NL1006056C2 - Enzym-immobiliserende drager en geïmmobiliseerd lipase. - Google Patents

Description

VO 1122

Titel: Enzym-immobiliserende drager en geïmmobiliseerd lipase

ACHTERGROND VAN DE UITVINDING

1. Gebied van de uitvinding

De uitvinding heeft in het algemeen betrekking op enzym-immobiliserende dragers en geïmmobiliseerd lipase, 5 die gebruikt worden als bioreactor, biosensor, enz., om verscheidene biochemische reacties te vergemakkelijken in een industrieel gebied waarin verschillende enzymen gebruikt worden als biologische katalysator.

2. Beschrijving van de stand van de techniek 10 Voor uitvoering van verscheidene biochemische reacties in een industrieel gebied door gebruik van een organische katalysator, bijv. een enzymkatalysator, zijn de laatste jaren actief vele onderzoeken en studies gedaan naar een geïmmobiliseerde enzymbioreactor en biosensor. Bij 15 dezelfde gelegenheid zijn tevens studies ontwikkeld naar een drager voor immobilisatie van enzym; d.i. een enzym-immobiliserende drager, die bij deze bioreactor en biosensor wordt toegepast. Deze geïmmobiliseerde enzymbioreactor omvat een kolom die gevuld is met een organisch 20 katalytisch materiaal, gemaakt van een geïmmobiliseerde enzymdrager. Voor de drager kunnen verscheidene materialen worden gebruikt, bijv. hoogmoleculaire organische materialen en anorganische materialen, zoals gewoonlijk toegepast poreus glas, keramiek, enz.

25 Hoewel zulke anorganische materialen enkele voor delen hebben, zoals een hoge mechanische sterkte, en een uitstekende thermische en chemische stabiliteit tijdens een sterilisatiebehandeling, hebben ze het nadeel dat ze niet bij herhaling gebruikt kunnen worden, als gevolg van een 30 matige adsorptiekracht voor enzymen. Enkele conventionele technieken zijn voorgesteld om dit nadeel te overwinnen. Bijv. beschrijven de Japanse octrooipublikaties nrs.

1006056 2 55-32357 en 56-15231 een typerende werkwijze waarin een hoeveelheid silaankoppelingsmiddel met daarin reactieve organische groepen gecombineerd wordt met een anorganische drager, zoals poreus glas, alumina, silica, enz., en dan de 5 functionele groepen van het enzym worden gereageerd met de reactieve organische groepen van het silaankoppelingsmiddel om een binding tussen de anorganische drager en het enzym tot stand te brengen.

Als een typerend voorbeeld van dergelijk in de 10 anorganische drager geïmmobiliseerd enzym (verder aangeduid als "geïmmobiliseerd enzym") met inbegrip van het silaankoppelingsmiddel, zijn koolhydraat-ontledende enzymen, zoals a-amylase, glucoamylase, enz., bekend. Echter, omdat deze enzymen een lage activiteit hebben, d.i. een matige 15 reactiviteit met zetmeel of andere substraten, vergeleken met het niet in een drager geïmmobiliseerd enzym, is een grote hoeveelheid van het geïmmobiliseerde enzym nodig om hetzelfde niveau van reactiviteit als in een niet-geïmmobiliseerd enzym te verkrijgen. Derhalve is het 20 geïmmobiliseerde enzym niet aangepast voor een produktieproces in een industrieel gebied. Om dit probleem te overwinnen beschrijven de Japanse octrooipublikaties nrs. 5-219952 en 4-51894 een nieuwe drager en methode voor immobilisatie van enzym in de drager.

25 Anderzijds is een typerend vetsplitsend enzym, lipase, snel en op brede schaal toegepast voor verscheidene technieken op het gebied van de organische synthesechemie, zoals mono-esterontleding, estersynthese, optische scheiding van een racemische modificatie door ester-30 uitwisselingsreactie, enz., wat lijkt op een splitsings- functie op olie en vet. Niettemin is het alleen bestudeerd en ontwikkeld als een industriële immobilisatiemethode voor het fysisch adsorberen van een hooggeconcentreerde lipase-oplossing in diatomeeënaarde. Teneinde lipase-geadsorbeerde 35 diatomeeënaarde te produceren is nodig de hooggeconcentreerde oplossing van grof enzymisch lipase te mengen met 10060 rr 3 diatomeeënaarde en dan het mengsel te drogen. Echter, het fysische adsorptievermogen van de diatomeeënaarde is beperkt en zijn adsorptiekracht is relatief laag vanwege de fysische adsorptie. De activiteit van de lipase-5 geadsorbeerde diatomeeënaarde zal daarom herhaaldelijk geleidelijk afnemen.

Een hoofddoel van het gebruik van geïmmobiliseerd enzym is primair dat hoewel het enzym duur is, het herhaald gebruikt kan worden zonder na slechts één keer te zijn 10 gebruikt te worden weggeworpen, waardoor de produktiekosten worden verlaagd en het gereageerd hebbende produkt vrij is van eventueel achtergebleven enzymen. Het is met andere woorden wenselijk een specifiek geïmmobiliseerd enzym te realiseren, dat gedurende lange tijd herhaald gebruikt kan 15 worden in de kleinst mogelijke hoeveelheid. Wanneer de activiteit van geïmmobiliseerd enzym wordt verhoogd, wordt de schaal van de reactieapparatuur kleiner, waardoor het voordeel wordt bereikt van een verlaging van zijn initiële en bedrijfskosten.

20

KORTE SAMENVATTING VAN DE UITVINDING

Het is derhalve een doel van de onderhavige uitvinding een verbeterde anorganische drager voor het immobiliseren van enzym te verschaffen, die de hierboven 25 beschreven conventionele problemen overwint.

Een ander doel van de onderhavige uitvinding is een verbeterde anorganische drager voor het immobiliseren van enzym te verschaffen, die immobilisatie van lipase vergemakkelij kt.

30 Een additioneel doel van de onderhavige uitvinding is een geïmmobiliseerd lipase te verschaffen dat een hoge activiteit heeft.

Een verder doel van de onderhavige uitvinding is een anorganisch geïmmobiliseerd enzym en geïmmobiliseerd lipase 35 te verschaffen, dat herhaald gebruikt kan worden en tegelijkertijd nauwelijks aan activiteit inboet.

10 0 6 0 f: R

4

Ter realisatie van de bovenbeschreven doeleinden wordt een verbeterde anorganische drager geproduceerd door anorganische drager te combineren met een koppelingsmiddel met carbonzuuresterbrug, en een verbeterde anorganische 5 drager voor het dragen van lipase geproduceerd door anorganische drager te combineren met een koppelingsmiddel met carbonzuuresterbrug. Het koppelingsmiddel met carbonzuuresterbrug is een silaankoppelingsmiddel. De anorganische drager wordt gekozen uit kaoliniet type dragers voor enzym-10 immobilisatie, of willekeurig welke drager met functionele groep die aan silaankoppelingsmiddel kan binden, zoals poreus glas, bentoniet, silicagel, alumina, silica, silica-alumina hydroxyapatiet, calciumfosfaatgel, enz.

Het silaankoppelingsmiddel met carbonzuuresterbrug 15 wordt gekozen uit de koppelingsmiddelen met carbonzuuresterbrug, die beantwoorden aan de algemene formule RCOO(CH,) nSiR'3 (waarin R een organische functionele groep voorstelt; R' een groep voorstelt, gekozen uit de groep die lagere alkoxy, fenoxy en halogeen omvat; en n een geheel 20 getal voorstelt). Bijv. kunnen γ-methacryloxypropyltri- methoxysilaan, γ-acetoxypropyltrimethoxysilaan, γ-acryloxy-propyltrimethoxysilaan, enz., worden gebruikt.

Voorts verschaft de onderhavige uitvinding een geïmmobiliseerd lipase, waarin in lipase-eiwit aanwezige 25 functionele groepen in de volgende stappen met carbonzuur-ester zijn verbonden; de eerste stap is voor het combineren van anorganische drager met het koppelingsmiddel met carbonzuuresterbrug, de tweede stap is voor het mengen en roeren van de uit de eerste stap resulterende anorganische 30 drager met een lipase-oplossing met een voorafbepaalde concentratie, de derde stap is voor het filtreren van het mengsel, en de vierde stap is voor het drogen van het gefiltreerde materiaal.

Zulke verbeterde anorganische dragers voor enzym-35 immobilisatie en geïmmobiliseerd lipase bieden buitengewone voordelen. In detail hebben de door de onderhavige 1006056 5 uitvinding geproduceerde drager en geïmmobiliseerd lipase een buitengewoon hoge activiteit, ook al is de aan de drager geadsorbeerde hoeveelheid eiwit niet zo groot als bij de conventionele manier, waarbij lipase wordt gedragen 5 met andere dragers die gecombineerd zijn met silaan- koppelingsmiddelen zonder carbonzuuresterbrug of met niet behandelde dragers. Met andere woorden hebben de door de onderhavige uitvinding geproduceerde drager en geïmmobiliseerd lipase een naar verhouding bijzonder hoge 10 activiteit voor de aan de drager geadsorbeerde hoeveelheid eiwit en een extreem lage achteruitgang tijdens activiteit. Verder is voor de door de onderhavige uitvinding verschafte werkwijze voor het binden van de in lipase-eiwit aanwezige functionele groepen aan carbonzuurester geen gecompliceerde 15 immobilisatiebehandeling nodig, maar slechts gewone immobilisatiestappen, waarbij de lipase-oplossing met een voorafbepaalde concentratie met drager gemengd en geroerd wordt, en dan het mengsel aan filtratie en drogen wordt onderworpen. De geproduceerde drager en geïmmobiliseerd 20 lipase kan herhaald worden gebruikt terwijl zijn activiteit nauwelijks lager wordt. In het bijzonder kan de geproduceerde drager en geïmmobiliseerd lipase volgens de onderhavige uitvinding in een herhaald ladingsgewijs reactieprocédé met voordeel worden toegepast, vrij van 25 verlaging van hun activiteit.

BEKNOPTE FIGUURBESCHRIJVING

Fig. 1 is een grafische weergave die de relatie toont tussen de initiële activiteit en de hoeveelheid eiwit 30 die aan de drager van de uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding geadsorbeerd is en die van het vergelijkings-voorbeeld en niet-behandelde drager;

Fig. 2 is een grafische weergave die de relatie toont tussen de activiteitsverandering en het aantal 35 herhalingen van de ladingsgewijze reactie onder toepassing 1006056 6 van de drager volgens de onderhavige uitvinding en die van het vergelijkingsvoorbeeld en niet-behandelde drager.

GEDETAILLEERDE BESCHRIJVING VAN DE VOORKEURSUITVOERINGSVORM 5 De onderhavige uitvinding zal worden begrepen aan de hand van een bespreking van een voorkeursuitvoeringsvorm van de drager voor enzymimmobilisatie en geïmmobiliseerd lipase dat door gebruik van de drager is geproduceerd. Volgens de onderhavige uitvinding wordt deze gekenmerkt 10 doordat een anorganische drager gecombineerd wordt met een koppelingsmiddel met carbonzuuresterbrug, en de drager voor het dragen van lipase wordt geproduceerd door een koppelingsmiddel met carbonzuuresterbrug te combineren met een anorganische drager.

15 Tabel 1 toont verscheidene koppelingsmiddelen voor gebruik in de onderhavige uitvinding en hun struktuur-formules.

Tabel 1: Struktuurformules van koppelingsmiddelen 20 nr. naam van koppelingsmiddel functionele groep (X-) 1 y-methacryloxypropyltrimethoxysilaan CH2=C(CH3) -COO- 2 γ-acetoxypropyltrimethoxysilaan CH3-COO- 25 3 γ-acryloxypropyltrimethoxysilaan CH2=CH-COO- 4 allyltrimethoxysilaan CH2=CH-

O

5 fenyltrimethoxysilaan 6 yglycidoxypropyltrimethoxysilaan CH^CH-CHp-

O

30 7 γ-chloropropyltrimethoxysilaan Cl- 8 γ-aminopropyltrimethoxysilaan NH2- O-CH, 9 fenethyltrimethoxysilaan '—'

Algemene struktuurformule: X-(CH2) n-Si (OCH3) 3 (n = 0 ~ 3) 1006056 7

In Tabel 1 vertegenwoordigen de nrs. 1 t/m 3 de silaankoppelingsmiddelen met carbonzuuresterbrug die in de onderhavige uitvinding worden toegepast, terwijl de nrs. 4 t/m 9 de andere silaankoppelingsmiddelen als vergelijkings-5 voorbeelden vertegenwoordigen. In detail maakt de onderhavige uitvinding gebruik van de koppelingsmiddelen met carbonzuuresterbrug die bij voorkeur worden gekozen uit de silaankoppelingsmiddelen, weergegeven met de algemene formule RCOO(CH2) nSiR'3. In deze formule stelt R een 10 organische functionele groep voor, die een anorganische functionele groep aan het uiteinde kan omvatten. R' stelt een groep voor, gekozen uit de groep die lagere alkoxy, fenoxy, en halogeen omvat, n stelt een geheel getal voor.

De in de onderhavige uitvinding te gebruiken anorga-15 nische drager wordt gekozen uit kaoliniet-type dragers voor enzymimmobilisatie, of willekeurig welke drager met een functionele groep die in staat is aan silaankoppelings-middel te binden, zoals poreus glas, bentoniet, silicagel, alumina, silica, silica-alumina hydroxyapatiet, calcium-20 fosfaatgel, enz.

In de volgende uitvoeringsvormen van de onderhavige uitvinding werd een kaoliniet-type drager voor enzymimmobilisatie gebruikt, in de vorm van deeltjes met een gemiddelde diameter van 200 μΐη, voor het combineren van 25 verscheidene silaankoppelingsmiddelen op het oppervlak van de drager, en de drager dan lipase te laten dragen. Aldus geproduceerde dragervoorbeelden werden aan verscheidene tests onderworpen om hun reactie-activiteiten te vergelijken. De resultaten van deze tests gaven duidelijk 30 aan dat de monsters gebaseerd op nrs. 1 t/m 3 hogere activiteit hadden dan de conventionele monsters gebaseerd op nrs. 4 t/m 9, ook al was de hoeveelheid eiwit, die aan de door de onderhavige uitvinding geproduceerde dragers was geadsorbeerd, niet bijzonder groot. In detail werd een 35 drager, gecombineerd met een silaankoppelingsmiddel met carbonzuuresterbrug, gekozen uit γ-methacryloxypropyl- 1006956 8 trimethoxysilaan, γ-acetoxypropyltrimethoxysilaan, en γ-acryloxypropyltrimethoxysilaan, gebruikt voor het dragen van lipase (deze wordt hierna aangeduid als "ester-gecombineerd geïmmobiliseerd lipase"). Anderzijds werd een 5 drager, gecombineerd met een ander silaankoppelingsmiddel zonder carbonzuuresterbrug, gebruikt voor het dragen van lipase (deze wordt hierna aangeduid als "andere silaan-koppeling geïmmobiliseerd lipase").

De hierboven beschreven kaoliniet-type drager voor 10 enzymimmobilisatie werd geproduceerd door een werkwijze waarin een kaolienmineraal wordt onderworpen aan een hydro-thermale behandeling met een sterk zuur, een spoelbehande-ling met water ter vorming van een suspensie of poedervormig materiaal, en een bakbehandeling bij een temperatuur 15 van 350°C tot 1000°C. Aldus geproduceerde kaoliniet-type drager heeft een scherpe en uniforme poriëndistributie en een hoge poriënverhouding.

De hierboven beschreven werkwijze voor produktie van kaoliniet-type drager biedt enkele voordelen. De 20 hydrothermale behandeling met een sterk zuur zorgt ervoor dat basische componenten, die in het kaolienmineraal als onzuiverheden aanwezig zijn, daaruit worden opgelost zodat de suspensie of poedervormige materiaal als gevolg van de hydrothermale behandeling nagenoeg geen oplosbare basische 25 componenten omvat. Bijgevolg wordt de chemische stabiliteit die inherent toebehoort aan het kaolienmineraal aanmerkelijk verbeterd.

Er wordt opgemerkt dat in het geval van een drager, gecombineerd is met γ-aminopropyltrimethoxysilaan (nr. 8 in 30 Tabel 1), waarvan bekend is dat hij zeer effectief is voor andere enzymen dan lipase, een dergelijke drager een lage hoeveelheid lipase immobiliseert en de geïmmobiliseerde drager een lage activiteit heeft.

In het algemeen, aangezien in de handel verkrijgbaar 35 lipase veel grof enzympoeder omvat dat tevens verscheidene eiwitmaterialen naast zuiver lipase-eiwit omvat, is het 1006056 9 onmogelijk om selectief een dergelijke zuivere lipase-eiwit component op de drager te dragen. Om de activiteit te verhogen is het daarom noodzakelijk een grote hoeveelheid hooggeconcentreerd grof enzymisch lipase te bereiden om een 5 grote hoeveelheid eiwit op de drager te adsorberen. Dit zal leiden tot een lastige immobilisatiebewerking en vereist ook dat de drager een buitengewoon hoog adsorptievermogen bezit. Wanneer daarentegen de drager in combinatie met het silaankoppelingsmiddel met carbonzuuresterbrug wordt 10 gebruikt, is het mogelijk het geïmmobiliseerde lipase te produceren met een opmerkelijk hoge activiteit, ook al wordt niet een grote hoeveelheid eiwit aan de drager geadsorbeerd.

De onderhavige uitvinding vereist derhalve niet de 15 hierboven beschreven conventionele lastige immobilisatie-werkwijze voor het produceren van lipase-geadsorbeerde diatomeeënaarde, waarbij het noodzakelijk is de hooggeconcentreerde oplossing van grof enzymisch lipase te mengen met diatomeeënaarde en het mengsel daarna te drogen, 20 maar vereist slechts een algemeen gebruikte immobilisatie-werkwijze; d.i. de drager wordt gemengd en geroerd met een lipase-oplossing met een voorafbepaalde concentratie en het mengsel wordt gefiltreerd en gedroogd. Hoewel de reden voor dit verschijnsel niet geheel begrepen wordt, kan daarop als 25 volgt worden vooruitgelopen. Het is goed bekend dat enzym een specifiek eiwit is dat als een biologische katalysator werkt en de 20 aminozuurresten ervan hebben verschillende functionele groepen, zoals een aminogroep, een carboxyl-groep, enz. In het geval van lipase-eiwit wordt willekeurig 30 welke van deze functionele groepen gemakkelijk aan een carbonzuurester gebonden, zodat eerder lipase-eiwit selectief aan de carbonzuurester van de drager gebonden kan worden dan de andere eiwitten.

De vergelijkende proeven ter vergelijking van de 35 achteruitgang van activiteit tijdens herhaling wijzen erop dat het esterbrug geïmmobiliseerd lipase volgens de 1006056 10 onderhavige uitvinding een hoge adsorptiekracht heeft, wat tot een hoge activiteit leidt met een extreem geringe achteruitgang, vergeleken met de andere geïmmobiliseerde lipasemonsters die bereid worden door de andere silaan-5 koppelingsmiddelen of geen silaankoppelingsmiddel te gebruiken.

Voor een beter begrip van de onderhavige uitvinding zal hiernavolgend een typerende uitvoeringsvorm worden beschreven.

10

UITVOERINGSVORM

Als een voorbeeld van een reactie voor een optische resolutie van een racemische modificatie werd DL-1-fenethylalkohol gemengd met vinylacetaat als acyldonor om 15 de verestering van de racemische modificatie met lipase als katalysator uit te voeren. Het lipase dat werd toegepast, was een lipase PS (Pseudomonas cepacia, afkomstig van Amano Seiyaku Co., Ltd.) dat reeds geconformeerd was dat dit lipase PS een selectieve katalytische reactie van een 20 racemische modificatie kan uitvoeren, in het bijzonder voor de hierboven beschreven reactie, duidt het lipase PS op een bijzonder hoge selectiviteit. De lipase PS geïmmobiliseerde drager werd gebruikt.

25 VOORBEELDEN 1-3

Van elk van de silaankoppelingsmiddelen nrs. 1 t/m 3 in Tabel 1 met carbonzuuresterbrug werd 0,2 g verdund met 1,8 g tolueen. Van kaoliniet-type drager voor enzymimmobi-lisatie werd 1,5 g aan de met tolueen verdunde oplossing 30 van silaankoppelingsmiddel toegevoegd, en gedurende 1 uur gemengd. De oplossing werd in een vastestofgedeelte en een vloeistofgedeelte gescheiden. Het vastestofgedeelte werd 30 min bij 110°C gedroogd. Aldus werd het dragermateriaal geproduceerd.

35 Vervolgens werd 2,5 g grof enzymisch lipase (lipase PS, bereid door Amano Seiyaku Co., Ltd.) in 25 ml fosfor- 1006°ςρ 11 zuurbuffer (pH 7,0) opgelost. Deze oplossing werd gefiltreerd om onoplosbare materialen te verwijderen. Van de hierboven bereide drager werd 0,5 g aan deze enzym-oplossing toegevoegd en dit mengsel werd 1 dag geschud om 5 immobilisatie te bewerkstelligen. Tenslotte werd dit mengsel gefiltreerd om het geïmmobiliseerde lipase te winnen.

VERGELIJKINGSVOORBEELDEN 4-9 10 Van elk van de in Tabel 1 getoonde silaan- koppelingsmiddelen nrs. 4 t/m 9 werd 0,2 g verdund met 1,8 g tolueen. Van kaoliniet-type drager voor enzymimmobi-lisatie werd 1,5 g aan de met tolueen verdunde oplossing van silaankoppelingsmiddel toegevoegd, en gedurende 1 uur 15 gemengd. De oplossing werd in een vastestofgedeelte en een vloeistofgedeelte gescheiden. Het vastestofgedeelte werd 30 min bij 110°C gedroogd. Aldus werd het dragermateriaal geproduceerd.

Vervolgens werd 2,5 g grof enzymisch lipase (lipase 20 PS, bereid door Amano Seiyaku Co., Ltd.) in 25 ml fosfor-zuurbuffer (pH 7,0) opgelost. Deze oplossing werd gefiltreerd om onoplosbare materialen te verwijderen. Van de hierboven bereide drager werd 0,5 g aan deze enzym-oplossing toegevoegd en dit mengsel werd 1 dag geschud om 25 immobilisatie te bewerkstelligen. Tenslotte werd dit mengsel gefiltreerd om het geïmmobiliseerde lipase te winnen.

TESTEN VAN ACTIVITEIT

30 Van elk van deze bereide geïmmobiliseerde lipase- voorbeelden 1 t/m 3 en vergelijkingsvoorbeelden 4 t/m 9 werd 120 mg toegevoegd aan de gemengde oplossing van 1,2 ml DL-l-fenethylalkohol en 4,6 ml vinylacetaat ter uitvoering van een veresteringsreactie. De relatie tussen de initiële 35 activiteit (U/g) en de aan de dragers geadsorbeerde hoeveelheid eiwit (mg/g drager) na 20 min vanaf het begin *°°6056 12 van de verestering, wordt in Fig. 1 getoond. De activiteit, 1 Unit (U), stelt de hoeveelheid enzym voor die in 1 minuut 1 μιηοΐ fenethylester genereert.

In Fig. 1 corresponderen de initiële activiteiten 5 van 3 materialen, omcirkeld met A, met de drie voorbeelden volgens de onderhavige uitvinding waarin het ester-gecombineerde geïmmobiliseerde lipase wordt gebruikt waarin lipase gedragen wordt op de drager die gecombineerd is met het silaankoppelingsmiddel met carbonzuuresterbrug, nrs. 1 10 t/m 3, γ-methacryloxypropyltrimethoxysilaan, γ-acetoxy- propyltrimethoxysilaan of γ-acryloxypropyltrimethoxysilaan. Deze 3 voorbeelden geven een buitengewoon hoge initiële activiteit in vergelijking met de zes vergelijkingsvoor-beelden die geproduceerd worden door toepassing van de 15 andere silaankoppelingsmiddelen, nrs. 4 t/m 9, en het niet-behandelde voorbeeld zonder silaankoppelingsmiddel, ongeacht de hoeveelheid eiwit die aan de drager is geadsorbeerd. Bijv. wanneer de voorbeelden 1 t/m 3 worden vergeleken met vergelijkingsvoorbeeld 9, dat in hoofdzaak 20 dezelfde hoeveelheid geadsorbeerd eiwit heeft als deze voorbeelden, zijn de activiteitswaarden van deze drie, met A omcirkelde voorbeelden 1 t/m 3 buitengewoon veel hoger dan het met fenethyltrimethoxysilaan behandelde vergelij-kingsvoorbeeld 9. Anderzijds, wanneer de voorbeelden 1 t/m 25 3 worden vergeleken met vergelijkingsvoorbeeld 4, dat een grotere hoeveelheid geadsorbeerd eiwit heeft dan de voorbeelden 1 t/m 3, zijn de activiteitswaarden van deze drie voorbeelden 1 t/m 3 buitengewoon veel hoger dan het met allyltrimethoxysilaan behandelde vergelijkingsvoorbeeld 4. 30

LADINGSGEWIJZE REACTIE TEST

Een ladingsgewijze reactie onder toepassing van de drager (voorbeeld 1) die behandeld was met γ-methacryloxy-propyltrimethoxysilaan, nr. 1, werd 30 keer herhaald. Als 35 referentie werden twee reacties van ladingsgewijs type onder toepassing van twee dragers, resp. behandeld met 10060S6 13 allyltrimethoxysilaan, nr. 4, en niet-behandeld, 30 keer herhaald. Het resultaat van deze ladingsgewijze reactie test wordt in Fig. 2 getoond, waarbij duidelijk de relatie wordt verschaft tussen de verandering van de activiteit 5 (U/g) en het aantal batch reacties (aantal herhalingen) onder toepassing van de drager van het voorbeeld volgens de onderhavige uitvinding en die van het vergelijkings-voorbeeld en de niet-behandelde drager.

In Fig. 2 toont het voorbeeld volgens de onderhavige 10 uitvinding, aangeduid met "A", dat de activiteit na 10 keer een weinig is afgenomen en na 30 keer op in hoofdzaak hetzelfde niveau blijft. Daarentegen tonen vergelijkings-voorbeeld 4 en het niet-behandelde voorbeeld dat hun activiteit in het begin opmerkelijk laag is, en geleidelijk 15 afneemt bij herhaling van de batch reactie.

Vervolgens werden het kaoliniet-type drager voor enzymimmobilisatie, dat voor de hierboven beschreven voorbeelden 1 t/m 3 is gebruikt, resp. een andere anorganische drager, zoals in de handel verkrijgbare glasparels 20 (gemiddelde deeltjesdiameter 500 μπι) behandeld met twee behandelingen, waarbij een van deze behandelingen gebruik maakte van γ-methacryloxypropyltrimethoxysilaan, nr. 1, en de andere allyltrimethoxysilaan, nr. 4, gebruikte, als vergelijkingsvoorbeelden. Deze monsters werden aan de 25 immobilisatiebehandeling voor lipase en de veresterings- behandeling onderworpen, op dezelfde wijze als de hierboven beschreven voorbeelden 1 t/m 3. Tabel 2 toont de resulterende gegevens, die de hoeveelheid geadsorbeerd eiwit (mg/g), het initiële vermogen (U/g) en de relatieve 30 activiteit (U/mg) van de initiële activiteit/de hoeveelheid geadsorbeerd eiwit, voor niet-behandelde drager, het voorbeeld volgens de onderhavige uitvinding, en het vergelij kingsvoorbeeld voorstellen.

*006056 14

Tabel 2: Vergelijking tussen kaoliniet-type drager voor enzymimmobilisatie en glasparels

Monster Silaan hoeveelheid initiële rel.

5 koppelings- geadsorbeerd activlteit act.

middel eiwit (mg/g) (U/g) (U/mg) kaoli- niet- niet- behandeld 39.5 254_ — 6., 4 ...

10 type allyltrimethoxy- drager silaan 39.1 348_ 8,9 γ-methacryloxy-propyltrimethoxy- silaan 33.2 873 26.3 15 glas- niet- parels behandeld 7.6 6,3 allyltrimethoxy- silaan 1.2 £4 8.9 γ-methacryloxy- 20 propyltrimethoxy- silaan 5.7 150 26,3

Zoals duidelijk is uit de in Tabel 2 getoonde resulterende gegevens heeft het monster volgens de onderhavige 25 uitvinding een buitengewoon hoge initiële activiteit, ook al is de hoeveelheid aan de drager geadsorbeerd eiwit niet zo groot als in het vergelijkingsmonster en het niet-behandelde monster. In detail is, in het geval van de kaoliniet-type drager voor enzymimmobilisatie, de aan de 30 niet-behandelde drager geadsorbeerde hoeveelheid eiwit 39,5 mg/g, aan het vergelijkingsmonster (behandeld met allyltrimethoxysilaan) 39,1 mg/g, en aan het monster van de uitvinding (behandeld met γ-methacryloxypropyltrimethoxy-silaan) 33,2 mg/g. Het niet-behandelde monster en verge-35 lijkingsmonster zijn groter dan de onderhavige uitvinding. Daarentegen is de initiële activiteit van het monster 1°06ηη8 15 volgens de uitvinding 873 U/g, van het niet-behandelde monster 254 U/g, en van het vergelijkingsmonster 348 U/g. Het monster volgens de uitvinding vertoont een extreem hoge waarde. Ook is de relatieve activiteit van het niet-5 behandelde monster 6,4 U/mg, van het vergelijkingsmonster 8,9 U/mg, en van het monster volgens de uitvinding 26,3 U/mg. Het monster volgens de uitvinding vertoont eveneens een extreem hoge waarde.

In het geval dat in de handel verkrijgbare 10 glasparels als anorganische drager worden gebruikt, heeft het monster volgens de uitvinding een buitengewoon hoge initiële activiteit, 150 U/g, ook al is de aan de drager geadsorbeerde hoeveelheid eiwit kleiner dan bij het vergelijkingsmonster en het niet-behandelde monster. Verder 15 is de relatieve activiteit van het monster volgens de uitvinding 26,3 U/mg, wat buitengewoon veel hoger is dan bij de andere monsters. Deze hoge waarde is equivalent met die van het kaoliniet-type drager. Ongeacht de aard van het dragermateriaal, wordt bevestigd dat het koppelingsmiddel 20 met carbonzuuresterbrug een hoge activiteit van de drager veroorzaakt, ook al is de aan de drager geadsorbeerde hoeveelheid eiwit niet zo groot als bij de conventionele monsters. M.a.w. heeft een drager van in de handel verkrijgbare glasparels een lagere activiteitswaarde dan 25 een drager van het kaoliniet-type, maar hun relatieve activiteitswaarden zijn equivalent, hoger dan van de monsters van niet-behandelde en vergelijkingsdrager. Dit betekent dat het aan het silaankoppelingsmiddel met carbonzuuresterbrug te danken effect niet alleen tot een 30 specifiek type anorganisch dragermateriaal beperkt is.

Zoals uit de hierboven gegeven uitleg blijkt hebben de drager en geïmmobiliseerd lipase, die met de onderhavige uitvinding zijn geproduceerd, een bijzonder hoge activiteit (relatieve activiteit), ook al is de aan de drager 35 geadsorbeerde hoeveelheid eiwit niet zo groot als in de conventionele wijze waarbij lipase gedragen wordt met 10°60s6 16 andere dragers in combinatie met silaankoppelingsmiddelen zonder carbonzuuresterbrug of niet-behandelde dragers. Verder kunnen de geproduceerde dragers en geïmmobiliseerd lipase herhaald worden gebruikt terwijl de activiteit 5 nauwelijks achteruitgaat. In het bijzonder kunnen bij herhaling van een batch reactie werkwijze de geproduceerde dragers en geïmmobiliseerd lipase volgens de onderhavige uitvinding op voordelige wijze gedurende lange tijd worden toegepast.

10 Zoals duidelijk is, kunnen veel sterk verschillende uitvoeringsvormen van deze uitvinding worden gemaakt zonder buiten de geest en omvang ervan te komen, en dient te worden begrepen dat de uitvinding niet beperkt is tot de specifieke uitvoeringsvorm ervan zoals gedefinieerd in de 15 conclusies.

10060.sg

Claims (7)

1. Een enzym-immobiliserende drager voor immobilisatie van enzym, omvattende een anorganische drager gecombineerd met een koppelingsmiddel met carbonzuuresterbrug.

2. Een enzym-immobiliserende drager voor immobilisatie 5 van enzym, omvattende een anorganische drager voor het dragen van lipase, welke drager gecombineerd is met een koppelingsmiddel met carbonzuuresterbrug.

3. De enzym-immobiliserende drager volgens conclusie 1 of 2, waarin het koppelingsmiddel met carbonzuuresterbrug 10 een silaan-koppelingsmiddel is.

4. De enzym-immobiliserende drager volgens conclusie 3, waarin het silaan-koppelingsmiddel met carbonzuuresterbrug beantwoordt aan een algemene formule RCOO(CH2) nSiR'3 (waarin R een organische functionele groep is; R' een groep is, 15 gekozen uit de groep die lager alkoxy, fenoxy en halogeen omvat; en n een geheel getal voorstelt).

5. De enzym-immobiliserende drager volgens conclusie 3 of 4, waarin het silaan-koppelingsmiddel met carbonzuuresterbrug gekozen is uit γ-methacryloxypropyltrimethoxy- 20 silaan, γ-acetoxypropyltrimethoxysilaan en γ-acryloxy-propyltrimethoxysilaan.

6. De enzym-immobiliserende drager volgens een van de voorgaande conclusies, waarin de anorganische drager gekozen is uit dragers met een functionele groep die met 25 silaan-koppelingsmiddel kan combineren, zoals kaoliniet dragers voor immobilisatie van enzym, poreus glas, bentoniet, silicagel, alumina, silica, silica-alumina hydroxyapatiet, en calciumfosfaatgel.

7. Een geïmmobiliseerd lipase, geproduceerd door in een 30 eerste stap een anorganische drager te combineren met een koppelingsmiddel met carbonzuuresterbrug, de anorganische drager in een tweede stap te mengen en roeren met een lipase-oplossing met een voorafbepaalde concentratie, het 100605$ mengsel in een derde stap te filtreren en het gefiltreerde materiaal in een vierde stap te drogen, waardoor de in lipase-eiwit aanwezige functionele groepen met de carbon-zuurester worden gebonden. 5 JO 0 6 ^ c ς