CN105295447A

CN105295447A - 硅基材料表面生物功能化的方法

Info

Publication number: CN105295447A
Application number: CN201510594737.5A
Authority: CN
Inventors: 程昉; 王汉奇; 孙世猷; 李明洋; 孙蔷; 陆安慧; 曲景平; 彭伟
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2015-09-17
Filing date: 2015-09-17
Publication date: 2016-02-03

Abstract

本发明公开一种硅基材料表面生物功能化的方法，并公开以该方法所制备的功能化硅基材料。所述的方法是以二乙烯基砜连接由巯基/氨基硅烷偶联剂表面改性的羟基化硅基材料与生物分子的方法。该方法使用商业化的巯基/氨基硅烷偶联剂和二乙烯基砜为偶联试剂，无需前处理，可操作性强、重现性高、适用性广；乙烯基砜可以和巯基、氨基、羟基反应，适用生物分子具有广谱性；涉及的反应均在水溶液中进行，条件温和、环境友好；是一种潜力巨大的广谱性硅基材料表面生物功能化方法。

Description

硅基材料表面生物功能化的方法

技术领域

本发明涉及一种硅基材料表面生物功能化的方法及应用，尤其涉及一种基于天然生物分子对无机硅材料表面生物活性与惰性功能化的方法及其应用。

技术背景

硅基材料作为一种价格低，种类多，用途广，稳定性高，可加工性强的材料，在我们日常生活和科研中随处可见，如单晶硅，玻璃，光纤等，被广泛应用于航空航天、电子电气、建筑、运输、能源、化工、纺织、食品、轻工、医疗、农业等行业。另一方面，硅基材料在生理条件下有良好稳定性和生物相容性，使其在细胞培养、生物芯片、药物输送、抗垢材料等生物医药领域发展出广泛的应用。

在生物医药领域的应用中，通常需要对硅基材料进行生物修饰，使其具备应用所需的生物功能。常用的生物修饰方法主要包括两种，一种是通过氨基硅烷改性后用丁二酸酐引入羧基，利用琥珀酰亚胺活化羧基引入生物分子，但是这种方法仅适用于含有氨基的生物分子，且生物分子偶联率低。另一种方法是通过特定的硅烷偶联试剂，如卤代硅烷偶联剂，环氧基硅烷偶联剂等引入一定的化学官能团，实现生物分子固定，但是这种方法反应专一性高，而且反应过程中需要加热或者加入金属催化剂，可能造成生物分子失活。因此一种反应条件温和、具有广谱适用性的硅基材料生物功能化方法对于硅基材料在生物医药领域的应用有着很大的推动作用。

近些年研究发现乙烯基砜基团在温和条件下能与巯基、氨基和羟基反应，是一种很有潜力的生物分子偶联剂。硅基材料的硅烷偶联剂改性作为一种常用的硅基材料表面改性方法已经被广泛使用，选用两端均含有乙烯基砜基团的分子即可以将生物分子与硅基材料偶联，实现生物分子的化学固定，从而实现硅基材料的生物功能化。

发明内容

本发明旨在提供一种硅基材料表面生物功能化的方法以及由所述方法制得的表面功能化硅基材料，所述的方法是以二乙烯基砜连接由巯基/氨基硅烷偶联剂表面改性的羟基化硅基材料与生物分子的方法。

本发明利用乙烯基砜基团在一定条件下能与巯基、氨基和羟基反应的特性，以二乙烯基砜为偶联剂，在巯基/氨基改性的硅基材料表面引入生物分子，实现材料的生物活性或惰性功能化。该方法使用商业化的巯基/氨基硅烷偶联剂和二乙烯基砜为偶联试剂，无需前处理，可操作性强、重现性高、适用性广；乙烯基砜可以和巯基、氨基、羟基反应，适用生物分子具有广谱性；涉及的反应均在水溶液中进行，条件温和、环境友好；是一种潜力巨大的广谱性硅基材料表面生物功能化方法。

附图说明

本发明附图5幅，其中：

图1：HCG功能化光纤探针对不同浓度HCG抗体与BSA溶液的响应情况。

图2：BSA-HRP和PNA-HRP在乳糖糖基化和未处理玻璃片上的吸附情况。

图3.BSA-HRP和PNA-HRP在乳糖糖基化和未处理玻璃微载体上的吸附情况。

图4.BSA-HRP在半胱氨酸功能化和未处理硅片上的吸附情况。

图5.赖氨酸功能化硅纳米球(●)和未处理硅纳米球(■)在BSA(a)和NBS(b)溶液中水力学直径的变化。

具体实施方式

本发明公开一种以二乙烯基砜连接由巯基/氨基硅烷偶联剂表面改性的羟基化硅基材料与生物分子的硅基材料表面生物功能化的方法。

本发明的硅基材料表面生物功能化的方法中，所述的生物分子是含有巯基、氨基和/或羟基的生物分子；优选含有巯基和/或氨基的生物分子。所述的生物分子选自氨基酸，多肽，蛋白质或糖。优选氨基酸，多肽和蛋白质。更为优选的，本发明所述的生物分子选自含有巯基和/或氨基的氨基酸，多肽或蛋白质。

本发明的硅基材料表面生物功能化的方法中，所述的硅基材料是无机硅材料。具体是指具有硅或氧化硅材料表面，包括但不限于硅片，光纤，玻璃，硅纳米材料，以及以硅或氧化硅材料为包层的材料。

较为具体地，本发明的硅基材料表面生物功能化的方法可描述为：二乙烯基砜反应单元先与硅基材料反应单元和生物分子反应单元中之一反应，所得反应物再与其余一种进行反应；所述的二乙烯基砜反应单元是体积浓度为1～20％(优选5～15％)的二乙烯基砜溶液，溶剂为水或体积浓度5～20％的丙酮-水溶液；所述的硅基材料反应单元是巯基/氨基硅烷偶联剂改性的羟基化硅基材料；所述的生物分子反应单元是生物分子的水溶液。

具体的实施方式之一，所述的方法包括如下步骤：

(1)以巯基/氨基硅烷偶联剂对羟基化硅基材料进行表面改性。

(2)将表面改性的羟基化硅基材料置于二乙烯基砜溶液中，0～40℃保持1～16小时后取出，用水和乙醇清洗；

(3)将二乙烯基砜活化的硅基材料置于生物分子的水溶液中，0～40℃保持2～16小时后取出，用去离子水冲洗。

另一具体的实施方式，所述的方法包括如下步骤：

(1)以巯基/氨基硅烷偶联剂对羟基化硅基材料进行表面改性；

(2)二乙烯基砜与生物分子混合，0～40℃反应2～16小时；

(3)将表面改性硅基材料置于步骤(2)的混合溶液中，0～40℃保持1～16小时后取出，用水和乙醇清洗。

上述本发明的硅基材料表面生物功能化的方法的任意实施方式中，所述的硅基材料反应单元参与的反应中，反应温度0～40℃，优选20～30℃；反应时间1～16小时，优选8～12小时；所述的生物分子反应单元参与的反应中，反应温度0～40℃，优选20～30℃；反应时间1～16小时，优选8～12小时。

本发明中，以硅烷偶联剂对羟基化硅基材料进行表面改性以获得表面进一步改性的硅基材料，具体实施方式之一，使用巯基硅烷偶联剂对羟基化硅基材料进行改性，所制得的表面改性硅基材料反应单元参与的后续反应中，所的二乙烯基砜溶液pH≥7.0，优选pH7.5；具体实施方式之二，使用氨基硅烷偶联剂对羟基化硅基材料进行改性，所制得的表面改性硅基材料反应单元参与的后续反应中，所的二乙烯基砜溶液的pH≥8.5，优选pH9.5。

上述本发明的硅基材料表面生物功能化的方法中，所述的生物分子反应单元是生物分子的水溶液，具体实施方式之一，所述生物分子是含巯基的生物分子，其水溶液pH≥7.0，优选pH7.5～8.5；另一具体实施方式，所述的生物分子是含氨基的生物分子，其溶液pH≥8.5，优选pH8.5～9.5；再一具体的实施方式中，所述的生物分子是含羟基的生物分子，其溶液pH≥10，优选pH10。

上述本发明的硅基材料表面生物功能化的方法中，所述的硅基材料反应单元是巯基/氨基硅烷偶联剂改性的羟基化硅基材料，通过下述方法制备：

(1)制备羟基化硅基材料；

(2)将羟基化硅基材料置于质量浓度为0.5～5％的巯基/氨基硅烷偶联剂溶液中，0～40℃保持1～48小时，溶剂为添加少量乙酸(3～5滴)的体积浓度为90～95％的醇水溶液；所述的巯基/氨基硅烷偶联剂选自3-巯基丙基三甲氧基硅烷(MPTS)，3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTES)，3-氨基丙基二甲氧基硅烷(APDES)或3-氨基丙基甲氧基硅烷(APES)。其中：巯基/氨基硅烷偶联剂溶液浓度优选优选1～2％；羟基化硅基材料与硅烷偶联剂的反应温度优选20～30℃，反应时间优选12～24小时；溶剂优选90～95％的甲醇-水溶液或乙醇-水溶液。

上述步骤(1)中羟基化硅基材料的制备可参考相关技术领域中的通常方法对硅基材料表面进行羟基化处理。具体实施方式中，可通过使用酸或碱对硅基材料进行表面羟基化处理后得到，其中：所述的酸选自硫酸、硝酸或硫酸-双氧水溶液；所述的碱是氨水。优选用于宏观硅基材料表面羟基化处理的方法是：将硅基材料置于硫酸-双氧水溶液中，90℃保持0.5～1小时；优选用于纳米级硅基材料表面羟基化处理的方法是：将硅基材料置于pH4的硝酸溶液或pH9的氨水溶液，25～40℃保持0.5～1小时。

以下具体实施例的是对本发明的内容作进一步说明，不应理解为对本发明任何形式的限定。

实施例1：HCG功能化光导纤维的制备及性能测试

光导纤维(光纤)是一种常见的硅基材料，由于光在其中传输的损耗非常低而成为一种较为理想的光学材料。另一方面，光纤生物相容性好，而且价格低廉，商业化来源广泛，使其成为一种广泛使用的生物传感与医学检测元件。本实施例通过在光纤端面固定生物分子HCG，实现其生物功能化并用于HCG抗体的检测。

将氨基硅烷偶联剂改性的光纤探针(DipandRead^TMAminopropylsilane(APS)Biosensors，Fortebio，MenloPark，CA，USA)面浸入二乙烯基砜(DVS)的水溶液(10％，v/v，pH9.5，含10％丙酮助溶)中，室温活化12小时后取出，用去离子水冲洗3次，乙醇冲洗3次制备DVS活化的光纤探针。将DVS活化的光纤探针浸入HCG溶液(5mg/mL，w/v，pH9.5)中，室温反应12小时后取出，用去离子水冲洗3次制备HCG功能化光纤探针。

用HCG功能化的光纤探针在生物膜干涉传感器(BLItz)上分别测定不同浓度的HCG抗体溶液和1mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)溶液(杂蛋白样品，对照)，结果如图1所示。经过HCG功能化的光纤探针对BSA蛋白几乎没有响应，而对HCG抗体有明显响应，而且随着抗体浓度升高，响应值升高。该结果表明，经过HCG功能化，光纤探针能够选择性的识别HCG抗体，而对杂蛋白响应低，表明HCG功能化赋予了光纤材料HCG分子特异性识别响应抗体的生物活性。而且传感器响应值在一定范围内随着抗体浓度呈现线性关系，表明HCG功能化的光纤可以应用于抗体含量检测。

实施例2：乳糖糖基功能化玻璃片的制备及性能测试

将玻璃片分别用水和乙醇超声清洗2次，将清洗干净的玻璃片置于食人鱼洗液(硫酸-双氧水溶液，浓硫酸：双氧水＝3:1，v/v，注意：食人鱼洗液对有机物有强烈的腐蚀性，请小心使用。)中，90℃反应30分钟，水超声清洗3次，实现玻璃片羟基化。将羟基化的玻璃片置于3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTES)溶液(2％，v/v，溶剂为95％乙醇，含有5滴乙酸)中室温反应24小时，乙醇超声清洗3次，120℃真空交联4小时实现玻璃片氨基改性。将氨基改性的玻璃片置于二乙烯基砜(DVS)溶液(10％，v/v，pH9.5，含10％丙酮助溶)中，室温活化12小时后取出，用水超声清洗3次，乙醇超声清洗3次，制备DVS活化的玻璃片。将DVS活化的玻璃片浸泡在氨基乳糖溶液(10％，w/v，pH9.5)中，室温反应12小时后取出，用水超声清洗3次制备乳糖糖基功能化的玻璃片。

分别将乳糖糖基化和未处理的玻璃片浸入200μL花生凝集素-辣根过氧化物酶偶联物(PNA-HRP，PNA特异性识别乳糖)和牛血清白蛋白-辣根过氧化物酶偶联物(BSA-HRP，BSA为杂蛋白样品)溶液中，37℃孵育2小时后吸出蛋白溶液并用磷酸盐缓冲液冲洗3次。使用PiereceQuantaBlu^TMFlurogenicPeroxidaseSubstrate试剂盒测定孔板上蛋白吸附情况。测定方法如下：在酶标板每孔加入200μLHRP荧光发色底物，37℃孵育10分钟后加入200μL终止液。用酶标仪在激发波长320nm，发射波长410nm条件下测定各孔的荧光强度，荧光强度越高，则玻璃片上吸附的蛋白越多，结果如图2所示。未处理的玻璃片对杂蛋白BSA-HRP的吸附较多，而对特异性蛋白PNA-HRP的吸附较少，经过乳糖糖基化的玻璃片对杂蛋白BSA-HRP的吸附量明显减少，而对特异性蛋白PNA-HRP的吸附显著提高，表明经过乳糖糖基化处理，玻璃片具备了乳糖特异性识别凝集素蛋白的生物功能。

实施例3：乳糖糖基化玻璃微载体的制备及性能测试

将2g玻璃微载体加入95％乙醇中，用1M硝酸调节至pH4，40℃反应30min，加入1mL3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTES)室温反应24小时，乙醇冲洗3次，120℃真空交联4小时实现玻璃微载体的氨基改性。称取0.7g氨基乳糖(2.1mmol)溶于20mL4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液(10mM，pH9.5)中，加入2.5mLDVS(10倍当量)，并加入4mL丙酮助溶。溶液在室温条件下反应12小时，加入20mL乙酸乙酯萃取3次除去过量的DVS，制备二乙烯基砜修饰的氨基乳糖溶液。将氨基改性的玻璃微载体加入到二乙烯基砜修饰的氨基乳糖溶液中，室温反应12小时后取出，用水冲洗3次，制备乳糖糖基化的玻璃微载体。

分别将100mg乳糖糖基化和未处理的玻璃微载体浸入200μL花生凝集素-辣根过氧化物酶偶联物(PNA-HRP，PNA特异性识别乳糖)和牛血清白蛋白-辣根过氧化物酶偶联物(BSA-HRP，BSA为杂蛋白样品)溶液中，37℃孵育2小时后滤出玻璃微载体并用磷酸盐缓冲液冲洗3次。使用PiereceQuantaBlu^TMFlurogenicPeroxidaseSubstrate试剂盒测定孔板上蛋白吸附情况。测定方法如下：在酶标板每孔加入100μLHRP荧光发色底物，37℃孵育10分钟后加入100μL终止液。用酶标仪在激发波长320nm，发射波长410nm条件下测定各孔的荧光强度，荧光强度越高，则玻璃微载体上吸附的蛋白越多，结果如图3所示。经过乳糖糖基化，玻璃微载体对杂蛋白BSA-HRP的吸附量明显降低，对于特异性蛋白PNA-HRP的吸附量升高了约5倍，表明经过乳糖糖基化，玻璃微载体在蛋白水平具备了乳糖糖特异性识别凝集素蛋白的生物功能。

实施例4：半胱氨酸功能化硅片的制备及其性能测试

蛋白的非特异性吸附是降低材料在生物体系中使用寿命的主要原因，也是在生物传感与医疗检测中降低仪器检测灵敏度和选择性的重要元素，因此，学者们尝试了多种方法来降低蛋白的非特异性吸附。现在常用的方法可以归纳为亲水性高分子(典型实例为PEG)和两性离子材料，这两种方法都有一定的弊端。Gu等报道了氨基酸在生理条件下具有两性离子的性质，并在一定程度上可以降低蛋白的非特异性吸附。本实施例通过在硅片表面固定半胱氨酸分子，实现降低蛋白非特异性吸附功能化。

将硅片切割为1cm×1cm样品，分别用水和乙醇超声清洗2次，将清洗干净的硅片置于食人鱼洗液(硫酸-双氧水溶液，浓硫酸：双氧水＝3:1,v/v)中，90℃反应30min，水超声清洗3次。将羟基化的硅片置于3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTES)溶液(2％，v/v，溶剂为95％乙醇，含有5滴乙酸)中室温反应24小时，乙醇超声清洗3次，120℃真空交联4小时实现氨基改性。将氨基改性的硅片置于二乙烯基砜(DVS)溶液(10％，v/v，pH9.5，含10％丙酮助溶)中，室温活化12小时后取出，用水超声清洗3次，乙醇超声清洗3次。将DVS活化的硅片浸泡在半胱氨酸溶液(5mM，pH7.5)中，室温反应8小时后取出，用水超声清洗3次制备半胱氨酸功能化硅片。

分别将半胱氨酸功能化和未处理的硅片片浸入200μL牛血清白蛋白-辣根过氧化物酶偶联物(BSA-HRP，BSA为蛋白样品)溶液中，37℃孵育2小时后吸出蛋白溶液并用磷酸盐缓冲液冲洗3次。使用PiereceQuantaBlu^TMFlurogenicPeroxidaseSubstrate试剂盒测定孔板上蛋白吸附情况。测定方法如下：在酶标板每孔加入200μLHRP荧光发色底物，37℃孵育10分钟后加入200μL终止液。用酶标仪在激发波长320nm，发射波长410nm条件下测定各孔的荧光强度，荧光强度越高，则硅片上吸附的蛋白越多，结果如图4所示。经过半胱氨酸功能化，硅片表面的蛋白吸附量减少了约70％，说明经过半胱氨酸氨酸功能化，硅片具备了抗非特异性蛋白吸附的功能。

实施例5：赖氨酸功能化硅纳米球的制备及其性能测试

将5mLLUDOXAS-40硅纳米球(Sigma)加入100mL95％乙醇中，用1M硝酸调节至pH4，40℃反应30min，加入2mL3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTES)室温反应24小时，11,000rpm离心30min并用乙醇洗涤2次，实现氨基改性。将氨基改性的硅纳米球加入到二乙烯基砜(DVS)溶液(10％，v/v，pH9.5，含10％丙酮助溶)中，室温活化12小时后取出，11,000rpm离心30min并用乙醇洗涤2次，完成DVS活化。将DVS活化的硅纳米球加入到100mL赖氨酸溶液(50mM，pH9.5)中，室温反应12小时，11,000rpm离心30min并用水洗涤2次制备赖氨酸功能化的硅纳米球。

分别将1mL赖氨酸功能化和未处理的硅纳米球(100mg/mL)加入到9mL1mg/mL的BSA溶液和10％新生牛血清(NBS)溶液中，用动态光散射(DLS)的方法检测其水力学直径的变化。硅纳米球表面蛋白吸附越多，其水力学直径增大越多，结果如图5所示。未处理的硅纳米球在BSA和NBS溶液中水力学直径迅速增大，表明其表面有大量蛋白吸附，经过赖氨酸功能化之后，硅纳米球在测试期间水力学直径未发现显著增大，表明其表面蛋白吸附量很少。该结果表明经过赖氨酸功能化，硅纳米球具备了抗蛋白非特异性吸附的功能。

Claims

1.硅基材料表面生物功能化的方法，其特征在于是以二乙烯基砜连接由巯基/氨基硅烷偶联剂表面改性的羟基化硅基材料与生物分子的方法。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的生物分子是含有巯基、氨基和/或羟基的生物分子。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的生物分子选自含有巯基和/或氨基的氨基酸，多肽或蛋白质。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的硅基材料是无机硅材料。

5.权利要求1所述的方法，是二乙烯基砜反应单元先与硅基材料反应单元和生物分子反应单元中之一反应，所得反应物再与其余一种进行反应；

所述的二乙烯基砜反应单元是体积浓度为1～20％的二乙烯基砜溶液，溶剂为水或体积浓度5～20％的丙酮-水溶液；

所述的硅基材料反应单元是巯基/氨基硅烷偶联剂改性的羟基化硅基材料；

所述的生物分子反应单元是生物分子的水溶液。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：

所述的硅基材料反应单元参与的反应中，反应温度0～40℃；反应时间1～16小时；

所述的生物分子反应单元参与的反应中，反应温度0～40℃；反应时间1～16小时。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：

以巯基硅烷偶联剂对羟基化硅基材料进行改性的方法中，所述的二乙烯基砜溶液pH≥7.0；

以氨基硅烷偶联剂对羟基化硅基材料进行改性的方法中，所述的二乙烯基砜溶液pH≥8.5。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:

所述的含巯基的生物分子溶液pH≥7.0；

所述的含氨基的生物分子溶液pH≥8.5；

所述的含羟基的生物分子溶液pH≥10。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的硅基材料反应单元通过下述方法制备：

(1)制备羟基化硅基材料；

(2)将羟基化硅基材料置于质量浓度为0.5～5％的巯基/氨基硅烷偶联剂溶液中，0～40℃保持1～48小时，溶剂为添加少量乙酸的体积浓度为90～95％的醇水溶液；

所述的巯基/氨基硅烷偶联剂选自3-巯基丙基三甲氧基硅烷，3-氨基丙基三甲氧基硅烷，3-氨基丙基二甲氧基硅烷或3-氨基丙基甲氧基硅烷。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中羟基化硅基材料是用酸或碱对硅基材料进行表面羟基化处理后所得，其中：所述的酸选自硫酸、硝酸或硫酸-双氧水溶液；所述的碱是氨水。

11.权利要求1～10中任一权利要求所述的方法所制备的表面生物功能化的硅基材料。