JPS60501739A - 固定化酵素組成物およびその製法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 固定化酵素組成物およびその製法 本発明は酵素組成物、酵素の固定化法、酵素反応を行う方法および酵素用担体物 質に関ずろ。

発明の簡単な記載 本発明は酵素を、有利な物性を有する無機担体物質１−に、吸着させ、ついて、 所望により、分子間架橋ずろか、または所望によりカップリンク剤を用いて共有 結合させることによって固定化することができろという事実に屑づく。無機担体 物質は、所望の特性、例えは、所望の化学組成、および多孔性および表面積のよ うな所望の物性を何していない天然の物質から、多孔性を増加させる酸処理によ −・て製造ずろことかてきろ。

先行技術の記載 米国特許第３５１９５３８号〔メノンクら（Ｍｅｓｓｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、　） ）は、その担体か、とりわ（Ｊ、ノリ力含有物質である、無機担体に共有結合的 に連結させた酵素からなる不溶化酵素を開示している。ソリカ含打担体物質の具 体例は無定形（ガラス、ノリカゲルおよびコロイド状ノリ力）、１；よび結晶性 （ベントナイト、珪灰石）物質である。ノリカ含有物質に関する実施例には、無 定形物質の使用たけが記載さＡ１でいろ。多孔性カラスか好ましいマトリックス である。多孔性ガラス物質の表面を希ＨＮ○３溶液で洗浄し、蒸留水で水洗し、 乾燥し、０．の／Ｉ；扛下にて約６２５°Ｃに加熱する。ついて、該表面１４の オキシドまたはヒト［１キノ基を、アミド、チオウレア、ア゛バエ−チル、ニー ステルおよびジスルフィド結合によって酵素が連結されうる有機ノラノカゾプリ ンタ剤と反応させろ。酵素として、ヒトロラーセ、酸化還元酵素およびト・ラン スフ−ｒラ−セか記載されている。

米国特許第３６６９８４．１号〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ））は、酵素の７リカ含 有物質への共有結合による結合を開示している。有機フランはノリカ含有物質の 表面上に保持され、酵素は架橋剤に共有結合的に結合され、該架橋剤は有機フラ ンに共有結合的に結合されろ。酵素はプ［ｌテア−セとアミラーゼの混合物であ る。

米国特許第４．３８４０４．５号〔ホーら（Ｈｏ、ｅｔ　ａｌ、　）：ｌにはノ リカ含有無機担体物質を強塩晧溶液と、ついて、強酸溶液と反応させろことによ −・て該表面上に非常に数多くの反応性ヒドロキシ基が得られる酵素固定化用担 体の製法が開示されてし１ろ。適当な担体物質としてソリカゲルか記載されてい る。酵素を担体表面から垂れ下がったヒドロキシ基に共有結合さ１１゛て該担体 表面上に固定させろことかでき、固定化酵素の多数の［層−１を得ろことが可能 となる。この酵素は一二、官能カップリンタ剤に」；リンリル化された表面に結 合され、ラクターゼかクレー！、に記載さメ１ている唯一の酵素である。

発明の詳細な記載 本発明による酵素組成物は、１２重量％以下の３価金属イオンからなろ炭酸カル シ「ｊツノ−１、酸化カルシウム１′３よび他の酸可溶性成分を実質的に含まな い粒状の無機担体物質に結合させろことにより固定化された酵素からなり、該無 機担体の各粒状は、少なくとも９０重量％の５１０２からなり、 （１）水銀ＩＥＩＥ人法（ｍ［！ｒｃｕｒｙ　ｐｏｒｏｓｉｍｃｔｒｙ）により 測定した約０．１５−０４５’ｃｍ３／！ｊの気孔容ｔ（ｖｏｉｄ　ｖｏｌｕｍ ｅ）に相当する、水銀属人法に括り、キ２３−５０容量％の多孔度（ｐｏｒｏｓ 　ｉ　ｔ　ｙ）をｆｊ″し、（ｉｉ）０．０２−０．１μｍの平均細孔半径をｆ Ｊシ、（ｉｉｉ）Ａ　Ｓ　ＴＭＥ　７２８−８０に従い測定した少なくとし０５ ％、好よしくは、約９９％の耐摩耗性を有する。

好ましい担体物質は少なくとし９５重量％の８１０２からなる１、該酵素組成物 に用いろ好ましい担体物質（Ｊ水銀Ｈ１人法に括っき、（νなくとも１５ｍ’／ ！７、好ましくは、少なくとも２５ｍ２／ｙ、よ・）好ましくＩＪ、少なくとも ３５ｍ２／９の表面積を有する物質である。

該＋Ｈ体物質において、０．（’］　０５−１　、ｔｔｍの半径を有−４−ろ細 孔＜　−１１；Ｈ！　：Ｈドゝ体の少なくとら８０％、好ましくは、少Ｇくどし ９０％を、１１．・ろろ。

該担体物質には、固定化酵素を包含４−ろ該製法に適当すい、４・１ノ）拉ｒ− 径し用いろことができろ。その用途により、適当な粉、了ｉそは１′５０１１ｍ 以下、０．１−０．５ｍｍ、０．５−１ｍｍ、ｌ−２ｍｍ、、１．５−２ｍｍ、 ｌ　う〜２．５ｍｍ、２〜４ｍｍおよび１〜６ｍｍである。

少なくと１，９０％の５１０２からなる担体物質はモース硬度スケールに基−７ ）さ約７以ｌ−の硬度をＴ１する。

践担体物質は多孔性を増１＋ｏさＵ゛ろ処理により天然の無機物質から製造４′ ろことかてき、天然の無機物質は、２０〜５０％のＣａＣ０Ｊ、１ひ’８０〜５ ０％、’ノ）３　ｉ　０？からなり、部分的に結晶性であって、主要な反射ピー クの位置（面間隔、ｄ（人）として）が４３２８．４２６７．４０９２、ＬＩ　 、　０５３．３８６０．３３４９．３０１０．２４９７．２２８３．２０９３． １９１２．１８７３なとであるＸ線回折パター７を（−ｉ’Ｌ、（１）水銀ＬＬ 人法で測定した少なくとら約０．０５ｃ第３／′９、好ましく：ま、少なくとら 、Ｏ、ｌ　０ｃｍ３／ｇＯ）気孔容量に相当４′ろ、水銀圧入法に基つき少αく とちｌ　Ｏ容３′Ｘ％、好ましく：ま、少なくとら２０容量％の多孔度をｆ了１ ２、 （１１）水銀圧入法で測定した０、００２５７１ｍｌＪ下から、約５μｍまての 細孔）１′径の、広範な細孔半径分布を有し、（…）水銀圧入法に基つき、少な くともｌＯｍ’／ｇ、好ましくは、少なくと６１６ｍ？／ｈの表面積を有する。

本発明の具体的な態様において、該担体物質は面間隔の関数として相対的に強度 によって示訴茫たＸ線回折パタ　ン（１／　ｌ　ｍａｘ、ｄ（人）２３゜４３２ ８．２５．ｉｌ、２６７．３５．４，０９２．３６．４．０う３．１５３８６０ ．４．３，７９２．５４．３，３４９，１００，３，０４０、・１，２８４６、 ｌ　、２，５３３．２３．２，４９７．５，２，４７８．５．２　□１６（）、 ２３．２，２８３．２．２．２：う６．４．２．１３０．２０．２，０９３．２ ゜１９７９、？、１，９２４．２０．１．９＋２．２２．１８７３．７．１８１ ８）を有する無機原料から、多孔性を増加さＵる処理によって製造さ２′：た物 質に同一である。

担体物質を製造することかできろ原料（Ｊ珪化石灰岩の塊からち゛ろ天然物であ る。該原料は石灰沈殿物におりろ珪化二［、程によって形成されろ。

ノリ力は石灰蛋白石（ｃａｌｃａｒｉｏｕｓ　ｏｐａｌ）　ＣＴフリントとして 特徴イ」けろ二とかできる物質を生しろ珪化ＩＮ４″におけろ学友定性の鉱物と （−で沈殿する。該シリカ成分は石英、蛋白石、クリストバル石および鱗珪石か らｔろと考えられろ４、　天然の出発物質の化学組成（原子吸光分析に基つき、 酸化物として算出し、重量％て示す）は、Ｓ　＋　０２　５０〜８０ ＣａＯＩＩ〜２８ このＣａＯ含白量ｔ」Ｃａ　ＣＯ３の約２５〜５０重量％、好ましくは、約３０ 〜３５重量％の炭酸カルシウム含ｒｆＬ賃に桂１当電ろ、、Ｓ＋０．約〔］０〜 ６５　’ＪＩＥｔ（％、好ましく（上、Ｓ　ｉ　（、ｉ　、約６３重量θに、ｉ ’：　、’Ｆ、　ｊ　Ｃａ　Ｏｉ　５−２０重量％、好ましくは、Ｃ’ａＯ約１ ９重量％（酸化物として算出、後者はＣａＣＯ３：ｊ；白゛量の約３４重量％に 相当する）を含（−Ｊ゛する天然の出発物質を用いろごとか好ましい、 天然の出発物質は面間隔の関数として相対的強度によ−１、て示さメ１ｆ二Ｘ線 回折バ２ターン（１／　ｌ　ｍａｘ、ｄ（人）：２３，４，３２８．２５，４， ２６７．３５．４．０９２．３６，４，０５３、ｌ　５，３，８６０．４．３， ７９２．５４．３　３４９、Ｉ　００，３，０４０．．１．２．８．＋　６、Ｉ 　、２，５３３．２；３゜２４９７．５．２，４７８．５，２．４’６０，２３ ，２，２８３．２　、２　、２３６．４．２．＋３０．２０，２．０’ン３．２ ．１　（）７９．７　、　Ｉ　、　９２４．２０．１．９１２．２２．１．８７ ３．７．１．８１８）を有し、第２図は代表的なＸ線回折図を示す。

天然の出発物質の多孔度は吸水憧′（物理的ツース）・法（ま以−１・に示４っ て測定しノコ場合、約２０容量％てあ、て、約０．ｌＯｃπ１／′９の気孔容量 に相当する。

天然の出発物質自体はそのＣａ　ＣＯ、含有量おｊ、び不十分な物性（多孔性お よび表［ａｉ情）の、忙めに、酵素固定用のＰ−！体物τよとじで用し・ろコ′ ）には適当てはない。

天然の出発物質は０．００２５Ｉｚｍ以下て、約５７ｚｍまての細孔１−径を有 し、最大細孔半径分布（ｊ約０．ＯＩ７１ｍて、平均細孔゛１′ｉそは約０．０ ２μｍてめろ。

その表面積は水銀圧入法に基つき、少なくとらｌ０ｍ２／＆、好ましくは、少η ＣくとちＬ（ｉｍ２／９てめろと計算４−ろことかできろ。

ＢＥＴ法を用いた場合、該表面積は少なくとも５ＩＩ１２／ｇ、好ましくは、少 なくとも９ｍ”７ｇであると計算することができる。

出発物質の見掛密度は約２．５９１０１１１３である。

１以下の種々の相対蒸気圧Ｐ　／　Ｐ　ｏにおける等温水分吸着度測定に基づき 、００４μｍ以下の半径の細孔が総細孔容量の約６４容量％を占めるものと計算 することかできる。

多孔性担体物質の製造に用いる出発物質は酵素担体として用いらイ１．ろ他の物 質とは実質的に異なり、該担体物質の製法は特別な方法てある。

該担体物質は約４０ｃｚまての直径を有する比較的太さな石材として供給さね、 た天然の物質から製造することができる。この物質は、多孔性を増加させる処理 、すなわち、粒子を所望の粒径に減少処理し、ついて、適当なフラクション、例 えば、００１〜１０ｍｍのフラクションに分級および選別した後、酸処理に付さ れる。粒径の減少はンヨークラソンヤ−、ホールミルなどによって行うことかで きろ。粒径の減少（砕解）後、該物質を、分級−Ｌ程、例えば、ふるいシステム に付し、ついて、所望のフラクションに選別する。

その粒子径が最大１０ｍｍ、とくに、最大６ｍｍ、好訳７く（よ、最）（２ｍｍ である物質に対し、多孔性を増加させろ処理を行うこと力＼に子ましし１゜つい で、粉砕した粒子を、出発物質に含まれろ実質ヒＪζこ全てのＣａＣＯ３を溶解 するのに十分な条件下にて酸に（ＪＩ−４−、適＝＋４な酸ＩＸ　’Ｊｒ　）ｒ 　ｒ、；　ｋｎ：酸または有機酸、好ましくは、硝酸、塩酸および酢酸てある。

粉砕物質中のＣａ　Ｃ０３は迅速に溶解するので、：王んの）″１−４−力飄１ こ過佃ｊθ）酸を用いろことが最も都合よ円ＣａＣ０ａ含量と共に、他の酸抽出 〒ＩＪｆ屯成分ち除去し、減少した担体物質の内容物、例えは、二価金属イ」ン の減少をもたらす。酸処理によって製造された担体物質は少り゛＜とち９０重量 ％、好ましくは、少なくと６９５中量％、より好ましく（Ｊ、約９９重量％の５ １０２からなろ。

用いる酸の量はＣａ　ＣＯ３含量に基−）き計神し、好ましく（よ、化学”１１ ３Ｑ量の１〜１５倍、とくに、約１２倍喰を用いろ。

酸処理は適当な処理期間か提供されるような温度にて行うへきてあって、高温が 好まし１約２０〜９０°Ｃ１とくに、約８０°Ｃｏ′）温度力＼好ましい。

反応の完了はＣａＣＯ３か存在しなくなったことにより示され、ＣａＣＯ３につ いての分析は、例えは、Ｘ線回折分析または原子吸光分析によって行うことかで きる。

酸処理後、得られた物質を、生した酸の塩を含む液層から分離し、ついて、すす いて残った酸およびカチオンを実質的に含まない担体物質を得る。すすぎ処理（ 通常、水で行う）後、該物質を乾燥する。

酸処理の結果、約２０〜５０％、通常は、約２５〜４０％、とくに、約３０〜３ ５％の重里損失が生しろ。

酸処理中のＣａ　Ｃ０３の溶解によって、気孔容量か増加し、水銀圧入法で測定 した約０．１５−０．４５ｃ＝″／９、好ま（７く：ま、０．１８−０　３６ａ ｍ３／９、より好ましくは、０．２９−０．３６ｃａ３／凱　とくに、約０３２ ａｍ″／ｇの気孔容量に相当ずろ、水銀圧入法に基づき、２５〜５０容量％、好 ま（２くは、３０〜４５容量％、より好ましくは、４０〜４５容量％の有孔度と 共に、優れた機械的強度を何する物質が形成さイ１ろ。この機織的強度により、 該担体物質を高いカラムに用いることかできろ。

酸処理により、０．００１１１ｍ−１０７１ｍの細孔半径と、約０．０１　μｍ および約０２μｍの最大細孔半径分布を何才ろ物質か得られろ。平均細孔半径分 布を有する物質か得らメ１ろ。平均細孔”−Ｆ　ｉ＊は００２〜（１、Ｉ　ｔｔ 眠とくに、０．０３−０．０５　μｍ、好ましくは、０．０５７１ｍである。０ ００５〜Ｉ　０μｍの半径を有する細孔（」該細孔全体の少なくとし８０％、好 ましくは、少なくとも９０％を占めろ、。

酸処理により、水銀圧入法に基づき、少なくとし２０ｍ２／ｙ、好ましくは、少 なくとも３０ｍ’／！７、より好ましくは、約４０−４５ｍ２／！／の表面積を ａずろ物質か得られろ。

Ｂト〕Ｔ法による表面積は少なくとしｌ０ｍ２／９、好ましく（」、少なくと５ １９ｍ’／７である− 該担体物質は２．３ｇ／ａｍ３の見掛密度および０６〜０　、７　ｙ７ｃｔパの 嵩密度を有ずろ。

本発明による酵素組成物に用いろ担体物質は、結晶性Ｓ　ｉ　Ｏ２と無定形蛋白 石との混合物である米国特許第３５１９５３８号に記載の物質と：よ異なる。

多孔性増加処理によって、予期ｔ！ぬことに、酵素の固定化に杓゛刊な細孔径を 有する１１体物質が得ら２村ろ。（１′−均粒子半径が０．０２〜Ｏ１μｍ、ど くに、Ｑ、Ｏ３−０，０５１１ｍ、好ましくは、０．Ｏ５ｌ１ｍであること、お よび該担体物質において０．０５−１／１ｍ１７”半ｉ￥を有ずろ細孔か該細孔 の少なくとも８０％、好ま（−＜は、少なくとも約９０％を占めろ事実か生成物 および基質の拡散にｆｉ′利な実現性を提供する。、多孔性増加処理後、該担体 物質は、細孔長面に有利ｒｊ′量の酵素を結合さｔ［る実現性を提供する該表面 上のフラノ　ル基を告白′ずろことか示されろ。

酵素の固定化は、いくつかの利点を提供するよく知られた技術であって、例えは 、（Ａ）用１　）Ｌ−、；−（乙酵素り）操り返しの使用つ）達成を可能し、酵 素の安定性を、しはしは、高め、（Ｂ）生成物と酵素の分離を促進し、最終生成 物にお（−１ろ酵素に、１−ろｔり染を減し、（Ｃ’）例え（よ、流動宋および カラム反応器が使いやすくなるように、良好な反応器の設計を可能にする。

酵素は、例えは、該担体に吸着させ、ついて、所望により分子間架橋４′るか、 また（」所望に、にりカップリンタ剤を用いて共存結合させることによ−）で結 合さノ′！る。本明細吉において用いる吸着なる語はδ−・ろ物質を池の物質の 表面に結合さけろことを色味４゛ろ−こ′ｌ′Ｉにより、酵素（１担体物質の表 面に、直接的に４１共何結合により、部分的に；ま水索結ａに、Ｌつ、また、部 分的には酵素と該担体物質のフラノ　ルＬ１、の間しりイオン結合によ−）で結 合さ、ｉ７．ろことを色味オろ。

酵素の担体物質への結合用の方法および試薬は原理的に：よ知らシ］でいろが、 しかし、本発明に従う該担体物質の組＃　ｔ！’は新規で３うろ。さらに、機能 的に活性な酵素をノリカ含ａ表面のその表面に直接吸着させろこと、ついで、所 望により架橋させることは、先行技術におｆＪろ特許明細書に１、ｊシ己載Ｊれ −ごいｆ謀い。

該担体物質（固定化剤）はその表面−ヒにシラノール基を含み、該基は官能基と して作用し、そこに、酵素用のカップリング剤よたは酵素自体か結合することが できろ。フラノ　−ル基の数（Ｊ本発明の担体物質１００人２当たり、約２２で あると算出される。表向にお（Ｉるシラノール基の数はつぎの反応式に従う水酸 化カルシウムとの中和反応により決定することかでさろ。

＝Ｓ　ｉ−（月し−Ｃａ（０ト１）、＝　ＥＳ　ｉＯ−Ｃａ＝　−ＯＨ−＝　ｆ Ｉ、０詮無機担体物質に結合することかできろ酵素はインク−ナノ３ナル・ユニ コ４ン・オツ−）＜、４オケミストリイ（Ｉ　ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｕｎ ｉｏｎ　ｏｆ［うｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）０分類システムに従い、オキシドレ タクターゼ、トランスフＪラーセ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼおよ びりカーゼからなる群から選ばれろ酵素のいずれてあ−、てらよＬ）。

該担体物質への結合は吸−？）により、好土しくは、ついて醇索分子り−）架橋 によって行うことができろ。架橋剤は用いろ酵素に従い選択することがてき、架 橋剤の例はグルタ−ルンアルデヒドである。

酵素θ）担体物質への結合は、また、酵素と無機担体物質との間のｊ（Ｙ−ｊ結 合によイ（＝得ろことかでさ、その−具体例において、そのような共存結合はカ ップリング剤によ、って行う。

カーブリンク剤とし７て、つぎのよ゛）に反応−４ろ臭化シアンか争げられ／ 　０ 臭化シアン活性化担体を酵素にお（＋ろ活Ｖ１ヒ１［２キノまｆコＪアミノ活と 反応させろことがでさる。

酵素を担体物質に結合するも−）１−）別のカー去：１該ｔ１（体物質を（３ア ミ２ノプロビル））・リエトキノノラン、７）よう１５ンリル化剤によ−）でノ リル化することて、うる。ノリル化の後、該担体物質をン゛ルν　ルノアルデヒ ドようなカップリンク剤て処理」ろごとかてさろ４、反応！」−ｔ　Ｉｑ　ｙ＞ ように小−４ことができろ（他の反応式ら、その止血な反応条件によりＩＩＪ能 である）３゜（担体）−０Ｈ＋（ＰＬＯ）３Ｓｉ（ＣＩ−１２：ｈ医Ｉ−１＋・ ０′ ＼ ／ −−−−−−−−（担体）−０−Ｓ　ｉ　−（Ｃｌ（２）＋　＼−ＣＩｌ−（Ｃ ＩＬ）ａｃｌＩ。

＼ ＼ 一ノ（１て、カップリング剤て処理しｆニノリル化担体物質を酵素のアミン基と 反応させろことができる。反応はつぎのように示すことがてきる（他の反応式も 、その正確な反応条件により可能である）。

。′ ＼ ＼ ＼ ＼ 用いるカップリング剤によれば、酵素上の種々の反応基を反応性末端基誘導担体 物質に結合することができる。

酵素上の反応基の例として、例えば、アミノ基、カルポキソル基、脂肪族および 芳香族ヒト〔Ｉキノ基およびメルカプト基か挙げられ、担体物質−１，の反応性 末端基の例として、以下のものに制限されろものではＧいが、アミノ基、カルボ ギノル基、アシルハライド基、アルギルハライド基、メルカプト基等が挙げられ る。酵素十の反応ＬＣＸ　）、担体物質上の反応性末端基（Ｙ）およびカップリ ンク剤の例示は以下のとおりである。

本発明による担体物質上に固定化される好ましい酵素はアノラーゼ、とくに、ア ミダーゼおよびエステラーゼ、および脱炭酸酵素である。

好ましい例として、前記したアミダーゼか挙げられ、３５う例：まつさの反応を 触媒ずろアミノアノラーゼ（Ｅ、Ｃ，３，５，１，＋　４）である。

もう１つ別の重要なアノラーゼの例はペニシリンの合成に用０られろペニンジン アノラーゼである。

さらに重要な酵素にはリアーゼおよびグルコースイソメラーゼがめる。

特に重要な酵素にはっき゛の反応を触媒するアセトラクチ−トチカルボキンラー ゼ（Ｅ、Ｃ，４，、Ｉ　、　Ｉ　５）がある。

Ｃ１，−Ｃ−ＣＯＯＨ−−−−−−−→ＣＨ３−ＣＨ＋ＣＯ２１ ＣＯＣＨ，ＣＯＣＨ３ この反応により、高濃度にである種の生化学的生成物に好ましくない特性を与え るノアセチルの前駆体であるアセドラクチ−１・を除去することができろ〔ゴソ トフレノ）・セン、ニス・イーおよびオノテセノ、エム、カルルスハ−り、レス 、コミュノ（Ｇｏｄｔｆｒｅｄｓｃｎ、Ｓ、Ｅ、　、ａｎｄ　０ｔｔｅｓｅｎ、 Ｍ、　ＣａｒｌｓｂｅｒｇＲｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　）４７．　Ｉ　９８２， ９３Ｍ参照Ｊ０図面の記載 第１図は天然の出発物質（り゛ラフ（１））および該無機担体物質（クラ７（２ ））について水銀圧入法の結果を示す。細孔容量Ｃｃｖｔ３／ｙ）を細孔半径（ μｍ、対数スケールとして示す）に対しプロット。細孔半径の計詐ては、水銀と 担体物質の間の接触角がＩ　４０°であるとしノｌ＝。該担体物質にお（１ろ細 孔は、最大細孔半径分布か、各々、約０．０１および０　、２７１ｍてめろ２つ の群に分ζジられろ北うてめろ。

第２図：：ｌ：該担体物質の出発物質のＸ線回折図を示１５、第３図は該担体物 質のＸ線回折図を示−４−０第４図は天然の出発物質のＳ　Ｅ　ｉＶＩ写真を示 す。

第５図は該担体物質のＳＥＭ写真を示オ。

物理的方法 水銀圧入法 水銀圧入法は細孔径分布の測定に適し／＝テスト法である。固体に′１１−ｇ− る液体の接触角が９０°以Ｆである場合（水銀、約１４０°）、゛（′ｉそ「の ノリンダー状の空間内に液体を押込めろために（」、少ζζ（と乙［１６，すｒ ）か必要てあろ〔ホット、アール・エル（多孔性力　ホン固体、アカテミノ？７ ０プレス（丁３ｏｎｄ、Ｒ，Ｌ、、Ｐｏｒｏｕｓ　Ｃ：ａｒｂｏｎ　５ｏｌｉ（ ｌｓ、八ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒ（１ｓｓ）、ロンドンおよびニコーヨ−り、１９ ６７）による文献に従う〕。

〔式中、δ−液体の表面張力、０−接触角（〉９０°〕〕細孔径分布は、原理的 には、かかる液体を１．ＵＴ：、力を増ｊＪｕさし−ろことによって径か減少す る細孔内に押込め、浸透する液体のその量、■、をｐの関数として決定すること によって測定することができる。ただし、該細孔はノリンダー状で、ｒはｐの関 数として算出することができる。Ｖをｒに対１．てプロットした場合、細孔容量 分布ｄＶ／ｄｒはグラフ上の微分によりｒの関数とし２て決定することかできろ 。

半径ｒ、とｒｂ（ｒａ＞ｒｂ）の間の細孔全ての総内面積Ｓはっぎの式によって 計％ずろことかできる。

（プリング−状の細孔について） 〔式中、ｓｐ−該細孔の表面積、Ｖｐ−＝該細孔の容量、ｒｐ＝該細孔の半径〕 担体物質に対する水銀圧入法の測定はメルキコリ−・ペネトレ　ンヨン・ボ〔１ ツメ−ター、９０５−１型〔マイクロメリティクス・インス］・メンツ・コーポ レーション、ノルグラス、ジョーシアＵ　Ｓ　Ａ　（ＭｅｒｃｕｒｙＰｅｎｅｔ ｒａｔｉｏｎ　Ｐｏｒｏｓｉｍｅｔｅｒ、Ｍｏｄｅｌ　９０５−１．Ｍｉｃｒｏ ｍｅｒｉｔｉｃｓＩｎｓｔｒａｍｅｎｔ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｎｏｒｇｒ ａｓｓ、Ｇｅｏｇｉａ、ＵＳＡ）’］によって（−ｊ　−）た。

各テスト実験には、３〜４ｇの試料を用いた５、圧力ｐに相当ずろ細孔半径ｒの 計算には、δ＝　４８４　ｄｙｎ／　ｃｒｔｔおよびθ−１４０６を用いノニ（ 水銀と固体の間の通常の接触角は１４０°である）。第１図は水銀圧入法により 測定した、細孔半径に対しプロットした細孔容量を示オクラフてδうる。

ＢＥＴ法による表面積の測定 比表面積の算出には、Ｂ　Ｅ　Ｔ法〔ネルソン、エフ・エムおよびニゲールトセ ン、エフ・ナイ（Ｎｅｌｓｏｎ、Ｆ、　Ｍ、　ａｎｄ　Ｅｇｇｅｒｔｓｅｎ、Ｆ 、　Ｔ、　）、３０．１９５８．１３８７頁の文献による〕を用い、ノー。−１ ９６℃（ハ窒素を吸着剤として用いた。

水分の等温吸看量 出発物質の等温水分吸着量は１以下の種々の相対蒸気圧Ｐ／Ｐｏｉ叫５いて７− １い、固体１００ｇ当たりの水分吸着量と相対蒸気圧との間につきのような関係 を得）−８ ９／１００ｆ＋、Ｐ／Ｐｏ：０．０，０．１１．０．０，０．２３．０．５．０ ．５８．１．２．０．７５、１．６．０．８３．４．０．０．９２．６．９．０ ．９７密度および吸水率 見掛密度および吸水率は、原理的にはダニンンユ・スタンタート（Ｄａｎｉｓｈ 　５ｔａｎｄａｒｄ）４０５．２に従い、細孔内の水分の吸収促進には排気工程 を用いた。

吸水率によって決定された多孔度は水銀圧入法によって決゛定されろよりら大き な値を示す。これは、水分が、用いた圧力（５００００ｐｓｉ）にお（Ｊる水銀 浸透のために井筒に小さい細孔内に浸透でさるという事フニによろらのてある。

平均細孔半径の測定 平均細孔半径はつきの式によ−）で訓算した。

〔式中、■・吸水率によって決定（、た細孔容量、５−ＢＦ：′■゛法によりＥ 　Ｔ る表面積〕 Ｘ線回折図 Ｘ線回折図１はＣｕＫα、輻射線を用い作成した。回折分析：よ、毎分ｌ／４° または毎分ピの速度にて、各々、８秒ま几は２秒の時疋数−ζ行・／ニインパル スの量を回折角２θに対してプロットし１．、ｏ相対的強度を、呂々の最大の高 さとスペクトル中の最大強度の高さとの比とｊ７てル１算しｆ二。

面間隔の値はつぎの式に従い算出ＬＩ二、、〔式中、”ＣａＫα＋は１．５４０ ５１人で、Ｏ（Ｊ入射線の方向と而との間の角度てめろ〕 算出した面間隔ｄおよび十票学表（ΔＳ　ｉ”　Ｍ　）による相欠１的強度を文 献のテークと比較することにより、分析した物質を同定しノー。

Ｘ線回折用テスト試料の調製 物質約１９をアケートポールミルにより微粉末か得られろすて粉砕１゜た（１５ 分）。

ノラノール括の測定 該担体物質の表面上のノラノール基の数はつきの式に従い決定Ａ−ろことかてき ろ。

＝Ｓ　ｉ−ＯＩＩ　Ｃａ（ＯＨ）、−＝Ｓ　ｉ−０’　Ｃａ″’　０　ｌ−１− ＬＩ−１２０約３０°Ｃにお：するＣａ（ＯＨ）２の飽誉１」、濾過溶液から、 １２個の異なろＣａ（Ｏ）Ｄ２溶液を調製し、その濃度をＩＱ当たり、０．６− １．０９のＣａＯ変化させた。その１１−確な濃度を原子吸光法でＪす定した。

該担体物質の試利約１！／をポリエチレン製フラスコに入れ、窒素で覆った。Ｃ ａ（ＯＨ）ｐ溶液５０ｕ夕を加え１こ。フラスコを３分間激しく振とうし、導電 率（Ｉ７）を測定１．た、各Ｃａ（ＯＨ）２溶液の導電率および既知濃度Ｃ８に 基づき、平衡濃度Ｃ１はつぎの式によって計算することかできろ。

担体物質１ｇ当たりのＣａＯの吸収量（９）をＣ，（モル１０）に対しプロット ・すると、ＣａＯの最大吸収量は担体物質１ｇ当たり、０．００４９であること が判明した。これは担体物質１００ｇ当たり、ＯＨ７、１Ｈ当量に相当オろ。Ｂ 　ＥＴ法による表面積（担体物質１ｇ当たり、１９ｍ２）およびアボカトロ数に 基づき、該担体物質１００人２当たりのノラノール基の数を１００人２当たり、 ２２と算出電ることかできろ。

検定 アミ２アノラーセ（ブタ腎臓から調製した凍結乾燥物としてシグマ（Ｓｉｇｍａ ）から入手）を２５°Ｃに゛て、２０ｍＭリン酸塩緩衝剤く、ｐＨ７、（］　） ］中１５ｍＭＮ−アセチルーＩ−メチオニン３０心川］−ご検定しノコ。検定中 、固定化酵素をクリフィンンエイカ−（Ｇ　ｒｉｆｆｉｎ　５ｈａｋｅｒ）て臥 とうし八。１５分後、液層のサンプルを採取し、′１モ成しｆ二遊離アミノ酸を ニノヒトリン法〔モーラ、ニスおよびスデイン、タブリュウ・ユイチ、ツヤーリ ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ　（Ｍｏｏｒｃ、Ｓ、　ａｎｄ’　５Ｌ ｅｉｎ、〜’、＋１、、Ｊ　、　ｌ３ｉｏ１．　Ｃｈｅｍ、　）、１７０．１９ ４８．３（）７頁〕により１測定した６、検定終了後、固定化酵素を濾取し、１ １５℃にて一夜乾燥し、秤量しノコ。

この検定において、毎分１マイクロモルのＬ７　メチオニンを生成オろアミ２ノ アノラ　ゼの量をＩＩＵと定義オろ。

溶解形のアセトラクテートを１）「ｊ記したように測定する〔ジノ１〜フレツト セン、ニス・イ　おＬびオｌテセノ、−Ｘ、ム、カルルスベル′）・レス・コミ コン（Ｇｏｄｔｆｒｅｄｓｅｎ、Ｓ、　Ｅ、　ａｎｄ　０ｔｔｅｓｅｎ、Ｍ、、 Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　）、４７．１９８２．９３頁 〕。固定化アセドラクチ−トデカルボキシラ−ゼを振とう表に従い検定し、固定 化アミ２アノラーセをフライント（ｂｌｉｎｄ）として用いた。検定終了後、固 定化酵素を濾取し、洗浄し１．１１５℃にて一夜乾燥し、秤量しノー。ｌＬ：の アセトラクテ−トデカルボキシラーセが、アセト・ラクテートから、３７℃にて 、ｐＩＩ６　、５で毎時１マイクロモルのアセトインを生成し１こ。

蛋白質はボビン・セルム・アルブミン（Ｂｏｏｉｎ　Ｓｅｒｕｍ　、へｌｂｕｍ ｉｎ）を１票専“とじて用い、〔ｌ−リ−ら〔ンヤーナル−オブ・バイオロンカ ル・ケミストリー（Ｌａｗｒｙ　ｅｔ　ａｌ、　、Ｊ、　Ｆ３ｉｏ１．　Ｃｈｅ ｍ、　）、１９３．１９５ｊ。

２６５頁〕の方法に従Ｌ）測定した。

実施例１ 該担体物質の製造 粉砕した、原料の石灰蛋白質−ＣＴフリント石÷オを過剰の酸で処理し、該石材 のＣａ　ＣＯ：＋含量（平均３４％のＣａＣ０Ｊ）を溶解しｊ二。

粉砕石灰蛋白質−ＣＴフリット石材の３つのフラクション（粒径く１／２．１／ ２〜２および３〜５　ｍｍ）を加熱し戸から、まｒ詔よ加熱しｔいて、種々の期 間、種々の酸て処理した。

粉砕も（づの試料をインキコｌ＼−ター中、１００℃にて、・１８時間乾燥し１ ニ。該物質約２９をビーカー中にはかり出し、過剰（最小量２５．ｖＣ／石材　 １　ｙＣ）　０．４　１ｖＩ酸（１−１＼・０３、　ｌＩＣ１ｊ：／：：はに　 Ｈ、Ｃ００１−１＞をＩｘ＋えｆ二。　（ｌ材および酸を含Ｕヒーカ−を室温に て、（］　５へ一１時間、・）挿入・、）Ｋ１１間処理に付し、た。ガラス製ス バヂコクでルｒｌ繁に攪拌し八、１試目を熱酸て処理し、頻繁に攪拌しながら、 電気プし＝−１ソヒζ約８０℃にｌ＋ｕ熱した。

各々の試料をカラスフィルターて濾過し、蒸留／＋＜　−Ｑ　ｐ　１１６ま−５ 二洗浄いインキコへ一ター中、該フィルタ　」雪こて、ｚｏｏｃて、恒゛量にな るよて乾燥しｆこ。、重量の損失を計算した６゜酸処理試料（重量損失≧３４％ ）についてＸ線回折分析をｉうい、ＣａＣＯ３含量を飴かめた。

該担体物質の有孔度を水銀圧入法で測定しｊ：：　、、結果を第１は１、グラフ （２）に示す。Ｂ　Ｅ　ｌ”法による表面積は１．９ｍ２／！／＝−あ−・八。

表 ３つの径のフラクノミＩン、市なイ′）ら、ａ：０．５ｍｍより小さいｔｌ”を 子、ｂ・０５〜２ｍｍおよび０３〜５ｍｍの粒子についで酸で処理（７八後の重 量損失（％、試料の初期型ｆｔに基つく） Ｍ　＝　−一重反復試験の平均イ１＾、Ｓ　標Ｈ／′偏Ｘ（％）第８表 ＊　１回の測定 ＊　＊　ＨＮ　Ｏ３処理後の結果 第す表 第Ｃ表 ＊２θ−２９４゜ 担体物質の前処理 バッチ間の変動を防ぐために、該担体物質（その製法は実施例１に記載、０．Ｅ ＋−１ｍｍ）３００ｇを５％ＨＮＯ３１２５０ｙｘＱと共に、頻繁に振とうしな がら、８０℃にて１時間加熱した。担体物質を濾取し、水で十分に洗浄し、１１ ５℃にて一夜乾燥した。この酸洗浄し１．−、担体物質を、後に行う全てのノリ ル化および酵素固定化に用いた。

実施例３ ノリル化 （３−アミノプロピル）トリエトキノノラン〔クイナミント・ノーヘル（ｒ）Ｙ ｎａｍ口　Ｎａｂｅり：ｌを蒸留しく沸点１０９−１ｉｏ℃／／’　Ｉ　２　ｍ ｎ市ｇ）、ウィト　ル、エイチ・エイヂ〔メソッド・エンザイモル（Ｗｅｃｔａ ｌｌ、Ｉｌ、Ｉｌ、。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｍｏｌ、　）、・１４．１９７６．１３４頁〕記載の方 法により、種々の量のフランを用いた水性媒体およびトルエン中のノリル化に用 いた。反応条イ１は第１表に示す（第４０頁参照）。

実施例４ ゲルタールノアルデヒドを用いたカップリンクによるノリル化担体物質へのアセ トラクテ−トデカルポキノラーゼＣＥ、Ｃ，４，１，１，５’］の固定化 ノリル化（■または■）担体物質４０！７に５０ｍＭリン酸塩緩衝剤（ｐ　Ｊ− ４６，５）中２５％グルタールンアルデヒド８０〃Ｑを加えｌ二。混合物を頻繁 に振とうしながら、室温にて保持ずろと、担体物質は、徐々に、黄褐色から赤味 がかった褐色を呈する。数パーセントの粒子は、はぼ白色てあって、かつ、グル タ　ルノアルデヒドとは反応しないよゞ）である残りの粒子とは明白に異なる。

３時間の反応後、混合物を濾過し、生成物を水で十分に洗浄した。

該湿潤物質を、６０ｍＭリン酸塩緩衝剤、ｐｌ−（６，５中のアセドラクチ−） ・テカルボキシラーセ（２４４０Ｕ）、蛋白質（］０６ｓ７）を合む酵素溶液Ｉ Ｏ順に加え、混合物を頻繁に振とうしながら、室ｌｈｋにて５時間放置した。赤 味かかった褐色固定化物を濾取し、フィルター十にて０　、２　Ｍリン酸緩衝剤 （ｐｌ（６，５）８０ｍρで洗浄し、吸着した酵素を採取し、ついで、水］１０ ｍＱて洗浄する。固定化した酵素を密閉容器中にて湿潤下で貯蔵した。

実施例５ ■　ンクロヘギノル　３−（２−モルホリノエチル）カルホジイミト、メソ−１ ）−）ルエンスルホネート（Ｃ１ｖＩＣ）を用いたカンプリングによるノリル化 担体物質へのアセトラクテ−トデカルポギシラーゼ（Ｅ、Ｃ，４，１，１，５） の固定化 ノリル化（Ｖ）担体物質３０９に、酵素溶液１３　’Ｉｔ２ＣＯ、Ｉ　５’Ｍリ ン酸塩緩衝剤、ｐＨ４，０中のアセトラクテートデ力ルホキンラーセ（８８０Ｕ ）、蛋白質４０ｍ９を含む〕、ついで、ＣＭＣ５００ａｇを加え７′為反応混合 物を４℃にて一夜帷拮したが、すくに無定形沈殿物か生しはしめた。翌日、上澄 液（ｐ）＋　６　、０　）および無定形沈殿物をデカンテーノヨン（、て除いた 。

該担体物質を濾取し、フィルター七にて、０　、２　Ｍリン酸塩（吐１６５）５ ０ｘＣ１ついて水３００ｍ０．て洗浄し、該生成物を密閉容器中にて湿潤下で貯 蔵した。

実施例６ 非シリル化担体物質へのアセドラクチ−トデカルポキンラーセ（Ｅ、Ｃ１１，１ ，１，５）の吸着、ついでグルタ−ルノアルデビによる架橋水に対して透析じた 酵素溶液８６〒Ｑ（アセ）・ラタテート・−ノ゛カルボキノラーゼ２２８０ＬＩ および蛋白質５８・＋７を含Ｃ）に４１ノリル・化社（体物質３０９を加え、溶 液を・１℃にて−・夜准）５し、吸着し１こ酵素をｔ８取し、水７５仄Ｑて洗浄 した。

該湿潤物質をほぼ等しい径の２−九）部分に分り、こ、ノーらを、別へ・に、グ ルタ−ルノアルデヒドの０５％および２５％の水溶液２’Ｏａａ、Ｋ々に加えた 。室温にて、２時間頻繁に振とうしｂ後、２つの反応混合物を、別々に、濾過し 、０．２Ｍリン酸塩緩衝剤（ｐＨ６，５）＋　００．ＩＩＣ！および水２００ｚ （２て洗浄した。２つの固定化しｆこ酵素組成物を密閉容器中にて湿潤下で貯蔵 した。

実施例７ クルタールノアルデヒドを用いＩこカップリングによろノリル化担体物質へのア ミノアノラーセ（Ｅ、Ｃ，３，５，１，Ｉ　４）の固定化５０ｍＭリン酸塩緩衝 剤（ｐＨ７，０）９０ｖｄ）に、水性２５％タルタールノアルデヒドＩＯｍＱお よびノリル化（■）担体物質５０９を加えｆ二。室温にて、２時間頻繁に振とう した後、ついて、赤味がかっｆ二褐色物質を一芒取し、水で十分に洗浄した。こ の湿潤物質を、５０ｍＭリン酸塩緩衝剤（ｐ、Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ　Ｒｅｓ、　 Ｃｏｍｍｕｎ、　）、４８．１９８３．２３９頁〕、文献に記載されているよう に精製することかできる〔ロノケン、ノエイ・ビイおよびストールマー、エフ・ シイ、ヨーロピアン・ツヤ−ナル・オブＨバイオケミストリー（Ｌｏｋｅｎ、Ｊ 、　Ｐ、　ａｎｄ　Ｓｔｏｒｍｅｒ、Ｆ、　Ｃ，、Ｅｕｒ、Ｊ　、　Ｂｉｏｃｈ ｅＩｌｌ、　）、Ｉ４．１９７０．１３３頁〕。部分的な精製〔ゴツトフレッド セン、ニス・イーおよびオソテセン、エム、カルルスベルグ°コミュン（Ｇｏｄ ｔｆｒｅｄｓｅｎ、Ｓ、　Ｅ、　ａｎｄ　０ｔｔｅｓｅｎ、ｉｖｌ、　、Ｃａｒ ｌｓｂｅｒｇＲｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　）、４７、ｌ９８２．９３頁〕は該酵 素を硫酸アンモニラ１、沈殿物として提供し、これを、蒸留水または２５ｍＭリ ン酸塩（ｐＨ６５）のい−４冒ｔかに透析した。この２つの透析酵素溶液は、各 々、蛋白質１ｍｇ当たり、３９Ｕの蛋白質６８．ｌｌ□９／！Ｉρおよび蛋白質 １〜当たり、２３Ｕの蛋白質１３　、２　ｍｇ′ｍＱを有し、共者とも、実施例 ４．５および６に記載したように固定化実験に用いた。

アセトラクテ−トデカルポキノラーゼを用いた固定化実験の結果を第２表に示す 。グルタ−ルンアルデヒドを用いたカッブリンクは、最も高度なシリル化（第１ 表）を示したシリル化（Ｖ）担体物質、および水性媒体中でシリル化したこわす かにシリル化されたｆこ：Ｊのよってあるノリル化（１）担体物質の両方を用い て行った。ノリル化担体物質組成物は、雨音とも、クルタールノアルデヒド反応 の間、黄褐色から赤味かか−・ｆ二褐色を示すか、ノリル（Ｖ）担体物質は、は っきりと、より濃く着色されノこ。

２つのノリル化担体物質組成物は、共に、グルタ−ルノアルデヒドによるカップ リングの間に酵素活性生成物を提供するか、活性ならひに収率および蛋白質結合 量は、水性媒体中においてシリル化され／こ担体物質の方がより高い。

ＣＭ　Ｃによるカップリンタはアセドラクチ　トデ力ルポギノラーゼに適してい るようには思えない。ｐＨ調整および６し争の間の活性損失（Ｊアミノアシラ− セについて観察されろよりも少ないか、その固定化物は、実際には、酵素活性を 全く示さない。

非ノリル化担体物質へ吸石させ、ついて、グルタ−ルノアルテヒトにより架橋す ることにより、良好な活（！■を有する固定化アセ１ラクテ−トデカルポキノラ ーセの組成物が得られる。加えた蛋白量の７９％および加えた活性の８９％か吸 着し、架橋後、活性および収率ば得らねｒ民Ｊｖ）のうち、最も高い。架橋を０ ５％または２５％のグルタールノアルデヒドて行うかは、とくに重要なことでは ないようである。

クルタールンアルデヒドを用いたカップリングによるシリル化担体物質へのアミ ノアンラーゼの固定化は酵素活性固定化物を提供オろか、収率は低く（０，５％ ）、洗浄による出発物質の回収は５６％であった。

固定化後、担体物質を高緩衝濃度の溶液で洗浄して吸着した蛋白質を遊離ざ０− た。したかって、固定化した酵素は共有結合さぺているとしＧ（Ｊればならす、 検定条件下にて酵素の溶液への漏出か全く観察されない事実、および効果的ｊＳ 濾過による固定化酵素の除去か全ての酵素活性を除去する事実によって支持され ろ。

アミノアノラーゼならひにアセトラクテ−トデカルポキノラーセについて、タル タールノアルデヒドによろカップリンクおよび吸着↓グルクールノＹルテヒト架 橋は、共に、担体物質１ｇ当たり、１１〜１８ｍ９の結合量を提供オろ。

第１表 担体物質のノリル化 （ａ）トルエン中てノリル化し、に担体を濾取し、トルエンおよびアセトンで洗 浄しノニ。濾液および洗液を真空下にて蒸発させ、水に溶解し、塩酸で滴定しｌ ：、、ノリル化担体を１１５°Ｃにて一夜乾燥しノニ。

（ｂ）回収されなかったフランから算出。

第２表 アセトラクテートデカルＨでギノフ　ゼの固定化、Ａ−ノリル化（１）担体物質 のクルク　ルノアルデヒドカツブリンク（第１表参、照） Ｂ−ノリル化（＼７）担体物質５１）タルクールンアルフ゛ヒ）・カッシリ／７ （第１表参照） Ｃ−・ノリル化（Ｖ）担体物質のＣＭＣカップリンタ（第１２２参照）ｒ）、− 非ノリル化担体物質への吸ｒ１、ついて、（１、ｂ　％クルタ　ルアルデヒ謔ま たは０２５％グルタ　ルアルデヒ）坪による架橋（ｂ）酵素溶液をｐｌ−＋４に 調整］ろと、ノリル化担体物質添＋］ｌ前の初期の酵素量か４５％失われた。

拵≠＝緑律 −，４−＋−６−・洪い妄Ｃヒぢ朱番ギ哄抽婁−８罷月ヰ官弁耕テＦｉｇ、　４ Ｆｉｇ、　５ 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｌ　その無機担体の各粒子か少なくとも９０重量％の５ｉＯ７を含有し、かつ （１）水銀細孔方により測定しｆ口約０．１５〜０４５ｃηｊの気孔容量に相当 する、水銀圧入法に基つき２５〜５０容吊％の多孔度を有し、（ｉｉ）０．０２ 〜０１μ屑の平均細孔半径を有し、（ｉｉｉ）ＡＳ’ＦＭ　Ｅ７２８−８０に従 って測定しｆこ少なくとし０５％、好ましくは約９９％の耐厚耗性を６４〜ろ、 炭酸カルシウム、酸化カルシウムおよび酸可治性成分を実質的に含まない、１２ 重唱％以下の三価金属イオンを含む・粒状無機担体物質に結合させろことにより 固定化された酵素からなるごとを特徴と４“ろ酵素組成物、 ２　該担体物質か水銀圧入法に基−）き、少ηＣくとム１５＋ｔ’、／＠、好ま しくは少なくとも２５ぞ２／９、より好ましく：」少なくとら３　ｖ　ｐ’、、 ’ｖＪ）表面積を自する前記第１項の酵素組成物。 ３　該押体物質か、水銀圧入法により測定しｆ口約０１８〜０　３６　ｃ−／／ ９、好ましくは０．２９〜０．３６ｃｚ３／９の気孔容量に相当オろ、水根１１ 人法に基づき３０〜４５容量％、好ましくはｌＩ　Ｏ〜（１，５容量％の多孔度 を打子る前記第１項の酵素組成物。 ４　該担体物質か水銀圧）Ｘ法により　ｄｔｌ＋疋し７・二がｊＯ，３２乙゛′ ・′９．）気ｆＬ容量に相当する、水銀圧入法に基づき約４２容１ｉｔ％Ｊ）多 孔（９）をＯＪ・（゛ろ［）Ｉノ記第３項の酵素組成物。 ５　該担体物質か０．００３〜００５ノｌｋ、好１　Ｌ　＜　Ｌｌ約（］　、　 （］　５　ｌｔ　：の平均細孔半径を打−４−ろ前記第１項Ｊ・−）酵素イ１（ 酸物、６　該担体物質か２０〜５０％のＣａ　ＣＯ、および８０−５０％の５ｉ ０２を含ろ、部分的に結晶性であり、Ｅｌｌｔ」゛反射ビータＱ）位置（ｉ［ｉ ｉ間隔、（１（人）として）、４，３２８．４２６７．１．０９２．４，０５３ ．３．８６０．３．：；ｌＩす、３．０４１１．２．４！Ｊ７．２，２８３．２ （）（）３、Ｉ（）１２．１８７３を持つＸ線回折パターンを（〕Ｌ、、更に（ １）水銀圧入法により測定しノニ少なくとし約０１］５ｃ、・１／９、ＩＩｒＪ ：Ｌ＜（Ｊ少なくとし０　、１　Ｏｃｑ’／＆の気孔容量に相当ずろ、水銀Ｊ］ −人法にＪｌｌ＞〜さ少なくとら１０容屯％、好土しく（」少なくと乙２０容１ １λ％ζ・）多孔度を有し、 （１１）水銀圧入法によ？）測定しｌ二０．００２５７ｚ・、・以［″か５約５ １１η・ま−ζの細孔半径の、広範な細孔半径分布を何し、（ｉｉｉ）水銀圧入 法に基つき、少なくとちＩ　Ｏｚ’／！？、好ましくは少なくとも＋６ｚ’／ｙ の表面積を有する天然の無機物質から多孔ｔｔを増加させろ処理により製造され た前記第１項の酵素組成物。 ７　該担体物質か、面間隔、０関数と１−１て（［Ｉ対的強閲にＪ−・て示さ９ −たＸ線間１；１バク〜ン（１／’　ｌ　ｍａｘ、　（１（人）２３．４３２８ ．２５．’４．２ｆｉ７．３５．４，０９２．３６，４，０５３、ｌ　５．．３ 　８６０．１．３７９２．５４．３，３４９、＋００．３，０４０．４，２，８ ４６．１，２５３３．２３，２，４９７．５．　２．４７’８．５’、２．’４ ６０．２３．２２８′３．２．２．．２３６．１，２　１′（０、”０２０’ｌ ！、Ｊ１４１７９．７，１，９２４．２（［、］、９１２．２２．１，８７３． ７．Ｉ　８１８）をｆ〕オろ無機物質から、多ｒＬ性を増加さ且ろ型理に上−１ て製造さ、ＩＩ　／Ｚ物質と同一てあろ前記第６項の酵素組成物。 ８　該担体物質の」雪ニド（１、（）　（］　５〜ｌ、Ｑｌｌｒｈをもするイ［ １）孔か該細孔全体の少なくとし８０％、好ましくは少なくとも９０％を占めろ 前記第１項の酵素組成物。 ９　該担体物質か最大６−の粒子径を有オろ前記第１項の酵素組成物。 １０　該担体物質がモース硬度スノγ−ノ冒、−従し）約７の硬度を何ａ−／） 前記第１項の酵素組成物。 １Ｆ　該酵素を該担体に、吸６に上ｉ）、７）　ｌ　）−ｉ：所望にｈｌ）分子 間ｊ４′（橋（より、まｆニ（」所望に上りカフ　７’リノケ昂］汐用Ｌ）ノー １１、（ｊ結りによ・てＦ！ｉ合さ且ｆ：前ハ１１第１項〜第１０項のい−４れ かに記・Ｉ２（ハ酵素）′旧戊物５．１２　該酵Ｘかオキシドし・タグラーゼ、 ［・秒ンスーノ［ラーゼ、ヒトし！−ノーセ、リアーゼ、イソメラーセ圭へはリ ガー七てっろ＋ｉ７ｊ記第１起筆・第１１項のいずれかに記載の酵素組成物、 １３　ソノ（Ｑ１４世休０）各１−Ｂ１．　ｘｉ　ｉＮＮ１３′＜とｔ−１９Ｑ 　＄’３Ｈ’＜％０）３１０．＜、）：　４）’　ｉ、かっ （ｉ）水銀圧入法により測定しへ約ＯＩ５〜０１５ｃ・′／家、打上しくは約０ ．１８−０．３６ｃｚ”／７１．）、すを丁土Ｌ　＜　Ｉｉｏ　、２９−０．３ 　ＧｃＩＩ１＝””ｙの気孔容量に相当する、水銀圧入法に括−）き２５〜５０ 容ｒｒ１％、好よしく　ハ３０−４５容量％、ヨ’）好＊シ＜ＩＩ４０−４５容 ｎＸ　％（・＞、多ｆＬ度をｒｊし、 （ｉｉ）０．０２〜０１μｍの平均細孔半径を有し、（ｉｉｉ）ＡＳＴＭ　Ｅ７ ２８−８０に従って測定した少なくとし９５％、より好ましくは約９９％の耐摩 耗性を有する、炭酸カルシウムおよび酸化カル７ウムを含まない、１２重量％以 下の三価金属イオンを含む粒状の無機担体物質に、酵素を結合させろことを特徴 とする酵素固定化法。 １４　該担体物質か水銀圧入法に括つき、少なくと８１５　＋１１２／凱好まし くは少なくとも２５ｔ２／ｙ、より好ましくは少なくとら３５１＋＋２／９の表 面積を有する０ｆｆ記第１３項の方法。 １５　該担体物質か水銀圧入法により測定しｌ口約０１８〜０．３６ｃｑ３／凱 好ましくは０．２９〜０　、３６　ｃｍ３７ｇの気孔容量に相当する、水銀圧入 法に基づき３０〜４５容量％、好ましくは４０〜４５容量％の多孔度を有ずろ前 記第１３項の方法。 １６　該担体物質が水銀圧入法により測定した約０　、３２　Ｃ，＝＋３／！？ ■気孔容爪に相当する、水銀圧入法に基つき約４２容量％の多孔度を何する前記 第１５項の方法。 １７　該担体物質か００３〜００５Ｉ１．７、灯ましくは約（１，０５／ｚヱの 平均細孔半径を有する前記第１３項の方法。 １８　吸着させ、好ましくは酵素分子を架橋し、て結合さ且ろ［１１■記第１； ３項の方法。 １９　架橋かクルタールノアルデヒドにより行な））２′ｌろ前記第１８項（１ ）方法。 ２０　結合か酵素と無機■−Ｉ体の間のＪｔ打結合によイζ行ｒ、；、　：′＋ 　；７１ろ前記第１３項の方法。 ２１共有結合かブノノプリンタ剤により行なわ相ろ前記第２０項の方法。 ２２　結合か担体物質をノリル化し、酵素をカップリンタ剤に１、り該ノリル化 物質にカップリックずろことに、Ｊ−１り行Ｉ璽つれろ前１足第１３項り）ｔ、 ・法。 ２３　該ノリル化剤か（３−アミノプロピル）トリュ、トギノノラノである前記 第２２項の方法。 ２４　担体に結合した（３−アミノプロピル月・リエ）・キノ７ランのｈ″（か 該担体物質１ｇ当たり１ｏ０７ｉＬｊ以下てあろｒＩｉｉ記第２３項の方υ、。 ２５　該カッ７プリンタ剤かノリル化担体物質上のアミノ基を酵素の酸基と連結 き０−ろか、ま１厘よ該担体物質十の酸基を該酵素のアミ、／基と連結させるよ うなカップリング剤からなる群から選（す７！−る面起筆２２項う）方法。 ２６　該カップリング剤かカルポノイミ！・である前記第２５項の方法。 ２７　カップリンク剤かノリル化担体七のアミノ基を酵素上のアミノ基と、また は酸基を酸基と連結と５せろ前記第２２項の方法。 ２８　該カップリンク剤かゲルタールジアルデヒドで６うろ前記第２７項の方法 。 ２９　結＆か酵素を担体に臭化ノアンてカノブリンンさＵることがらノ′。 る前記第１３項の方法１゜ ３０　該酵素かオキシドルグクラーセ、（・ラノスフエラーゼ、ヒトラーセ、リ アーゼ、イソメラーゼまたはリカーセてめろ面起筆１３項〜第２９項のい４′メ １かに８己載の方〆去、：ｎ１ｉ７＋記第１項〜第１２項のいずれかに記載の固 定化酵素組成物をその酵素の粘質と接触さ仕ろことを特徴とする酵素反応を行Ｇ −）方法。 ３２　その無ｖ）、担体の各粒子か、少なくと８（）０重量９わ・）Ｓｉｎ、を 含ぞ了（］）水銀圧入法により測定しｆ口約Ｏ１５〜０．４５ｃ７”／＆の気孔 容量に相当する、水銀圧入法に基つき２５〜５０容吊％、７）多ＦＬ度を白し、 （目）００２〜Ｏｌμ７の＼１４均紺（孔′１−径を何１７、（ｉｉｉ）ＡＳＴ Ｍ　ト：７２８−８０に従−）で測定しｌこ少なくとム５）５％、好ましくは約 ９９％の耐摩耗性を何４−ろ、炭酸カルシウム、酸化カルシウムおよび酸可溶Ｖ ［、成分を実質的に金主ない、１２重量％以下の二価金属イオンを含む無機押体 物質。 ３３　水銀Ｉ（−人法に括づき、少なくとちＩ５が／９、好ましく・：」少４． ｊ　（とら２　ｊａ’／＠、より好ましくは少なくと０３５ｉ’／ｇの表面積を イ］する前記第３２項の無機担体物質。 ３４　水銀圧入法により測定しｉ：０．１８〜０．３６ｃ、ｔ３／凱好ましくｉ Ｊｏ　２９〜０．３６ｃｉ々３／９の気孔容量に相当−４゛ろ、水銀圧入法に基 つき３０〜４５谷徹％、好ましく（：１：４０〜４５容量％の多孔度を有ずろ前 記第３２項の無機担体物質。 ３５　水銀（［゛入法により測定１１．ｆこ約０．３２ｃ、＝３／９に相当ずろ 、水銀圧入法に基つき約・１２容量％Ｇ）多孔度を有オろ前記第３２項の無機担 体ギ］質。 ３８．０．０３−０．０５７１ｔ、好ましくは約０．０５４＝の平均細孔半径を 有する前記第３２項〜第３５項のいずイ１かに記載の無機担体物質、３７．２（ １−５０％のＣａＣ０，＋および８０−５０％り・）ＳＩＯ２力じ）’ＩＳ　ｊ ）、部分的に結晶性てあ・・で、主要な反射ピークの位置（面間隔、ｄ（人）と （２て）：４，３２８．４，２６７．４０９２．４０５３．３，８６０．３３４ ９．３．０４．０，２　１１．９７．２２８３．２０９３．１９Ｉ２．１８７′ ３を持一つＸ線回折パターンを白ｊ−１更に（１）水銀圧入法により測定した少 なくとし約０．０５ｃｑ”／９、好ましくは少なくと００　、　ｌ　Ｏｃｔｒｔ ”／ｇｔｔ＞気孔容量に相当する、水根用人法に基つさ少なくとち１０容量％、 好ましくは少ｆバ七し２０容量％の多孔度を白゛し、 （ｌ］）ノ１（銀ト＋人法によ二）測定し１こ＜０．ＯＯ’２′Ｄｐワから約５ μ−１−〇の細孔’Ｆ　ｔＭ　”、広範１．；　ｌ１８’ｌｌ孔Ｔｉｆ分布Ｇ− ＭＬ、（ｉｉｉ）水銀圧入法に基つき、少なくとしｌ（Ｈ：、”９、好ましく： よ少ｒ；くとも［Ｓ７２／９の表面積を自オろ無機物質から、多孔性・（増１＋ ＋、＋さ４１ろ史り理によって製造された物質と同一である＋ｉ？ｉ記第、起筆 項〜”：ｉｅ、ｔ、ｉｑ・）（１４れかに記載の無機担体物質３