CN101330951A - 将液体介质与蛋白质分离的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于从液体介质分离蛋白质的方法,包括提供含有蛋白质的液体介质,提供粘土材料,其具有:大于150m2/g的比表面,大于0.35ml/g的孔体积,大于40meq/100g的离子交换能力,以及小于15ml/2g的水中沉降体积,平衡所述粘土材料至3.5至9.0的pH,用所述平衡的粘土材料处理所述液体介质,以及将纯化的、蛋白质贫化的液体介质与粘土材料分离。
Description
本发明涉及用于将蛋白质与液体介质分离的方法。
如今,借助于细胞培养技术成功地大规模产生生物活性物质。建立的方法使得既能产生用于工业应用、例如如食品生产的酶又能产生药学上重要的重组蛋白质。这涉及通过微生物或哺乳动物细胞产生并然后从培养基或细胞分开而制备的靶标蛋白质。这种生产过程分为用上游培养基制备物发酵和用于纯化靶标蛋白质的系列下游步骤。蛋白质纯化过程的步骤的花费通常超过总生产费用的80%。纯化通常涉及色谱方法的使用,以便在生产流程中首先浓缩靶蛋白质以及其次分离异种蛋白质和其它污染物,例如内毒素、病毒或DNA。如果色谱材料用了几次,则必须不断检测它们的分离性能或可能的微生物污染。确认和纯化的花费可以通过使用一次性材料而部分减少。为了成功地得到采用,这样的一次性色谱材料必须可重复地产生高的分离性能以及要求耗费的每个单位的低的投资。其对所关注的靶蛋白质或干扰污染物应该具有高的结合能力和快速的结合动力学。
膨润土,以及更特别是它们的主要矿物成分蒙脱石,适于蛋白质的可逆结合。膨润土以及其它相当的片状硅酸盐在此充当天然的阳离子交换剂并且可以在低于它们的等电点的pH值下吸附蛋白质。然而,钠膨润土具有在水中充分膨胀的性质。将数克钠膨润土引入至水溶液中导致粘度大大增加,使得该液体介质的处理更加困难。而且,因为充分的膨胀极大地增加了过滤组合件或柱填充物的体积,由此阻塞了过滤器或柱,因此钠膨润土在色谱柱中作为过滤介质或用作填充物的使用非常复杂。因而,到目前为止唯一可能的工业应用包括在每种情况下将钠膨润土分批加入至待纯化的液体介质中,并在吸附蛋白质后,再通过过滤分离所述膨润土或通过将纯化的液体介质挤出膨润土而将其分离。
C.Buttersack,K.Novikow,A.Schaper和K.Buchholz(Zuckerind.119(1994),No.4,pp.284-291)报道了片状硅酸盐用于从均质化的甜菜滤过汁液分离酶的用途。通过吸附至钠膨润土并随后用pH缓冲液解吸而以简单的方式分离纯的酶。研究证明,片状矿物质十分适于分离或浓缩蛋白质。然而,处理这些片状矿物质是复杂的,因为它们大大增加了水中的悬浮液的粘度,伴随着所述的片状矿物质崩解产生非常小的颗粒。因而通过将该片状材料填充到柱中,然后将含有蛋白质的流体经过该柱的方式浓缩蛋白质是非常困难的。如果没有辅助措施,该柱因为片状矿物质重复地膨胀而相对快地被阻塞。然而为了使得酶从柱中分离,作者提出将钠膨润土包埋在藻酸钙凝胶中。将加氢的匀浆液在pH=5.0下用泵经过用固定化的膨润土珠粒填料的柱。在未吸附级分离开该柱后,用调节至pH=8的缓冲溶液洗脱酶。如作者所述,由于产生了高的费用,固定于藻酸钙中的钠膨润土的使用不太适用于蛋白质的工业化分离。
DE1 160 812 A1描述了使用大孔硅胶作为吸收剂增加啤酒的蛋白质稳定性的方法。啤酒用细磨的硅胶处理,所述硅胶具有200至400m2/g的表面、大于0.6ml/g的孔体积和大于60的孔直径。
GB 752,669描述了将含硅污染物与含有胰岛素的溶液分离的方法。在生产胰岛素期间,后者可以通过将其吸附至二氧化硅或粘土以使得溶剂被分离而与有机溶液分离。然后可以用强碱水溶液再次洗脱所述胰岛素。然而由于强碱pH,水胰岛素溶液被从吸收剂脱离的含硅污染物污染。所述污染物是胶质的,因而使得它们难以通过过滤分离。为了分离这些污染物,人们提出将水溶液调节至从6.5到9.0的pH,并随后保持。沉淀形成,其可以容易地通过过滤分离。
US 4,605,621描述了用于固定化酶的方法,其中酶与有机改性的粘土反应。使用的粘土是蒙脱石、锂蒙脱石或蛭石,在粘土中至少部分阳离子被鎓离子和/或有机金属阳离子替代,使得该粘土具有疏水性质。
US 4,126,605描述了用于制备γ-球蛋白的方法,其中从血浆获得的γ-球蛋白级分被进一步纯化。为此,首先将γ-球蛋白吸收于含有水胶体例如羟乙基淀粉、明胶、右旋糖或白蛋白的水溶液中并用缓冲液调节pH的范围为3.5至8.0。该溶液可以进一步通过将其与粘土矿物质的悬浮液混合而纯化。可以使用的粘土矿物质是(例如)膨润土或蛭石。通过加入大约10重量%的量的有机溶剂、例如聚乙二醇,沉淀出基本含有污染物的第一级分。可以例如通过离心而分离所述部分。然后在大约7.0-7.2的pH下加入最多16-24重量%的比例的更多有机溶剂。在该过程中,沉淀出非常纯的γ-球蛋白级分,可随后例如通过离心而分离该级分。
EP 0071647A1描述了用于将干扰素与水溶液分离的方法。为了该目的,将该溶液与含有硅酸的组合物混合。可以使用的这种组合物的例子是膨润土、酸性粘土、高岭土或硅酸铝镁。干扰素被该组合物吸附并可以用含有非离子表面活性剂的水溶液洗脱。合适的表面活性剂的例子是脱水山梨糖醇单烷基酯、多烷基酯或聚环氧乙烷-聚环氧丙烷共聚物。
近来,已经发现一类新的粘土材料,其具有非常好的关于生物分子吸附的性质。这些材料,类似先前使用的粘土,是风化的产物。然而,它们不再显示出任何结晶性质并因而是x-射线非晶形的。与先前使用的粘土比较,它们具有非常高比例的SiO2和非常高的孔体积。与例如钠膨润土相反,它们在水中不膨胀。在本申请的优先权日期后公开的DE 102005012639A1描述了利用这样的粘土材料来将干扰生物分子与液体介质分离的方法。因而,例如,这样的粘土材料适用于使酒澄清或用于稳定啤酒。
本发明的目标是提供一种可以、甚至是在工业规模上、用于将蛋白质成功地从液体介质分离的方法,并且在优选的实施方案中,也应该可以回收分离的蛋白质,而后者不受到活性的不适当丧失。
该目标通过具有权利要求1的特征的方法实现。本发明方法的有利进展是从属权利要求的主题。
本发明方法通过以下步骤将蛋白质与液体介质分离:
-提供含有蛋白质的液体介质,
-提供粘土材料,其具有:
-大于150m2/g的比表面。
-大于0.35ml/g的孔体积。
-大于40meq/100g的离子交换能力,以及
-少于15ml/2g的水中沉降体积,
-平衡所述粘土材料至pH为3.5至9.0。
-用平衡的粘土材料处理所述液体介质,并
-将纯化的、蛋白质贫化的液体介质与粘土材料分离。
令人惊讶的是,发现具有上述性质的粘土材料能以工业应用上感兴趣的量结合蛋白质。平衡所述的粘土材料至pH为3.5至9.0防止了吸附于该粘土材料上的蛋白质的不可逆的失活或变性,从而使得所述蛋白质能被回收,如果合适,不必接受它们活性的基本丧失。所述的平衡优选以下面的方式进行:即用缓冲液处理粘土材料,所述缓冲液具有所关注的蛋白质也是稳定的并且不会受到过度失活的pH。对于所述的平衡,优选使用随后也用于纯化液体介质或所关注的蛋白质的缓冲液。所述缓冲液优选调节至大约与液体介质中已经调节到的pH相同。平衡时间取决于例如粘土材料的量或,如果所述粘土材料以填充物或柱的形式提供,取决于其维数(dimension)。如果柱非常小,则平衡时间可以、如果合适、仅为数秒,而对于非常大的柱或过滤组合件也可能需要更长的时间。平衡优选进行至少10秒,优选至少30秒,特别优选1-60分钟。优选用待纯化液体介质或待纯化蛋白质还未加入的缓冲溶液进行平衡。
进一步的优点是用于本发明方法的粘土材料具有少于15ml/2g、优选少于10ml/2g的低的沉降体积,即所述材料在水中仅可忽略地膨胀。由于粘土材料的低膨胀,待纯化的且含有蛋白质的液体介质在将粘土材料加入至其中时粘度没有显示实质性的增加。另外也可以将相对大的量的粘土材料引入至液体介质中,以使得所关注的蛋白质可以毫无问题地、甚至是与具有高的所述蛋白质浓度的介质分离。使用的粘土材料也可以毫无问题地通过过滤从所述液体介质分离。由于低的膨胀度,该粘土材料不会阻塞过滤器。因此,当滤掉蛋白质贫化的液体介质时仅需要相对低的压力。
使用的液体介质原则上可以是任何来自生物源或含有蛋白质的流体。该方法特别适用于从生物反应器处理反应混合物,以便以大的流体量分离或浓缩所关注的生物活性物质。另一可能的用途是例如从体液例如尿或其它生物样品分离蛋白质。这使得蛋白质能快速地从例如体液样品分离和纯化。为此目的,将样品,例如体液或其它的含有蛋白质的样品加入到已经预先平衡至合适的pH的粘土材料中。蛋白质被吸附于粘土材料上,而液相可以分离。然后可以冲洗该粘土材料,优选使用其pH大致对应于含蛋白质的液体介质在施用至该粘土材料前已经调节至的pH的缓冲溶液。这使得污染物能被洗掉,而蛋白质保持吸附于粘土材料上并因而被进一步纯化。在冲洗步骤后,可以洗脱蛋白质并然后将是浓缩的形式。
如果合适,样品必须以通常的方式、例如通过进行粗过滤或通过缓冲样品而制备。优选将样品缓冲至在平衡粘土材料期间已经调节到的pH。这种样品制备是本领域技术人员所已知的。推测为用于本发明方法的粘土材料充当阳离子交换剂,伴随碱金属或碱土金属离子从该粘土材料释放并被蛋白质所替代。蛋白质在蛋白质表面上含有带电荷的氨基酸残基,其能与粘土材料表面上的带电荷的基团相互作用。蛋白质的净电荷是围绕所述蛋白质的溶液的pH和所述蛋白质的pI所决定的。蛋白质的pI对应于所述蛋白质的净电荷等于零时的pH。pI是蛋白质的氨基酸组成和三级结构所决定的。在酸性pH范围内,氨基酸(优选强碱性氨基酸精氨酸、赖氨酸和组氨酸)质子化,该蛋白表现出阳离子特征。在碱性pH范围内,酸性基团天冬酰胺和谷氨酰胺携带负电荷,蛋白质是阴离子。蛋白质和粘土材料之间的相互作用在接近等电点时很低,并随着pH和pI之间差值增加而增加。因而优选将介质调节至与待分离蛋白质的等电点相差至少一个单位的pH。例如,如果蛋白质具有5.5的pI,则优选在低于大约4.5的pH下分离。
用于本发明方法的粘土材料具有大于0.35ml/g、优选大于0.5ml/g的孔体积(通过BJH方法测定(对于具有直径在1.7-300nm范围的孔,累加孔体积),大于150m2/g、优选大于180m2/g、特别优选大于200m2/g的比表面(BET表面),以及大于40meq/100g的离子交换能力。该粘土材料的特征也在非常低的膨胀度。膨胀体积优选对应于沉降体积。适用于测定孔体积、比表面、离子交换能力和膨胀体积的分析方法在下文中详述。
特别优选使用其离子交换能力大于40meq/100g、优选范围为45-75meq/100g的粘土材料。粘土材料优选具有范围为150-280m2/g、特别优选范围为170-260m2/g的比表面(BET)。使用的粘土材料的孔体积优选范围为大于0.35ml/g、优选大于0.5ml/g、特别优选范围为0.7-1.1ml/g,并且非常特别优选范围为0.80-1.0ml/g。
如上文所解释的,用于本发明方法的粘土材料仅非常小程度地膨胀,对于水悬浮液的粘度增加不造成问题,例如其通常用钠膨润土观察到。将粘土材料室温下保留在水中3天后,沉降体积优选少于15ml/2g、优选少于10ml/2g。室温指大约15-25℃、特别是大约20℃的温度。
使用的优选粘土材料是天然存在的、天然活性的或不是天然活性的粘土材料,其优选没有经历任何化学修饰,更具体地讲没有用强酸脱铝。该粘土材料,根据需要,可以被干燥合研磨至合适的颗粒尺寸。技术人员根据所打算的应用而获得颗粒尺寸。
除了天然存在的粘土材料,具有上述性质的合成产生的粘土材料原则上也可以使用。这种粘土材料可以例如,由水玻璃和合适的片状硅酸盐例如膨润土生产。然而,优选使用来自天然来源的粘土材料。
特别优选使用以无水粘土材料计,作为Al2O3计的铝含量少于11重量%的粘土材料。该铝含量优选大于2重量%,特别优选大于4重量%,尤其优选大于6重量%。铝含量尤其优选为8-10重量%的范围。通过用强酸提取而获得的粘土材料表现出比用于本发明的方法的粘土材料低的Al2O3含量。
特别优选使用仅具有低结晶度,即本身没有分类为片状硅酸盐一类的粘土材料。所述低结晶度可以通过例如X-射线衍射测量法测定。特别优选的粘土材料是基本上非晶形的,即它们的X-射线衍射图片没有显示任何尖峰。因此,它们不属于纯凹凸棒石或蒙脱石的类。
尽管不愿受该理论的束缚,但本发明人假定用于本发明方法的粘土材料包含由硅胶构成的骨架。片状硅酸盐包埋在这种相对刚性的骨架中。通过锚定于该硅胶骨架中,该片状矿物质能够极大地膨胀而不极大地增加其总体积。然后该膨胀的片状硅酸盐可用于大程度地吸附蛋白质。硅胶是主相,而粘土相形成了该粘土材料的较小部分。据推测该粘土材料负责阳离子交换能力。
在优选的实施方案中,用于本发明方法的粘土材料具有特殊的孔径分布。该粘土材料的孔体积这里基本上通过具有直径至少为14nm的孔产生。
特别优选的是,至少40%的总孔体积(通过BJH方法测定,参见下文)由直径大于14nm的孔产生。优选多于50%、并且尤其优选多于60%的总孔体积由直径大于14nm的孔产生。孔径分布或总孔体积通过氮孔隙率测定仪(DIN 66131)测定并通过BJH方法(参见下文)评价吸附等温线。
为了防止蛋白质变性,在施用至液体介质前将粘土材料平衡至大约3.5-9.0、优选4.0-6.0的pH。为了该目的,将粘土材料悬浮于合适的缓冲液、例如柠檬酸缓冲液、或诸如施用至例如由所述粘土材料制备的过滤组合件或柱的缓冲液中。这里缓冲液优选具有为30-100mmol/l范围的浓度。
根据另一实施方案,粘土材料也可以分离蛋白质之前通过用含钠化合物、例如苏打或含钾化合物、例如碳酸钾处理而活化。因此,该粘土材料的二价阳离子部分或优选全部由钠离子替代。如也由钙膨润土的活化而已知的那样,二价阳离子以通常的方式用钠离子替代。将湿含量优选在10至70重量%之间、优先在45至65重量%之间的湿粘土材料与对应与于大约1.2至2.5当量的粘土材料的阳离子交换能力的苏打捏合。或者也可以将苏打以溶液形式喷淋于粘土材料上。然后可以干燥该粘土材料,并如果合适,将其研磨。所述的活化可以进一步增加该粘土材料吸附蛋白质的能力。
在最简单的情况下,可以以下面的方式处理含有蛋白质的液体介质:即将粘土材料直接或以悬浮液形式加至液体介质中,并在一段孵化时间、优选1-30分钟、特别优选5-20分钟后,可以通过合适的方法、例如过滤或离心将其与所述液体介质分离,从而对所述蛋白质的介质进行贫化。
根据另一实施方案,蛋白质可以通过将液体介质经过至少部分由粘土材料形成的过滤组合件而分离。该过滤组合件原则上可以具有任何形式。合适的是例如用该粘土材料填料的滤筒(filter cartridge)。一旦滤筒的吸附能力耗尽,可以用新的滤筒代替该滤筒。可以将负载了蛋白质的滤筒或者丢弃或优选对其进行处理操作,在该操作中吸附于粘土材料上的蛋白质得以回收。
根据一个实施方案,通过预涂覆过滤而制备过滤组合件。这包括将粘土材料优选与助滤剂例如硅藻土或混合。该粘土材料也可以与另外的吸收剂例如硅胶混合。在过滤过程中,粘土材料与助滤剂以及、如果合适、另外的吸收剂一起形成滤饼,所述滤饼形成用于后面的混浊物质的过滤活性介质和助滤剂颗粒。如果蛋白质作为干扰物有待从液体介质中除去,则该实施方案是特别合适的。
优选的是,在直接过滤之前,将助滤剂层用作过滤装置的第一层。可以使用的过滤装置的例子是具有合适窄的筛目的筛。可以用于形成第一层的助滤剂的例子是硅藻土。该过程也称为初步预涂敷。在随后的过滤阶段中,将根据本发明含有上述粘土材料的另外的助滤剂加入至悬浮液中。所述的助滤剂与浑浊的物质颗粒一起形成称作第二层的滤饼。
根据本发明方法的另一个实施方案,所述的方法通过色谱法实施。这包括将粘土材料填充进色谱柱中并将液体介质施加于该柱,蛋白质有待与所述液体介质分离。然后让洗脱剂经过该柱,使得蛋白质由于吸附效果而分级成不同的级分。这对于分离生物反应器中产生的蛋白质而言是特别令人感兴趣的。这证明本发明方法中使用的粘土材料的优点,这种材料以非常低的膨胀度而显著。
为了能够将根据本发明的粘土材料用于柱填充,有利的是通过筛选将所述材料调节至合适的颗粒尺寸。在此特别优选的是特别除去粘土材料的微粒部分。
将该粘土材料调节至优选>10μm、尤其>20μm、特别优选>30μm、特别是40至300μm范围的颗粒尺寸。特别优选的是,粘土材料在45μm网筛上具有>95%的初始重量的干筛残余物,在63μm网筛上具有>80%的干筛残余物,而在150μm网筛上具有>30%的干筛残余物。
本发明的方法优选用于从液体介质中获得蛋白质。为此目的,将蛋白质吸附至粘土材料并,如果合适,通过进一步的冲洗步骤进行纯化并然后从粘土材料再洗脱。吸附至粘土材料的蛋白质可以通过各种方法洗脱。例如,可以通过增加盐浓度将蛋白质从粘土材料的结合位点置换。也可以以吸附的蛋白质的电荷受到修饰并因而后者不再被粘土材料结合的方式调节用于洗脱的溶液的pH。如果被提供用于将液体介质和蛋白质分离的粘土材料为液体介质经过其中的柱的形式,则吸附的蛋白质可以、例如通过将盐梯度以不同的蛋白质在不同的盐浓度下洗脱,即吸附的蛋白质得以分级的这样一种方式经过该柱而得以洗脱。蛋白质通过特别是电的相互作用和/或范德华力等结合至本发明方法中使用的粘土材料等。用高盐浓度的缓冲液洗脱减弱了充当阳离子交换剂的粘土材料和蛋白质之间的静电相互作用。因此所述的蛋白质可从粘土材料上脱离和洗脱。
在进一步的实施方案中,通过改变pH洗脱结合的蛋白质。在这种情况下,洗脱剂的pH不同于液体介质的pH。
例如,蛋白质可以以在其下它们是带电荷的形式的pH施加。然后优选调节溶液的pH以使其其低于蛋白质的等电点,即蛋白质总体带正电荷。蛋白质由于粘土材料的阳离子交换剂作用而结合。因此用于本发明方法的粘土材料充当阳离子交换剂材料。如果pH随后增加至达到或超过蛋白质的等电点的程度时,在大多数情况下,蛋白质总体带负电荷。因此所述的蛋白质再次从粘土材料脱离并可以洗脱。
如果合适,洗脱剂可以与甘油或聚乙二醇类混合。这些化合物对粘土材料具有非常高的亲和力并因此可促进蛋白质从粘土材料脱离。
优选包含水作为溶剂的液体介质。
用于本发明方法的粘土材料可以单独使用或者与另外的吸附材料组合使用。该另外的吸附材料优选选自硅胶、纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。
粘土材料和另外的吸附材料优选以1∶10和10∶1之间的比例。然而,取决于期望的应用,也可使用在该特定范围之外的比例。
用于本发明方法的粘土材料具有非常高的载水能力但仍然保持可流动。粘土材料具有优选大于30重量%、尤其大于40重量%、特别优选大于50重量%的水含量。
本发明的方法基于下列实施例并结合附图来进行更详细地描述,其中:
图1:描述表示与pH相关的本发明方法中使用的粘土材料对模型蛋白质的吸附的图;
图2:描述在50mM柠檬酸盐缓冲液中记录的用于本发明方法中的粘土材料对多种模型蛋白质的吸附等温线,以及
图3:描述表示与多种模型蛋白质的施加速率相关的用于本发明方法中的粘土材料的负载的图。
分析方法
表面/孔体积:
粘土材料的表面根据DIN 66131在来自Micromeritics的ASAP2010型全自动氮孔隙率测定仪上进行测量。使用BJH方法(I.P.Barrett,L.G.Joyner,P.P.Haienda,J.Am.Chem.Soc.73(1951),373)测定孔体积。通过合计通过BJH评估吸附等温线而获得的增加的孔体积测定详细的孔径大小范围的孔体积。根据BJH方法的总孔体积指得是直径为1.7-300nm的孔。
水含量:
使用DIN/ISO 787/2方法测定在105℃下产物的水含量。
元素分析:
该分析是基于粘土材料或相应产物的完全解聚。在固体溶解后,例如通过特定的分析方法例如如ICP对各种组分进行分析和定量。
离子交换能力:
通过在105℃下将要检验的粘土材料干燥2小时来测定离子交换能力。然后将干燥了的粘土材料与过量的2N NH4Cl的水溶液回流1小时。让该混合物保持在室温下16小时并然后过滤,随后洗涤、干燥和研磨滤饼,并根据生产商的说明书通过氮测定(来自Leco公司的CHN分析仪)测定粘土材料中的NH4含量。交换了的金属离子的比例和类型在滤出液中通过ICP-AES光谱法测定。
X-射线衍射:
使用配备有铜阳极的来自Phillips的高分辨率粉末衍射仪(X′-Pert-MPD(PW 3040))进行X-射线成像。
沉降体积的测定:
将100ml刻度的量筒装满100ml蒸馏水。使用匙形物,将2g待测量物质缓慢地且每一情况下以约0.1-0.2g的部分施加至水的表面。在先前的部分沉淀后加入另一部分。在所述的2g物质加入并沉淀到量筒的底部后,将后者保留在室温下1小时。随后从量筒的刻度以ml/2g读取沉降体积的高度。为了测定在水中储存3天后的沉降体积,将该样品混合物用密封并无振动地放置在室温下3天。然后从量筒的刻度读取沉降体积。
干筛残余物的测定:
在45μm筛网上称出约50g待检验的风干的粘土材料。所述筛连接至真空吸尘器,该真空吸尘器经由在筛底部循环的吸气槽通过所述筛抽而吸入所有比筛微细的部分。用塑料盖将筛覆盖并且接通真空吸尘器。5分钟后,断开真空吸尘器并通过重量差异而确定残留在筛上的较粗大部分的量。
湿筛残余物的测定:
首先,通过在约930rpm下搅拌相应量的待检验的粘土材料至水中约5分钟而制备5%浓度的悬浮液。将该悬浮液在约1865rpm下再搅拌15分钟并然后倾注通过期望筛目的筛。用自来水洗涤残余物直至流出物澄清。然后将具有残余物的筛置于超声浴中5分钟以除去剩余的微细部分。将剩下的残余物用自来水简单洗涤,并重复超声处理,如果合适,直到在所述超声处理过程中没有另外的微细物质进入水中。然后将筛干燥至重量恒定。将残留再筛上的残余物转移至称量过的瓷皿中称重。
粘土材料的特征:
a)粘土材料A:
检验适合于本发明方法的粘土材料(EX 1221I;Süd-Chemie AG,Moosburg,DE,(Rohtonlager Res.No.:03051))的物理化学性质。获得的结果总结在表1中。
表1:粘土材料A的物理化学分析
比表面 (m2/g) | 219 |
孔体积1 (ml/g) | 0.881 |
IUF (meq/100g) | 52 |
元素分析:SiO2 (重量%)Fe2O3 (重量%)Al2O3 (重量%)CaO (重量%)MgO (重量%)Na2O (重量%)K2O (重量%)TiO2 (重量%)赤热时的损耗 (2h 1000℃) | 70.62.89.81.44.10.261.50.257.9 |
总量(重量%) | 98.6 |
1:对于直径在1.7和300nm之间的孔根据BHJ的累加孔体积。
将本发明的硅酸盐筛选至颗粒尺寸>45μm,以便其为可以容易地填充进柱中的形式。筛选的材料在45μm筛网上具有>95%的干筛残余物。该干筛残余物在63μm筛网上为85%以及在150μm筛网上为30%。
进一步检验在表1中表征的粘土材料的具有特定孔径的孔产生的孔体积比例。对应的数据总结在表2a至c中。
表2a
孔的相对孔体积比例
表2b
孔的相对孔体积比例
表2c
孔的相对孔体积比
b)粘土材料B:
适合于实施本发明方法的另一种粘土材料的物理化学性质总结在表3中。
表3
粘土材料B的物理化学分析
比表面 (m2/g) | 198-206 |
孔体积1 (ml/g) | 0.402 |
IUF (meq/100g) | 62 |
元素分析:SiO2 (重量%)Fe2O3 (重量%)Al2O3 (重量%)CaO (重量%)MgO (重量%)Na2O (重量%)K2O (重量%)TiO2 (重量%)赤热时的损耗 (2h 1000℃) | 35.20.934.615.416.00.470.660.125.4 |
总量 (重量%) | 98.76 |
c)粘土材料A的碱性活化
当测定总离子交换能力(IUF)时,可由洗出液中的离子浓度测定出总阳离子交换能力的Na+和K+的比例是32%(Na+:23%,K+:9%)。由此,可以计算出实现用单价离子的化学计量活化所需要的2%的苏打的量。
在表1中表征的粘土材料A最先破碎成直径小于3cm的碎片。如果合适,可通过用水喷射碎的粘土材料以调节水含量而达到约45重量%至65重量%的水含量。将350g预先破碎的粘土材料A置于混合装置(例如Werner&Pfleiderer混合器)中并捏合1分钟。随着混合装置依然运行,随后加入2重量%的固体苏打(基于无水的粘土材料A)并将该混合物再捏合10分钟。如果该混合物不充分光滑,可加入蒸馏水以便获得充分剧烈的剪切作用(intense shear ing action)。
将捏合了的物体分成小份,其在循环空气干燥器中在约75℃下2至4小时被干燥至10±2%的水含量。然后将干燥了的材料在旋转破碎机(例如Retsch碾磨机)研磨中0.12mm筛网上的。
使用的模型蛋白质
将下列模型蛋白质以研究蛋白质的吸附:
α-糜蛋白酶(CHY):
α-糜蛋白酶是来自牛胰腺的消化酶。该酶具有25.3kDa的质量。等电点在pH8.1和8.6之间。
人血清白蛋白(HSA):
HSA是用作脂肪酸和两亲物从血液进入周围组织的载体的球状的运输蛋白。HSA含有三个结构域,该结构域依次由585个氨基酸组成,总质量为66.4kDa。分子的等电点在pH4.9。
碱性磷酸酶(AP):
碱性磷酸酶是在所有物种、从大肠杆菌到人中作为同一亚基的二聚体存在的非特异性磷酸单酯酶。AP是包含两个Zn2+离子和一个Mg2+离子的金属蛋白。用于实施例中的AP分离自牛肠粘膜。等电点在pH6.0。二聚体的分子量是140kDa。
实施例1:静态体系中蛋白质的吸附
粘土材料的平衡
在每一情况下,50ml反应器(Sarstedt AG&Co.,N ümbrecht,DE)中称量25.0mg上述表征的粘土材料A。在每一情况下,加入10ml在表4中标明的样品制备缓冲液,并将反应器在超声浴中处理30分钟。然后将含有悬浮液的反应器在振动台上在100rpm和室温下搅动1小时。在每一情况下,将样品在4000g下离心10分钟并然后通过移液移出澄清的上清液。将沉淀物再悬浮于10ml二次蒸馏水中并在100rpm下搅动5分钟。然后将该悬浮液在4000g下离心10分钟并通过移液移出澄清的上清液。然后将该平衡了的粘土材料在60℃下干燥16小时。
表4:使用的100mM缓冲液
缓冲液pH3.0 | 100mM磷酸钠缓冲液 |
缓冲液pH4.0 | 100mM柠檬酸钠缓冲液 |
缓冲液pH5.0 | 100mM醋酸钠缓冲液 |
缓冲液pH6.0 | 100mM MES缓冲液 |
缓冲液pH7.0 | 100mM Tris缓冲液 |
缓冲液pH8.0 | 100mM Tris缓冲液 |
缓冲液pH9.0 | 100mM Tris缓冲液 |
模型蛋白质的制备
对于每种模型蛋白质,在二次蒸馏水中制备具有2mg/ml浓度的储备溶液。将该蛋白质溶液用表4中标明的pH3至8的100mM缓冲液以1∶1的比例稀释而得到20ml的总体积。
通过UV分光光度法产生用于测定蛋白质浓度的校准曲线
蛋白质的分光光度定量是基于在280nm处测量芳族氨基酸酪氨酸(酚基,275nm)、色氨酸(吲哚基,279nm)以及,在较低程度的苯丙氨酸(257nm)的UV吸光度。取决于氨基酸的组成,可以检测20和3000μgml蛋白质之间的浓度。
为了测定未知的蛋白质浓度,首先对于已知蛋白质浓度的校准系列溶液测定在280nm处的吸光度。未知的蛋白质浓度可以由吸光度和蛋白质浓度之间的线性关系计算出。
对于分光光度定量的评估,在表5中确定的相应pH值的50mM缓冲液中制备模型蛋白质的系列标准品。将标准品在振动台上于4℃和100rpm下孵化3小时。在所述孵化后,将样品在4000g下离心10分钟,并测定澄清上清液的消光度。由测定的数据建立校准曲线。
表5:使用的50mM缓冲液
缓冲液pH3.0 | 50mM磷酸钠缓冲液 |
缓冲液pH4.0 | 50mM柠檬酸钠缓冲液 |
缓冲液pH5.0 | 50mM醋酸钠缓冲液 |
缓冲液pH6.0 | 50mM MES缓冲液 |
缓冲液pH7.0 | 50mM Tris缓冲液 |
缓冲液pH8.0 | 50mM Tris缓冲液 |
缓冲液pH9.0 | 50mM Trus缓冲液 |
a)蛋白质吸附的pH依赖性的检测
在每一情况下,将如上所述制备的20ml模型蛋白质溶液在每一情况下加入至25mg平衡了的粘土材料中。将样品在振动台上于4℃和100rpm下孵化3小时。在所述孵化结束后,将样品在4000g下离心10分钟。相对于在相关缓冲液中的所述蛋白质的系列标准品,通过分光光度法在280nm处测定样品上清液中的模型蛋白质的浓度。粘土材料的负载由孵化前和孵化后上清液中的蛋白质浓度差异,以及粘土材料的质量和蛋白质溶液的体积计算。测量结果在图1中作为相对pH值的多次测量的平均值绘出。对于所有模型蛋白质,粘土材料A的负载在pH4的柠檬酸盐缓冲液中最高。
b)蛋白质吸附等温线的记录
吸附等温线的记录通过与上清液中的模型蛋白质浓度相关的粘土材料A的平衡负载来研究。
对于具体的模型蛋白质在pH4的50mM柠檬酸盐缓冲液中进行试验。其对应于在其下在检测与pH相关的蛋白质吸附时已经测得最大值的条件。
为了记录吸附等温线,首先制备在50mM柠檬酸盐缓冲液中蛋白质含量为3mg/ml的所考虑的模型蛋白质的储备溶液。然后根据表6中标明的方案将该蛋白质储备溶液用50mM柠檬酸盐缓冲液稀释。
表6:用于记录蛋白质吸附等温线的稀释蛋白质储备溶液的方案
试验号 | 蛋白质储备溶液体积[ml] | 缓冲液体积[ml] | c(蛋白质)[mg·ml-1] | 蛋白质/吸收剂质量比率 |
1234567 | 25812162024 | 33302723191511 | 0.170.430.691.031.371.712.06 | 0.240.600.961.441.922.402.88 |
然后在每一情况下将模型蛋白质的稀释溶液加入至如上所述的用50mM柠檬酸盐缓冲液平衡了的25mg粘土材料A中。
为了测定模型蛋白质的浓度,在50mM柠檬酸盐缓冲液中制备每种模型蛋白质的系列标准品。将样品和标准溶液在振动台上于4℃和100rpm下孵化3小时,然后在4000g下离心10分钟。
校准曲线通过测定蛋白质系列标准品的消光度产生。通过分光光度地定量在离心了的样品的上清液中的蛋白质测定粘土材料的负载。数据作为多次的平均值示于图2。
实施例2:动态体系中蛋白质的吸附
粘土材料的平衡
在每一情况下,将100mg粘土材料A在每一情况下用1ml的表5中所标明的50mM缓冲液悬浮于1ml的Eppendorf管中,并用移液管将该悬浮液移液到在底部用塞封闭的色谱柱(15×50mm,具有10μm PTFE塞)中。附接第二个柱尾端件,并将该柱与FPLC装置以流动相能从底部到顶部流通过该装置的方式进行连接。将FPLC泵调节至测定其吸附能力的流速。在用20ml的50mM缓冲液平衡过程中将柱的可活动的塞用手缓慢上紧并然后通过转动螺纹的4分之一圈而放松。
蛋白质结合能力的测定
将在50mM柠檬酸盐缓冲液中的25ml具体蛋白质溶液以可变的流速泵抽吸通过用100mg粘土材料A填充的柱。相对在50mM柠檬酸盐缓冲液中模型蛋白质的系列标准,在280nm处通过分光光度测定流通液中的蛋白质含量。测定的粘土材料A的流速依赖的模型蛋白质负载作为多次的平均值示于图3。
实施例3人血清白蛋白的洗脱
将结合至粘土材料A的HSA用2种不同的缓冲液洗脱。所有色谱步骤均以1ml/min的流速进行。
洗脱缓冲液1:在二次蒸馏水中的50mM柠檬酸盐、1M的NaCl,pH4
洗脱缓冲液2:在二次蒸馏水中的50mM Na2HPO4,pH7.2
将100mg粘土材料A与25ml HSA溶液一起以流动模式负载,所述HSA溶液具有在50mM柠檬酸盐缓冲液中的1mg/ml的浓度,pH为4。负载后,将柱用20ml的50mM、pH为4的柠檬酸盐缓冲液冲洗。通过将35ml洗脱缓冲液通过该柱而洗脱HSA。在280nm处通过分光光度法测定流通液、洗涤和洗脱级分的蛋白质含量。两种洗脱缓冲液的结果作为多次的平均值列于表7中。
表7:用2种不同的洗脱缓冲液从粘土材料A洗脱HSA的流通液、洗涤和洗脱级分中的蛋白质含量
与洗脱缓冲液1相比,用洗脱缓冲液2洗脱出3倍多的蛋白质。
Claims (17)
1.一种用于将蛋白质与液体介质分离的方法,包括
-提供含有蛋白质的液体介质,
-提供粘土材料,其具有:
-大于150m2/g的比表面,
-大于0.35ml/g的孔体积,
-大于40meq/100g的离子交换能力,以及
-小于15ml/2g的水中沉降体积,
-平衡所述粘土材料至3.5至9.0的pH,
-用平衡的粘土材料处理所述液体介质,以及
-将纯化的、蛋白质贫化的液体介质与粘土材料分离。
2.根据权利要求1所述的方法,其中以无水粘土材料(atro)计,粘土材料具有小于11%的Al2O3含量。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中以无水粘土材料(atro)计,粘土材料具有大于65重量%的SiO2含量。
4.根据前述权利要求的任意一项所述的方法,其中粘土材料的孔体积的至少40%由具有至少14nm孔直径的孔提供。
5.根据前述权利要求的任意一项所述的方法,其中在所述粘土材料已在室温下保持在水中3天后,粘土材料的沉降体积小于15ml/2g,优选小于10ml/2g。
6.根据前述权利要求的任意一项所述的方法,其中粘土材料没有经受用酸进行的表面活化。
7.根据前述权利要求的任意一项所述的方法,其中粘土材料用缓冲液平衡。
8.根据权利要求7所述的方法,其中缓冲液浓度在30至100mmol的范围内。
9.根据前述权利要求的任意一项所述的方法,其中粘土材料已经通过用含碱土金属的化合物、尤其是含钠的化合物处理而活化。
10.根据前述权利要求的任意一项所述的方法,其中蛋白质通过使液体介质经过至少部分由粘土材料形成的过滤组合件而分离。
11.根据前述权利要求的任意一项所述的方法,其中蛋白质通过使液体介质经过其填充物基本上是由粘土材料形成的色谱柱而分离。
12.根据前述权利要求的任意一项所述的方法,其中在纯化的、蛋白质-贫化的液体介质分离后,用洗脱剂洗脱结合至粘土材料的蛋白质。
13.根据权利要求12所述的方法,其中洗脱剂具有和液体介质不同的pH。
14.根据前述权利要求的任意一项所述的方法,其中粘土材料具有>45μm的颗粒尺寸。
15.根据前述权利要求的任意一项所述的方法,其中粘土材料混合物与另外的吸附材料一起使用。
16.根据权利要求15所述的方法,其中另外的吸附材料选自硅胶、纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。
17.根据权利要求15或16所述的方法,其中以重量计,粘土材料和另外的吸附材料的比例在1∶10和10∶1之间。
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