JP3857439B2 - 液体クロマトグラフィー用フィルター、液体クロマトグラフィー用カラム及びヘモグロビン類の測定方法 - Google Patents
液体クロマトグラフィー用フィルター、液体クロマトグラフィー用カラム及びヘモグロビン類の測定方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体クロマトグラフィー用フィルター、液体クロマトグラフィー用カラム及び該フィルター又はカラムを用いるヘモグロビン類の測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
有機化学、生化学、医学などの分野における試料中の成分の分離や分取に液体クロマトグラフが汎用されている。この液体クロマトグラフは、通常、図７のようなシステムに構成されている。溶離液などの移動相１１が電磁弁１２を通り、送液ポンプ１３により試料導入装置１４を経由して、フィルタ−装置１５を通り分離カラム１６に入り、この分離カラム１６により試料中の各成分が分離される。分離された各成分は検出器１７によって、例えば、吸光度を測定する等によって検出され、その結果がデーター処理装置１８により処理されてクロマトグラム１９として表される。
【０００３】
上記、分離カラム１６の上流のフィルタ−装置１５はラインフィルタ−（例えば、後述の図４）と呼ばれ、フィルターとそれを収容するホルダーで構成されており、該フィルターによって、試料中の固形物や送液ポンプのシール部品の摩耗物などの不溶物が濾過される。また、液体クロマトグラフにおいて使用されるフィルタ−には、上記のラインフィルタ−の他に、分離カラムの試料導入側及び試料導出側に取り付けられるフィルターもある。このようなフィルターが装着された液体クロマトグラフィー用カラムを図８に示した。図８において、符号４０は分離カラム本体、符号４１はフィルター、符号４２はエンドフィッティングである。なお、図８は試料導入側のみを示したものであり、試料導出側を省略しているが、試料導出側も同様に構成される。このカラムにおいては、エンドフィッティング４２の中にフィルター４１が装着され、フィルター４１とエンドフィッティング４２との間隙はシール部材４３で密閉されている。そして、エンドフィッティング４２と分離カラム本体４０が螺合されることにより、分離カラム本体４０の端部にフィルター４１が密着されている。
【０００４】
このようなフィルタ−装置に用いられるフィルタ−は、一般に、円板状であり、材質はステンレス製焼結体などが用いられている。
【０００５】
特開平７−２６０７６３号公報には、充填剤が収納されたカラム本体のエンドフィティングフィルターとして、ステンレス鋼繊維を積層し、それを焼結した繊維焼結フィルターを用いた高速液体クロマトグラフィーカラムが提案されている。このフィルターが装着された液体クロマトグラフィーカラムを、生体試料の測定に用いると、フィルターに生体試料が吸着し、圧力が上昇し、連続して多数の試料を測定できないという問題があった。
【０００６】
また、クロマトグラフィー用カラムの製造方法の一つとして、管の内壁に、珪素化合物の溶液を通流し、ＣＬＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｑｕｉｄ Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）法により、不活性な二酸化珪素被膜を形成させ、この管内部に充填剤を充填する方法がある（特公平２−１３２６８号公報）。
【０００７】
液体クロマトグラフィーによる測定の一つとして、血液中の糖化ヘモグロビン、特にヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃという）が糖尿病診断の指標となるため広く測定されている。糖化ヘモグロビンとは血液中の糖がヘモグロビンと結合して生成したものである。溶血液試料中の糖化ヘモグロビンは、過去１〜２カ月間の血液中の平均的な糖濃度を反映するので溶血液中の糖化ヘモグロビンは、糖尿病の診断の指標となる。
【０００８】
このＨｂＡ１ｃの液体クロマトグラフィー法による測定は、主にカチオン交換液体クロマトグラフィー法により行われている（特公平８−７１９８号公報など）。溶血液試料をカチオン交換液体クロマトグラフィーにより分離すると、通常、ヘモグロビンＡ１ａ（以下、ＨｂＡ１ａという）及びヘモグロビンＡ１ｂ（以下、ＨｂＡ１ｂという）、ヘモグロビンＦ（以下、ＨｂＦという）、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ並びにヘモグロビンＡ０（以下、ＨｂＡ０という）などのピークに分画できる。なお、糖尿病の診断の指標として使用されているＨｂＡ１ｃは、上記のうちの安定型ＨｂＡ１ｃであり、全ヘモグロビンピークの面積に対する安定型ＨｂＡ１ｃピークの面積の比率（％）として求められている。
【０００９】
このＨｂＡ１ｃの液体クロマトグラフィー法による測定は、カラムとしてカチオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤（例えば、カルボキシル基やスルホン酸基を官能基として有する充填剤）が充填されたものを用い、ｐＨ５．０〜９．０の溶離液を用いて行われている。
【００１０】
この測定において、ステンレス焼結体からなるフィルターを用いると、該フィルターに生体試料が吸着し、圧力が上昇し、連続して多数の試料を測定できない、及び、分離性能に悪影響がでるという問題があった。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、生体試料の吸着が少なく、寿命が長く、分離性能に悪影響を与えない液体クロマトグラフィー用フィルター、該フィルターを用いることにより寿命が長く、分離性能に悪影響を与えない液体クロマトグラフィー用カラム及び該フィルター又はカラムを用いるヘモグロビン類の測定方法を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明の液体クロマトグラフィー用フィルターは、シリコーン被膜でコーティングされていることを特徴とする。
【００１３】
本発明で用いるシリコーン被膜でコーティングされる前のフィルターは、フィルターとしての強度と、孔を持つものであれば良く、特に限定されない。
上記フィルターの材質としては、例えば、ステンレス、アルミニウム、銅、チタン、ニッケル、鉄、クロム、スズ等の金属；ナイロン、フッ素樹脂、セルロース、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリプロピレン、ポリエチレン、アクリル樹脂、ポリエステル、ビニロン、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリエーテルエーテルケトン、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、ノリル樹脂等のプラスチック；セラミック；ガラスなどが挙げられる。
【００１４】
上記フィルターの材質として、好ましくは、シリコーン被膜との接着性が良い材質であり、例えば、ステンレス、アルミニウム、銅、ニッケル、鉄、クロム、スズ等の金属；ナイロン、アクリル樹脂、ポリエステル、ビニロン、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、ノリル樹脂等のプラスチック；セラミック；ガラスなどが挙げられる。
【００１５】
フィルターの形態は、メンブレンフィルター、繊維を積層し焼結したもの、濾紙状のもの、不織布など特に限定されない。
【００１６】
本発明で用いられるシリコーン被膜とは、シリコーンから得られる被膜であれば特に限定されない。上記シリコーンとしては、被膜を形成できるものであれば特に限定されず、例えば、オイル、ワニス、ゴム、シランなどの種類がある。好ましくは、硬化型シリコーンゴムである。シリコーン被膜を形成させる方法には、室温又は加熱して、図１１に示すようなベースポリマーと架橋剤（図１１におけるＸは、例えば、メトキシ基、ケトオキシム基、アセトキシ基のような加水分解性の有機基）を縮合、又は、付加反応、又は、ＵＶ硬化反応などさせる方法があり、いずれも用いることができる。好ましくは、縮合、又は、付加反応が良い。
【００１７】
シリコーン被膜の厚さは、好ましくは、０．１ｎｍ〜１００μｍ、より好ましくは、０．５ｎｍ〜１０μｍ、最も好ましくは、０．７ｎｍ〜２μｍである。
シリコーン被膜でフィルターをコーティングする場合、フィルター全体をコーティングする必要はなく、少なくともフィルターの孔部分がコーティングされていればよい。
フィルターの孔部分のコーティングの割合は、孔部分の全表面積に対して、好ましくは、１０％以上、より好ましくは、３０％以上、最も好ましくは、６０％以上である。
【００１８】
本発明のフィルターは、上記の液体クロマトグラフィー用フィルターが、更に、ブロッキング試薬でブロッキング処理されていることが好ましい。上記ブロッキング試薬としては、例えば、ウシ血清アルブミン、カゼイン、ゼラチン、ヘモグロビン、ミオグロビンなどの蛋白質；例えば、リン脂質等の極性脂質；例えば、ＳＤＳ、ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００）などの界面活性剤などが挙げられる。
【００１９】
本発明のフィルターの形状は、液体の流れを乱さない構造であれば、特に限定されない。例えば、図１に示すような、（イ）円柱状、（ロ）円錐状、（ハ）円錐台状の凸部を有するもの、（ニ）円錐状の凸部と円柱部分を組み合わせた形状、（ホ）円錐台状の凸部と円柱部分を組み合わせた形状、（ヘ）２つの円錐の、底面同士を接触したような形状が挙げられる。図１において、符号１は本発明の液体クロマトグラフィー用フィルター、符号２は必要に応じて使用されるシール部材である。上記凸部の位置は、液体流入側又は液体流出側のどちらでもよく、また上記の両側でもよい。
【００２０】
本発明のフィルターのサイズは、直径は１〜１０００ｍｍが好ましく、２〜５０ｍｍがより好ましい。厚さは０．１〜１００ｍｍが好ましく、０．２〜１０ｍｍがより好ましい。濾過孔径は、公知の孔径でよく、０．１〜２０μｍが好ましく、０．２〜１０μｍがより好ましい。
【００２１】
本発明のフィルターを製造するには、上記記載の金属フィルター、プラスチックフィルターなどに硬化型シリコーンを塗布、又はコーティングし、室温、又は、加温して硬化させる方法が挙げられる。
金属フィルター、プラスチックフィルターなどの製造方法は、公知の方法でよく、例えば、繊維状のもの、粉体状のものを積層し、焼結処理する方法やメンブレン状、濾紙状に加工する方法などが挙げられる。
また、特開平２−２６２０５４号公報に記載あるような濾過孔径の異なるフィルターを組み合わせてもよい。すなわち、溶液の流入側に濾過孔径の大きなものを使用し、溶液の流出側に濾過孔径の小さなものを使用して組み合わせる。このように、濾過孔径の異なるフィルターを組み合わせたものを製造するには、それぞれのフィルターを製造後、貼り合わせてもよいが、直径の太い繊維を液体の流入側に用い、直径の細い繊維を液体の流出側に用いて、積層した状態で型に入れて焼結するのが好ましい。積層数は、特に限定されないが、通常、２〜３層で必要に応じて増やしてもよい。
【００２２】
また、本発明のブロッキング試薬でブロッキング処理されているフィルターを製造するには、シリコーン被膜でコーティングされているフィルターに、濃度０．０１〜５重量％程度のブロッキング試薬溶液を通液すればよい。
【００２３】
本発明のフィルターの用途としては、液体クロマトグラフィーのラインフィルター、カラムの試料導入側及び試料導出側のフィルターなどがある。
【００２４】
本発明のフィルターをラインフィルターとして用いる場合について以下説明する。ラインフィルターは、フィルターがホルダー内に装着されて構成されている。本発明のフィルターがラインフィルター中に装着される態様は、従来の態様と同様である。
【００２５】
図２は、本発明のフィルターが装着されるホルダーの一例を示す断面図である。ホルダー３は半体３ａ及び３ｂからなり（図２に矢印で示したように、半体３ａ側を液体流入側とし、半体３ｂ側を液体流出側とする）、半体３ａには内面の一部に雌ねじが設けられており、半体３ｂにはその外周面に上記雌ねじに螺合する雄ねじが設けられている。各半体３ａ及び３ｂは、液体の通流方向に並設されている。半体３ａの内部には、それぞれ開口部が相互に対向するように形成された円柱状の空間部３１ａと円錐状の空間部３２ａが設けられ、更に、該空間部３２ａの先端には薄い円板状の空間部３３ａが設けられており、また、円柱状の空間部３１ａを形成している部分の半体３ａの内面には雌ねじが設けられ、この雌ねじに溶離液などの液体が通流するための配管がネジ止めされ得るようにされている。また、半体３ｂの内部にも、それぞれ開口部が相互に対向するように形成された円柱状の空間部３１ｂと円錐状の空間部３２ｂが設けられ、円柱状の空間部３１ｂを形成している部分の半体３ｂの内面には雌ねじが設けられ、この雌ねじに液体が通流するための配管がネジ止めされ得るようにされている。
【００２６】
上記円錐状の空間部３２ａ及び３２ｂの円錐の頂角Ａは、試料をフィルター全体に導くことによりフィルター全体で濾過されるようにし、しかも、試料の拡散を最小に抑える大きさであることが好ましい。上記頂角Ａは、９０度よりも小さくなると、空間部が大きくなり、試料の拡散が起こり易くなり、１７９度よりも大きくなると、更に、空間部が大きくなり、試料の拡散が起こり易くなるので、９０〜１７９度が好ましく、１００〜１７０度がより好ましい。
【００２７】
ホルダー３の形状は、例えば、円柱状、立方体状など特に限定されない。
【００２８】
また、ホルダー３は、フィルター交換時に工具を使う必要がないように、図３に示すように、半体３ａと３ｂの外周面を、それぞれ円筒形の被覆部３４ａと３４ｂで被覆することにより、ホルダーの大きさを大きくして、手で十分締められるようにしてもよい。
【００２９】
ホルダーの材質としてはステンレス等の金属；ポリエチレン、ポリエーテルエーテルケトン、フッ素樹脂、ポリエーテルエーテルケトンとフッ素樹脂の混合物等のプラスチックなどが挙げられるが、生体試料の吸着が少ないポリエーテルエーテルケトンやフッ素樹脂が好ましい。また、生体試料の吸着が起こり易い材質のもの、例えば、ステンレスのようなものは、シリコーン被膜でコーティングしてもよい。
【００３０】
図４は、本発明のフィルター１がホルダー３内に装着されて構成されているラインフィルター５の断面図である。ラインフィルター５においては、ホルダー３の半体３ａの薄い円板状の空間部３３ａに本発明のフィルター１が収められている。
【００３１】
ホルダー３とフィルター１との間の気密性を十分保てない場合は、ホルダー３とフィルター１の間にシール部材２を設ける必要がある。具体的には、ホルダー３とフィルター１の間に隙間ができないように、図５（イ）、（ロ）に示すように、フィルター１をシール部材２で囲む方法がある。
【００３２】
上記シール部材の材質は、フィルターを保持できる強度を有するものであれば特に限定されず、例えば、ポリエーテルエーテルケトン、フッ素樹脂、ポリエーテルエーテルケトンとフッ素樹脂の混合物、ステンレスなどが挙げられる。シール部材の大きさ及び形状については、フィルターの形状にフィットした形状が好ましく、しかも、試料の拡散を起こさない大きさ及び形状が好ましい。
【００３３】
本発明の液体クロマトグラフィー用カラムは、本発明の液体クロマトグラフィー用フィルターが装着されたことを特徴とする。以下、本発明の液体クロマトグラフィー用カラムについて説明する。
【００３４】
本発明の液体クロマトグラフィー用カラムは、本発明のフィルターがカラムの試料導入側及び試料導出側のフィルターとして装着されている。すなわち、本発明の液体クロマトグラフィー用カラムは、図６に示すように、フィルター１として本発明のフィルターが装着されている他は、図８に示した従来の液体クロマトグラフィー用カラムと同様である。
【００３５】
本発明のフィルター及びカラムは、生体試料の吸着が特に少ない。従って、本発明のフィルター又はカラムを用いた液体クロマトグラフィーは、生体試料の分離に特に適している。上記生体試料とは、血液、血清、血漿、尿などの生体由来の試料を指し、その中には、蛋白質や脂質などが含まれているものである。
【００３６】
本発明のフィルターを用いた液体クロマトグラフィー用カラムにおいて、カラム本体（カラムの管部分）の材質は、カラム本体としての強度を有するものであれば特に限定されず、例えば、ステンレス、チタン等の金属；ポリエーテルエーテルケトン等のプラスチック；ガラス；ステンレス等の金属の内面をフッ素樹脂又はポリエーテルエーテルケトン等で被覆したものなどが挙げられる。
【００３７】
上記カラム本体は、必要に応じて、シリコーン被膜でコーティングされてもよい。この場合に用いられるシリコーン被膜、およびシリコーン被膜の厚さは、フィルターに用いられるシリコーン被膜として前述したものと同様である。
【００３８】
上記シリコーン被膜でカラム本体をコーティングする場合、カラム本体全体をコーティングする必要はなく、少なくとも分析試料が接触する部分（すなわち、カラム本体内側）がコーティングされていればよい。
カラム本体内側のコーティングの割合は、内側部の全表面積に対して、好ましくは、１０％以上、より好ましくは、３０％以上、最も好ましくは、６０％以上である。
【００３９】
上記のシリコーン被膜でコーティングされたカラム本体を製造するには、上記記載のカラム本体に硬化型シリコーンを塗布、又はコーティングし、室温、又は、加温して硬化させる方法が挙げられる。
【００４０】
また、上記カラム本体は、必要に応じて、ブロッキング試薬でブロッキングされてもよい。上記ブロッキング試薬及びブロッキング方法としては、フィルターに用いられるブロッキングとして前述したものと同様である。
【００４１】
本発明のフィルターを用いた液体クロマトグラフィーにおいて、溶離液などの移動相は、公知のものでよい。また、液体クロマトグラフ装置も公知のものでよい。
【００４２】
本発明のカラムを用いた液体クロマトグラフィーにおいて、溶離液などの移動相は、公知のものでよく、また、液体クロマトグラフ装置も公知のものでよい。
【００４３】
本発明の請求項６記載のヘモグロビン類の測定方法は、本発明の液体クロマトグラフィー用フィルターを用いることを特徴とする。
【００４４】
本発明の請求項７記載のヘモグロビン類の測定方法は、本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを用いることを特徴とする。
【００４５】
【作用】
本発明のフィルターは、シリコーン被膜でコーティングされているので、生体試料の吸着が起こりにくいため、フィルター寿命が長く、また、同様に、試料の吸着が少ないので、フィルター中で試料の拡散が起こりにくいため、分離性能に悪影響を与えない。
更に、ブロッキング試薬でブロッキング処理されているフィルターにおいては、上記の作用の全てを奏すると共に、更に、より一層、生体試料の吸着が起こりにくいため、生体試料の液体クロマトグラフ測定に使用すると、測定の最初から正確な測定値を得ることができる。
【００４６】
本発明のカラムは、本発明のフィルターを装着しているので、寿命が長く、分離性能に悪影響を与えない。
【００４７】
本発明の請求項６記載のヘモグロビン類の測定方法は、本発明の液体クロマトグラフィー用フィルターを用いているため、ヘモグロビン類がフィルターに吸着しにくいので、フィルター寿命が長い。また、同様に、ヘモグロビン類がフィルターに吸着しにくいので、フィルター中でのヘモグロビン類の拡散が少なくヘモグロビン類の分離性能に悪影響を与えない。また、ヘモグロビン類の分離に適したｐＨ範囲において、ヘモグロビン類の吸着が非常に起こりにくいので、ヘモグロビン類の分離性能に悪影響を与えない。
【００４８】
本発明の請求項７記載のヘモグロビン類の測定方法は、本発明の液体クロマトグラフィー用フィルターを用いたカラムを用いるので、ヘモグロビン類が吸着しにくいため、カラム寿命が長い。また、同様に、フィルターにヘモグロビン類が吸着しにくいので、カラム中でヘモグロビン類の拡散が少なく、ヘモグロビン類を効果的に分離できる。また、ヘモグロビン類の分離に適したｐＨ範囲において、ヘモグロビン類の吸着が非常に起こりにくいので、ヘモグロビン類が効果的に分離できる。
【００４９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施例及び比較例を挙げることにより、本発明を詳細に説明する。
【００５０】
（実施例１）
図１（イ）に示した形状のフィルターをステンレス焼結体の一体成形品として製造した。その構造の詳細は、直径５ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱体からなり、濾過孔径は２μｍとした。次に、コーティング剤として、２液型硬化型シリコーンを用い、上記ステンレス製フィルター全体をシリコーンコーティングした（濾過孔の中は、コーティング剤を通液した）。その後、１００℃で３０分間加熱して乾燥・硬化させ、均一なコーティング層を形成させ、本発明のフィルター１を得た。
次に、このフィルター１をフッ素樹脂（テフロン）製のシール部材２に挿入した後、図４に示すように、ステンレス製ホルダー３（頂角Ａ＝９０度）に嵌め込み、半体３ａ及び３ｂ同士をネジ結合して、ラインフィルター５を作製した。
【００５１】
（実施例２）
実施例１と同様にして得られた本発明のフィルター１をフッ素樹脂（テフロン）製のシール部材２に挿入した後、ポリエーテルエーテルケトン製のホルダー３（頂角Ａ＝１５０度）に嵌め込み、半体３ａ及び３ｂ同士をネジ結合して、ラインフィルター５を作製した。
【００５２】
（比較例１）
図１（イ）に示したフィルターを、ステンレス焼結体の一体成形品として製造した。その構造の詳細は、直径５ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱体からなり、濾過孔径は２μｍとした。
次に、このフィルターをフッ素樹脂（テフロン）製のシール部材２に挿入した後、ステンレス製ホルダー３（頂角Ａ＝９０度）に嵌め込み、半体３ａ及び３ｂ同士をネジ結合して、ラインフィルター５を作製した。
【００５３】
（比較例２）
図１（イ）に示した形状のフィルターをステンレス焼結体の一体成形品として製造した。その構造の詳細は、直径５ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱体からなり、濾過孔径は２μｍとした。
次に、従来の技術の項に記載したＣＬＤ法により、二酸化珪素被膜をフィルターに形成させる処理をした。具体的には、日本曹達社製アトロンをＨＰＬＣ用ポンプ（島津製作所社製）を用いて、上記フィルターの内部まで通液した後、余剰の液をフィルター内部から除去した。その後、２００℃で３０分間乾燥し、次に、５００℃で３０分間加熱し、二酸化珪素被膜を形成させた。
次に、このフィルターをフッ素樹脂（テフロン）製のシール部材２に挿入した後、ポリエーテルエーテルケトン製ホルダー３（頂角Ａ＝１５０度）に嵌め込み、半体３ａ及び３ｂ同士をネジ結合して、ラインフィルター５を作製した。
【００５４】
実施例１、２及び比較例１、２で得られたラインフィルターを用いて以下のようにして、（１）吸着性の評価、及び（２）生体試料の吸着性とｐＨ（ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０）の関係の評価を行った。
【００５５】
（１）吸着性の評価
以下に示した測定条件を用い、実施例１、２又は比較例１、２で作製したラインフィルターのみを用いて（すなわち、カラムは使用せず）、ヘモグロビン類の測定をすることにより、生体試料の吸着性について検討した。
測定条件
システム：送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）
オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学社製）
検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
溶離液：溶離液Ａ：１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）
溶離液Ｂ：３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）
測定開始より０〜３分の間は溶離液Ａを流し、３〜５分の間は溶離液Ｂを流し、５〜１０分の間は溶離液Ａを流した。
流速：２．０ｍｌ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μｌ
【００５６】
測定試料
以下のようにして調製した糖負荷血液を用いた。
血液抗凝固剤としてフッ化ナトリウムを用いて採血した健常人血に、５００ｍｇ／ｄｌとなるようグルコース水溶液を添加し、３７℃で３時間反応させた後、溶血希釈液Ｘ（０．１重量％トリトンＸ−１００のリン酸緩衝液溶液、ｐＨ７．０）で溶血し、１５０倍に希釈して測定試料とした。
【００５７】
測定結果
上記測定条件により、測定試料を測定して得られた代表的なクロマトグラムを図９（イ）（ラインフィルター使用せず）、図９（ロ）（実施例１又は２のラインフィルター使用）、図９（ハ）（比較例１又は２のラインフィルター使用）に示した。ピーク６１はヘモグロビン類のピークを示す（なお、カラムで分離されていないので単一のピークとなっている）。ピーク６２は、溶離液Ａではフィルタに吸着したヘモグロビン類が溶離液Ｂによって脱着したために表れたピークと思われる。
【００５８】
評価方法
ラインフィルターを装着せずに、測定試料を測定したときのヘモグロビン類のピーク面積を１００％として、実施例１、実施例２、比較例１、比較例２のラインフィルターを用いて測定（ｎ＝５）したときのヘモグロビン類のピーク面積（ピーク６１の面積）から、以下の式により溶離液Ａによる回収率を求め、結果を表１に示した。
回収率（％）＝（ラインフィルター装着時のヘモグロビン類のピーク面積）÷（ラインフィルター装着なし時のヘモグロビン類のピーク面積）×１００
【００５９】
【表１】
【００６０】
比較例１、２では、回収率の平均値がそれぞれ５６．４０％、５８．８０％であったのが、実施例１及び２では、回収率の平均値がそれぞれ９７．８４％、９８．１２％であった。以上より、実施例１及び２のラインフィルターを用いたものでは、比較例１及び２のラインフィルターを用いたものに比べてヘモグロビン類の吸着が少なかったことがわかる。
【００６１】
また、表１（及び後述の表２）における、ＣＶ（％）とは変動係数（すなわち、ＣＶ（％）＝標準偏差÷平均値×１００）のことであるが、比較例１、２のラインフィルターを用いたものは、実施例１又は２のラインフィルターを用いたものに比較してＣＶがはるかに大きく、ヘモグロビン類の吸着量のばらつきが大きいことが分かる。
【００６２】
（２）生体試料の吸着性とｐＨの関係の評価
以下に示した測定条件を用い、実施例１、２又は比較例１、２で作製したラインフィルターのみを用いて（すなわち、カラムは使用せず）、ヘモグロビン類の測定をすることにより、生体試料の吸着性とｐＨ（ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０）の関係を評価した。
【００６３】
測定条件
システム：送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）
オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学社製）
検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
溶離液：溶離液Ａ：１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０）
溶離液Ｂ：３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）
測定開始より０〜３分の間は溶離液Ａを流し、３〜５分の間は溶離液Ｂを流し、５〜１０分の間は溶離液Ａを流した。
流速：２．０ｍｌ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μｌ
【００６４】
測定試料
血液抗凝固剤としてフッ化ナトリウムを用いて採血した健常人血を、溶血希釈液Ｘ（０．１重量％トリトンＸ−１００のリン酸緩衝液溶液、ｐＨ７．０）で溶血し、１５０倍に希釈して測定試料とした。
【００６５】
評価方法
ラインフィルターを装着せずに、測定試料を測定したときのヘモグロビン類のピーク面積を１００％として、実施例１、実施例２、比較例１又は比較例２で得られたラインフィルターを用いて測定（ｎ＝５）したときのヘモグロビン類のピーク面積から、以下の式により溶離液Ａによる回収率を求め、結果を表２及び表３に示した。
回収率（％）＝（ラインフィルター装着時のヘモグロビン類のピーク面積）÷（ラインフィルター装着なし時のヘモグロビン類のピーク面積）×１００
【００６６】
【表２】
【００６７】
【表３】
【００６８】
比較例１では、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０での回収率がそれぞれ平均１３．５６％、７６．５２％、９１．９８％であった。比較例２では、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０での回収率がそれぞれ平均２４．６６％、７７．０４％、９１．７０％であった。また、ＣＶ％は、比較例１、２でｐＨが低くなるほど悪くなり、ｐＨ５．０で、それぞれ３７．２７％、１２．２１％であった。
実施例１では、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０での回収率がそれぞれ平均９７．２４％、９７．８８％、９７．８４％であった。
実施例２では、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０での回収率がそれぞれ平均９８．０２％、９８．４２％、９８．５６％であった。
また、実施例１及び実施例２でのＣＶ％は、いずれのｐＨにおいても、１％以下であった。
【００６９】
以上より、比較例１のシリコーンコーティングしていないステンレス製フィルターではヘモグロビン類の吸着性は、ｐＨの影響を非常に強く受けることが明らかになった。また、ヘモグロビン類の定量には、通常、ｐＨ５〜９程度の溶離液を用いるのが一般的であるので、シリコーンコーティングしていないステンレス製フィルターではヘモグロビン類の吸着が極めて大きくなり、吸着率も大きくばらつくので、シリコーンコーティングしていないステンレス製フィルターをヘモグロビン類の測定に用いるとフィルター寿命が短くなり、データーのばらつく原因になると考えられる。また、比較例２のように、ステンレス製フィルターを二酸化珪素膜で被覆してもヘモグロビン類の吸着性は改善されなかった。
実施例１及び実施例２のシリコーンコーティングしたステンレス製フィルターでのヘモグロビン類の吸着性は、ｐＨ９．０から酸性側５．０付近までのｐＨの影響を受けず、回収率もほぼ１００％であった。
以上より、ヘモグロビン類の測定に用いるフィルターとしては、広いｐＨの範囲でヘモグロビン類の吸着が殆どないシリコーンコーティングしたフィルターを用いた方がよいことが明らかである。
【００７０】
（実施例３）
図１（イ）に示したフィルターを、ステンレス焼結体の一体成形品として製造した。その構造の詳細は、直径４．６ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱体からなり、濾過孔径は２μｍとした。次に、コーティング剤として、２液型硬化型シリコーンを用い、上記ステンレス製フィルター全体をシリコーンコーティングした（濾過孔の中は、コーティング剤を通液した）。その後、１００℃で３０分間加熱して乾燥・硬化させ、均一なコーティング層を形成させ、本発明のフィルター１を得た。
次に、このフィルター１をフッ素樹脂（テフロン）製のシール部材２（外径６．３ｍｍ、内径４．６ｍｍ、厚さ１．５ｍｍ）に挿入した後、これを図６に示したステンレス製カラム本体４０（内径４．６ｍｍ、長さ３５ｍｍ）のカラム両端に取り付けるためのエンドフィッティング４２に装着した。
【００７１】
上記のカラム本体４０に、以下のようにして調製した充填剤を、以下に示すカラムの作製の項で述べるようにして充填して、本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
・充填剤の調製
テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）４００ｇ及び２−アクリルアミド−２−メチルスルホン酸（和光純薬社製）１５０ｇの混合物にベンゾイルパーオキサイド（重合開始剤、和光純薬社製）１．５ｇを溶解した。これを、４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液２５００ｍｌに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で７５℃に昇温し、８時間重合した。重合後、洗浄し、乾燥した後、分級して平均粒径６μｍの粒子を得た。
・カラムの作製
カラム１本あたり、上記充填剤１．０ｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）３０ｍｌに分散し、５分間超音波処理した後、よく攪拌した。全量を上記のステンレス製カラム本体４０（内径４．６φ×３５ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカー（梅谷精機社製）に送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、上記充填剤を上記ステンレス製カラム本体４０に圧力３００ｋｇ／ｃｍ2 で定圧充填した後、エンドフィッティング４２とカラム本体４０を螺合して本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
【００７２】
（実施例４）
実施例３と同様にして本発明のフィルター１を得た。
一方、図６に示したステンレス製カラム本体４０（内径４．６ｍｍ、長さ３５ｍｍ）に、上記実施例３においてフィルターにコーティングした方法と同様の方法で、シリコーンコーティングした。
次に、上記のフィルター１をフッ素樹脂（テフロン）製のシール部材２（外径６．３ｍｍ、内径４．６ｍｍ、厚さ１．５ｍｍ）に挿入した後、これを上記のシリコーンコーティングしたカラム本体４０（内径４．６ｍｍ、長さ３５ｍｍ）のカラム両端に取り付けるためのエンドフィッティング４２に装着した。
【００７３】
上記のシリコーンコーティングしたカラム本体に、実施例３と同様にして調製した充填剤を、実施例３と同様にして充填して、本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
【００７４】
（比較例３）
実施例３における、ステンレス焼結体の一体成形品として製造したフィルターを、シリコーンコーティングしなかったことの他は、実施例３と全く同様にして液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
【００７５】
（比較例４）
図１（イ）に示したフィルターを、ステンレス焼結体の一体成形品として製造した。その構造の詳細は、直径４．６ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱体からなり、濾過孔径は２μｍとした。
次に、従来の技術の項に記載したＣＬＤ法により、二酸化珪素被膜をフィルター及びカラム本体に形成させる処理をした。具体的には、日本曹達社製アトロンをＨＰＬＣ用ポンプ（島津製作所社製）を用いて、上記フィルターの内部まで通液した後、余剰の液をフィルター内部から除去した。その後、２００℃で３０分間乾燥し、次に、５００℃で３０分間加熱し、二酸化珪素被膜を形成させた。
また、カラム本体は、上記アトロンに浸し、その後、２００℃で３０分間乾燥し、次に、５００℃で３０分間加熱し、二酸化珪素被膜を形成させた。
次に、このフィルター１をフッ素樹脂（テフロン）製のシール部材２（外径６．３ｍｍ、内径４．６ｍｍ、厚さ１．５ｍｍ）に挿入した後、これを上記の二酸化珪素被膜を形成させたステンレス製カラム本体（内径４．６ｍｍ、長さ３５ｍｍ）のカラム両端に取り付けるためのエンドフィッティング４２に装着した。
【００７６】
上記の二酸化珪素被膜を形成させたカラム本体に、実施例３と同様にして調製した充填剤を、実施例３と同様にして充填して（フィルターは、上記の二酸化珪素被膜を形成させたフィルターを用いた）、液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
【００７７】
実施例３、４及び比較例３、４で得られた液体クロマトグラフィー用カラムを用いて以下のようにして、ヘモグロビン類の測定を行うことにより、該カラムの分離性能に与える評価を行った（なお、ラインフィルターは用いなかった）。
測定条件
得られたカラムを以下の液体クロマトグラフに取り付けた後、以下の測定を行った。
システム：送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）
オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学社製）
検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
溶離液：溶離液Ａ：１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）
溶離液Ｂ：３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）
測定開始より０〜５分の間は溶離液Ａを流し、５〜６分の間は溶離液Ｂを流し、６〜１０分の間は溶離液Ａを流した。
流速：１．６ｍｌ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μｌ
【００７８】
測定試料
実施例１の（１）吸着性の評価の項で用いた測定試料と同様の方法で調製したもの。
【００７９】
測定結果
上記測定条件により、試料を測定して得られたクロマトグラムを図１０（イ）（実施例３又は４の液体クロマトグラフィー用カラムを用いたもの）、図１０（ロ）（比較例３又は４の液体クロマトグラフィー用カラムを用いたもの）に示した。ピーク５１はＨｂＡ１ａ及びＨｂＡ１ｂ、ピーク５２はＨｂＦ、ピーク５３は不安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク５４は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク５５はＨｂＡ０を示す。この結果、実施例３又は４の液体クロマトグラフィー用カラムを用いたものでは、比較例３又は４の液体クロマトグラフィー用カラムを用いたものに比較して分離性能に優れていることが分かる。
【００８０】
（実施例５）
実施例３で得られたシリコーンコーティングしたフィルター１に、０．１重量％ヘモグロビン水溶液を通液し、ブロッキング処理した。このフィルターを用いたこと以外は、実施例３と同様にして本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
【００８１】
（実施例６）
実施例３で得られたシリコーンコーティングしたフィルター１に、０．１重量％ウシ血清アルブミン水溶液を通液し、ブロッキング処理した。
一方、図６に示したステンレス製カラム本体４０（内径４．６ｍｍ、長さ３５ｍｍ）に、上記実施例３においてフィルターにコーティングした方法と同様の方法で、シリコーンコーティングした。
このフィルター及びカラム本体を用いたこと以外は、実施例３と同様にして本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
【００８２】
（比較例５）
図１（イ）に示したフィルターを、ポリエーテルエーテルケトンの一体成形品として製造した。その構造の詳細は、直径４．６ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱体からなり、濾過孔径は２μｍとした。このフィルターを用いたこと以外は、実施例３と同様にして液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
【００８３】
実施例３、５、６及び比較例３、５で得られた液体クロマトグラフィー用カラムを用いて、実施例３と同様にして、ヘモグロビン類の測定を行うことにより、該カラムの分離性能に与える評価を行った。
【００８４】
測定試料
健常人血液を溶血したものであって、後述の定義による安定型ＨｂＡ１ｃ濃度が４．５％であるものを用いた。
【００８５】
測定結果
試料を５回連続して測定し、得られたクロマトグラムから、以下の式で定義される安定型ＨｂＡ１ｃ濃度を求め、測定回数と安定型ＨｂＡ１ｃ濃度の関係を表４に示した。
安定型ＨｂＡ１ｃ濃度（％）＝（安定型ＨｂＡ１ｃピークの面積）÷（全ヘモグロビンピークの面積の和）×１００
【００８６】
【表４】
【００８７】
比較例３のカラムでは、安定型ＨｂＡ１ｃ濃度は、測定１回目から５回目にかけて、３．５％から３．９％に上昇した。比較例５のカラムでは、安定型ＨｂＡ１ｃ濃度は、測定１回目から５回目にかけて、３．９％から４．３％に上昇した。すなわち、これらのカラムでは、測定初期では正確な値が得られないことがわかる。
一方、実施例３のカラムでは、測定１回目〜３回目までは安定型ＨｂＡ１ｃ濃度は４．４％であったが、測定４回目と５回目では、４．５％となり、正確な値が得られた。更に、ブロッキングしたフィルターを用いた実施例５及び６のカラムでは、測定１回目から安定型ＨｂＡ１ｃ濃度は４．５％と正確な値が得られた。
【００８８】
【発明の効果】
本発明の液体クロマトグラフィー用フィルターの構成は、上記の通りであり、生体試料の吸着がおこりにくいシリコーン被膜でコーティングされているので、フィルター性能の寿命が長く、しかも、試料の吸着が少ないので、フィルター中で試料拡散が起こりにくいため、分離性能に悪影響を与えない。
【００８９】
本発明の請求項２記載の液体クロマトグラフィー用フィルターの構成は、上記の通りであり、生体試料の吸着がおこりにくいシリコーン被膜でコーティングされており、更に、ブロッキング試薬でブロッキング処理されているので、上記の効果の全てを奏すると共に、更に、より一層、生体試料の吸着が起こりにくいため、生体試料の液体クロマトグラフ測定に使用すると、測定の最初から正確な測定値を得ることができる。
【００９０】
本発明の請求項３記載の液体クロマトグラフィー用カラムの構成は、上記の通りであり、生体試料の吸着がおこりにくいシリコーン被膜でコーティングされているフィルターを用いているので、寿命が長く、分離性能に悪影響を与えない。
【００９１】
本発明の請求項４記載の液体クロマトグラフィー用カラムの構成は、上記の通りであり、生体試料の吸着がおこりにくいシリコーン被膜でコーティングされているフィルター及びカラム本体を用いているので、より寿命が長く、より分離性能に悪影響を与えない。
【００９２】
本発明の請求項５記載の液体クロマトグラフィー用カラムの構成は、上記の通りであり、更に、カラム本体がブロッキング試薬でブロッキング処理されているので、請求項３又は４記載のカラムの効果に加えて、測定の最初からより正確な測定値を得ることができる。
【００９３】
本発明の液体クロマトグラフィー用フィルターを用いるヘモグロビン類の測定方法は、広いｐＨの範囲でヘモグロビン類の吸着が少ないシリコーン被膜でコーティングされたフィルターを用いているので、フィルターの寿命が長い。そのため、フィルターの交換頻度がきわめて少なくなる。また、ヘモグロビン類の吸着が少ないフィルターを用いているので、ヘモグロビン類分析の分離性能に悪影響を与えない。
【００９４】
本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを用いるヘモグロビン類の測定方法は、広いｐＨの範囲でヘモグロビン類の吸着が少ないシリコーン被膜でコーティングされたフィルターを用いたカラムを用いているので、カラムーの寿命が長い。また、ヘモグロビン類の吸着が少ないフィルターを用いているので、カラム中でのヘモグロビン類の拡散が起こりにくいためヘモグロビン類分析の分離性能に悪影響を与えない。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の液体クロマトグラフィー用フィルターの例を示す断面図。
【図２】本発明のフィルターが装着されるホルダーの一例を示す断面図。
【図３】本発明のフィルターが装着されるホルダーの他の例を示す断面図。
【図４】本発明のフィルターがホルダー内に装着されて構成されているラインフィルターの断面図。
【図５】本発明の液体クロマトグラフィー用フィルターを示す図であり、図５（イ）はその断面図。図５（ロ）は平面図。
【図６】本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを示す断面図。
【図７】液体クロマトグラフのシステムの構成を示す説明図。
【図８】従来の液体クロマトグラフィー用カラムを示す断面図。
【図９】測定試料を測定して得られたクロマトグラム。
【図１０】測定試料を測定して得られたクロマトグラム。
【図１１】シリコーン被膜を形成させるための反応の例を示す図。
【符号の説明】
１ 液体クロマトグラフィー用フィルター
２ シール部材
３ ホルダー
３ａ、３ｂ 半体
３１ａ、３１ｂ 円柱状の空間部
３２ａ、３２ｂ 円錐状の空間部
３３ａ 円板状の空間部
３４ａ、３４ｂ 被覆部
５ ラインフィルター
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体クロマトグラフィー用フィルター、液体クロマトグラフィー用カラム及び該フィルター又はカラムを用いるヘモグロビン類の測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
有機化学、生化学、医学などの分野における試料中の成分の分離や分取に液体クロマトグラフが汎用されている。この液体クロマトグラフは、通常、図７のようなシステムに構成されている。溶離液などの移動相１１が電磁弁１２を通り、送液ポンプ１３により試料導入装置１４を経由して、フィルタ−装置１５を通り分離カラム１６に入り、この分離カラム１６により試料中の各成分が分離される。分離された各成分は検出器１７によって、例えば、吸光度を測定する等によって検出され、その結果がデーター処理装置１８により処理されてクロマトグラム１９として表される。
【０００３】
上記、分離カラム１６の上流のフィルタ−装置１５はラインフィルタ−（例えば、後述の図４）と呼ばれ、フィルターとそれを収容するホルダーで構成されており、該フィルターによって、試料中の固形物や送液ポンプのシール部品の摩耗物などの不溶物が濾過される。また、液体クロマトグラフにおいて使用されるフィルタ−には、上記のラインフィルタ−の他に、分離カラムの試料導入側及び試料導出側に取り付けられるフィルターもある。このようなフィルターが装着された液体クロマトグラフィー用カラムを図８に示した。図８において、符号４０は分離カラム本体、符号４１はフィルター、符号４２はエンドフィッティングである。なお、図８は試料導入側のみを示したものであり、試料導出側を省略しているが、試料導出側も同様に構成される。このカラムにおいては、エンドフィッティング４２の中にフィルター４１が装着され、フィルター４１とエンドフィッティング４２との間隙はシール部材４３で密閉されている。そして、エンドフィッティング４２と分離カラム本体４０が螺合されることにより、分離カラム本体４０の端部にフィルター４１が密着されている。
【０００４】
このようなフィルタ−装置に用いられるフィルタ−は、一般に、円板状であり、材質はステンレス製焼結体などが用いられている。
【０００５】
特開平７−２６０７６３号公報には、充填剤が収納されたカラム本体のエンドフィティングフィルターとして、ステンレス鋼繊維を積層し、それを焼結した繊維焼結フィルターを用いた高速液体クロマトグラフィーカラムが提案されている。このフィルターが装着された液体クロマトグラフィーカラムを、生体試料の測定に用いると、フィルターに生体試料が吸着し、圧力が上昇し、連続して多数の試料を測定できないという問題があった。
【０００６】
また、クロマトグラフィー用カラムの製造方法の一つとして、管の内壁に、珪素化合物の溶液を通流し、ＣＬＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｑｕｉｄ Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）法により、不活性な二酸化珪素被膜を形成させ、この管内部に充填剤を充填する方法がある（特公平２−１３２６８号公報）。
【０００７】
液体クロマトグラフィーによる測定の一つとして、血液中の糖化ヘモグロビン、特にヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃという）が糖尿病診断の指標となるため広く測定されている。糖化ヘモグロビンとは血液中の糖がヘモグロビンと結合して生成したものである。溶血液試料中の糖化ヘモグロビンは、過去１〜２カ月間の血液中の平均的な糖濃度を反映するので溶血液中の糖化ヘモグロビンは、糖尿病の診断の指標となる。
【０００８】
このＨｂＡ１ｃの液体クロマトグラフィー法による測定は、主にカチオン交換液体クロマトグラフィー法により行われている（特公平８−７１９８号公報など）。溶血液試料をカチオン交換液体クロマトグラフィーにより分離すると、通常、ヘモグロビンＡ１ａ（以下、ＨｂＡ１ａという）及びヘモグロビンＡ１ｂ（以下、ＨｂＡ１ｂという）、ヘモグロビンＦ（以下、ＨｂＦという）、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ並びにヘモグロビンＡ０（以下、ＨｂＡ０という）などのピークに分画できる。なお、糖尿病の診断の指標として使用されているＨｂＡ１ｃは、上記のうちの安定型ＨｂＡ１ｃであり、全ヘモグロビンピークの面積に対する安定型ＨｂＡ１ｃピークの面積の比率（％）として求められている。
【０００９】
このＨｂＡ１ｃの液体クロマトグラフィー法による測定は、カラムとしてカチオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤（例えば、カルボキシル基やスルホン酸基を官能基として有する充填剤）が充填されたものを用い、ｐＨ５．０〜９．０の溶離液を用いて行われている。
【００１０】
この測定において、ステンレス焼結体からなるフィルターを用いると、該フィルターに生体試料が吸着し、圧力が上昇し、連続して多数の試料を測定できない、及び、分離性能に悪影響がでるという問題があった。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、生体試料の吸着が少なく、寿命が長く、分離性能に悪影響を与えない液体クロマトグラフィー用フィルター、該フィルターを用いることにより寿命が長く、分離性能に悪影響を与えない液体クロマトグラフィー用カラム及び該フィルター又はカラムを用いるヘモグロビン類の測定方法を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明の液体クロマトグラフィー用フィルターは、シリコーン被膜でコーティングされていることを特徴とする。
【００１３】
本発明で用いるシリコーン被膜でコーティングされる前のフィルターは、フィルターとしての強度と、孔を持つものであれば良く、特に限定されない。
上記フィルターの材質としては、例えば、ステンレス、アルミニウム、銅、チタン、ニッケル、鉄、クロム、スズ等の金属；ナイロン、フッ素樹脂、セルロース、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリプロピレン、ポリエチレン、アクリル樹脂、ポリエステル、ビニロン、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリエーテルエーテルケトン、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、ノリル樹脂等のプラスチック；セラミック；ガラスなどが挙げられる。
【００１４】
上記フィルターの材質として、好ましくは、シリコーン被膜との接着性が良い材質であり、例えば、ステンレス、アルミニウム、銅、ニッケル、鉄、クロム、スズ等の金属；ナイロン、アクリル樹脂、ポリエステル、ビニロン、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、ノリル樹脂等のプラスチック；セラミック；ガラスなどが挙げられる。
【００１５】
フィルターの形態は、メンブレンフィルター、繊維を積層し焼結したもの、濾紙状のもの、不織布など特に限定されない。
【００１６】
本発明で用いられるシリコーン被膜とは、シリコーンから得られる被膜であれば特に限定されない。上記シリコーンとしては、被膜を形成できるものであれば特に限定されず、例えば、オイル、ワニス、ゴム、シランなどの種類がある。好ましくは、硬化型シリコーンゴムである。シリコーン被膜を形成させる方法には、室温又は加熱して、図１１に示すようなベースポリマーと架橋剤（図１１におけるＸは、例えば、メトキシ基、ケトオキシム基、アセトキシ基のような加水分解性の有機基）を縮合、又は、付加反応、又は、ＵＶ硬化反応などさせる方法があり、いずれも用いることができる。好ましくは、縮合、又は、付加反応が良い。
【００１７】
シリコーン被膜の厚さは、好ましくは、０．１ｎｍ〜１００μｍ、より好ましくは、０．５ｎｍ〜１０μｍ、最も好ましくは、０．７ｎｍ〜２μｍである。
シリコーン被膜でフィルターをコーティングする場合、フィルター全体をコーティングする必要はなく、少なくともフィルターの孔部分がコーティングされていればよい。
フィルターの孔部分のコーティングの割合は、孔部分の全表面積に対して、好ましくは、１０％以上、より好ましくは、３０％以上、最も好ましくは、６０％以上である。
【００１８】
本発明のフィルターは、上記の液体クロマトグラフィー用フィルターが、更に、ブロッキング試薬でブロッキング処理されていることが好ましい。上記ブロッキング試薬としては、例えば、ウシ血清アルブミン、カゼイン、ゼラチン、ヘモグロビン、ミオグロビンなどの蛋白質；例えば、リン脂質等の極性脂質；例えば、ＳＤＳ、ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００）などの界面活性剤などが挙げられる。
【００１９】
本発明のフィルターの形状は、液体の流れを乱さない構造であれば、特に限定されない。例えば、図１に示すような、（イ）円柱状、（ロ）円錐状、（ハ）円錐台状の凸部を有するもの、（ニ）円錐状の凸部と円柱部分を組み合わせた形状、（ホ）円錐台状の凸部と円柱部分を組み合わせた形状、（ヘ）２つの円錐の、底面同士を接触したような形状が挙げられる。図１において、符号１は本発明の液体クロマトグラフィー用フィルター、符号２は必要に応じて使用されるシール部材である。上記凸部の位置は、液体流入側又は液体流出側のどちらでもよく、また上記の両側でもよい。
【００２０】
本発明のフィルターのサイズは、直径は１〜１０００ｍｍが好ましく、２〜５０ｍｍがより好ましい。厚さは０．１〜１００ｍｍが好ましく、０．２〜１０ｍｍがより好ましい。濾過孔径は、公知の孔径でよく、０．１〜２０μｍが好ましく、０．２〜１０μｍがより好ましい。
【００２１】
本発明のフィルターを製造するには、上記記載の金属フィルター、プラスチックフィルターなどに硬化型シリコーンを塗布、又はコーティングし、室温、又は、加温して硬化させる方法が挙げられる。
金属フィルター、プラスチックフィルターなどの製造方法は、公知の方法でよく、例えば、繊維状のもの、粉体状のものを積層し、焼結処理する方法やメンブレン状、濾紙状に加工する方法などが挙げられる。
また、特開平２−２６２０５４号公報に記載あるような濾過孔径の異なるフィルターを組み合わせてもよい。すなわち、溶液の流入側に濾過孔径の大きなものを使用し、溶液の流出側に濾過孔径の小さなものを使用して組み合わせる。このように、濾過孔径の異なるフィルターを組み合わせたものを製造するには、それぞれのフィルターを製造後、貼り合わせてもよいが、直径の太い繊維を液体の流入側に用い、直径の細い繊維を液体の流出側に用いて、積層した状態で型に入れて焼結するのが好ましい。積層数は、特に限定されないが、通常、２〜３層で必要に応じて増やしてもよい。
【００２２】
また、本発明のブロッキング試薬でブロッキング処理されているフィルターを製造するには、シリコーン被膜でコーティングされているフィルターに、濃度０．０１〜５重量％程度のブロッキング試薬溶液を通液すればよい。
【００２３】
本発明のフィルターの用途としては、液体クロマトグラフィーのラインフィルター、カラムの試料導入側及び試料導出側のフィルターなどがある。
【００２４】
本発明のフィルターをラインフィルターとして用いる場合について以下説明する。ラインフィルターは、フィルターがホルダー内に装着されて構成されている。本発明のフィルターがラインフィルター中に装着される態様は、従来の態様と同様である。
【００２５】
図２は、本発明のフィルターが装着されるホルダーの一例を示す断面図である。ホルダー３は半体３ａ及び３ｂからなり（図２に矢印で示したように、半体３ａ側を液体流入側とし、半体３ｂ側を液体流出側とする）、半体３ａには内面の一部に雌ねじが設けられており、半体３ｂにはその外周面に上記雌ねじに螺合する雄ねじが設けられている。各半体３ａ及び３ｂは、液体の通流方向に並設されている。半体３ａの内部には、それぞれ開口部が相互に対向するように形成された円柱状の空間部３１ａと円錐状の空間部３２ａが設けられ、更に、該空間部３２ａの先端には薄い円板状の空間部３３ａが設けられており、また、円柱状の空間部３１ａを形成している部分の半体３ａの内面には雌ねじが設けられ、この雌ねじに溶離液などの液体が通流するための配管がネジ止めされ得るようにされている。また、半体３ｂの内部にも、それぞれ開口部が相互に対向するように形成された円柱状の空間部３１ｂと円錐状の空間部３２ｂが設けられ、円柱状の空間部３１ｂを形成している部分の半体３ｂの内面には雌ねじが設けられ、この雌ねじに液体が通流するための配管がネジ止めされ得るようにされている。
【００２６】
上記円錐状の空間部３２ａ及び３２ｂの円錐の頂角Ａは、試料をフィルター全体に導くことによりフィルター全体で濾過されるようにし、しかも、試料の拡散を最小に抑える大きさであることが好ましい。上記頂角Ａは、９０度よりも小さくなると、空間部が大きくなり、試料の拡散が起こり易くなり、１７９度よりも大きくなると、更に、空間部が大きくなり、試料の拡散が起こり易くなるので、９０〜１７９度が好ましく、１００〜１７０度がより好ましい。
【００２７】
ホルダー３の形状は、例えば、円柱状、立方体状など特に限定されない。
【００２８】
また、ホルダー３は、フィルター交換時に工具を使う必要がないように、図３に示すように、半体３ａと３ｂの外周面を、それぞれ円筒形の被覆部３４ａと３４ｂで被覆することにより、ホルダーの大きさを大きくして、手で十分締められるようにしてもよい。
【００２９】
ホルダーの材質としてはステンレス等の金属；ポリエチレン、ポリエーテルエーテルケトン、フッ素樹脂、ポリエーテルエーテルケトンとフッ素樹脂の混合物等のプラスチックなどが挙げられるが、生体試料の吸着が少ないポリエーテルエーテルケトンやフッ素樹脂が好ましい。また、生体試料の吸着が起こり易い材質のもの、例えば、ステンレスのようなものは、シリコーン被膜でコーティングしてもよい。
【００３０】
図４は、本発明のフィルター１がホルダー３内に装着されて構成されているラインフィルター５の断面図である。ラインフィルター５においては、ホルダー３の半体３ａの薄い円板状の空間部３３ａに本発明のフィルター１が収められている。
【００３１】
ホルダー３とフィルター１との間の気密性を十分保てない場合は、ホルダー３とフィルター１の間にシール部材２を設ける必要がある。具体的には、ホルダー３とフィルター１の間に隙間ができないように、図５（イ）、（ロ）に示すように、フィルター１をシール部材２で囲む方法がある。
【００３２】
上記シール部材の材質は、フィルターを保持できる強度を有するものであれば特に限定されず、例えば、ポリエーテルエーテルケトン、フッ素樹脂、ポリエーテルエーテルケトンとフッ素樹脂の混合物、ステンレスなどが挙げられる。シール部材の大きさ及び形状については、フィルターの形状にフィットした形状が好ましく、しかも、試料の拡散を起こさない大きさ及び形状が好ましい。
【００３３】
本発明の液体クロマトグラフィー用カラムは、本発明の液体クロマトグラフィー用フィルターが装着されたことを特徴とする。以下、本発明の液体クロマトグラフィー用カラムについて説明する。
【００３４】
本発明の液体クロマトグラフィー用カラムは、本発明のフィルターがカラムの試料導入側及び試料導出側のフィルターとして装着されている。すなわち、本発明の液体クロマトグラフィー用カラムは、図６に示すように、フィルター１として本発明のフィルターが装着されている他は、図８に示した従来の液体クロマトグラフィー用カラムと同様である。
【００３５】
本発明のフィルター及びカラムは、生体試料の吸着が特に少ない。従って、本発明のフィルター又はカラムを用いた液体クロマトグラフィーは、生体試料の分離に特に適している。上記生体試料とは、血液、血清、血漿、尿などの生体由来の試料を指し、その中には、蛋白質や脂質などが含まれているものである。
【００３６】
本発明のフィルターを用いた液体クロマトグラフィー用カラムにおいて、カラム本体（カラムの管部分）の材質は、カラム本体としての強度を有するものであれば特に限定されず、例えば、ステンレス、チタン等の金属；ポリエーテルエーテルケトン等のプラスチック；ガラス；ステンレス等の金属の内面をフッ素樹脂又はポリエーテルエーテルケトン等で被覆したものなどが挙げられる。
【００３７】
上記カラム本体は、必要に応じて、シリコーン被膜でコーティングされてもよい。この場合に用いられるシリコーン被膜、およびシリコーン被膜の厚さは、フィルターに用いられるシリコーン被膜として前述したものと同様である。
【００３８】
上記シリコーン被膜でカラム本体をコーティングする場合、カラム本体全体をコーティングする必要はなく、少なくとも分析試料が接触する部分（すなわち、カラム本体内側）がコーティングされていればよい。
カラム本体内側のコーティングの割合は、内側部の全表面積に対して、好ましくは、１０％以上、より好ましくは、３０％以上、最も好ましくは、６０％以上である。
【００３９】
上記のシリコーン被膜でコーティングされたカラム本体を製造するには、上記記載のカラム本体に硬化型シリコーンを塗布、又はコーティングし、室温、又は、加温して硬化させる方法が挙げられる。
【００４０】
また、上記カラム本体は、必要に応じて、ブロッキング試薬でブロッキングされてもよい。上記ブロッキング試薬及びブロッキング方法としては、フィルターに用いられるブロッキングとして前述したものと同様である。
【００４１】
本発明のフィルターを用いた液体クロマトグラフィーにおいて、溶離液などの移動相は、公知のものでよい。また、液体クロマトグラフ装置も公知のものでよい。
【００４２】
本発明のカラムを用いた液体クロマトグラフィーにおいて、溶離液などの移動相は、公知のものでよく、また、液体クロマトグラフ装置も公知のものでよい。
【００４３】
本発明の請求項６記載のヘモグロビン類の測定方法は、本発明の液体クロマトグラフィー用フィルターを用いることを特徴とする。
【００４４】
本発明の請求項７記載のヘモグロビン類の測定方法は、本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを用いることを特徴とする。
【００４５】
【作用】
本発明のフィルターは、シリコーン被膜でコーティングされているので、生体試料の吸着が起こりにくいため、フィルター寿命が長く、また、同様に、試料の吸着が少ないので、フィルター中で試料の拡散が起こりにくいため、分離性能に悪影響を与えない。
更に、ブロッキング試薬でブロッキング処理されているフィルターにおいては、上記の作用の全てを奏すると共に、更に、より一層、生体試料の吸着が起こりにくいため、生体試料の液体クロマトグラフ測定に使用すると、測定の最初から正確な測定値を得ることができる。
【００４６】
本発明のカラムは、本発明のフィルターを装着しているので、寿命が長く、分離性能に悪影響を与えない。
【００４７】
本発明の請求項６記載のヘモグロビン類の測定方法は、本発明の液体クロマトグラフィー用フィルターを用いているため、ヘモグロビン類がフィルターに吸着しにくいので、フィルター寿命が長い。また、同様に、ヘモグロビン類がフィルターに吸着しにくいので、フィルター中でのヘモグロビン類の拡散が少なくヘモグロビン類の分離性能に悪影響を与えない。また、ヘモグロビン類の分離に適したｐＨ範囲において、ヘモグロビン類の吸着が非常に起こりにくいので、ヘモグロビン類の分離性能に悪影響を与えない。
【００４８】
本発明の請求項７記載のヘモグロビン類の測定方法は、本発明の液体クロマトグラフィー用フィルターを用いたカラムを用いるので、ヘモグロビン類が吸着しにくいため、カラム寿命が長い。また、同様に、フィルターにヘモグロビン類が吸着しにくいので、カラム中でヘモグロビン類の拡散が少なく、ヘモグロビン類を効果的に分離できる。また、ヘモグロビン類の分離に適したｐＨ範囲において、ヘモグロビン類の吸着が非常に起こりにくいので、ヘモグロビン類が効果的に分離できる。
【００４９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施例及び比較例を挙げることにより、本発明を詳細に説明する。
【００５０】
（実施例１）
図１（イ）に示した形状のフィルターをステンレス焼結体の一体成形品として製造した。その構造の詳細は、直径５ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱体からなり、濾過孔径は２μｍとした。次に、コーティング剤として、２液型硬化型シリコーンを用い、上記ステンレス製フィルター全体をシリコーンコーティングした（濾過孔の中は、コーティング剤を通液した）。その後、１００℃で３０分間加熱して乾燥・硬化させ、均一なコーティング層を形成させ、本発明のフィルター１を得た。
次に、このフィルター１をフッ素樹脂（テフロン）製のシール部材２に挿入した後、図４に示すように、ステンレス製ホルダー３（頂角Ａ＝９０度）に嵌め込み、半体３ａ及び３ｂ同士をネジ結合して、ラインフィルター５を作製した。
【００５１】
（実施例２）
実施例１と同様にして得られた本発明のフィルター１をフッ素樹脂（テフロン）製のシール部材２に挿入した後、ポリエーテルエーテルケトン製のホルダー３（頂角Ａ＝１５０度）に嵌め込み、半体３ａ及び３ｂ同士をネジ結合して、ラインフィルター５を作製した。
【００５２】
（比較例１）
図１（イ）に示したフィルターを、ステンレス焼結体の一体成形品として製造した。その構造の詳細は、直径５ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱体からなり、濾過孔径は２μｍとした。
次に、このフィルターをフッ素樹脂（テフロン）製のシール部材２に挿入した後、ステンレス製ホルダー３（頂角Ａ＝９０度）に嵌め込み、半体３ａ及び３ｂ同士をネジ結合して、ラインフィルター５を作製した。
【００５３】
（比較例２）
図１（イ）に示した形状のフィルターをステンレス焼結体の一体成形品として製造した。その構造の詳細は、直径５ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱体からなり、濾過孔径は２μｍとした。
次に、従来の技術の項に記載したＣＬＤ法により、二酸化珪素被膜をフィルターに形成させる処理をした。具体的には、日本曹達社製アトロンをＨＰＬＣ用ポンプ（島津製作所社製）を用いて、上記フィルターの内部まで通液した後、余剰の液をフィルター内部から除去した。その後、２００℃で３０分間乾燥し、次に、５００℃で３０分間加熱し、二酸化珪素被膜を形成させた。
次に、このフィルターをフッ素樹脂（テフロン）製のシール部材２に挿入した後、ポリエーテルエーテルケトン製ホルダー３（頂角Ａ＝１５０度）に嵌め込み、半体３ａ及び３ｂ同士をネジ結合して、ラインフィルター５を作製した。
【００５４】
実施例１、２及び比較例１、２で得られたラインフィルターを用いて以下のようにして、（１）吸着性の評価、及び（２）生体試料の吸着性とｐＨ（ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０）の関係の評価を行った。
【００５５】
（１）吸着性の評価
以下に示した測定条件を用い、実施例１、２又は比較例１、２で作製したラインフィルターのみを用いて（すなわち、カラムは使用せず）、ヘモグロビン類の測定をすることにより、生体試料の吸着性について検討した。
測定条件
システム：送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）
オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学社製）
検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
溶離液：溶離液Ａ：１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）
溶離液Ｂ：３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）
測定開始より０〜３分の間は溶離液Ａを流し、３〜５分の間は溶離液Ｂを流し、５〜１０分の間は溶離液Ａを流した。
流速：２．０ｍｌ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μｌ
【００５６】
測定試料
以下のようにして調製した糖負荷血液を用いた。
血液抗凝固剤としてフッ化ナトリウムを用いて採血した健常人血に、５００ｍｇ／ｄｌとなるようグルコース水溶液を添加し、３７℃で３時間反応させた後、溶血希釈液Ｘ（０．１重量％トリトンＸ−１００のリン酸緩衝液溶液、ｐＨ７．０）で溶血し、１５０倍に希釈して測定試料とした。
【００５７】
測定結果
上記測定条件により、測定試料を測定して得られた代表的なクロマトグラムを図９（イ）（ラインフィルター使用せず）、図９（ロ）（実施例１又は２のラインフィルター使用）、図９（ハ）（比較例１又は２のラインフィルター使用）に示した。ピーク６１はヘモグロビン類のピークを示す（なお、カラムで分離されていないので単一のピークとなっている）。ピーク６２は、溶離液Ａではフィルタに吸着したヘモグロビン類が溶離液Ｂによって脱着したために表れたピークと思われる。
【００５８】
評価方法
ラインフィルターを装着せずに、測定試料を測定したときのヘモグロビン類のピーク面積を１００％として、実施例１、実施例２、比較例１、比較例２のラインフィルターを用いて測定（ｎ＝５）したときのヘモグロビン類のピーク面積（ピーク６１の面積）から、以下の式により溶離液Ａによる回収率を求め、結果を表１に示した。
回収率（％）＝（ラインフィルター装着時のヘモグロビン類のピーク面積）÷（ラインフィルター装着なし時のヘモグロビン類のピーク面積）×１００
【００５９】
【表１】
比較例１、２では、回収率の平均値がそれぞれ５６．４０％、５８．８０％であったのが、実施例１及び２では、回収率の平均値がそれぞれ９７．８４％、９８．１２％であった。以上より、実施例１及び２のラインフィルターを用いたものでは、比較例１及び２のラインフィルターを用いたものに比べてヘモグロビン類の吸着が少なかったことがわかる。
【００６１】
また、表１（及び後述の表２）における、ＣＶ（％）とは変動係数（すなわち、ＣＶ（％）＝標準偏差÷平均値×１００）のことであるが、比較例１、２のラインフィルターを用いたものは、実施例１又は２のラインフィルターを用いたものに比較してＣＶがはるかに大きく、ヘモグロビン類の吸着量のばらつきが大きいことが分かる。
【００６２】
（２）生体試料の吸着性とｐＨの関係の評価
以下に示した測定条件を用い、実施例１、２又は比較例１、２で作製したラインフィルターのみを用いて（すなわち、カラムは使用せず）、ヘモグロビン類の測定をすることにより、生体試料の吸着性とｐＨ（ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０）の関係を評価した。
【００６３】
測定条件
システム：送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）
オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学社製）
検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
溶離液：溶離液Ａ：１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０）
溶離液Ｂ：３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）
測定開始より０〜３分の間は溶離液Ａを流し、３〜５分の間は溶離液Ｂを流し、５〜１０分の間は溶離液Ａを流した。
流速：２．０ｍｌ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μｌ
【００６４】
測定試料
血液抗凝固剤としてフッ化ナトリウムを用いて採血した健常人血を、溶血希釈液Ｘ（０．１重量％トリトンＸ−１００のリン酸緩衝液溶液、ｐＨ７．０）で溶血し、１５０倍に希釈して測定試料とした。
【００６５】
評価方法
ラインフィルターを装着せずに、測定試料を測定したときのヘモグロビン類のピーク面積を１００％として、実施例１、実施例２、比較例１又は比較例２で得られたラインフィルターを用いて測定（ｎ＝５）したときのヘモグロビン類のピーク面積から、以下の式により溶離液Ａによる回収率を求め、結果を表２及び表３に示した。
回収率（％）＝（ラインフィルター装着時のヘモグロビン類のピーク面積）÷（ラインフィルター装着なし時のヘモグロビン類のピーク面積）×１００
【００６６】
【表２】
【表３】
比較例１では、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０での回収率がそれぞれ平均１３．５６％、７６．５２％、９１．９８％であった。比較例２では、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０での回収率がそれぞれ平均２４．６６％、７７．０４％、９１．７０％であった。また、ＣＶ％は、比較例１、２でｐＨが低くなるほど悪くなり、ｐＨ５．０で、それぞれ３７．２７％、１２．２１％であった。
実施例１では、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０での回収率がそれぞれ平均９７．２４％、９７．８８％、９７．８４％であった。
実施例２では、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０での回収率がそれぞれ平均９８．０２％、９８．４２％、９８．５６％であった。
また、実施例１及び実施例２でのＣＶ％は、いずれのｐＨにおいても、１％以下であった。
【００６９】
以上より、比較例１のシリコーンコーティングしていないステンレス製フィルターではヘモグロビン類の吸着性は、ｐＨの影響を非常に強く受けることが明らかになった。また、ヘモグロビン類の定量には、通常、ｐＨ５〜９程度の溶離液を用いるのが一般的であるので、シリコーンコーティングしていないステンレス製フィルターではヘモグロビン類の吸着が極めて大きくなり、吸着率も大きくばらつくので、シリコーンコーティングしていないステンレス製フィルターをヘモグロビン類の測定に用いるとフィルター寿命が短くなり、データーのばらつく原因になると考えられる。また、比較例２のように、ステンレス製フィルターを二酸化珪素膜で被覆してもヘモグロビン類の吸着性は改善されなかった。
実施例１及び実施例２のシリコーンコーティングしたステンレス製フィルターでのヘモグロビン類の吸着性は、ｐＨ９．０から酸性側５．０付近までのｐＨの影響を受けず、回収率もほぼ１００％であった。
以上より、ヘモグロビン類の測定に用いるフィルターとしては、広いｐＨの範囲でヘモグロビン類の吸着が殆どないシリコーンコーティングしたフィルターを用いた方がよいことが明らかである。
【００７０】
（実施例３）
図１（イ）に示したフィルターを、ステンレス焼結体の一体成形品として製造した。その構造の詳細は、直径４．６ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱体からなり、濾過孔径は２μｍとした。次に、コーティング剤として、２液型硬化型シリコーンを用い、上記ステンレス製フィルター全体をシリコーンコーティングした（濾過孔の中は、コーティング剤を通液した）。その後、１００℃で３０分間加熱して乾燥・硬化させ、均一なコーティング層を形成させ、本発明のフィルター１を得た。
次に、このフィルター１をフッ素樹脂（テフロン）製のシール部材２（外径６．３ｍｍ、内径４．６ｍｍ、厚さ１．５ｍｍ）に挿入した後、これを図６に示したステンレス製カラム本体４０（内径４．６ｍｍ、長さ３５ｍｍ）のカラム両端に取り付けるためのエンドフィッティング４２に装着した。
【００７１】
上記のカラム本体４０に、以下のようにして調製した充填剤を、以下に示すカラムの作製の項で述べるようにして充填して、本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
・充填剤の調製
テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）４００ｇ及び２−アクリルアミド−２−メチルスルホン酸（和光純薬社製）１５０ｇの混合物にベンゾイルパーオキサイド（重合開始剤、和光純薬社製）１．５ｇを溶解した。これを、４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液２５００ｍｌに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で７５℃に昇温し、８時間重合した。重合後、洗浄し、乾燥した後、分級して平均粒径６μｍの粒子を得た。
・カラムの作製
カラム１本あたり、上記充填剤１．０ｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）３０ｍｌに分散し、５分間超音波処理した後、よく攪拌した。全量を上記のステンレス製カラム本体４０（内径４．６φ×３５ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカー（梅谷精機社製）に送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、上記充填剤を上記ステンレス製カラム本体４０に圧力３００ｋｇ／ｃｍ2 で定圧充填した後、エンドフィッティング４２とカラム本体４０を螺合して本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
【００７２】
（実施例４）
実施例３と同様にして本発明のフィルター１を得た。
一方、図６に示したステンレス製カラム本体４０（内径４．６ｍｍ、長さ３５ｍｍ）に、上記実施例３においてフィルターにコーティングした方法と同様の方法で、シリコーンコーティングした。
次に、上記のフィルター１をフッ素樹脂（テフロン）製のシール部材２（外径６．３ｍｍ、内径４．６ｍｍ、厚さ１．５ｍｍ）に挿入した後、これを上記のシリコーンコーティングしたカラム本体４０（内径４．６ｍｍ、長さ３５ｍｍ）のカラム両端に取り付けるためのエンドフィッティング４２に装着した。
【００７３】
上記のシリコーンコーティングしたカラム本体に、実施例３と同様にして調製した充填剤を、実施例３と同様にして充填して、本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
【００７４】
（比較例３）
実施例３における、ステンレス焼結体の一体成形品として製造したフィルターを、シリコーンコーティングしなかったことの他は、実施例３と全く同様にして液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
【００７５】
（比較例４）
図１（イ）に示したフィルターを、ステンレス焼結体の一体成形品として製造した。その構造の詳細は、直径４．６ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱体からなり、濾過孔径は２μｍとした。
次に、従来の技術の項に記載したＣＬＤ法により、二酸化珪素被膜をフィルター及びカラム本体に形成させる処理をした。具体的には、日本曹達社製アトロンをＨＰＬＣ用ポンプ（島津製作所社製）を用いて、上記フィルターの内部まで通液した後、余剰の液をフィルター内部から除去した。その後、２００℃で３０分間乾燥し、次に、５００℃で３０分間加熱し、二酸化珪素被膜を形成させた。
また、カラム本体は、上記アトロンに浸し、その後、２００℃で３０分間乾燥し、次に、５００℃で３０分間加熱し、二酸化珪素被膜を形成させた。
次に、このフィルター１をフッ素樹脂（テフロン）製のシール部材２（外径６．３ｍｍ、内径４．６ｍｍ、厚さ１．５ｍｍ）に挿入した後、これを上記の二酸化珪素被膜を形成させたステンレス製カラム本体（内径４．６ｍｍ、長さ３５ｍｍ）のカラム両端に取り付けるためのエンドフィッティング４２に装着した。
【００７６】
上記の二酸化珪素被膜を形成させたカラム本体に、実施例３と同様にして調製した充填剤を、実施例３と同様にして充填して（フィルターは、上記の二酸化珪素被膜を形成させたフィルターを用いた）、液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
【００７７】
実施例３、４及び比較例３、４で得られた液体クロマトグラフィー用カラムを用いて以下のようにして、ヘモグロビン類の測定を行うことにより、該カラムの分離性能に与える評価を行った（なお、ラインフィルターは用いなかった）。
測定条件
得られたカラムを以下の液体クロマトグラフに取り付けた後、以下の測定を行った。
システム：送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）
オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学社製）
検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
溶離液：溶離液Ａ：１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）
溶離液Ｂ：３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）
測定開始より０〜５分の間は溶離液Ａを流し、５〜６分の間は溶離液Ｂを流し、６〜１０分の間は溶離液Ａを流した。
流速：１．６ｍｌ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μｌ
【００７８】
測定試料
実施例１の（１）吸着性の評価の項で用いた測定試料と同様の方法で調製したもの。
【００７９】
測定結果
上記測定条件により、試料を測定して得られたクロマトグラムを図１０（イ）（実施例３又は４の液体クロマトグラフィー用カラムを用いたもの）、図１０（ロ）（比較例３又は４の液体クロマトグラフィー用カラムを用いたもの）に示した。ピーク５１はＨｂＡ１ａ及びＨｂＡ１ｂ、ピーク５２はＨｂＦ、ピーク５３は不安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク５４は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク５５はＨｂＡ０を示す。この結果、実施例３又は４の液体クロマトグラフィー用カラムを用いたものでは、比較例３又は４の液体クロマトグラフィー用カラムを用いたものに比較して分離性能に優れていることが分かる。
【００８０】
（実施例５）
実施例３で得られたシリコーンコーティングしたフィルター１に、０．１重量％ヘモグロビン水溶液を通液し、ブロッキング処理した。このフィルターを用いたこと以外は、実施例３と同様にして本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
【００８１】
（実施例６）
実施例３で得られたシリコーンコーティングしたフィルター１に、０．１重量％ウシ血清アルブミン水溶液を通液し、ブロッキング処理した。
一方、図６に示したステンレス製カラム本体４０（内径４．６ｍｍ、長さ３５ｍｍ）に、上記実施例３においてフィルターにコーティングした方法と同様の方法で、シリコーンコーティングした。
このフィルター及びカラム本体を用いたこと以外は、実施例３と同様にして本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
【００８２】
（比較例５）
図１（イ）に示したフィルターを、ポリエーテルエーテルケトンの一体成形品として製造した。その構造の詳細は、直径４．６ｍｍ、厚さが１．５ｍｍの円柱体からなり、濾過孔径は２μｍとした。このフィルターを用いたこと以外は、実施例３と同様にして液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
【００８３】
実施例３、５、６及び比較例３、５で得られた液体クロマトグラフィー用カラムを用いて、実施例３と同様にして、ヘモグロビン類の測定を行うことにより、該カラムの分離性能に与える評価を行った。
【００８４】
測定試料
健常人血液を溶血したものであって、後述の定義による安定型ＨｂＡ１ｃ濃度が４．５％であるものを用いた。
【００８５】
測定結果
試料を５回連続して測定し、得られたクロマトグラムから、以下の式で定義される安定型ＨｂＡ１ｃ濃度を求め、測定回数と安定型ＨｂＡ１ｃ濃度の関係を表４に示した。
安定型ＨｂＡ１ｃ濃度（％）＝（安定型ＨｂＡ１ｃピークの面積）÷（全ヘモグロビンピークの面積の和）×１００
【００８６】
【表４】
比較例３のカラムでは、安定型ＨｂＡ１ｃ濃度は、測定１回目から５回目にかけて、３．５％から３．９％に上昇した。比較例５のカラムでは、安定型ＨｂＡ１ｃ濃度は、測定１回目から５回目にかけて、３．９％から４．３％に上昇した。すなわち、これらのカラムでは、測定初期では正確な値が得られないことがわかる。
一方、実施例３のカラムでは、測定１回目〜３回目までは安定型ＨｂＡ１ｃ濃度は４．４％であったが、測定４回目と５回目では、４．５％となり、正確な値が得られた。更に、ブロッキングしたフィルターを用いた実施例５及び６のカラムでは、測定１回目から安定型ＨｂＡ１ｃ濃度は４．５％と正確な値が得られた。
【００８８】
【発明の効果】
本発明の液体クロマトグラフィー用フィルターの構成は、上記の通りであり、生体試料の吸着がおこりにくいシリコーン被膜でコーティングされているので、フィルター性能の寿命が長く、しかも、試料の吸着が少ないので、フィルター中で試料拡散が起こりにくいため、分離性能に悪影響を与えない。
【００８９】
本発明の請求項２記載の液体クロマトグラフィー用フィルターの構成は、上記の通りであり、生体試料の吸着がおこりにくいシリコーン被膜でコーティングされており、更に、ブロッキング試薬でブロッキング処理されているので、上記の効果の全てを奏すると共に、更に、より一層、生体試料の吸着が起こりにくいため、生体試料の液体クロマトグラフ測定に使用すると、測定の最初から正確な測定値を得ることができる。
【００９０】
本発明の請求項３記載の液体クロマトグラフィー用カラムの構成は、上記の通りであり、生体試料の吸着がおこりにくいシリコーン被膜でコーティングされているフィルターを用いているので、寿命が長く、分離性能に悪影響を与えない。
【００９１】
本発明の請求項４記載の液体クロマトグラフィー用カラムの構成は、上記の通りであり、生体試料の吸着がおこりにくいシリコーン被膜でコーティングされているフィルター及びカラム本体を用いているので、より寿命が長く、より分離性能に悪影響を与えない。
【００９２】
本発明の請求項５記載の液体クロマトグラフィー用カラムの構成は、上記の通りであり、更に、カラム本体がブロッキング試薬でブロッキング処理されているので、請求項３又は４記載のカラムの効果に加えて、測定の最初からより正確な測定値を得ることができる。
【００９３】
本発明の液体クロマトグラフィー用フィルターを用いるヘモグロビン類の測定方法は、広いｐＨの範囲でヘモグロビン類の吸着が少ないシリコーン被膜でコーティングされたフィルターを用いているので、フィルターの寿命が長い。そのため、フィルターの交換頻度がきわめて少なくなる。また、ヘモグロビン類の吸着が少ないフィルターを用いているので、ヘモグロビン類分析の分離性能に悪影響を与えない。
【００９４】
本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを用いるヘモグロビン類の測定方法は、広いｐＨの範囲でヘモグロビン類の吸着が少ないシリコーン被膜でコーティングされたフィルターを用いたカラムを用いているので、カラムーの寿命が長い。また、ヘモグロビン類の吸着が少ないフィルターを用いているので、カラム中でのヘモグロビン類の拡散が起こりにくいためヘモグロビン類分析の分離性能に悪影響を与えない。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の液体クロマトグラフィー用フィルターの例を示す断面図。
【図２】本発明のフィルターが装着されるホルダーの一例を示す断面図。
【図３】本発明のフィルターが装着されるホルダーの他の例を示す断面図。
【図４】本発明のフィルターがホルダー内に装着されて構成されているラインフィルターの断面図。
【図５】本発明の液体クロマトグラフィー用フィルターを示す図であり、図５（イ）はその断面図。図５（ロ）は平面図。
【図６】本発明の液体クロマトグラフィー用カラムを示す断面図。
【図７】液体クロマトグラフのシステムの構成を示す説明図。
【図８】従来の液体クロマトグラフィー用カラムを示す断面図。
【図９】測定試料を測定して得られたクロマトグラム。
【図１０】測定試料を測定して得られたクロマトグラム。
【図１１】シリコーン被膜を形成させるための反応の例を示す図。
【符号の説明】
１ 液体クロマトグラフィー用フィルター
２ シール部材
３ ホルダー
３ａ、３ｂ 半体
３１ａ、３１ｂ 円柱状の空間部
３２ａ、３２ｂ 円錐状の空間部
３３ａ 円板状の空間部
３４ａ、３４ｂ 被覆部
５ ラインフィルター
Claims (7)
- 架橋シリコーン被膜でコーティングされていることを特徴とする液体クロマトグラフィー用フィルター。
- 請求項１記載の液体クロマトグラフィー用フィルターが、更に、ブロッキング試薬でブロッキング処理されていることを特徴とする液体クロマトグラフィー用フィルター。
- シリコーン被膜でコーティングされている液体クロマトグラフィー用フィルターが装着されたことを特徴とする液体クロマトグラフィー用カラム。
- 更に、カラム本体がシリコーン被膜でコーティングされていることを特徴とする請求項３記載の液体クロマトグラフィー用カラム。
- 更に、カラム本体がブロッキング試薬でブロッキング処理されていることを特徴とする請求項４記載の液体クロマトグラフィー用カラム。
- 請求項１又は２記載の液体クロマトグラフィー用フィルターを用いることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法。
- 請求項３〜５のいずれかに記載の液体クロマトグラフィー用カラムを用いることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法。
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