を用いた実施例１０〜１３のカラムでは、測定１回目から安定型ＨｂＡ１ｃ濃度は４．５％と正確な値が得られた。
【０１１０】
【発明の効果】
本発明の請求項１記載の液体クロマトグラフィー用フィルターの構成は、上記の通りであり、その表面が生体試料の吸着が起こりにくい材質で構成されているので、フィルター性能の寿命が長く、しかも、試料の吸着が少ないので、フィルター中で試料拡散が起こりにくいため、分離性能に悪影響を与えない。
本発明の請求項３記載の液体クロマトグラフィー用フィルターの構成は、上記の通りであり、更に、ブロッキング試薬でブロッキング処理されているので、上記の効果の全てを奏すると共に、更に、より一層、生体試料の吸着が起こりにくいため、生体試料の液体クロマトグラフ測定に使用すると、測定の最初から正確な測定値を得ることができる。
【０１１１】
本発明の請求項１記載の液体クロマトグラフィー用カラムの構成は、上記の通りであり、生体試料の吸着がおこりにくい材質で構成されているフィルターを用いているので、寿命が長く、分離性能に悪影響を与えない。
【０１１２】
本発明の請求項１記載の液体クロマトグラフィー用カラムの構成は、上記の通りであり、更にカラム本体がシリコーン被膜でコーティングされているので生体試料の吸着がより起こりにくくなり、カラム寿命がより一層長くなると共に、分離性能に悪影響をより一層与えない。
【０１１３】
本発明の請求項２記載の液体クロマトグラフィー用カラムの構成は、上記の通りであり、更に、カラム本体がブロッキング試薬でブロッキング処理されているので、請求項１記載のカラムの効果に加えて、測定の最初からより正確な測定値を得ることができる。
【０１１５】
本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを用いるヘモグロビン類の測定方法の構成は、上記の通りであり、広いｐＨの範囲でヘモグロビン類の吸着が少ない材質で構成されているフィルターを用いたカラムを用いているので、カラムの寿命が長い。また、ヘモグロビン類の吸着が少ないフィルターを用いているので、カラム中でのヘモグロビン類の拡散が起こりにくいためヘモグロビン類分析の分離性能に悪影響を与えない。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の液体クロマトグラフィー用フィルターの例を示す断面図。
【図２】本発明のフィルターが装着されるホルダーの一例を示す断面図。
【図３】本発明のフィルターが装着されるホルダーの他の例を示す断面図。
【図４】本発明のフィルターがホルダー内に装着されて構成されているラインフィルターの断面図。
【図５】本発明の液体クロマトグラフィー用フィルターを示す図であり、図５（イ）はその断面図。図５（ロ）は平面図。
【図６】本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを示す断面図。
【図７】液体クロマトグラフのシステムの構成を示す説明図。
【図８】従来の液体クロマトグラフィー用カラムを示す断面図。
【図９】測定試料を測定して得られたクロマトグラム。
【図１０】測定試料を測定して得られたクロマトグラム。
【図１１】シリコーン被膜を形成させるための反応の例を示す図。
【符号の説明】
１ 液体クロマトグラフィー用フィルター
２ シール部材
３ ホルダー
３ａ、３ｂ 半体
３１ａ、３１ｂ 円柱状の空間部
３２ａ、３２ｂ 円錐状の空間部
３３ａ 円板状の空間部
３４ａ、３４ｂ 被覆部
５ ラインフィルター
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体クロマトグラフィー用カラム及び該カラムを用いるヘモグロビン類の測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
有機化学、生化学、医学などの分野における試料中の成分の分離や分取に液体クロマトグラフが汎用されている。この液体クロマトグラフは、通常、図７のようなシステムに構成されている。溶離液などの移動相１１が電磁弁１２を通り、送液ポンプ１３により試料導入装置１４を経由して、フィルタ−装置１５を通り分離カラム１６に入り、この分離カラム１６により試料中の各成分が分離される。分離された各成分は検出器１７によって、例えば、吸光度を測定する等によって検出され、その結果がデーター処理装置１８により処理されてクロマトグラム１９として表される。
【０００３】
上記、分離カラム１６の上流のフィルタ−装置１５はラインフィルタ−（例えば、後述の図４）と呼ばれ、フィルターとそれを収容するホルダーで構成されており、該フィルターによって、試料中の固形物や送液ポンプのシール部品の摩耗物などの不溶物が濾過される。また、液体クロマトグラフにおいて使用されるフィルタ−には、上記のラインフィルタ−の他に、分離カラムの試料導入側及び試料導出側に取り付けられるフィルターもある。このようなフィルターが装着された液体クロマトグラフィー用カラムを図８に示した。図８において、符号４０は分離カラム本体、符号４１はフィルター、符号４２はエンドフィッティングである。なお、図８は試料導入側のみを示したものであり、試料導出側を省略しているが、試料導出側も同様に構成される。このカラムにおいては、エンドフィッティング４２の中にフィルター４１が装着され、フィルター４１とエンドフィッティング４２との間隙はシール部材４３で密閉されている。そして、エンドフィッティング４２と分離カラム本体４０が螺合されることにより、分離カラム本体４０の端部にフィルター４１が密着されている。
【０００４】
このようなフィルタ−装置に用いられるフィルタ−は、一般に、円板状であり、材質はステンレス製焼結体などが用いられている。
【０００５】
特開平７−２６０７６３号公報には、充填剤が収納されたカラム本体のエンドフィティングフィルターとして、ステンレス鋼繊維を積層し、それを焼結した繊維焼結フィルターを用いた高速液体クロマトグラフィーカラムが提案されている。このフィルターが装着された液体クロマトグラフィーカラムを、生体試料の測定に用いると、フィルターに生体試料が吸着し、圧力が上昇し、連続して多数の試料を測定できないという問題があった。
【０００６】
また、クロマトグラフィー用カラムの製造方法の一つとして、管の内壁に、珪素化合物の溶液を通流し、ＣＬＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｑｕｉｄ Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）法により、不活性な二酸化珪素被膜を形成させ、この管内部に充填剤を充填する方法がある（特公平２−１３２６８号公報）。
【０００７】
液体クロマトグラフィーによる測定の一つとして、血液中の糖化ヘモグロビン、特にヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃという）が糖尿病診断の指標となるため広く測定されている。糖化ヘモグロビンとは血液中の糖がヘモグロビンと結合して生成したものである。溶血液試料中の糖化ヘモグロビンは、過去１〜２カ月間の血液中の平均的な糖濃度を反映するので溶血液中の糖化ヘモグロビンは、糖尿病の診断の指標となる。
【０００８】
このＨｂＡ１ｃの液体クロマトグラフィー法による測定は、主にカチオン交換液体クロマトグラフィー法により行われている（特公平８−７１９８号公報など）。溶血液試料をカチオン交換液体クロマトグラフィーにより分離すると、通常、ヘモグロビンＡ１ａ（以下、ＨｂＡ１ａという）及びヘモグロビンＡ１ｂ（以下、ＨｂＡ１ｂという）、ヘモグロビンＦ（以下、ＨｂＦという）、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ並びにヘモグロビンＡ０（以下、ＨｂＡ０という）などのピークに分画できる。なお、糖尿病の診断の指標として使用されているＨｂＡ１ｃは、上記のうちの安定型ＨｂＡ１ｃであり、全ヘモグロビンピークの面積に対する安定型ＨｂＡ１ｃピークの面積の比率（％）として求められている。
【０００９】
このＨｂＡ１ｃの液体クロマトグラフィー法による測定は、カラムとしてカチオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤（例えば、カルボキシル基やスルホン酸基を官能基として有する充填剤）が充填されたものを用い、ｐＨ５．０〜９．０の溶離液を用いて行われている。
【００１０】
この測定において、ステンレス焼結体からなるフィルターを用いると、該フィルターに生体試料が吸着し、圧力が上昇し、連続して多数の試料を測定できない、及び、分離性能に悪影響がでるという問題があった。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、生体試料の吸着が少なく、寿命が長く、分離性能に悪影響を与えない液体クロマトグラフィー用フィルターを用いることにより寿命が長く、分離性能に悪影響を与えない液体クロマトグラフィー用カラム及び該カラムを用いるヘモグロビン類の測定方法を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の発明は、少なくとも表面素材が、セルロース系樹脂、フッ素系樹脂、スルホン系樹脂、ポリエチレン、エチレンのアルキル誘導体の重合体、アクリル系樹脂、ナイロン、炭化物セラミック、窒化物セラミック、珪化物セラミック、硼化物セラミック、表面がシリル化処理された二酸化珪素、ガラス及びチタンからなる群より選ばれる少なくとも一種よりなる、又は、これらを複数組み合わせてなることを特徴とする液体クロマトグラフィー用フィルターを用いる。
【００１３】
請求項３記載の発明は、請求項１に記載の液体クロマトグラフィー用フィルターが、更に、ブロッキング試薬でブロッキング処理されていることを特徴とする。
【００１４】
請求項１記載の発明は、上記の液体クロマトグラフィー用フィルターが装着されたことを特徴とする液体クロマトグラフィー用カラムであり、更に、カラム本体がシリコーン被膜でコーティングされていることを特徴とする。
請求項２記載の発明は、更に、カラム本体がブロッキング試薬でブロッキング処理されていることを特徴とする請求項１記載の液体クロマトグラフィー用カラムである。
【００１６】
請求項４記載の発明は、請求項１〜３のいずれかに記載の液体クロマトグラフィー用カラムを用いることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法である。
【００１７】
以下、本発明の液体クロマトグラフィー用フィルターについて詳述する。
本発明の液体クロマトグラフィー用フィルターは、少なくとも表面素材が、セルロース系樹脂、フッ素系樹脂、スルホン系樹脂、ポリエチレン、エチレンのアルキル誘導体の重合体、アクリル系樹脂、ナイロン、炭化物セラミック、窒化物セラミック、珪化物セラミック、硼化物セラミック、表面がシリル化処理された二酸化珪素、ガラス及びチタンからなる群より選ばれる少なくとも一種よりなる、又は、これらを複数組み合わせてなることを特徴とする。
【００１８】
上記セルロース系樹脂には、例えば、酢酸セルロース、三酢酸セルロース、セルロース、硝酸セルロースなどが挙げられる。
上記フッ素系樹脂には、例えば、ポリ四フッ化エチレン、四フッ化エチレン−パーフルオロアルキルビニルエーテル共重合体、四フッ化エチレン−六フッ化プロピレン共重合体、ポリ三フッ化塩化エチレン、ポリフッ化ビニリデン、四フッ化エチレン−エチレン共重合体、三フッ化塩化エチレン−エチレン共重合体などが挙げられる。
【００１９】
上記スルホン系樹脂には、例えば、ポリスルホン、ポリエーテルスルホンが挙げられる。
上記エチレンのアルキル誘導体の重合体としては、例えば、ポリプロピレン、ポリブチレンが挙げられる。
上記アクリル系樹脂には、例えば、アクリル共重合体が挙げられる。
【００２０】
上記「表面がシリル化処理された二酸化珪素」におけるシリル化処理とは、二酸化珪素の表面のシラノール基の水酸基をトリアルキルシリル化（例えば、トリメチルシリル化）、ジアルキルシリル化（例えば、ジメチルシリル化）などのシリル化する処理のことをいう。シリル化に使用される薬剤としては、例えば、ヘキサメチルジシラザン、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド、ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド、ジメチルジクロロシラン、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−Ｎ−メチルトリフロロアセトアミド、ｔ−ブチルジメチルクロロシラン、トリメチルクロロシラン、トリメチルシリルジエチルアミン、トリメチルシリルイミダゾールなどが挙げられる。
【００２１】
本発明のフィルターの形態は、メンブレンフィルター、繊維を積層し焼結したもの、微粒子を焼結成形したもの等が挙げられる。
【００２２】
本発明でいうフィルター表面とは、測定試料が接触する孔表面などの部位である。本発明においては、上記フィルター表面に、上記の素材が、好ましくは３０％以上、より好ましくは６０％以上、最も好ましくは８０％以上存在するのがよい。
【００２３】
本発明のフィルターは、必要に応じて、シリコーンコーティングされてもよい。
【００２４】
本発明のフィルターは、上記の液体クロマトグラフィー用フィルターが、更に、ブロッキング試薬でブロッキング処理されていることが好ましい。上記ブロッキング試薬としては、例えば、ウシ血清アルブミン、カゼイン、ゼラチン、ヘモグロビン、ミオグロビンなどの蛋白質；例えば、リン脂質等の極性脂質；例えば、ＳＤＳ、ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００）などの界面活性剤などが挙げられる。
【００２５】
本発明のフィルターの形状は、液体の流れを乱さない構造であれば、特に限定されない。例えば、図１に示すような、（イ）円柱状、（ロ）円錐状、（ハ）円錐台状の凸部を有するもの、（ニ）円錐状の凸部と円柱部分を組み合わせた形状、（ホ）円錐台状の凸部と円柱部分を組み合わせた形状、（ヘ）２つの円錐の、底面同士を接触したような形状が挙げられる。図１において、符号１は本発明の液体クロマトグラフィー用フィルター、符号２は必要に応じて使用されるシール部材である。上記凸部の位置は、液体流入側又は液体流出側のどちらでもよく、また上記の両側でもよい。
【００２６】
本発明のフィルターのサイズは、直径は１〜１０００ｍｍが好ましく、２〜５０ｍｍがより好ましい。厚さは０．１〜１００ｍｍが好ましく、０．２〜１０ｍｍがより好ましい。濾過孔径は、公知の孔径でよく、０．１〜２０μｍが好ましく、０．２〜１０μｍがより好ましい。
【００２７】
本発明のフィルターを製造するには、上記記載の素材を用いる以外は、公知の方法でよく、例えば、上記記載の素材の繊維状のもの、粉体状のものを積層し、焼結処理する方法や上記記載の素材をメンブレン状、濾紙状に加工する方法などが挙げられる。また、上記記載の素材を通常のフィルターの表面に被覆する方法でもよい。
【００２８】
また、表面素材がシリル化処理された二酸化珪素よりなる液体クロマトグラフィー用フィルターを製造するには、例えば、ステンレス焼結体からなるフィルターを製造し、その表面に二酸化珪素を被覆した後、例えば、ヘキサメチルジシラザン、トリメチルクロロシランなどのシリル化処理剤と反応させる方法が挙げられる。
【００２９】
また、本発明のフィルターを製造するには、特開平２−２６２０５４号公報に記載あるような濾過孔径の異なるフィルターを組み合わせてもよい。すなわち、溶液の流入側に濾過孔径の大きなものを使用し、溶液の流出側に濾過孔径の小さなものを使用して組み合わせる。このように、濾過孔径の異なるフィルターを組み合わせたものを製造するには、それぞれのフィルターを製造後、貼り合わせてもよいが、直径の太い繊維を液体の流入側に用い、直径の細い繊維を液体の流出側に用いて、積層した状態で型に入れて焼結するのが好ましい。積層数は、特に限定されないが、通常、２〜３層で必要に応じて増やしてもよい。
【００３０】
また、本発明のブロッキング試薬でブロッキング処理されているフィルターを製造するには、請求項１に記載の液体クロマトグラフィー用フィルターを、濃度０．０１〜５重量％程度のブロッキング試薬溶液と接触させればよい。上記接触方法としては、上記フィルターに上記ブロッキング試薬溶液を通液する方法が挙げられる。
【００３１】
本発明のフィルターの用途としては、液体クロマトグラフィーのラインフィルター、カラムの試料導入側及び試料導出側のフィルターなどがある。
【００３２】
本発明のフィルターをラインフィルターとして用いる場合について以下説明する。ラインフィルターは、フィルターがホルダー内に装着されて構成されている。本発明のフィルターがラインフィルター中に装着される態様は、従来の態様と同様である。
【００３３】
図２は、本発明のフィルターが装着されるホルダーの一例を示す断面図である。ホルダー３は半体３ａ及び３ｂからなり（図２に矢印で示したように、半体３ａ側を液体流入側とし、半体３ｂ側を液体流出側とする）、半体３ａには内面の一部に雌ねじが設けられており、半体３ｂにはその外周面に上記雌ねじに螺合する雄ねじが設けられている。各半体３ａ及び３ｂは、液体の通流方向に並設されている。半体３ａの内部には、それぞれ開口部が相互に対向するように形成された円柱状の空間部３１ａと円錐状の空間部３２ａが設けられ、更に、該空間部３２ａの先端には薄い円板状の空間部３３ａが設けられており、また、円柱状の空間部３１ａを形成している部分の半体３ａの内面には雌ねじが設けられ、この雌ねじに溶離液などの液体が通流するための配管がネジ止めされ得るようにされている。また、半体３ｂの内部にも、それぞれ開口部が相互に対向するように形成された円柱状の空間部３１ｂと円錐状の空間部３２ｂが設けられ、円柱状の空間部３１ｂを形成している部分の半体３ｂの内面には雌ねじが設けられ、この雌ねじに液体が通流するための配管がネジ止めされ得るようにされている。
【００３４】
上記円錐状の空間部３２ａ及び３２ｂの円錐の頂角Ａは、試料をフィルター全体に導くことによりフィルター全体で濾過されるようにし、しかも、試料の拡散を最小に抑える大きさであることが好ましい。上記頂角Ａは、９０度よりも小さくなると、空間部が大きくなり、試料の拡散が起こり易くなり、１７９度よりも大きくなると、更に、空間部が大きくなり、試料の拡散が起こり易くなるので、９０〜１７９度が好ましく、１００〜１７０度がより好ましい。
【００３５】
ホルダー３の形状は、例えば、円柱状、立方体状など特に限定されない。
【００３６】
また、ホルダー３は、フィルター交換時に工具を使う必要がないように、図３に示すように、半体３ａと３ｂの外周面を、それぞれ円筒形の被覆部３４ａと３４ｂで被覆することにより、ホルダーの大きさを大きくして、手で十分締められるようにしてもよい。
【００３７】
ホルダーの材質としてはステンレス等の金属；ポリエチレン、ポリエーテルエーテルケトン、フッ素樹脂、ポリエーテルエーテルケトンとフッ素樹脂の混合物等のプラスチックなどが挙げられるが、生体試料の吸着が少ないポリエーテルエーテルケトンやフッ素樹脂が好ましい。また、本発明のフィルターの素材に用いられるものも必要に応じて用いられる。また、生体試料の吸着が起こり易い材質のもの、例えば、ステンレスのようなものは、シリコーン被膜でコーティングしてもよい。
【００３８】
図４は、本発明のフィルター１がホルダー３内に装着されて構成されているラインフィルター５の断面図である。ラインフィルター５においては、ホルダー３の半体３ａの薄い円板状の空間部３３ａに本発明のフィルター１が収められている。
【００３９】
ホルダー３とフィルター１との間の気密性を十分保てない場合は、ホルダー３とフィルター１の間にシール部材２を設ける必要がある。具体的には、ホルダー３とフィルター１の間に隙間ができないように、図５（イ）、（ロ）に示すように、フィルター１をシール部材２で囲む方法がある。
【００４０】
上記シール部材の材質は、フィルターを保持できる強度を有するものであれば特に限定されず、例えば、ポリエーテルエーテルケトン、フッ素樹脂、ポリエーテルエーテルケトンとフッ素樹脂の混合物、ステンレスなどが挙げられる。シール部材の大きさ及び形状については、フィルターの形状にフィットした形状が好ましく、しかも、試料の拡散を起こさない大きさ及び形状が好ましい。
【００４１】
本発明の液体クロマトグラフィー用カラムは、本発明の液体クロマトグラフィー用フィルターが装着されたことを特徴とする。以下、本発明の液体クロマトグラフィー用カラムについて説明する。
【００４２】
本発明の液体クロマトグラフィー用カラムは、本発明のフィルターがカラムの試料導入側及び試料導出側のフィルターとして装着されている。すなわち、本発明の液体クロマトグラフィー用カラムは、図６に示すように、フィルター１として本発明のフィルターが装着されている他は、図８に示した従来の液体クロマトグラフィー用カラムと同様である。
【００４３】
本発明のフィルター及びカラムは、生体試料の吸着が特に少ない。従って、本発明のフィルター又はカラムを用いた液体クロマトグラフィーは、生体試料の分離に特に適している。上記生体試料とは、血液、血清、血漿、尿などの生体由来の試料を指し、その中には、蛋白質や脂質などが含まれているものである。
【００４４】
本発明のフィルターを用いた液体クロマトグラフィー用カラムにおいて、カラム本体（カラムの管部分）の材質は、カラム本体としての強度を有するものであれば特に限定されず、例えば、ステンレス、チタン等の金属；ポリエーテルエーテルケトン等のプラスチック；ガラス；ステンレス等の金属の内面をフッ素樹脂又はポリエーテルエーテルケトン等で被覆したものなどが挙げられる。
【００４５】
上記カラム本体の試料が接する部位は、本発明のフィルターの表面素材として用いる素材で被覆されてもよい。
【００４６】
上記カラム本体は、必要に応じて、シリコーン被膜でコーティングされてもよい。上記シリコーン被膜とは、シリコーンから得られる被膜であれば特に限定されない。上記シリコーンとしては、被膜を形成できるものであれば特に限定されず、例えば、オイル、ワニス、ゴム、シランなどの種類がある。好ましくは、硬化型シリコーンゴムである。シリコーン被膜を形成させる方法には、室温又は加熱して、図１１に示すようなベースポリマーと架橋剤（図１１におけるＸは、例えば、メトキシ基、ケトオキシム基、アセトキシ基のような加水分解性の有機基）を縮合、又は、付加反応、又は、ＵＶ硬化反応などさせる方法があり、いずれも用いることができる。好ましくは、縮合、又は、付加反応が良い。
【００４７】
シリコーン被膜の厚さは、好ましくは、０．１ｎｍ〜１００μｍ、より好ましくは、０．５ｎｍ〜１０μｍ、最も好ましくは、０．７ｎｍ〜２μｍである。
【００４８】
上記シリコーン被膜でカラム本体をコーティングする場合、カラム本体全体をコーティングする必要はなく、少なくとも分析試料が接触する部分（すなわち、カラム本体内側）がコーティングされていればよい。
カラム本体内側のコーティングの割合は、内側部の全表面積に対して、好ましくは、１０％以上、より好ましくは、３０％以上、最も好ましくは、６０％以上である。
【００４９】
上記のシリコーン被膜でコーティングされたカラム本体を製造するには、上記記載のカラム本体に硬化型シリコーンを塗布、又はコーティングし、室温、又は、加温して硬化させる方法が挙げられる。
【００５０】
また、上記カラム本体は、必要に応じて、二酸化珪素膜が形成され、次いでシリル化処理がなされていてもよい。このような処理をカラム本体に施す方法としては、前述のフィルターをこのように処理する方法と同様である。
【００５１】
また、上記カラム本体は、必要に応じて、ブロッキング試薬でブロッキングされてもよい。上記ブロッキング試薬及びブロッキング方法としては、フィルターに用いられるブロッキングとして前述したものと同様である。
【００５２】
本発明のフィルターを用いた液体クロマトグラフィーにおいて、溶離液などの移動相は、公知のものでよい。また、液体クロマトグラフ装置も公知のものでよい。
【００５３】
本発明のカラムを用いた液体クロマトグラフィーにおいて、溶離液などの移動相は、公知のものでよく、また、液体クロマトグラフ装置も公知のものでよい。
【００５５】
本発明の請求項４記載のヘモグロビン類の測定方法は、本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを用いることを特徴とする。
【００５６】
【作用】
本発明のフィルターは、その表面が生体試料の吸着が起こりにくい材質で構成されているので、フィルター寿命が長く、また、同様に、試料の吸着が少ないので、フィルター中で試料の拡散が起こりにくいため、分離性能に悪影響を与えない。
更に、ブロッキング試薬でブロッキング処理されているフィルターにおいては、上記の作用の全てを奏すると共に、更に、より一層、生体試料の吸着が起こりにくいため、生体試料の液体クロマトグラフ測定に使用すると、測定の最初から正確な測定値を得ることができる。
【００５７】
本発明のカラムは、本発明のフィルターを装着しているので、寿命が長く、分離性能に悪影響を与えない。
【００５９】
本発明の請求項４記載のヘモグロビン類の測定方法は、本発明の液体クロマトグラフィー用フィルターを用いたカラムを用いるので、ヘモグロビン類が吸着しにくいため、カラム寿命が長い。また、同様に、フィルターにヘモグロビン類が吸着しにくいので、カラム中でヘモグロビン類の拡散が少なく、ヘモグロビン類を効果的に分離できる。また、ヘモグロビン類の分離に適したｐＨ範囲において、ヘモグロビン類の吸着が非常に起こりにくいので、ヘモグロビン類が効果的に分離できる。
【００６０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施例及び比較例を挙げることにより、本発明を詳細に説明する。
【００６１】
（実施例１）
図１（イ）に示した形状のフィルター１をポリエチレン樹脂の一体成形品として製造した。その構造の詳細は、直径５ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱体からなり、濾過孔径は２μｍとした。
次に、このフィルター１をポリエーテルエーテルケトン製のシール部材２に挿入した後、図４に示すように、ステンレス製ホルダー３（頂角Ａ＝９０度）に嵌め込み、半体３ａ及び３ｂ同士をネジ結合して、ラインフィルター５を作製した。
【００６２】
（実施例２）
実施例１と同様にして得られた本発明のフィルター１をポリエーテルエーテルケトン製のシール部材２に挿入した後、ポリエーテルエーテルケトン製のホルダー３（頂角Ａ＝１５０度）に嵌め込み、半体３ａ及び３ｂ同士をネジ結合して、ラインフィルター５を作製した。
【００６３】
（実施例３）
図１（イ）に示した形状のフィルター１をチタンの一体成形品として製造した。その構造の詳細は、直径５ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱体からなり、濾過孔径は２μｍとした。
次に、このフィルター１をフッ素樹脂（テフロン）製のシール部材２に挿入した後、ポリエーテルエーテルケトン製のホルダー３（頂角Ａ＝１５０度）に嵌め込み、半体３ａ及び３ｂ同士をネジ結合して、ラインフィルター５を作製した。
【００６４】
（実施例４）
図１（イ）に示した形状のフィルター１をポリプロピレン樹脂の一体成形品として製造した。その構造の詳細は、直径５ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱体からなり、濾過孔径は２μｍとした。
次に、このフィルター１をポリエーテルエーテルケトン製のシール部材２に挿入した後、ポリエーテルエーテルケトン製のホルダー３（頂角Ａ＝１５０度）に嵌め込み、半体３ａ及び３ｂ同士をネジ結合して、ラインフィルター５を作製した。
【００６５】
（実施例５）
図１（イ）に示した形状のフィルター１をステンレス焼結体の一体成形品として製造した。その構造の詳細は、直径５ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱体からなり、濾過孔径は２μｍとした。
次に、従来の技術の項に記載したＣＬＤ法により、二酸化珪素被膜をフィルターに形成させる処理をした。具体的には、日本曹達社製アトロンをＨＰＬＣ用ポンプ（島津製作所社製）を用いて、上記フィルターの内部まで通液した後、余剰の液をフィルター内部から除去した。その後、２００℃で３０分間乾燥し、次に、５００℃で３０分間加熱し、二酸化珪素被膜を形成させた。
次に、このフィルターをヘキサメチルジシラザンでシリル化処理した。
次に、このフィルターをフッ素樹脂（テフロン）製のシール部材２に挿入した後、ポリエーテルエーテルケトン製ホルダー３（頂角Ａ＝１５０度）に嵌め込み、半体３ａ及び３ｂ同士をネジ結合して、ラインフィルター５を作製した。
【００６６】
（比較例１）
図１（イ）に示した形状のフィルターを、ステンレス焼結体の一体成形品として製造した。その構造の詳細は、直径５ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱体からなり、濾過孔径は２μｍとした。
次に、このフィルターをフッ素樹脂（テフロン）製のシール部材２に挿入した後、ステンレス製ホルダー３（頂角Ａ＝９０度）に嵌め込み、半体３ａ及び３ｂ同士をネジ結合して、ラインフィルター５を作製した。
【００６７】
（比較例２）
実施例５と同様のステンレス焼結体の一体成形品として製造したフィルターに、実施例５と同様にして二酸化珪素被膜を形成させた後、このフィルターをヘキサメチルジシラザンでシリル化処理することなく、フッ素樹脂（テフロン）製のシール部材２に挿入した後、ポリエーテルエーテルケトン製ホルダー３（頂角Ａ＝１５０度）に嵌め込み、半体３ａ及び３ｂ同士をネジ結合して、ラインフィルター５を作製した。
【００６８】
実施例１〜５及び比較例１、２で得られたラインフィルターを用いて以下のようにして、（１）吸着性の評価、及び（２）生体試料の吸着性とｐＨ（ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０）の関係の評価を行った。
【００６９】
（１）吸着性の評価
以下に示した測定条件を用い、実施例１〜５又は比較例１、２で作製したラインフィルターのみを用いて（すなわち、カラムは使用せず）、ヘモグロビン類の測定をすることにより、生体試料の吸着性について検討した。
測定条件
流速：２．０ｍｌ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μｌ
【００７０】
測定試料
以下のようにして調製した糖負荷血液を用いた。
血液抗凝固剤としてフッ化ナトリウムを用いて採血した健常人血に、５００ｍｇ／ｄｌとなるようグルコース水溶液を添加し、３７℃で３時間反応させた後、溶血希釈液Ｘ（０．１重量％トリトンＸ−１００のリン酸緩衝液溶液、ｐＨ７．０）で溶血し、１５０倍に希釈して測定試料とした。
【００７１】
測定結果
上記測定条件により、測定試料を測定して得られた代表的なクロマトグラムを図９（イ）（ラインフィルター使用せず）、図９（ロ）（実施例１〜５のラインフィルター使用）、図９（ハ）（比較例１又は２のラインフィルター使用）に示した。ピーク６１はヘモグロビン類のピークを示す（なお、カラムで分離されていないので単一のピークとなっている）。ピーク６２は、溶離液Ａではフィルタに吸着したヘモグロビン類が溶離液Ｂによって脱着したために表れたピークと思われる。
【００７２】
評価方法
ラインフィルターを装着せずに、測定試料を測定したときのヘモグロビン類のピーク面積を１００％として、実施例１〜５、比較例１、２のラインフィルターを用いて測定（ｎ＝５）したときのヘモグロビン類のピーク面積（ピーク６１の面積）から、以下の式により溶離液Ａによる回収率を求め、結果を表１に示した。
回収率（％）＝（ラインフィルター装着時のヘモグロビン類のピーク面積）÷（ラインフィルター装着なし時のヘモグロビン類のピーク面積）×１００
【００７３】
【表１】
比較例１、２では、回収率の平均値が、それぞれ５６．４０％、５８．８０％であったのが、実施例１〜５では、回収率の平均値がそれぞれ９７．７０％、９７．９８％、９７．４０％、９６．０８％、９７．８６％であった。以上より、実施例１〜５のラインフィルターを用いたものでは、比較例１、２のラインフィルターを用いたものに比べてヘモグロビン類の吸着が少なかったことがわかる。
【００７５】
また、表１（及び後述の表２〜４）における、ＣＶ（％）とは変動係数（すなわち、ＣＶ（％）＝標準偏差÷平均値×１００）のことであるが、比較例１、２のラインフィルターを用いたものは、実施例１〜５のラインフィルターを用いたものに比較してＣＶがはるかに大きく、ヘモグロビン類の吸着量のばらつきが大きいことが分かる。
【００７６】
（２）生体試料の吸着性とｐＨの関係の評価
以下に示した測定条件を用い、実施例１〜５又は比較例１、２で作製したラインフィルターのみを用いて（すなわち、カラムは使用せず）、ヘモグロビン類の測定をすることにより、生体試料の吸着性とｐＨ（ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０）の関係を評価した。
【００７７】
測定条件
流速：２．０ｍｌ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μｌ
【００７８】
測定試料
血液抗凝固剤としてフッ化ナトリウムを用いて採血した健常人血を、溶血希釈液Ｘ（０．１重量％トリトンＸ−１００のリン酸緩衝液溶液、ｐＨ７．０）で溶血し、１５０倍に希釈して測定試料とした。
【００７９】
評価方法
ラインフィルターを装着せずに、測定試料を測定したときのヘモグロビン類のピーク面積を１００％として、実施例１〜５又は比較例１、２で得られたラインフィルターを用いて測定（ｎ＝５）したときのヘモグロビン類のピーク面積から、以下の式により溶離液Ａによる回収率を求め、結果を表２〜４に示した。
回収率（％）＝（ラインフィルター装着時のヘモグロビン類のピーク面積）÷（ラインフィルター装着なし時のヘモグロビン類のピーク面積）×１００
【００８０】
【表２】
【表３】
【表４】
比較例１では、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０での回収率がそれぞれ平均１３．５６％、７６．５２％、９１．９８％であった。また、ＣＶ％は、ｐＨが低くなるほど悪くなり、ｐＨ５．０で、３７．２７％であった。
比較例２では、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０での回収率がそれぞれ平均２４．６６％、７７．０４％、９１．７０％であった。また、ＣＶ％は、ｐＨが低くなるほど悪くなり、ｐＨ５．０で、１２．２１％であった。
実施例１では、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０での回収率がそれぞれ平均９６．６４％、９７．８６％、９７．９４％であった。
実施例２では、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０での回収率がそれぞれ平均９７．７２％、９８．２２％、９８．４６％であった。
実施例３では、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０での回収率がそれぞれ平均９７．６４％、９８．１６％、９８．４８％であった。
実施例４では、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０での回収率がそれぞれ平均９６．２６％、９７．２０％、９７．２８％であった。
実施例５では、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０での回収率がそれぞれ平均９７．９８％、９８．２８％、９８．４２％であった。
また、実施例１〜５でのＣＶ％は、いずれのｐＨにおいても、１％以下であった。
【００８４】
以上より、比較例１のステンレス製フィルター；比較例２のステンレス製フィルターに二酸化珪素膜を被覆したもののいずれにおいても、ヘモグロビン類の吸着性は、ｐＨの影響を非常に強く受けることが明らかになった。また、ヘモグロビン類の定量には、通常、ｐＨ５〜９程度の溶離液を用いるのが一般的であるので、ステンレス製フィルターではヘモグロビン類の吸着が極めて大きくなり、吸着率も大きくばらつくので、ステンレス製フィルターをヘモグロビン類の測定に用いるとフィルター寿命が短くなり、データーのばらつく原因になると考えられる。
実施例１〜５の本発明のフィルターでのヘモグロビン類の吸着性は、ｐＨ９．０から酸性側５．０付近までのｐＨの影響を受けず、回収率もほぼ１００％であった。
以上より、ヘモグロビン類の測定に用いるフィルターとしては、広いｐＨの範囲でヘモグロビン類の吸着が殆どない本発明のフィルターを用いた方がよいことが明らかである。
【００８５】
（実施例６）
図１（イ）に示したフィルター１を、ポリエチレン樹脂の一体成形品として製造した。その構造の詳細は、直径４．６ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱体からなり、濾過孔径は２μｍとした。
次に、このフィルター１をポリエーテルエーテルケトン製のシール部材２（外径６．３ｍｍ、内径４．６ｍｍ、厚さ１．５ｍｍ）に挿入した後、これを図６に示したステンレス製カラム本体４０（内径４．６ｍｍ、長さ３５ｍｍ）のカラム両端に取り付けるためのエンドフィッティング４２に装着した。
【００８６】
上記のカラム本体４０に、以下のようにして調製した充填剤を、以下に示すカラムの作製の項で述べるようにして充填して、本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
・充填剤の調製
テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）４００ｇ及び２−アクリルアミド−２−メチルスルホン酸（和光純薬社製）１５０ｇの混合物にベンゾイルパーオキサイド（重合開始剤、和光純薬社製）１．５ｇを溶解した。これを、４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液２５００ｍｌに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で７５℃に昇温し、８時間重合した。重合後、洗浄し、乾燥した後、分級して平均粒径６μｍの粒子を得た。
・カラムの作製
カラム１本あたり、上記充填剤１．０ｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）３０ｍｌに分散し、５分間超音波処理した後、よく攪拌した。全量を上記のステンレス製カラム本体４０（内径４．６φ×３５ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカー（梅谷精機社製）に送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、上記充填剤を上記ステンレス製カラム本体４０に圧力３００ｋｇ／ｃｍ2 で定圧充填した後、エンドフィッティング４２とカラム本体４０を螺合して本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
【００８７】
（実施例７）
図１（イ）に示したフィルター１を、チタンの一体成形品として製造した。その構造の詳細は、直径４．６ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱体からなり、濾過孔径は２μｍとした。
次に、このフィルター１をフッ素樹脂（テフロン）製のシール部材２（外径６．３ｍｍ、内径４．６ｍｍ、厚さ１．５ｍｍ）に挿入した後、これを図６に示したステンレス製カラム本体４０（内径４．６ｍｍ、長さ３５ｍｍ）のカラム両端に取り付けるためのエンドフィッティング４２に装着した。
【００８８】
上記のカラム本体４０に、実施例６と同様の充填剤を、実施例６と同様にして充填して、本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
【００８９】
（実施例８）
図１（イ）に示したフィルター１を、ポリプロピレン樹脂の一体成形品として製造した。その構造の詳細は、直径４．６ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱体からなり、濾過孔径は２μｍとした。
次に、このフィルター１をポリエーテルエーテルケトン製のシール部材２（外径６．３ｍｍ、内径４．６ｍｍ、厚さ１．５ｍｍ）に挿入した後、これをシリコーン処理したステンレス製カラム本体４０（直径４．６ｍｍ、長さ３５ｍｍ）のカラム両端に取り付けるためのエンドフィッティング４２に装着した。
【００９０】
なお、上記のシリコーン処理したステンレス製カラム本体は、以下のようにして作製した。２液型硬化型シリコーンを用い、上記カラム本体をシリコーンコーティングした後、１００℃で３０分間加熱して、乾燥・硬化させ、均一なコーティング層を形成させた。
【００９１】
上記のカラム本体４０に、実施例６と同様の充填剤を実施例６と同様にして充填して、本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
【００９２】
（実施例９）
図１（イ）に示したフィルター１を、ステンレス焼結体の一体成形品として製造した。その構造の詳細は、直径４．６ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱体からなり、濾過孔径は２μｍとした。
次に、従来の技術の項に記載したＣＬＤ法により、二酸化珪素被膜をフィルターに形成させる処理をした。具体的には、日本曹達社製アトロンをＨＰＬＣ用ポンプ（島津製作所社製）を用いて、上記フィルター１の内部まで通液した後、余剰の液をフィルター内部から除去した。その後、２００℃で３０分間乾燥し、次に、５００℃で３０分間加熱し、二酸化珪素被膜を形成させた。
次に、このフィルター１をヘキサメチルジシラザンでシリル化処理した。
次に、このフィルター１をフッ素樹脂（テフロン）製のシール部材２（外径６．３ｍｍ、内径４．６ｍｍ、厚さ１．５ｍｍ）に挿入した後、これをシリコーン処理したステンレス製カラム本体４０（直径４．６ｍｍ、長さ３５ｍｍ）のカラム両端に取り付けるためのエンドフィッティング４２に装着した。
【００９３】
なお、上記のシリコーン処理したステンレス製カラム本体の作製方法は、実施例８と同様である。
【００９４】
上記のカラム本体４０に、実施例６と同様の充填剤を実施例６と同様にして充填して、本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
【００９５】
（比較例３）
ステンレス焼結体の一体成形品として製造したフィルターを用いたことの他は、実施例６と全く同様にして液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
【００９６】
（比較例４）
ステンレス焼結体の一体成形品として製造したフィルターを、実施例９と同様にして二酸化珪素被膜を形成させて製造したフィルター（シリル化処理はせず）を用いたことの他は、実施例６と全く同様にして液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
【００９７】
実施例６〜９及び比較例３、４で得られた液体クロマトグラフィー用カラムを用いて以下のようにして、ヘモグロビン類の測定を行うことにより、該カラムの分離性能に与える評価を行った（なお、ラインフィルターは用いなかった）。
測定条件
得られたカラムを以下の液体クロマトグラフに取り付けた後、以下の測定を行った。
流速：１．６ｍｌ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μｌ
【００９８】
測定試料
実施例１の（１）吸着性の評価の項で用いた測定試料と同様の方法で調製したもの。
【００９９】
測定結果
上記測定条件により、試料を測定して得られたクロマトグラムを図１０（イ）（実施例６〜９の液体クロマトグラフィー用カラムを用いたもの）、図１０（ロ）（比較例３又は４の液体クロマトグラフィー用カラムを用いたもの）に示した。ピーク５１はＨｂＡ１ａ及びＨｂＡ１ｂ、ピーク５２はＨｂＦ、ピーク５３は不安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク５４は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク５５はＨｂＡ０を示す。この結果、実施例６〜９の液体クロマトグラフィー用カラムを用いたものでは、比較例３又は４の液体クロマトグラフィー用カラムを用いたものに比較して分離性能に優れていることが分かる。
【０１００】
（実施例１０）
実施例６で得られたポリエチレンフィルター１に、０．１重量％ヘモグロビン水溶液を通液し、ブロッキング処理した。また、カラム本体は、実施例８と同様にシリコーンコーティングした。上記フィルター及びカラム本体を用いた以外は、実施例６と同様にして本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
【０１０１】
（実施例１１）
実施例７で得られたチタンフィルター１に、０．１重量％ウシ血清アルブミン水溶液を通液し、ブロッキング処理した。また、カラム本体は、実施例８と同様にシリコーンコーティングした。上記フィルター及びカラム本体を用いた以外は、実施例６と同様にして本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
【０１０２】
（実施例１２）
実施例８で得られたポリプロピレンフィルター１に、０．１重量％ウシ血清アルブミン水溶液を通液し、ブロッキング処理した。また、カラム本体は、実施例８と同様にシリコーンコーティングした。上記フィルター及びカラム本体を用いた以外は、実施例６と同様にして本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
【０１０３】
（実施例１３）
実施例９で得られたフィルター１（シリル化処理二酸化珪素被覆ステンレス焼結体フィルター）に、０．１重量％カゼイン水溶液を通液し、ブロッキング処理した。また、カラム本体は、実施例９のフィルター処理と同様にして、二酸化珪素膜を形成させた後、ヘキサメチルジシラザンでシリル化処理した。上記フィルター及びカラム本体を用いた以外は、実施例６と同様にして本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
【０１０４】
（比較例５）
図１（イ）に示したフィルターをポリエーテルエーテルケトンの一体成形品として製造した。その構造の詳細は、直径４．６ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱体からなり、濾過孔径は２μｍとした。このフィルターを用いたこと以外は、実施例６と同様にして液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
【０１０５】
実施例６、７、１０〜１３及び比較例３〜５で得られた液体クロマトグラフィー用カラムを用いて、実施例６と同様にして、ヘモグロビン類の測定を行うことにより、該カラムの分離性能に与える評価を行った。
【０１０６】
測定試料
健常人血液を溶血したものであって、後述の定義による安定型ＨｂＡ１ｃ濃度が４．５％であるものを用いた。
【０１０７】
測定結果
試料を５回連続して測定し、得られたクロマトグラムから、以下の式で定義される安定型ＨｂＡ１ｃ濃度を求め、測定回数と安定型ＨｂＡ１ｃ濃度の関係を表５に示した。
安定型ＨｂＡ１ｃ濃度（％）＝（安定型ＨｂＡ１ｃピークの面積）÷（全ヘモグロビンピークの面積の和）×１００
【０１０８】
【表５】
比較例３のカラムでは、安定型ＨｂＡ１ｃ濃度は、測定１回目から５回目にかけて、３．５％から３．９％に上昇した。
比較例４のカラムでは、安定型ＨｂＡ１ｃ濃度は、測定１回目から５回目にかけて、３．６％から４．１％に上昇した。
比較例５のカラムでは、安定型ＨｂＡ１ｃ濃度は、測定１回目から５回目にかけて、３．９％から４．３％に上昇した。すなわち、これらのカラムでは、測定初期では正確な値が得られないことがわかる。
一方、実施例６又は７のカラムでは、測定１回目〜３回目までは安定型ＨｂＡ１ｃ濃度は４．４％であったが、測定４回目と５回目では、４．５％となり、正確な値が得られた。更に、ブロッキングしたフィルター及びシリコーンコーティング（又は二酸化珪素膜被覆をシリル化処理）したカラム本体を用いた実施例１０〜１３のカラムでは、測定１回目から安定型ＨｂＡ１ｃ濃度は４．５％と正確な値が得られた。
【０１１０】
【発明の効果】
本発明の請求項１記載の液体クロマトグラフィー用フィルターの構成は、上記の通りであり、その表面が生体試料の吸着が起こりにくい材質で構成されているので、フィルター性能の寿命が長く、しかも、試料の吸着が少ないので、フィルター中で試料拡散が起こりにくいため、分離性能に悪影響を与えない。
本発明の請求項３記載の液体クロマトグラフィー用フィルターの構成は、上記の通りであり、更に、ブロッキング試薬でブロッキング処理されているので、上記の効果の全てを奏すると共に、更に、より一層、生体試料の吸着が起こりにくいため、生体試料の液体クロマトグラフ測定に使用すると、測定の最初から正確な測定値を得ることができる。
【０１１１】
本発明の請求項１記載の液体クロマトグラフィー用カラムの構成は、上記の通りであり、生体試料の吸着がおこりにくい材質で構成されているフィルターを用いているので、寿命が長く、分離性能に悪影響を与えない。
【０１１２】
本発明の請求項１記載の液体クロマトグラフィー用カラムの構成は、上記の通りであり、更にカラム本体がシリコーン被膜でコーティングされているので生体試料の吸着がより起こりにくくなり、カラム寿命がより一層長くなると共に、分離性能に悪影響をより一層与えない。
【０１１３】
本発明の請求項２記載の液体クロマトグラフィー用カラムの構成は、上記の通りであり、更に、カラム本体がブロッキング試薬でブロッキング処理されているので、請求項１記載のカラムの効果に加えて、測定の最初からより正確な測定値を得ることができる。
【０１１５】
本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを用いるヘモグロビン類の測定方法の構成は、上記の通りであり、広いｐＨの範囲でヘモグロビン類の吸着が少ない材質で構成されているフィルターを用いたカラムを用いているので、カラムの寿命が長い。また、ヘモグロビン類の吸着が少ないフィルターを用いているので、カラム中でのヘモグロビン類の拡散が起こりにくいためヘモグロビン類分析の分離性能に悪影響を与えない。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の液体クロマトグラフィー用フィルターの例を示す断面図。
【図２】本発明のフィルターが装着されるホルダーの一例を示す断面図。
【図３】本発明のフィルターが装着されるホルダーの他の例を示す断面図。
【図４】本発明のフィルターがホルダー内に装着されて構成されているラインフィルターの断面図。
【図５】本発明の液体クロマトグラフィー用フィルターを示す図であり、図５（イ）はその断面図。図５（ロ）は平面図。
【図６】本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを示す断面図。
【図７】液体クロマトグラフのシステムの構成を示す説明図。
【図８】従来の液体クロマトグラフィー用カラムを示す断面図。
【図９】測定試料を測定して得られたクロマトグラム。
【図１０】測定試料を測定して得られたクロマトグラム。
【図１１】シリコーン被膜を形成させるための反応の例を示す図。
【符号の説明】
１ 液体クロマトグラフィー用フィルター
２ シール部材
３ ホルダー
３ａ、３ｂ 半体
３１ａ、３１ｂ 円柱状の空間部
３２ａ、３２ｂ 円錐状の空間部
３３ａ 円板状の空間部
３４ａ、３４ｂ 被覆部
５ ラインフィルター
Claims (4)
- 少なくとも表面素材が、セルロース系樹脂、フッ素系樹脂、スルホン系樹脂、ポリエチレン、エチレンのアルキル誘導体の重合体、アクリル系樹脂、ナイロン、炭化物セラミック、窒化物セラミック、珪化物セラミック、硼化物セラミック、表面がシリル化処理された二酸化珪素、ガラス及びチタンからなる群より選ばれる少なくとも一種よりなる、又は、これらを複数組み合わせてなる液体クロマトグラフィー用フィルターが装着された液体クロマトグラフィー用カラムであって、更に、カラム本体がシリコーン被膜でコーティングされていることを特徴とする液体クロマトグラフィー用カラム。
- 更に、カラム本体がブロッキング試薬でブロッキング処理されていることを特徴とする請求項１記載の液体クロマトグラフィー用カラム。
- 液体クロマトグラフィー用フィルターが、更に、ブロッキング試薬でブロッキング処理されていることを特徴とする請求項１又は２記載の液体クロマトグラフィー用カラム。
- 請求項１〜３のいずれかに記載の液体クロマトグラフィー用カラムを用いることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法。
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