KR100916151B1

KR100916151B1 - 키토산-리파아제 접합체를 포집한 메조 포러스 실리카복합 분체 및 이의 제조 방법

Info

Publication number: KR100916151B1
Application number: KR1020040105553A
Authority: KR
Inventors: 권순상; 전상훈; 박창만; 심민경; 남개원; 이승환; 김덕희; 장이섭; 손정국; 김지만
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2004-12-14
Filing date: 2004-12-14
Publication date: 2009-09-08
Also published as: KR20060067294A

Abstract

본 발명은 키토산-리파아제 접합체가 포집된 메조포러스 실리카 복합 분체에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 피지를 다량 흡수하며 키토산-리파아제 접합체가 더욱 안정화된 키토산-리파아제 접합체가 포집된 메조포러스 실리카 복합 분체에 관한 것이다. 본 발명에 의한 키토산-리파아제 접합체가 포집된 메조포러스 실리카 복합 분체는 피지를 분해할 수 있을 뿐만 아니라 분해된 산출물인 지방산에 흡착하여 자극원인을 제거할 수 있다.

리파아제, 키토산, 효소안정화, 메조포러스 실리카

Description

키토산-리파아제 접합체를 포집한 메조 포러스 실리카 복합 분체 및 이의 제조 방법{Mesoporous silica with chitosan-lipase conjugates and the method for manufacturing thereof}

도 1은 키토산에 접합된 리파아제와 접합되지 않은 리파아제의 온도별 안정성 비교 결과를 보여주는 그래프이다.

도 2는 광택도와 luster 값의 정의를 설명해주는 그림이다(Luster = R/D).

키토산은 새우, 게 및 오징어 뼈로부터 추출되는 키틴을 탈아세틸화시킨 양이온 고분자로서, "반응성 및 기능성 고분자들(Reactive & Functional Polymers, 46, 1-27면, 2000)"에서 보고된 바와 같이 면역 강화 기능, 약물 전달 담체, 피부 대용물, 상처 치유능, 중금속 제거능, 염료 흡착능 및 지질을 흡착하는 효능이 있어 산업적, 의학적으로 많은 연구가 이루어지고 있다. 최근 비만이 사회적 문제로 대두되면서 키토산의 지질 감소 효능에 연구가 집중되고 있으나, 주로 콜레스테롤과 중성 지방에 관한 것이 대부분이고 지방산 흡착능에 관한 연구는 많지 않아 이에 대한 활용도가 적은 실정이다.

리파아제는 트리글리세라이드(triglyceride) 가수 분해 효소로서 피지의 주 성분이자 피부 광택의 주원인인 트리글리세라이드를 분해하여 피부의 번들거림을 감소시킨다. 과도한 피지는 여드름 등의 원인이 될 뿐만 아니라 여성의 경우 화장의 지속성을 떨어뜨리는 주 요인이므로 이에 대한 대응 방안이 연구되어 왔다. 한국특허 출원 제1997-0073454호 및 제2003-0034474호에서는 천연 추출물을 이용하여 피지의 분비를 억제하거나, 파우더를 이용하여 피지를 흡수하는 두 가지 방법에 관하여 기재하고 있다.

이와 같이 피지를 분해하는 기능을 갖는 리파아제의 활성을 유지하기 위해서는 이를 고정화하는 것이 필요하다.

효소를 고정화하는 방법은 크게 흡착 등과 같은 물리적 결합력에 의한 방법과 담체와 효소의 공유 결합, 효소 결정체의 가교 결합(cross-linked enzyme crystal) 등과 같은 화학적 결합력에 의한 방법으로 나누어진다. 물리적 결합력에 의한 고정화 방법은 결합력이 상대적으로 약하므로 효소의 구조 변화에 미치는 영 향이 적어 활성 손상의 위험이 낮지만 동시에 약한 결합력 때문에 온도, pH 및 이온 세기 등의 주변 환경에 영향을 크게 받아 효소의 활성이 오래 유지되기 어려운 단점이 있다. 화학적 결합에 의한 고정화 방법은 공유 결합이 형성되면서 구조 변형이 일어나므로 효소 본래의 활성이 상당히 저해되는 경우가 많다는 단점이 있지만 일단 결합이 형성되고 나면 외부 환경에 큰 영향 없이 일정한 구조 및 효소의 활성이 유지될 수 있다는 장점을 가지고 있다.

상술한 바와 같이, 리파아제의 활성을 이용하여 피부에서 분비되는 피지를 분해하여 피부 번들거림, 즉 광택을 저하시키기 위해서는 다음과 같은 세 가지의 문제를 극복해야 한다. 첫째 주위 환경, 특히 온도에 대해 피지를 분해하는 리파아제의 활성을 안정화시키는 방법, 둘째 리파아제에 의하여 피지의 주성분인 트리글리세라이드가 분해된 후 생성되는 지방산을 피부에서 제거 또는 격리시키는 방법, 및 셋째 분비된 피지를 다량 흡유할 수 있으며, 이를 외부와 격리시킬 수 있는 담체를 설계한 후 안정하게 리파아제 접합체를 포집하는 방법이 그것이다.

이에 본 발명자들은 가교제가 과량인 조건에서 리파아제에 다기능성 가교제를 도입한 후 아미노기를 갖고 있는 키토산 담체에 이를 고정화하여 키토산-리파아제 접합체를 제조한 다음 이 키토산-리파아제 접합체를 메조포러스 실리카에 포집시킴으로써 피지를 다량 흡수하는 담체로서의 기능뿐만 아니라 키토산-리파아제 접합체를 2차적으로 안정화시키는 기능을 나타낼 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성 하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 피지의 주성분이자 번들거림의 원인 물질인 트리글리세라이드가 키토산-리파아제 접합체에 의하여 분해된 후 생성되는 지방산을 키토산과 잘 흡착할 수 있도록 제조한 메조포러스 실리카를 제공하는 것이다.

또 본 발명의 목적은 상기 키토산-리파아제 접합체가 포집된 메조포러스 실리카 복합 분체 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 피지(sebum)를 분해하며 피지가 분해된 후 생성되는 지방산을 제어할 수 있는 키토산-리파아제 접합체의 2차적 안정화 방법에 관한 것이다.

본 발명에서는 리파아제 활성도의 1차 안정화를 위하여 수용성 키토산를 담체로 사용하여 높은 수율로 화학적으로 결합하고, 온도, 계면활성제 등의 외부 변수에 대한 안정성을 지닌 키토산-리파아제 접합체를 제조한다. 또한 메조포러스 실리카를 제조하여 표면의 기공을 조절함으로써 키토산-리파아제 접합체의 포집율 및 2차 안정도를 향상시켰다. 즉, 키토산-리파아제 접합체가 포집된 메조포러스 실리카는 외부와의 접촉을 차단시킴으로써 키토산-리파아제 접합체의 안정성을 향상시킬 수 있었으며, 흡유된 피지를 분해, 흡착함을 확인하였다. 이러한 안정화된 키토산-리파아제 접합체가 포집된 메조포러스 실리카는 피지를 분해할 수 있을 뿐만 아니라 분해가 된 산출물인 지방산을 흡착함으로써 자극원인을 해결할 수 있기 때문에 화장료 조성물 등에 첨가하여 제형화할 수 있다.

본 발명은 리파아제를 활성화시킨 후 수용성 키토산 담체와 결합함으로써 일차적으로 리파아제를 안정화시킨 후 메조포러스 실리카를 제조하여 기공내로 키토산-리파아제 접합체를 포집시키는 방법에 관한 것이다.

리파아제(lipase)는 얼굴에서 분비되는 피지를 분해할 수 있으며, 피지가 분해된 후 생성되는 지방산은 천연 양이온 고분자인 키토산으로 흡착시킬 수 있다. 본 발명에서는 이러한 키토산을 리파아제와 접합시켜 키토산-리파아제 접합체를 제조함으로써 리파아제의 활성을 유지하여 안정화시켰으며, 나아가 피지의 흡유 및 2차 안정화를 위하여 기공이 조절된 메조포러스 실리카를 이용하여 키토산-리파아제 접합체를 안정하게 포집시켰다. 이때, 기공이 조절된 메조포러스 실리카는 높은 표면적과 적절하게 조절된 기공으로 인하여 그 자체로도 높은 피지 흡입율을 보였으며 흡입된 피지는 기공 내부에 존재하는 키토산-리파아제 접합체의 작용을 받게 되어 분해 및 흡착된다. 따라서, 이러한 메조포러스 실리카에 포집된 키토산-리파아제 접합체는 매우 높은 피지 분해능을 보이며 피지에 의한 번들거림 즉 광택도를 현저히 감소시킨다.

본 발명에서는 피지의 분해 산물인 지방산을 흡착할 수 있으면서 동시에 리파아제의 활성화를 안정화시킬 수 있는 천연 양이온성 고분자인 키토산을 선정하여 사용한다.

본 발명에서 사용하는 양이온의 천연 고분자인 키토산은 기존의 수 불용성 담체와는 달리 수용성 담체로서 공유 결합 형성을 통해 리파아제를 고정시켜 리파아제의 안정성을 향상시키는 역할을 할 뿐만 아니라 그 자체로 지방산을 흡착하는 기능을 가진다. 여드름의 원인 중 하나인 지방산은 키토산에 흡착되어 피부트러블을 방지할 수 있는 것이다.

본 발명에 의한 리파아제와 키토산의 접합은 리파아제의 자체적인 가교결합을 막을 수 있는 조건에서 가교제를 이용하여 이룰 수 있다. 가교제는 리파아제를 먼저 활성화시키고, 이후 활성화된 리파아제는 키토산에 결합하여 높은 활성 안정성을 보이는 수용성 키토산-리파아제 접합체를 형성하게 된다. 보다 상세히 설명하면 가교제가 과량인 조건에서 리파아제와 결합을 이루어 결합체를 형성한 후 아미노기를 갖고 있는 키토산에 고정화함으로써 접합율을 높이고, 리파아제의 고정화 효과를 극대화하여 키토산-리파아제 접합체의 안정성을 탁월하게 향상시킬 수 있었다.

본 발명에 의한 키토산-리파아제 접합체는 높은 효율로 피지를 흡유할 수 있으며 키토산-리파아제 접합체의 안정성을 향상시킬 수 있는 메조포러스 실리카에 의하여 포집하게 된다. 메조포러스 실리카는 피지를 다량 흡수하는 담체의 기능뿐만 아니라 키토산-리파아제 접합체를 이중으로 안정화시키는 기능을 가진다.

본 발명에서 담체로서 개발된 메조포러스 실리카는 메조포어 분자체(mesoporous molecular sieve)들 중 하나이다. 이는 균일한 크기의 메조포어가 규칙적으로 배열되어 있는 메조포어 분자체이다. 기존 분자체의 합성과는 다르게 이 메조포어 분자체들은 액정 주형 경로(liquid crystal templating mechanism)를 통하여 합성되는데 합성 과정 중 주형 물질(templating material)로 사용되는 계면활성제의 종류나 합성 조건을 조절함으로써 기공의 크기를 16∼100Å까지 조절할 수 있는 장점을 가지고 있다.

순수응용화학국제연합(IUPAC)의 정의에 따르면 기공을 갖는 무기물질은 기공의 크기에 따라 크게 마이크로포러스(microporous, < 2nm), 메조포러스(mesoporous, 2∼50nm) 및 매크로포러스(macroporous, > 50nm) 물질로 분류된다. 일반적으로 마이크로포러스 물질인 제올라이트(zeolite)는 유기 암모늄 염이나 무기 양이온 등을 주형물질(template) 또는 구조 유도 물질(structure directing agent)로 사용하여 수열 조건에서 합성된다. 이와 유사하게 메조포러스 물질도 계면활성제나 친양쪽성 고분자(amphiphilic polymer)와 같은 유기 분자를 구조 유도 물질로 사용하는 수열 반응을 통하여 합성된다. 제올라이트의 경우는 일반적으로 무기 또는 유기 분자 하나가 기공 구조를 유도하는 주형물질로 작용하는 반면, 메조포러스 물질은 단분자가 아닌 여러 개의 계면활성제 분자들이 집합된 마이셀(micelle) 구조가 기공을 유도한다. 계면활성제는 일반적으로 친수성의 머리 부분과 소수성의 꼬리 부분으로 이루어져 있어 수용액 하에서 다양한 구조의 자기 조합된(self-assembled) 마이셀 및 액정 구조를 이룬다고 알려져 있다. 이러한 마이셀 또는 액정 구조의 표면에 위치한 친수성 부분과 무기 물질의 전구체가 상호 작용을 통하여 유기/무기 나노 복합체가 형성되고 계면활성제를 제거하면 메조포러스 물질을 얻을 수 있다. 이러한 메조포러스 물질은 산업 전반에 걸쳐 응용연구가 활발히 진행되고 있다. 그 예로써 정밀화학촉매로서 활용되는데, 메조포러스의 높은 표면적(>700㎡/g)과 균일한 기공 크기 때문에 전이금속 화합물, 아민류 산화물 등의 촉매 활성체들의 담체로 응용되고 있다. 또한 분리/제고 소재, 분자체 막, 센서, 포 집화 담체로도 연구되어지고 있다.

본 발명에 의한 메조포러스 실리카는 피지의 주성분이자 번들거림의 원인 물질인 트리글리세라이드가 키토산-리파아제 접합체에 의하여 분해된 후 생성되는 지방산을 키토산과 잘 흡착할 수 있는 환경을 제공한다.

상기와 같은 방법으로 제조한 키토산-리파아제 접합체가 포집된 메조포러스 실리카 복합 분체는 피지를 분해하는 능력이 뛰어나고 또한 피지 분해 후 생성되는 지방산에 흡착함으로써 피부 자극원인을 해결할 수 있으므로, 통상적인 방법으로 화장료 조성물 등에 첨가하여 제형화할 수 있다.

다음으로, 본 발명의 키토산-리파아제 접합체가 포집된 실리카 복합 분체의 제조 방법을 살펴보면, 크게 두 단계로 나누어 진행한다.

첫번째 단계는 활성화된 리파아제를 키토산에 접합시켜 키토산-리파아제 접합체를 제조하는 공정이다. 보다 상세하게는 과량의 글루타르알데히드 용액에 10∼100 Unit/ml 정도의 농도 혹은 더욱 바람직하게는 50∼100 Unit/ml의 농도인 동일한 부피의 리파아제 용액을 방울방울 떨어뜨려 교반하면서 리파아제를 활성화한다. 이때 적가(滴加) 속도는 5∼15 ml/min 이 되도록 하며, 적가 시간을 포함하여 2시간 동안 교반하면서 반응을 진행한다.

가교제로는 글루타르알데히드(glutaraldehyde), 글리옥살(glyoxal), 말론디알데히드(malondialdehyde), 숙시닉알데히드(succinicaldehyde), 아디프알데히드(adipaldehyde) 등의 폴리알데히드류를 들 수 있으며, 바람직하게는 글루타르알데히드를 사용하는 것이 좋다. 가교제의 농도는 동일한 부피의 리파아제 1∼2.5 mg/ml에 대해서 0.1∼10%(w/v), 바람직하게는 0.5∼2%(w/v)가 좋다.

활성화된 리파아제를 키토산과 접합시키기 위하여 2% 아세트산 용액에 녹인 1% 키토산 용액에 활성화된 리파아제 용액을 4:1∼1:1의 부피비로 혼합한 후 교반한다. 1시간 정도 반응을 진행한 후 수소화붕소 나트륨(sodium borohydride)을 소량의 물에 미리 녹인 후 첨가하여 20분간 환원시킨다.

두 번째 단계는 적절히 조절된 메조포러스 실리카를 제조한 후 상기에서 제조한 키토산-리파아제 접합체를 포집시키는 공정이다.

일반적으로 마이크로포러스 물질인 제올라이트는 유기 암모늄 염이나 무기 양이온 등을 주형물질(template) 또는 구조 유도 물질로 사용하여 수열 조건에서 합성한다. 이와 유사한 메조포러스 물질도 계면활성제나 친양쪽성 고분자와 같은 유기 분자를 구조 유도 물질로 사용하여 수열 반응을 통해 합성한다. 분자체의 대표적인 예는 제올라이트 A나 Y, L, ZSM-5 등과 같은 다공 결정성 규산알미늄(aluminosilicate)으로써 균일한 크기의 미세세공이 규칙적으로 배열되어 있는 구조를 갖는다. 메조포러스 분자체는 MCM 계열 및 SBA 계열이 존재한다.

본 발명에서의 메조포러스 실리카는 테트라에톡시오르소실란(tetraethoxyorthosilane, TEOS)을 전구체로 하여 제조한다. 먼저, 고분자 계면활성제인 폴리에틸렌옥사이드블락(폴리프로필렌옥사이드)폴리에틸렌옥사이드(poly ethylene oxide-block-(poly propylene oxide)-polyethylene oxide)를 물에 용해한 다. 이때 폴리에틸렌옥사이드블락(폴리프로필렌옥사이드)폴리에틸렌옥사이드는 주형물질로서 작용하며 적절한 농도에서 자기 조합형 분자 구조체를 형성한다. 상기 용액에 테트라에톡시오르소실란과 촉매로서 염산을 가하여 40℃에서 반응시킨다. 이때 테트라에톡시오르소실란은 형성된 폴리에틸렌옥사이드블락(폴리프로필렌옥사이드)폴리에틸렌옥사이드 마이셀의 표면 위에서 반응하여 올리고머를 형성한다. 이후 100℃에서 24시간 다시 교반하여 형성된 올리고머를 다시 반응시켜서 고분자화한다. 이때 염산 촉매는 일종의 다리 역할을 하여 반응에 참여하게 된다. 이렇게 형성된 구조체는 여과, 분리 단계를 거친 후 건조하고, 에탄올 세척 후 소결 과정을 거쳐서 주형 물질인 폴리에틸렌옥사이드블락(폴리프로필렌옥사이드)폴리에틸렌옥사이드를 제거하여 최종적으로 메조포러스 실리카를 제조한다.

본 발명에서 제조한 메조포러스 실리카의 입자는 약 1㎛∼5㎛이며, 기공은 약 7nm∼15nm이고, 비표면적은 약 900㎡/g∼300㎡/g이다.

본 발명에 의한 메조포러스 실리카는 상기에서 제조한 키토산-리파아제 접합체와 적절한 농도에서 혼합한다. 이때 메조포러스 실리카와 키토산-리파아제 접합체와의 혼합 비율은 1:5∼60가 적절하며, 보다 바람직하게는 메조포러스 실리카 0.5∼2g에 키토산-리파아제 접합체 10∼30g을 혼합하는 것이 좋다.

이하, 본 발명을 실시예 및 시험예에 의거하여 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명이 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 키토산-리파아제 접합체 제조

1) 리파아제 활성화 단계

0.1M 인산염 완충액(pH 6) 500ml에 글루타르알데히드의 농도가 1% 되도록 리파아제(Novozymes, Netherlands)를 첨가하여 리파아제의 농도가 100 Unit/ml이 되도록 희석하여 리파아제 용액을 준비하였다. 상기 용액을 충분히 교반한 후 적가 깔때기(dropping funnel)를 이용하여 약 50분에 걸쳐 적가한 다음 20℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응하지 않고 남은 잔여 글루타르알데히드를 제거하기 위하여 상기 반응액을 투석막(dialysis membrane)에 담고 20L의 증류수가 담긴 통에서 교반하면서 24∼48시간 동안 투석(spectrum laboratories Inc, Spectra/Por, MWCO 12-14,000)하였다.

2) 키토산과 리파아제의 접합 단계

2% 아세트산 용액 2L에 1% 키토산(분자량 80,000, 국내 삼성키토산)을 교반하면서 용해하고, 여기에 상기 1)단계에서 제조한 활성화된 리파아제 용액 1L를 첨가하여 반응시켰다. 20℃의 온도에서 1시간 동안 반응시킨 후 30ml의 증류수에 수소화붕소 나트륨 1g을 녹인 용액을 상기 접합 반응액에 첨가하여 20분간 환원시켰다.

[시험예 1] 키토산의 지방산 흡착능 측정

키토산의 지방산 흡착능은 Ahmad F.B.H. 등(Chitin and Chitosan, eds MB Zacharia, M Wan, A Pauzi, University Kebangsaan, Malayisia, 1995)의 보고에서 제시되었으며, 키토산과 지방산의 상호작용을 최대로 하기 위해 유화 조건에서 키토산의 지방산 흡착능을 평가하였다. 먼저, 0.5% 아세트산에 1.2% 키토산을 녹인 수상부분과 오일에 팔미트산과 계면활성제로 트윈 60(tween 60)을 녹인 유상 부분을 8대 2의 부피 비로 유화시킨 후 초기의 지방산 양을 측정하였다. 3배 부피의 아세톤을 이용하여 키토산을 침전시킴으로써 키토산에 흡착된 지방산을 함께 분리하였다. 남은 상청의 지방산 양을 측정하여 초기 값에서 빼줌으로써 키토산에 흡착된 지방산 양을 정량하였다. 지방산의 정량은 0.1N 수산화칼륨 용액으로 적정하였다. 상기 방법으로 평가하였을 때 키토산 1g 당 팔미트산 1.44g을 흡착하였으며, 이를 몰 단위로 환산하면 키토산의 기본 단위인 글루코스 아민을 기준으로 하여 1몰 당 팔미트산 0.9몰을 흡착하였다.

[시험예 2] 키토산-리파아제 접합체의 안정도 향상

키토산-리파아제 접합체의 안정도는 리파아제의 활성이 유지되는 정도로 판단하였으며, 리파아제의 활성은 p-니트로페닐부티레이트(p-nitrophenylbutyrate)를 기질로 하여 에스테르 결합을 끊는 능력을 측정하였다. 분해된 기질을 410nm에서 감지하였고, 활성은 리파아제의 단위 무게당 단위시간 당 흡광도 변화량으로 나타내었다. 리파아제와 키토산-리파아제 접합체 모두 수용액상이고 45℃에서 22주간 보관하였다.

도 1은 실시예 1에서 제조한 키토산에 접합된 리파아제와 대조군으로서 키토산에 접합시키지 않은 리파아제의 안정도를 비교한 것으로서, 키토산에 접합되지 않은 리파아제의 경우 10일 이후부터 활성이 급격히 떨어졌지만 키토산-리파아제 접합체의 경우 한달 동안 초기와 동등한 활성을 유지하는 것을 볼 수 있었다. 상기와 같은 결과로부터 고분자 다당류인 키토산과 결합함으로써 단백질인 리파아제의 응집을 막아 활성 저하를 방지할 수 있음을 알 수 있었다.

[실시예 2] 메조포러스 실리카 제조 (1)

폴리에틸렌옥사이드블락(폴리프로필렌옥사이드)폴리에틸렌옥사이드 25g을 물461.1g에 용해한 후 TMB(trimethyl benzen)의 비율이 폴리에틸렌옥사이드블락(폴리프로필렌옥사이드)폴리에틸렌옥사이드 중량 대비 1.5가 되도록 용해하였다. 이때 폴리에틸렌옥사이드블락(폴리프로필렌옥사이드)폴리에틸렌옥사이드와 TMB를 동시에 용해하여도 상관없다. 이후에 온도를 80℃로 상승시키면 폴리에틸렌옥사이드블락(폴리프로필렌옥사이드)폴리에틸렌옥사이드의 계면활성에 의한 마이셀의 구조가 유연해지면서 친수성/친유성의 영역이 좁아진다. 이 상태에서 다시 상온으로 온도를 낮추어 교반하였다. 이러한 온도 상승과 하강의 리사이클링 과정을 3회 이상 반복하면 상온에서의 교반시 용액의 상태가 투명하게 되었다. 이때의 상태는 TMB가 폴리에틸렌옥사이드블락(폴리프로필렌옥사이드)폴리에틸렌옥사이드의 내부 CAVITY에 포집이 잘 되어 있는 경우이며 잘 포집이 안되는 경우에는 용액의 상태가 불투명해지는 형상을 보였다. 이 경우에는 다시 80℃에서 정치 보관을 시킨 후 다시 상온에서 교반하며 용액의 상태를 투명하게 만들어 TMB가 마이셀의 내부에 유입되도록 하여 폴리에틸렌옥사이드블락(폴리프로필렌옥사이드)폴리에틸렌옥사이드가 이차원 육 각(hexagonal) 형태의 마이셀을 형성시켰다. 이후에 메조 포러스 실리카의 전구체인 TEOS 34.155g 및 물 100g을 투입하여 교반하였다. 이후 40℃에서 TMB의 반응에 의한 올리고머화를 진행한 후 100℃에서 반응을 더욱 진행시켜 고분자화하였다. 그런 다음 생성물을 분리, 건조 및 소결하여 최종 메조포러스 실리카 25g을 얻었다.

[실시예 3] 메조포러스 실리카 제조 (2)

TMB(trimethyl benzen)와 폴리에틸렌옥사이드블락(폴리프로필렌옥사이드)폴리에틸렌옥사이드의 혼합비율을 1:1로 한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 수행하였다.

[실시예 4] 메조포러스 실리카 제조 (3)

TMB(trimethyl benzen)와 폴리에틸렌옥사이드블락(폴리프로필렌옥사이드)폴리에틸렌옥사이드의 혼합비율을 1:0.7로 한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 수행하였다.

[실시예 5] 메조포러스 실리카 제조 (4)

TMB(trimethyl benzen)와 폴리에틸렌옥사이드블락(폴리프로필렌옥사이드)폴리에틸렌옥사이드의 혼합비율을 1:0.5로 한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 수행하였다.

[실시예 6] 메조포러스 실리카 제조 (5)

TMB(trimethyl benzen)와 폴리에틸렌옥사이드블락(폴리프로필렌옥사이드)폴리에틸렌옥사이드의 혼합비율을 1:0.1로 한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 수행하였다.

[실시예 7∼11] 키토산-리파아제 접합체와 메조포러스 실리카와의 접합

상기 실시예 2∼6에서 제조한 메조포러스 실리카를 각각 1g씩 취하여 실시예 1에서 제조한 키토산-리파아제 접합체 20g과 상온에서 혼합하고 약 12∼15시간 동안 교반 후 분리 건조하여 최종의 키토산-리파아제 접합체가 포집된 메조포러스 실리카를 얻었다.

[시험예 3] TMB의 비율에 따른 키토산-리파아제 접합체의 포집율

TMB의 농도를 각각 다르게 하여 제조한 상기 실시예 2∼6의 메조포러스 실리카를 각각 1g씩 취하여 실시예 1에서 제조한 키토산-리파아제 접합체 20g과 혼합, 교반하였다. 이때 교반시간은 5시간으로 하였다. 이후 분리, 건조한 후 각각의 포집율을 측정하여 하기 표 1에 나타내었다.

TMB의 비율에 따른 포집율 변화

	실시예 2	실시예 3	실시예 4	실시예 5	실시예 6
포집율(%)	4.812	4.81	5.012	5.95	4.45

상기 결과에서, TMB의 혼합비율이 0.5인 실시예 5에서 제조한 메조포러스 실 리카에서 최대의 포집율을 나타내었다.

[시험예 4] 키토산-리파아제 접합체와 메조포러스 실리카와의 교반시간에 따른 포집율 변화

실시예 5에서 제조한 메조포러스 실리카와 키토산-리파아제 접합체와의 교반시간을 조절하면서 포집율 변화를 측정하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 이 결과, 교반 시간이 12시간 이상에서는 포집율이 일정함을 알 수 있었다. 따라서, 주어진 조건에서 최대의 포집율을 나타내기 위해서는 최소 12시간 이상의 교반시간을 설정하여야 함을 알 수 있었다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 메조포러스 실리카 담체를 이용하여 1차로 안정화된 키토산-리파아제 접합체를 포집시켜 2차적으로 안정화하고, 또한 피부에서 분비된 피지를 분해 및 지방산을 흡착·격리시킴으로써, 피지의 번들거림으로 인하여 화장색이 칙칙해지며 화장을 수정해야하는 등의 피지에 의한 화장료의 문제점을 개선할 수 있었다. 따라서, 본 발명에 의한 키토산-리파아제 접합체가 포집된 메조포러스 실리카는 높은 안정성을 가지며, 피지 분해가 우수하며 자극이 없는 피부 외용제 조성물 등에 사용할 수 있다.

Claims

키토산-리파아제 접합체가 포집되어 있으며, 기공이 7 nm를 초과하고 15 nm 이하인 실리카 복합 분체.
제 1항에 있어서, 상기 실리카는 메조포러스 물질임을 특징으로 하는 복합 분체.
다기능성 가교제와 리파아제를 반응시켜 리파아제를 활성화시키는 단계;

활성화된 리파아제와 수용성 키토산 담체를 접합시켜 수용성 키토산-리파아제 접합체를 제조하는 단계;

트리메틸벤젠을 사용하여 입자크기가 1∼5 ㎛이고, 기공이 7 nm를 초과하고 15 nm 이하이며, 비표면적이 900∼300 ㎡/g인 메조포러스 실리카를 제조하는 단계; 및

상기 키토산-리파아제 접합체와 메조포러스 실리카를 혼합하는 단계;

를 포함하는 키토산-리파아제 접합체가 포집된 실리카 복합 분체의 제조방법.
제 3항에 있어서, 상기 실리카와 키토산-리파아제 접합체의 혼합 비율은 1:5~60임을 특징으로 하는 방법.