FR2879186A1 - Immobilisation de proteines a l'interieur d'une matrice de silice mesoporeuse par synthese directe a partir d'alcoxysilanes - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un procédé de synthèse d'une silice mésoporeuse avec immobilisation de protéines dans celle-ci, comprenant les étapes consistant(a) à préparer une solution aqueuse homogène de la protéine et d'un agent de stabilisation de la protéine, choisi parmi les composés organiques polyhydroxylés,(b) à préparer une solution alcoolique d'au moins un premier agent tensioactif choisi parmi les phospholipides et d'au moins un deuxième agent tensioactif choisi parmi les agents tensioactifs non-ioniques ou cationiques à chaîne grasse unique en C8-24, les sels biliaires et le cholestérol,(c) à mélanger ces deux solutions,(d) à ajouter à la solution obtenue au moins un précurseur de silice choisi parmi les tétraalcoxysilanes,(e) à laisser reposer la solution pendant une durée suffisante pour former des particules solides, et(f) à isoler les particules formées, ainsi que l'utilisation du biomatériau ainsi obtenu pour la catalyse enzymatique.

Description

IMMOBILISATION DE PROTÉINES À L'INTÉRIEUR D'UNE MATRICE DE SILICE

MÉSOPOREUSE PAR SYNTHÈSE DIRECTE À PARTIR D'ALCOXYSILANES

L'invention concerne l'immobilisation de protéines, en particulier d'enzymes, dans une matrice à base de silice, par synthèse de cette silice à partir de tétraalcoxysilanes en présence de la protéine à immobiliser et d'une combinaison particulière d'agents tensioactifs.

Il est connu d'immobiliser des molécules biologiquement actives, et en particulier des enzymes, dans ou sur des supports solides, minéraux ou organiques, afin d'augmenter leur activité et leur résistance aux conditions réactionnelles, de faire apparaître de nouvelles activités enzymatiques, de faciliter leur récupération à partir du milieu réactionnel et de permettre ainsi leur réutilisation.

Cette immobilisation peut se faire, entre autres, par liaison covalente protéine-support, par adsorption de la protéine à la surface du solide ou à l'intérieur des pores de celui-ci, par encapsulation dans des membranes semi-perméables ou encore par piégeage de la protéine dans une matrice fabriquée par un procédé sol-gel.

L'avantage du piégeage des enzymes par un procédé sol-gel dans des matrices minérales ou organo-minérales réside dans la faible perte d'enzymes par lixiviation, mais les enzymes enfermées dans une telle matrice sont généralement peu accessibles et l'on rencontre des problèmes de transfert de masse (transport des molécules de substrat vers les sites actifs des enzymes et des produits vers l'extérieur), liés à la structure trop faiblement poreuse de la matrice synthétisée. Les activités spécifiques des enzymes ainsi piégées à l'intérieur d'une silice préparée par un procédé sol-gel sont par conséquent généralement très médiocres.

Reetz et al. divulguent dans leur article publié dans J. Biotechnol. Bioeng., 1996, 49, 527, et dans la demande DE 44 08 152 l'immobilisation de lipases dans des matrices hybrides organominérales synthétisées par hydrolyse/polymérisation d'alcoxysilanes comportant une certaine fraction de résidus organiques non hydrolysables car fixés aux atomes de silicium par une liaison Si-C. Ces résidus organiques non hydrolysables confèrent à la matrice finale un caractère plus hydrophobe qu'une matrice minérale de type silice (SiO2).

2879186 2 Les activités spécifiques des lipases immobilisées dans de telles silices hydrophobes sont, notamment en synthèse d'esters, de plusieurs ordres de grandeurs supérieures à celles des enzymes correspondantes non immobilisées ou immobilisées dans des silices non hydrophobes.

La synthèse de supports de silice par les procédés sol-gel selon l'état de la technique ne permet toutefois pas de maîtriser la porosité des supports et d'améliorer l'accessibilité des protéines.

Une autre approche pour immobiliser des protéines sur des supports solides ayant une structure poreuse bien définie est l'adsorption desdites protéines sur des tamis moléculaires mésoporeux. Ces tamis moléculaire mésoporeux, généralement abrégés MTS (de l'anglais Micelle- Templated Silicas), sont synthétisés à partir de silice en présence d'agents tensioactifs, par exemple en présence de cétyltriméthylammonium (voir Beck et al., dans J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 10834 et V. Chiola et al. US 3 556 725, 1971). Plusieurs études décrivent l'immobilisation d'enzymes par adsorption à l'intérieur des pores de tels supports mésoporeux (voir Diaz et al., dans J. Mol. Catal. B: Enz., 1996, 2, 115, He et al., dans J. Mol. Catal. B: Enz., 2000, 11, 45, Yiu et al dans Microporous Mesoporous Mater., 2001, 44 - 45, 763, Yiu et al. dans J. Mol. Catal. B: Enz., 2001, 15, 81; Derre et al. dans J. Phys. Chem. B, 2002, 106, 7340; Fadnavis et al. dans Biotechnol. Prog., 2003, 19, 346; Gimon- Kinsel et al. dans Stud. Surf. Scie. Catal., 1998, 117, 373; Washmon- Kriel et al. dans J. Mol. Catal. B: Enzymatic, 2000, 10, 453; Deere et al. dans Chem. Commun., 2001, 465; Han et al. dans J. Am. Chem. Soc., 1999, 42, 121, et Li et al. dans Chemical Journal on Internet, 2000, 2(11), 48.) Les enzymes ainsi immobilisées par simple adsorption sont toutefois soumises à une certaine désorption et l'activité des biocatalyseurs diminue avec le temps et le nombre de cycles de récupération. Par ailleurs, l'immobilisation des protéines à l'intérieur de ces matériaux est limitée à des enzymes ayant une taille inférieure à celle des pores des tamis moléculaires utilisés.

Il existe par conséquent toujours un besoin pour un procédé permettant d'immobiliser des protéines sur des supports solides tout en préservant leur activité biologique, en particulier leur activité enzymatique, grâce à une bonne accessibilité auxdites protéines. Les 2879186 3 protéines ainsi immobilisées devraient en outre résister à une élimination par désorption ou lixiviation.

Dans le cadre de ses recherches visant à résoudre les problèmes cidessus, la Demanderesse a mis au point un nouveau procédé d'immobilisation de protéines par piégeage de celles-ci dans une matrice minérale ou organo-minérale à base de silice. Ce nouveau procédé est un procédé sol-gel basé sur l'hydrolyse et la polycondensation de tétraalcoxysilanes en milieu aqueux en présence de la protéine à immobiliser et se caractérise par la présence, lors de cette réaction de polymérisation, d'une combinaison particulière d'agents tensioactifs, capables de structurer la silice et de lui conférer une porosité contrôlée.

Les enzymes ainsi immobilisées à l'intérieur d'une matrice mésoporeuse à porosité contrôlée présentent d'excellentes activités relatives, une bonne résistance aux conditions réactionnelles, sont faciles à récupérer par simple filtration ou par centrifugation et peuvent ainsi être réutilisées un grand nombre de fois. Les biocatalyseurs obtenus résistent en outre très bien à la désorption ou lixiviation des enzymes.

La présente invention a par conséquent pour objet un procédé de synthèse d'une silice mésoporeuse avec immobilisation simultanée de protéines dans la matrice de celle-ci, comprenant les étapes suivantes consistant (a) à préparer une solution aqueuse homogène de la protéine à immobiliser et d'au moins un agent de stabilisation de la protéine, choisi parmi les composés organiques polyhydroxylés, de préférence les hydrates de carbone, (b) à préparer une solution alcoolique homogène d'au moins un premier agent tensioactif choisi parmi les phospholipides et d'au moins un deuxième agent tensioactif choisi parmi les agents tensioactifs nonioniques ou cationiques à chaîne grasse unique en C8-24, les sels biliaires et le cholestérol, (c) à mélanger ces deux solutions de manière à obtenir une solution micellaire ou une solution contenant une mésophase, (d) à ajouter à la solution obtenue à l'étape (c), sous agitation, au moins un précurseur de silice choisi parmi les tétraalcoxysilanes, (e) à laisser reposer la solution pendant une durée suffisante pour former des particules solides à base de silice, et (f) à isoler les particules formées du milieu de synthèse hydroalcoolique.

L'invention a en outre pour objet les produits protéine/silice, autrement dit la ou les protéines immobilisées dans une silice mésoporeuse, susceptibles d'être obtenues par un tel procédé ainsi que l'utilisation de ces enzymes immobilisées pour la catalyse enzymatique.

On entend par silice mésoporeuse au sens où cet adjectif est utilisé ici, une silice ayant des pores d'une taille moyenne comprise entre 2 et 50 nm (définition de l'IUPAC).

Dans l'étape (a) du procédé selon l'invention, la protéine à immobiliser est dissoute dans une quantité appropriée d'eau et d'au moins un agent de stabilisation choisi parmi les composés polyhydroxylés. Les protéines sont des molécules particulièrement sensibles aux conditions physicochimiques du milieu qui les entoure (pH, température, force ionique, agents oxydants, etc.) et il est connu de les stabiliser par adjonction de composés organiques polyhydroxylés. On peut citer à titre d'exemples de tels composés, les hydrates de carbone tels que les mono-, di- et polysaccharides, le glycérol, le sorbitol, ou encore les polymères synthétiques polyhydroxylés tels que le poly(alcool vinylique) ou les polymères d'acides carboxyliques insaturés. La Demanderesse a obtenu de bons résultats avec le E3-lactose et le glucose.

Parallèlement, on prépare une deuxième solution contenant la combinaison particulière d'agents tensioactifs de la présente invention.

Comme indiqué ci-dessus, on utilise l'association d'au moins un premier agent tensioactif choisi parmi les phospholipides et d'au moins un deuxième agent tensioactif (agent co-tensioactif) choisi parmi les agents tensioactifs non-ioniques ou cationiques à chaîne grasse unique en C8-24, les sels biliaires et le cholestérol. On peut citer par exemple les amines primaires à chaîne grasse en C8-24, les acides aminés à chaîne grasse en C8-24, les alkylglucosides à chaîne grasse en C8-24 et les (alkyle en C8 24)polyethyleneglycols. La Demanderesse a obtenu des résultats particulièrement intéressants avec les amines primaires à chaîne grasse saturée comportant de 8 à 24 atomes de carbone.

L'utilisation séparée de chacun de ces deux types d'agents tensioactifs ne permet pas l'obtention d'une silice mésoporeuse ayant les caractéristiques intéressantes recherchées. En effet, les 2879186 5 phospholipides utilisés seuls sont connus pour former non pas des micelles, mais des structures lamellaires ou vésiculaires constituées de doubles couches lipidiques. La Demanderesse a eu la surprise de constater que l'adjonction d'un co-tensioactif comportant une seule chaîne grasse permet une courbure suffisante des couches de phospholipides et la formation de micelles ou de mésophases. Parmi les nombreux agents co- tensioactifs disponibles, la Demanderesse a sélectionné les amines primaires comportant une chaîne grasse en C8.21, de préférence en C12_18, car ces amines grasses présentent l'avantage supplémentaire de catalyser la réaction d'hydrolyse et de polycondensation du ou des précurseurs de silice ajoutés à l'étape (d). Cette réaction d'hydrolyse/condensation peut ainsi se faire dans des conditions réactionnelles plus basiques qu'en l'absence d'amine, ce qui se répercute favorablement sur le rendement en biomatériau obtenu.

Utilisées comme seuls agents tensioactifs, ces amines grasses permettent, certes, l'obtention de silices mésoporeuses hexagonales mais l'activité des enzymes immobilisées est généralement insuffisante.

On peut citer, à titre d'exemples d'amines grasses préférées, la décylamine, la dodécylamine, la tétradécylamine et 1'hexadécylamine.

Parmi celles-ci la dodécylamine a donné des résultats particulièrement intéressants.

Le terme phospholipides au sens de la présente invention englobe les diglycérides phosphatés comportant de préférence un groupe azoté cationique lié au groupe phosphate. On peut citer à titre d'exemple de tels phospholipides, la phosphatidylcholine (souvent appelée lécithine) , la phosphatidylsérine et la phosphatidyléthanolamine. Ces phospholipides sont généralement utilisés sous forme de mélanges obtenus à partir de diverses sources naturelles telles que le jaune d'oeuf ou le soja.

La quantité globale de phospholipides et de co-tensioactifs doit être suffisante pour que la concentration globale d'agents tensioactifs dans la solution obtenue dans l'étape (c) soit supérieure à la concentration au-dessous de laquelle les molécules d'agents tensioactifs ne s'assemblent pas en micelles mixtes.

La concentration totale d'agents tensioactifs (phospholipides + cotensioactif) dans la solution de l'étape (c) est généralement comprise 2879186 6 entre 30 et 70 grammes/litre, de préférence entre 35 et 55 grammes/ litre.

Le rapport des phospholipides aux agents co-tensioactifs permet de contrôler la taille des micelles et, par conséquent, la taille des pores de la silice mésoporeuse. La Demanderesse a obtenu des porosités satisfaisantes pour un rapport molaire phospholipide/co-tensioactif supérieur ou égal à 1/2, par exemple compris entre 1/1,3 et 1/0,5, de préférence entre 1/0,9 et 1/0,7.

Le rapport des phospholipides aux agents co-tensioactifs peut également être exprimé en masse et est alors compris de préférence entre environ 2/1 et 10/1, en particulier entre 4,5/1 et 5,5/1, et idéalement entre 4,8/1 et 5,2/1.

Les quantités respectives des différents composants entrant dans la composition de la solution réactionnelle des étapes (c) - (e) du procédé de la présente invention peuvent être définies plus particulièrement par rapport à la quantité totale de précurseur de silice utilisée.

Ainsi, pour une mole de précurseur de silice (tétraalcoxysilane), on utilise de préférence de 14 à 112 moles de H2O, de 0,03 à 0,12 moles d'au moins un disaccharide et de 10-7 à 10-3 moles d'au moins une protéine pour préparer la solution aqueuse de l'étape (a), et de 0,05 à 0, 20 moles d'au moins un phospholipide, de 0,04 à 0,16 moles d'au moins une amine grasse à chaîne saturée en C8_24 et de 8,5 à 34 moles d'au moins un alcool en C1-6, pour préparer la solution alcoolique de l'étape (b).

Le tétraalcoxysilane, précurseur de la matrice silicique, peut en principe être n'importe quel tétraalcoxysilane permettant, par hydrolyse et polycondensation en présence d'eau, la formation d'un réseau de silice (SiO2). Pour des raisons de disponibilité commerciale, on préfère en particulier les composés de formule Si(O-Ri)4 où chaque R1 représente indépendamment un radical alkyle en C1-4, de préférence en C1-2. Le tétraéthoxysilane (TEOS) est le précurseur de silice particulièrement préféré.

L'utilisation d'un ou de plusieurs tétraalcoxysilanes aboutit à la formation d'une matrice minérale de silice comportant à sa surface des groupements silanol (SiOH). Il peut dans certains cas être intéressant de modifier les caractéristiques de surface de la matrice formée. Ceci peut être fait, de manière connue, par addition au mélange réactionnel 2879186 7 d'un ou de plusieurs composés copolymérisables avec les tétraalcoxysilanes, et qui comportent un ou plusieurs groupes organiques non hydrolysables. Ces composés sont connus dans la technique et l'on peut citer à titre d'exemples de tels composés les alkylalcoxysilanes de formule Si(R1)i,(O-R1)4_n où chaque RI représente indépendamment un radical alkyle en C1_4, et n vaut 1, 2 ou 3.

Le procédé de la présente invention peut en principe servir à immobiliser dans une matrice solide poreuse n'importe quelle molécule de masse moléculaire importante et présentant une activité biologique. Ces molécules sont de préférence des protéines et en particulier des enzymes. On peut citer à titre d'exemples de telles protéines les lipases, les déshydrogénases, les peroxydases, les sulfinases, les monooxygénases, les dioxygénases, les isomérases, la sérum albumine de boeuf (BSA) et la métallothionéine.

La plupart de ces molécules biologiquement actives sont très sensibles aux conditions environnementales (pH, température, force ionique, présence d'inhibiteurs etc.) et l'homme du métier veillera à choisir les conditions expérimentales du procédé de la présente invention de manière à préserver le mieux possible l'intégrité et l'activité des molécules à immobiliser. Ainsi, lorsque l'on souhaite immobiliser par exemple des enzymes thermosensibles, les différentes étapes du procédé, et en particulier les étapes (a), (c), (d) et (e) sont mises en oeuvre à une température n'excédant pas 50 C, de préférence à une température comprise entre 0 et 37 C.

De même le pH est de préférence proche de la neutralité, de préférence compris entre 6 et 9.

Comme indiqué ci-dessus, l'amine grasse joue non seulement le rôle de co-tensioactif des phospholipides, mais catalyse également la réaction de polycondensation des alcoxysilanes. D'autres catalyseurs connus de cette réaction de polycondensation, tels que des acides de Lewis, peuvent être ajoutés au milieu réactionnel. L'acide de Lewis le plus communément utilisé à cette fin est le fluorure de sodium (NaF).

Dans une variante du procédé de l'invention, l'addition du précurseur de silice peut se faire non pas à la solution de l'étape (c) mais à la solution aqueuse contenant la protéine et l'agent de 2879186 8 stabilisation polyhydroxylé, avant mélange de celle-ci avec la solution alcoolique contenant les agents tensioactifs.

La synthèse de la matrice de silice se fait au cours des étapes (d) et (e) du procédé de l'invention. L'addition du précurseur de silice à la solution de l'étape (c) se fait sous agitation pour assurer une bonne homogénéisation des différents ingrédients. L'agitation est généralement maintenue pendant quelques minutes, de préférence pendant 5 à 30 minutes, en particulier pendant 10 à 20 minutes. On laisse ensuite la solution réactionnelle reposer pendant plusieurs heures, de préférence pendant 2 à 48 heures, en particulier pendant 20 à 30 heures, au cours desquelles se déroule la réaction de polycondensation des tétraalcoxysilanes et des autres précurseurs de silice éventuellement présents. Au cours de l'étape (e), on observe non pas la prise en gel de la solution, mais la précipitation de fines particules de silice.

Ces particules peuvent être séparées du milieu réactionnel par simple filtration, par exemple sur du verre fritté, ou par centrifugation. Elles sont ensuite de préférence lavées avec un solvant ou mélange de solvants permettant de préserver l'activité des molécules biologiques. On préfère en particulier le lavage des particules avec un mélange eau/éthanol (rapport en poids eau/éthanol compris entre 1/9 et 9/1, de préférence entre 3/7 et 7/3).

L'isolement et le lavage des particules peut être suivie d'une étape d'extraction au Soxhlet avec un mélange en volume eau/tertiobutanol/acide acétique (1 /1 / 1).

Les particules de silice ainsi obtenues ont généralement une taille moyenne comprise entre 1 et 5 gin, et sont agglomérées dans des agrégats de taille supérieure à 10 m.

Leur volume poreux obtenu après calcination à une température comprise entre 450 C et 650 C pendant 6 - 10 heures sous air est déterminé à partir des isothermes d'adsorption d'azote à 77 K, et est généralement compris entre 0,2 et 1 ml/g, de préférence entre 0,3 et 0,6 ml/g.

La taille moyenne des pores, déterminée à partir des isothermes de désorption d'azote à 77 K, est comprise entre 20 et 100 Â, de préférence entre 30 et 70 A. La surface spécifique des particules de silice, mesurée par la méthode BET à partir des isothermes d'adsorption-désorption d'azote à 2879186 9 77 K, est généralement comprise entre 300 et 900 m2/g, de préférence entre 400 et 600 m2/g.

La présente invention a en outre pour objet l'utilisation pour la catalyse enzymatique d'une protéine immobilisée dans une silice mésoporeuse de la manière décrite ci-dessus.

Cette protéine peut être par exemple une lipase et la réaction catalysée peut alors être l'estérification, la transestérification, l'amidification d'amines ou encore l'hydrolyse d'esters.

Il peut également s'agir d'une alcool déshydrogénase et la réaction catalysée est alors l'oxydation d'alcools ou la réduction de cétones.

Les protéines immobilisées selon la présente invention peuvent également être utilisées dans des applications non catalytiques, par exemple, la métallothionéine immobilisée dans une silice mésoporeuse peut être utilisée pour la fixation sélective du cuivre.

L'immobilisation d'une enzyme (lipase) et l'utilisation de l'enzyme immobilisée pour l'hydrolyse d'esters est illustrée par les exemples ci-après.

Exemple 1

Synthèse d'une silice mésoporeuse contenant une lipase immobilisée La lipase utilisée dans cet exemple est l'esterase 30000 de Rhizomucor miehei, fournie par la société Gist-Brocades. L'enzyme est purifiée avant immobilisation. Pour cela, on dissout 500 mg d'enzyme brute dans 8 ml d'eau distillée, on agite pendant 15 minutes et l'on centrifuge la solution afin d'en éliminer les composants solides. On fait passer ensuite le surnageant sur une colonne de chromatographie d'exclusion par la taille (Sephadex G25) en éluant avec de l'eau distillée.

La solution d'enzyme recueillie en sortie de colonne a une concentration, déterminée selon la méthode connue de Bradford et al. (Dunn, M.J. dans l'ouvrage intitulé Protein Purification Methods - A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford, 1994, 17), de 3,50 mg de protéine/ml. L'activité spécifique de cette enzyme pour l'hydrolyse du thiodécanoate d'éthyle est de 35,5 UI/mg. L'activité spécifique de la lipase est exprimée en Unités Internationales par mg d'enzyme (UI: moles de substrat transformé par minute).

2879186 10 On prépare ensuite une première solution (A) à partir de 7 g de cette solution de lipase et de 0,15 g (0,03 mole) de 0-lactose, ainsi qu'une deuxième solution (B) à partir de 5,2 g (8,5 moles) d'éthanol, de 0,5 g (0,05 mole) de 3-sn-phosphatidycholine (lécithine de jaune d'oeuf) et de 0,1 g (0,04 mole) de dodécylamine.

On ajoute la solution (A) sous agitation à température ambiante à la solution (B), puis on ajoute au mélange 2,7 g (1 mole) de tétraéthoxysilane (TEOS), et l'on poursuit l'agitation pendant 15 minutes supplémentaires. On laisse ensuite reposer la solution ainsi obtenue pendant 24 heures à température ambiante. Au bout de ce temps, des particules de couleur blanc jaune se sont formées. On sépare ces particules par filtration sur un verre fritté ou par centrifugation et on les lave cinq fois avec 10 ml d'un mélange eau/éthanol (1/1, v/v), puis on les recueille par centrifugation et on les sèche pendant 24 heures à 50 C et à pression atmosphérique. La quantité d'enzyme ainsi immobilisée dans la silice mésoporeuse formée est déterminée par dosage des protéines soit dans les solutions de lavage, soit dans une solution contenant la silice mésoporeuse solubilisée à pH 9, dans les deux cas après séparation préalable de l'enzyme sur une colonne de Sephadex G25.

Exemple 2 (comparatif) Immobilisation d'une lipase par adsorption sur une silice mésoporeuse de l'état de la technique (MCM-41) Pour cet exemple on utilise une solution d'esterase 30000 de Rhizomucor miehei, purifiée de la même manière que dans l'Exemple 1, et ayant une concentration en protéines de 0,74 mg/ml, l'activité spécifique de cette enzyme pour l'hydrolyse du thiodécanoate d'éthyle étant de 35,5 UI/mg.

Deux silices mésoporeuses (MCM-41 avec taille moyenne des pores égale à 37 À et 62 Â) servant de support d'adsorption sont synthétisées selon le protocole expérimental décrit dans l'article de Desplantier- Giscard, D., Galarneau, A., Di Renzo, F. et Fajula, F., dans Stud. Surf Sci. Catal., 2001, 135, 1105, à partir de 1 mole de SiO2 (Aerosil 220V), 0,1 mole de bromure de cétyltriméthylammonium, 0,25 mole de NaOH et respectivement 0 et 0,27 moles de 1,3,5-triméthylbenzène et 20 moles H2O. La synthèse est réalisée pendant 24 heures à 115 C dans un autoclave. Les silices obtenues sont filtrées, lavées avec de l'eau et séchées pendant une nuit à 115 C.

On ajoute 5 ml de la solution de lipase purifiée à 0,50 g de chacune des silices mésoporeuses (MCM-41-37 A et MCM-41-62 Â). On agite les suspensions pendant 2 heures à température ambiante. On récupère les particules de silice par filtration, on les lave avec de l'eau et on les sèche pendant 24 heures à 50 C. La quantité d'enzyme immobilisée est déterminée de la même manière que dans l'exemple 1.

Exemple 3 (comparatif) Immobilisation d'une lipase dans une matrice de silice hydrophobe par un procédé sol-gel n'utilisant pas d'agents tensioactifs Pour ce troisième exemple on utilise une solution d'esterase 30000 de Rhizomucor miehei, purifiée de la même manière que dans l'Exemple 1, et ayant une concentration en protéines de 7,16 mg/ml, l'activité spécifique de cette enzyme pour l'hydrolyse du thiodécanoate d'éthyle étant de 10,1 UI/mg.

Le procédé sol-gel est réalisé selon le protocole expérimental décrit dans l'article de Reetz et al., J. Biotechnol. Bioeng., 1996, 49, 527.

564 pl de la solution de lipase purifiée sont ajoutés à 100 l d'une solution aqueuse de fluorure de sodium 1M, et 200 pl d'une solution aqueuse de poly(alcool vinylique) (4 % m/m). On agite la solution et on y ajoute 875 pl (5 moles) de propyltriméthoxysilane, puis 148 l (5 gnioles) de tétraméthoxysilane. Le rapport molaire global eau/silane est égal à 5. On agite le mélange réactionnel vigoureusement pendant 5 secondes sur un mélangeur Vortex puis, plus doucement, à la main. Après environ 30 secondes, la solution homogène limpide commence à chauffer et on la place dans un bain d'eau et de glace jusqu'à ce que la gélification se produise (environ 10 minutes). On laisse ensuite la maturation du gel se faire pendant 24 heures à température ambiante. On sèche le gel obtenu pendant 3 jours à 37 C, puis on le broie à l'aide d'un mortier. On reprend le solide dans 4 ml d'eau et on agite la suspension pendant 2 heures à 350 tours par minute. On recueille les particules par filtration et on les lave successivement avec 20 ml d'eau, 20 ml d'acétone et 20 ml de pentane. La teneur en protéine du matériau est déterminée de la manière indiquée dans l'exemple 1.

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Exemple 4

Comparaison de l'activité enzymatique des lipases immobilisées sur ou dans des supports solides en silice L'essai catalytique choisi pour comparer les activités des différentes lipases immobilisées de la manière décrite dans les exemples 1, 2 et 3 est l'hydrolyse du thiodécanoate d'éthyle. Le thioéthanol formé par cette réaction peut être détecté facilement par spectroscopie UV/visible, grâce à la couleur jaune qui se développe en présence d'acide 5,5-dithiobis(2-nitrobenzoïque) (DTNB), voir également Renard et al., Lipids, 1987, 22, 539.

En particulier, les essais enzymatiques sont réalisés de la manière suivante: (a) Solution enzymatique: On ajoute 100 gl de la solution enzymatique ayant servie à l'immobilisation de l'enzyme, à 2,7 ml de tampon Tris 0,05 M (pH 8), 100 l d'une solution de DTNB (20 mg/ml dans du DMSO) et 100 l d'une solution de thiodécanoate d'éthyle (0,2 mg/ml dans du DMSO), le tout dans une cellule de mesure d'un spectromètre UV/visible.

(b) Lipases immobilisées: On ajoute 0,05 g de silice avec l'enzyme immobilisée à un mélange contenant 28,7 ml de tampon Tris 0,05 M (pH8), 0, 7 ml de solution de DTNB (20 mg/ml dans du DMSO), 1,5 ml de thiodécanoate d'éthyle (0,2 mg/ml dans du DMSO). On agite le mélange vigoureusement à température ambiante. On prélève à des intervalles d'une minute des fractions aliquotes de 0,3 ml, on les filtre sur un filtre avec des pores de 0,2 mm afin d'éliminer les particules solides qui perturbent la lecture spectrophotométrique et on ajoute le filtrat à 2,7 ml de tampon Tris.

Dans les deux cas ((a) et (b)), on enregistre l'absorbance du produit jaune formé à 412 nm (s=14800 l.mol-i.cm-1) à des intervalles de 2 ou 3 minutes. L'activité spécifique de la lipase est exprimée en Unités Internationales par mg d'enzyme (UI: !moles de substrat transformé par minute). L'activité spécifique du biomatériau (silice + enzyme) est exprimée en UI par g de biomatériau. L'activité spécifique relative est le rapport (en %) de l'activité spécifique de la lipase immobilisée sur l'activité spécifique de la lipase en solution.

2879186 13 Le Tableau 1 rassemble les quantités de lipase immobilisée surou dans les différents supports des exemples 1 3 (exprimées en mg de protéine/g de biomatériau), l'activité spécifique du biomatériau (en UI/g de biomatériau) ainsi que l'activité spécifique relative (%) des lipases immobilisées.

Tableau 1

Biocatalyseur Quantité de Activité Activité lipase/g de spécifique du spécifique biomatériau biomatériau relative de (mg/g) (UI/g) la lipase (%) Silice mésoporeuse selon 1,3 20,7 46 l'invention (exemple 1) Silice mésoporeuse (MCM-41) 5,0 9,3 5,2 selon l'état de la technique (exemple 2), taille des pores 37 À Silice mésoporeuse (MCM-41) 7,2 3,0 1,1 selon l'état de la technique (exemple 2), taille des pores 62 A Silice hydrophobe sol-gel selon 4,8 13,9 29 l'état de la technique (exemple 3) Ces résultats montrent que le procédé d'immobilisation d'enzymes selon l'invention (exemple 1), par synthèse directe d'une silice à partir d'un tétraalcoxysilane en présence de l'enzyme, d'au moins un phospholipide et d'au moins une amine grasse, permet d'obtenir des biocatalyseurs présentant d'excellentes activités spécifiques. Ces activités sont supérieures non seulement à celles des enzymes adsorbées sur des silices mésoporeuses (exemple 2), mais également à celles des enzymes piégées à l'intérieur d'une silice organo-minérale hydrophobe, préparée par un procédé sol-gel en l'absence d'agents tensioactifs (exemple 3).

Claims (1)

14 REVENDICATIONS

1. Procédé de synthèse d'une silice mésoporeuse avec immobilisation simultanée de protéines dans celle-ci, comprenant les étapes suivantes consistant (a) à préparer une solution aqueuse homogène de la protéine à immobiliser et d'au moins un agent de stabilisation de la protéine, choisi parmi les composés organiques polyhydroxylés, de préférence les hydrates de carbone, (b) à préparer une solution alcoolique homogène d'au moins un premier agent tensioactif choisi parmi les phospholipides et d'au moins un deuxième agent tensioactif choisi parmi les agents tensioactifs non-ioniques ou cationiques à chaîne grasse unique en C8_24, les sels biliaires et le cholestérol, (c) à mélanger ces deux solutions de manière à obtenir une solution micellaire ou une solution contenant une mésophase, (d) à ajouter à la solution obtenue à l'étape (c), sous agitation, au moins un précurseur de silice choisi parmi les tétraalcoxysilanes, (e) à laisser reposer la solution pendant une durée suffisante pour former des particules solides à base de silice, et (f) à isoler les particules formées du milieu de synthèse hydroalcoolique.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que les phospholipides sont choisis parmi la phosphatidylcholine (lécithine), la phosphatidylsérine et la phosphatidyléthanolamine.

3. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le deuxième agent tensioactif (agent cotensioactif) est choisi parmi les amines primaires à chaîne grasse saturée en C8_24.

4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que l'amine primaire à chaîne grasse en C8-24 est choisie parmi la décylamine, la dodécylamine, la tétradécylamine et l'hexadécylamine, et est de préférence la dodécylamine.

5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le rapport en masse du phospholipide à l'amine grasse à chaîne en C8_24 est compris entre 2/1 2879186 15 et 10/1, de préférence entre 4,5/1 et 5,5/1, et en particulier entre 4,8/1 et 5, 2/1.

6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le composé organique polyhydroxylé utilisé dans l'étape (a) est choisi parmi les mono- et disaccharides, de préférence parmi le f3-lactose et le glucose.

7. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé par le fait que la solution aqueuse préparée dans l'étape (a) est constituée de 14 à 112 moles de H2O, de 0,03 à 0,12 moles d'au moins un disaccharide et de 10-' à 10-3 moles d'au moins une protéine à immobiliser, pour 1 mole de tétraalcoxysilane ajouté à l'étape (d).

8. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé par le fait que la solution alcoolique préparée dans l'étape (b) est constituée de 0,05 à 0,20 moles d'au moins un phospholipide, de 0, 04 à 0,16 moles d'au moins une amine grasse à chaîne saturée en CH_ 24 et de 8,5 à 34 moles d'au moins un alcool en C1-6, pour 1 mole de tétraalcoxysilane ajouté à l'étape (d).

9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le tétraalcoxysilane est choisi parmi ceux de formule Si(O-R1)4 où chaque R1 représente indépendamment un radical alkyle en C1-4, de préférence en C1_2.

10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'on ajoute, à l'étape (d), en plus du tétraalcoxysilane, au moins un alkylalcoxysilane de formule Si(R1)n(O-Ri) 4- où chaque R1 représente indépendamment un radical alkyle en C1-4, de préférence en C1-2 et n vaut 1, 2 ou 3.

11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que la protéine à immobiliser est une lipase, une déshydrogénase, une peroxydase, une sulfinase, une monooxygénase, une dioxygénase, une isomérase, la sérum albumine de boeuf (BSA) ou la métallothionéine.

12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que la durée de l'étape (e) est comprise entre 2 et 48 heures, de préférence entre 20 et 30 heures.

13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'isolement des particules de 2879186 16 silice mésoporeuse se fait par filtration ou centrifugation et lavage avec un mélange eau/éthanol.

14. Protéine immobilisée dans une silice mésoporeuse, susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes.

15. Utilisation de la protéine immobilisée dans une silice mésoporeuse selon la revendication 14 pour la catalyse enzymatique.

16. Utilisation selon la revendication 15, caractérisée par le fait que la protéine est une lipase et que la réaction catalysée est l'estérification, la transestérification, l'amidification d'amines ou l'hydrolyse d'esters.

17. Utilisation selon la revendication 15, caractérisée par le fait que la protéine est une alcool déshydrogénase et que la réaction catalysée est l'oxydation d'alcools ou la réduction de cétones.

18. Protéine immobilisée dans une silice mésoporeuse selon la revendication 14, caractérisée par le fait qu'il s'agit de la métallothionéine.

19. Utilisation de la métallothionéine immobilisée dans une silice mésoporeuse selon la revendication 18 pour la fixation spécifique du cuivre.