KR101411793B1

KR101411793B1 - 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소입자 제조방법 및 이를 통해 제조된 단분자 나노효소입자

Info

Publication number: KR101411793B1
Application number: KR1020120054318A
Authority: KR
Inventors: 김중배; 홍성길; 이병수
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2011-05-23
Filing date: 2012-05-22
Publication date: 2014-06-24
Also published as: KR20130028630A; US20140127778A1; WO2012161502A3; US9458448B2; WO2012161502A2

Abstract

본 발명의 실리카 캡슐화를 통한 단분자 나노효소입자 제조방법은 종래의 단분자 효소 나노입자 합성과정에서 표면작용기화 과정과 고분자화 과정을 포함하지 않으며, 반응조건이 마일드하여 대량생산에 적합하다.

Description

실리카 캡슐화된 단분자 나노효소입자 제조방법 및 이를 통해 제조된 단분자 나노효소입자{Manufacturing method of single enzyme nanoparticles by silica encapsulation, and manufactured single enzyme nanoparticles thereof}

본 발명은 실리카 캡슐화를 통한 단분자 나노효소입자 제조방법 및 이를 통해 제조된 단분자 나노효소입자에 관한 것으로, 보다 상세하게는 종래의 단분자 효소 나노입자 제조 방법에 비하여 훨씬 단순한 공정에 의하여 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소입자를 대량으로 생산할 수 있는 제조방법 및 이를 통해 제조된 단분자 나노효소입자를 제공하는 것이다.

전통적으로, 졸-젤 방법은 효소를 포함하는 고체상태의 입자를 합성함으로써 유기 또는 수용액 상에서 안정성을 향상시키기 위하여 사용되는 방법이다. 대부분의 응용에서 졸-젤 방법에 의해 효소가 포집된 실리카는 두 단계로 합성이 된다. 첫번째는 수용액상에서 실리카 모노머의 가수분해이고 효소가 첨가된다. 두번째로 가수분해된 실리카 모노머가 응축반응을 일으키며 효소를 포집하면서 실리카 네트워크가 크게 성장을 하게 된다. 이 두 과정에 의해 실리카가 응축된 졸-젤 매트릭스가 만들어진다. 하지만 효소 포집을 위한 졸-젤 매트릭스 접근방식은 매우 얇은 매트릭스만을 통과할 수 있는 기질의 확산저항을 크게 유발한다.

효소캡슐화는 효소의 포집 및 활성의 안정화를 위해 널리 사용되는 효소 고정화 방법 중의 하나이다. 그러나 대부분의 연구들은 마이크로미터 혹은 밀리미터 수준의 크기로 기질과 효소 간의 반응을 제한하는 결과를 보여주었다. 따라서 미카엘리스 상수을 줄이면서도 효소 개별 분자를 안정화 할 수 있는 캡슐화 방법에 대한 관심이 크게 증대되고 있다. 그에 대한 일반적인 방법으로는 역미셀을 형성하는 것인데 이는 크기가 7nm 보다 클 뿐만 아니라 캡슐화되는 효소의 수를 조절하는 것이 힘들다. 이러한 특징들 때문에 역미셀 방법은 하나 이상의 효소를 포집할 뿐만 아니라 7nm 이상의 크기를 가졌다.

최근 발표된 단분자 효소나노입자(SEN) 복합체는 효소군집체를 전체적으로 캡슐화하는 것이 아니라 개개의 효소 표면에 수십 나노미터 두께의 그물구조 네트워크를 형성하였다. 구체적으로 SEN의 합성은 헥세인(hexane) 용액에서 효소 분자들을 가용화(solubilization) 시키면서 시작된다. 이 가용화 기술은 역미셀 접근방식보다 적은 양의 계면활성제를 사용하는 것으로 효소의 응집을 막으면서도 효소 개별 분자를 유기용매상으로 추출하는 것이다. 게다가, 가용화된 효소의 표면은 최소한의 물분자와 함께 유기용매에 노출되어 있다. 이러한 기술은 매우 얇은 두께의 네트워크를 가진 SEN의 성공에 매우 중요한 요소였다. 하지만, 이를 위하여 단분자 효소나노입자의 합성은 헥세인에서 효소 표면에 작용기를 부착하고, 비닐 그룹 등을 이용한 고분자화 과정을 반드시 거쳐야 하는데, 이 고분자화 과정 등은 매우 복잡할 뿐만 아니라 조건이 민감하여 대량생산이 아주 어려운 문제가 있었다.

본 발명은 상술한 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 첫번째 해결하려는 과제는, 효소 표면에 작용기를 부착하는 공정 및 고분자화 공정을 거치지 않고서도, 효소 단분자에 실리카 캡슐화를 수행하여 대량생산을 도모하고 동시에 유리효소와 대비하여 미카엘리스 상수(Km)에 비교적 영향을 미치지 않는 대량생산에 적합한 실리카 캡슐화를 통한 단분자 나노효소입자 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 두번째 해결하려는 과제는 효소 표면에 어떠한 작용기 및 고분자가 부착되지 않으면서 효소표면에 극히 얇은 실리카 네트워크가 형성되며, 유리효소와 대비하여 미카엘리스 상수(Km)의 오차범위가 매우 작은 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소입자를 제공하는 것이다.

상술한 본 발명의 과제를 해결하기 위하여, (1) 수용액상의 효소를 유기용매상으로 가용화(solubilization) 시키는 단계; (2) 유기용매상에서 실리카를 첨가하고, 상기 실리카를 효소표면의 물분자와 반응시켜 1차 응축시키는 단계; (3) 유기용매상의 효소를 수용액상으로 역추출하는 단계; 및 (4) 수용액상에서 실리카를 2차 응축시키는 단계를 포함하는 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소입자 제조방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 수용액은 비스-트리스 프로페인 수용액, 인산나트륨 수용액, 트리스 수용액, 탄산수소나트륨 수용액으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이고, 유기용매는 소수성 유기용매일 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 (1) 단계는 가용화제를 첨가하여 수행될 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 가용화제는 한계미셀농도 이하의 계면활성제를 첨가하여 수행될 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 (2) 단계의 실리카는 테트라메톡시실란, 트리메톡시실란, 디메톡시실란, 테트라에톡시실란, 트리에톡시실란, 디에톡시실란으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 (3) 단계는 역추출 용액을 첨가하여 수행될 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 역추출 용액은 비스-트리스 프로페인 수용액, 인산나트륨 수용액, 트리스 수용액, 탄산수소나트륨 수용액으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 (3) 단계와 (4) 단계 사이에 교반 및 원심분리를 거쳐 수용액층을 분리수득하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 (4) 단계는 1 ~ 40℃에서 반응이 수행될 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 단분자 효소 및 단분자 효소를 감싸며 공극을 갖는 실리카 캡슐을 포함하며, 단분자 효소와 실리카 캡슐 사이에 공유결합을 포함하지 않는 실리카 캡슐화된 단분자 효소를 제공한다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 실리카 캡슐화된 단분자 효소는 미카엘리스 상수(Km) 값이 유리효소대비 20% 이내, 보다 바람직하게는 10% 이내, 더욱 바람직하게는 5% 이내, 가장 바람직하게는 3% 이내의 오차범위를 가질 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 실리카 캡슐의 두께는 0.5 ~ 2.5㎚일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 실리카 캡슐은 효소의 표면에 비닐 고분자 등을 포함하지 않을 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 공극의 크기는 0.1 ~ 2㎚일 수 있다.

본 발명의 실리카 캡슐화를 통한 단분자 나노효소입자 제조방법은 종래의 단분자 효소 나노입자 합성과정에서 표면작용기화 과정과 고분자화 과정을 포함하지 않으며, 반응조건이 마일드하여 대량생산에 적합하다. 이를 통해 제조된 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소입자는 효소의 표면에 실리카 캡슐화를 위한 어떠한 작용기 및 폴리머를 포함하지 않으면서, 매우 얇은 실리카 네트워크를 형성할 수 있다. 실리카 네트워크는 실리카 응축반응으로 인해 Si-O-Si 구조를 이룰 것이며, 일부 네트워크가 형성이 되지 않은 부분의 말단은 Si-OH 혹은 Si-O-R (R=alkyl group)의 구조를 가지고, 그 부분이 공극으로서의 작용을 할 수가 있다. 이를 통해 오랜 시간이 경과한 뒤에도 안정성을 유지할 수 있으며, 나아가, 종래의 실리카 캡슐화된 효소입자와는 달리 실리카가 캡슐화되지 않은 유리 효소의 Km 값과 거의 동일한 Km 을 가지므로 효소와 기질간의 촉매반응에서 최고반응속도에 쉽게 도달할 수 있는 장점이 있다.

반면, 역미셀을 통한 합성 방법은 과량으로 존재하는 물에 의해 실리카 응축반응이 효소 표면 전체에서 과도하게 일어나, 실리카 네트워크의 두께가 두꺼워지고 공극으로 작용할 수 있는 부분이 사라져 미카엘리스 상수이 심해지고 Km 값이 크게 상승하게 된다.

또한, 효소 표면의 실리카 네트워크는 다른 실리카 물질과 가교결합제를 사용하지 않고도 화학적 결합을 형성 할 수 있는 이점을 가진다. 이는 약산성, 중성, 약염기성 pH에서 효소 표면 실리카의 -OH기가 메조포러스 실리카와 같은 실리카 기반의 나노구조물질의 표면 -OH기와 응축반응을 통해 화학적 결합을 이룰 수 있음을 의미한다. 이를 통해 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소입자를 나노구조물질에 고정화를 할 수 있고 그 안정성은 더욱 향상되며 응용분야 또한 다양해 질 수 있게 된다.

따라서, 본 발명의 실리카 캡슐화 효소나노입자는 바이오 센서, 바이오 연료전지, 바이오정화, Antifouling 그리고 정량분석법 (ELISA) 등에 사용되어 안정성을 향상시키고 종래의 단분자 효소나노입자보다 실제 산업적 응용에 현실성을 보여줄 것으로 판단된다.

도 1은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 단분자 효소에 대한 실리카 캡슐화 공정(SEENs)을 나타내는 모식도이다.
도 2는 (a)는 SEEN-CT(실시예 1)의 TEM 사진이며 (b)는 RM-SEEN-CT (비교예 1)의 TEM 사진이다.
도 3은 200 rpm 교반 조건 아래에서 일정 시간이 경과한 후의 SEEN-CT (실시예 1), RM-SEEN-CT(비교예 1), Free CT (유리효소)의 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 MSU-F의 TEM 사진이다.
도 5는 200 rpm 교반 조건 아래에서 MSU-F에 고정화한 Free CT와 SEEN-CT의 시간에 따른 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 6은 200 rpm 교반 조건 아래에서 SEEN-LP의 시간에 따른 안정성을 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이, 종래의 효소표면에 실리카를 캡슐화하는 방법은 단일효소가 아닌 효소군집체에 실리카를 캡슐화하는 것이므로, 물질전달저항값을 의미하는 미카엘리스 상수(Km)가 현저하게 상승하는 문제가 발생하였다. 이를 극복하기 위하여 제안된, 종래의 단분자 나노효소입자 제조방법(SEN)은 표면 작용기화 과정과 고분자화 과정을 거쳐야 하므로 공정이 지나치게 복잡할 뿐만 아니라 조건이 민감하여 대량생산이 거의 불가능한 문제가 있었다.

이에 본 발명에서는 (1) 수용액상의 효소를 유기용매상으로 가용화(solubilization) 시키는 단계; (2) 유기용매상에서 실리카를 첨가하고, 상기 실리카를 효소표면의 물분자와 반응시켜 1차 응축시키는 단계; (3) 유기용매상의 효소를 수용액상으로 역추출하는 단계; 및 (4) 수용액상에서 실리카를 2차 응축시키는 단계를 포함하는 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소입자 제조방법을 제공하여 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해 본 발명의 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소입자 제조방법종래의 단분자 효소 나노입자 합성과정에서 표면작용기화 과정과 고분자화 과정을 포함하지 않으며, 반응조건이 마일드하여 대량생산에 적합하다. 상기 공정을 첨부된 도 1을 참조하여 설명한다.

먼저 (1) 단계로서 수용액상의 효소를 유기용매상으로 가용화한다. 한편, 실리카 전구체는 유기용매에 잘 용해되고 안정하기 때문에 실리카 캡슐화는 유기용매상에서 수행하는 것이 유리하다.

본 발명에 적용될 수 있는 수용액은 비스-트리스 프로페인 수용액, 인산나트륨 수용액, 트리스 수용액, 탄산수소나트륨 수용액 등 효소에 적합한 pH를 유지할 수 있는 수용액을 이용할 수 있으며, 효소의 종류에 따라 적절한 수용액의 종류 및 농도를 선택하는 것은 당업자에게 자명한 것이다.

본 발명에 사용가능한 유기용매는 효소를 가용화하여 실리카 캡슐공정을 수행할 수 있는 것이면 제한없이 사용될 수 있지만 바람직하게는 소수성 유기용매인 헥세인(hexane), 헵테인(heptane) 옥테인(octane) 및 이소옥테인 (isooctane) 등을 단독 또는 혼합하여 사용할 수 있다.

한편, 수용액상에서 효소를 유기용매상으로 가용화하는 방법은 양친매성을 띄는 폴리에틸렌 글리콜 고분자 및 폴리에틸렌 글리콜에 기반한 합성 고분자 (PEG₂)를 이용할 수 있지만, 바람직하게는 상기 유기용매상에 계면활성제를 첨가하여 가용화 공정을 수행할 수 있다. 본 발명에서는 음이온 계면활성제인 디옥틸 소듐 설포석시네이트(AOT)를 사용하였지만 계면활성제의 종류는 AOT에 제한되지 않고 효소의 종류와 그 등전점에 따라 양이온성, 비이온성 계면활성제가 모두 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, 계면활성제를 사용할 경우 사용되는 계면활성제의 농도는 역미셀을 형성하지 않도록 한계미셀농도(critical micelle concentration) 이하의 농도로서 사용하는 것이 바람직하다. 이를 통해 역미셀을 형성하지 않고 효소 표면에 소수의 계면활성제 분자만 달라붙는 이온쌍을 형성하게 한다. 만일 역미셀을 형성하게 되면 역미셀 내부에 물을 많이 함유하게 되어 실리카 네트워크가 두꺼워지고 미카엘리스 상수값이 커지게 된다.

한편 유기용매상에 계면활성제 등의 가용화제를 첨가하고 교반등을 통해 효소가 유기용매상으로 가용화되면 원심분리 등을 통해 효소가 가용화된 유기용매층만을 분리해낼 수 있다. 필요에 따라 농도를 조절하기 위해 질소가스로 유기용매를 휘발시키는 것도 가능하다.

한편, 수용액상에서 효소는 적절한 버퍼에 용해되고 그 pH는 효소의 등전점에 따라 다양하게 조절될 수 있다. 또한 가용화를 용이하게 하기 위하여 염화칼슘, 염화칼륨, 염화나트륨, 염화마그네슘으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나이상의 염과 메탄올, 에탄올, 프로판올, 뷰탄올, 펜탄올, 헥산올, 헵탄올으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 알콜을 소량 포함할 수 있다. 염은 기본적으로 수용액에 첨가하여 주며, 알콜은 계면활성제와 유기용매의 종류에 따라 적절하게 사용될 수 있으며, 친수성 알콜은 수용액에 첨가하고 소수성 알콜은 유기용매에 첨가하여 사용할 수 있다.

다음. (2) 단계로서 유기용매상에서 실리카를 첨가하고, 상기 실리카를 효소표면의 물분자와 반응시켜 1차 응축시킨다. 이 때 사용가능한 실리카는 바람직하게는 유기용매에 용해될 수 있으면 제한없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 실리카 전구체, 실리카 분말일 수 있다. 구체적으로 테트라메톡시실란, 트리메톡시실란, 디메톡시실란 등의 메톡시실란 계열 및 테트라에톡시실란, 트리에톡시실란, 디에톡시실란 등의 에톡시실란 계열을 사용할 수 있다.

효소의 표면에서 실리카 네트워크를 형성할 수 있는 것이면 제한없이 사용될 수 있다. 한편, 첨가되는 실리카는 전체 유기용매에 대하여 0.1 ~ 10vol%를 첨가할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.

상기 유기용매상에 실리카를 첨가한 후 1 ~ 40℃의 낮은 온도에서 1 ~ 5일간 보관하면, 첨가된 실리카 전구체는 효소표면의 소량의 물 분자와 반응하여 실리카 전구체의 말단에 포함된 알킬기가 -OH 기로 치환되는 1차 응축반응을 일으키게 되고 효소 표면에서 실리카 네트워크를 형성하게 된다.

다음, (3) 단계로서 유기용매상의 표면에 실리카 네트워크가 형성된 효소를 수용액상으로 역추출하는 단계를 수행한다. 유기용매상에서는 물분자의 함유량이 극미량이기 때문에 효소의 안정성을 향상시킬 만큼의 실리카 네트워크 형성이 일어나지 않는다. 따라서 수용액상으로 효소를 추출하고 이때 수용액상으로 함께 추출된 미반응 실리카 전구체에 의해 2차 응축반응이 일어날 수 있도록 해주어야 한다. 이를 위하여, 역추출 용액을 사용하여 일정시간 동안 교반을 하여 효소를 수용액 상으로 역추출 공정을 수행할 수 있다.

상기 역추출 용액은 유기용매상의 표면에 실리카 네트워크가 형성된 효소를 수용액상으로 추출할 수 있는 것이면 종류의 제한이 없지만 바람직하게는 비스-트리스 프로페인 수용액, 인산나트륨 수용액, 트리스 수용액, 탄산수소나트륨 수용액 등을 단독 또는 혼합하여 유기용매상에 첨가할 수 있다.

그 뒤 교반공정 등을 거치게 되면은 효소 표면에 형성된 실리카 네트워크의 친수성 작용기에 의해 효소 및 미반응된 실리카 전구체가 수용액상으로 추출된다. 원심분리로 유기용매층과 수용액 층을 분리시킨 후 수용액층만 분리시킬 수 있다. 이후 불순물을 여과하는 공정을 수행할 수도 있다.

다음, (4) 단계로서 수용액상에서 실리카를 2차 응축시키킨다. 바람직하게는 수용액상으로 추출된 효소를 낮은 온도(1 ~ 40℃)에서 일정시간(1 ~ 5일) 보관하여 미반응된 실리카가 효소 표면에서 2차 응축반응이 수행된다. 그 뒤 미반응된 실리카 입자 및 계면활성제 등을 제거하여 최종적으로 실리카 캡슐화를 통한 단분자 나노효소입자를 제조할 수 있다.

결국, 본 발명의 실리카 캡슐화를 통한 단분자 나노효소입자 제조방법은 종래의 단분자 효소 나노입자 합성과정에서 표면작용기화 과정과 고분자화 과정을 포함하지 않으며, 반응조건이 비교적 마일드하여 대량생산에 적합한 장점을 가진다.

한편, 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상술한 방법을 통해 제조된 실리카 캡슐화된 단분자 효소는분자 효소 및 단분자 효소를 감싸며 공극을 갖는 실리카 캡슐을 포함하며, 단분자 효소와 실리카 캡슐 사이에 공유결합을 포함하지 않는다.

먼저, 본 발명에 사용될 수 있는 단분자 효소는 실리카 캡슐화될 수 있는 것이면 제한없이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 트립신, 키모트립신, 펩신, 리파아제, 당산화효소, 양고추냉이 과산화효소, 티라시나아제, 탄산무수화효소, 포름알데히드 탈수소효소, 포름산 탈수소효소, 알콜 탈수소효소, 콜레스테롤 탈수소효소 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

한편, 상술한 방법을 통해 제조된 본 발명의 실리카 캡슐화를 통한 단분자 나노효소입자는 효소의 표면에 대략 0.5 ~ 5㎚두께, 바람직하게는 0.5 ~ 2.5㎚ 두께, 더욱 바람직하게는 0.5 ~ 2.0㎚두께를 갖는 실리카가 네트워크를 형성하게 된다. 이 때 상기 효소의 표면에는 어떠한 작용기 및/또는 폴리머 등을 포함하지 않을 수 있으며, 이를 통해 효소와 실리카 캡슐간에 공유결합이 형성되지 않으면서 단분자 효소를 캡슐화할 수 있다.

나아가, 실리카 네트워크는 실리카 응축반응으로 인해 Si-O-Si 구조를 이룰 것이며, 일부 네트워크가 형성이 되지 않은 부분의 말단은 Si-OH 혹은 Si-O-R (R=알킬기)의 구조를 가지고, 그 부분이 공극으로서의 작용을 할 수가 있다. 이를 통해 오랜 시간이 경과한 뒤에도 안정성을 유지할 수 있으며, 나아가, 종래의 실리카 캡슐화된 효소입자와는 달리 실리카가 캡슐화되지 않은 유리 효소의 Km 값과 거의 동일한 Km 을 가지므로 효소와 기질간의 촉매반응에서 최고반응속도에 쉽게 도달할 수 있는 장점이 있다.

이를 통해, 통상의 실리카 캡슐화된 효소입자의 Km 값이 유리효소의 Km 값에 비하여 현저하게 상승하나, 본 발명의 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소입자는 유리효소의 Km 값에 대하여 바람직하게는 20% 이하의 오차범위 내의 Km 값을 가질 수 있으며, 보다 바람직하게는 10 이하, 더욱 바람직하게는 5% 이하, 가장 바람직하게는 3% 이하의 오차범위 내의 Km 값을 가질 수 있다. 여기서 유리효소는 캡슐화되지 않은 하나의 효소(단분자 효소)를 의미하는 것으로서, 예를 들어 리파아제의 유리효소의 Km(μM) 값이 30 이라면, 본 발명의 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소입자의 Km(μM) 값은 바람직하게는 30 ± 6의 범위의 값을 가질 수 있으며, 보다 바람직하게는 30 ± 0.9의 범위의 값을 가질 수 있는 것이다. 이와 같이 유리효소와 매우 유사한 Km 값을 가지는 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소입자는 표면의 실리카 네트워크에 의해 효소와 기질간의 촉매 반응에 아무런 방해를 받지 않아 적은 양의 기질에도 최고 반응속도에 빠르게 도달할 수 있다. 나아가 오랜 시간이 경과한 뒤에도 효소의 활성을 유지할 수 있게 된다.

한편 종래의 캡슐화된 효소는 단분자 효소가 아닌 여러개의 효소들을 한꺼번에 실리카 캡슐화하거나, 단분자 효소에 실리카 캡슐화를 수행하기 위하여 효소의 표면에 적절한 작용기 및/또는 고분자를 포함하여 효소와 실리카 캡슐간에 공유결합을 형성하여야 하나 본 발명의 캡슐화된 효소는 단분자 효소만을 대상으로 하면서도 실리카 캡슐과 효소간에 공유결합이 존재하지 않는다. 그 결과 공정이 단순화되면서 대량생산이 가능해진다.

나아가, 본 발명의 효소 표면의 실리카 네트워크는 다른 실리카 물질과 가교결합제를 사용하지 않고도 화학적 결합을 형성할 수 있는 이점을 가진다. 이는 약산성, 중성, 약염기성 pH에서 효소 표면 실리카의 OH기가 메조포러스 실리카와 같은 실리카 기반의 나노구조물질의 표면 OH기와 응축반응을 통해 화학적 결합을 이룰 수 있음을 의미한다. 이를 통해 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소입자를 나노구조물질에 고정화를 할 수 있고 그 안정성은 더욱 향상되며 응용분야 또한 다양해 질 수 있게 된다.

이하 본 발명을 실시예를 중심으로 보다 상세히 설명한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1> 실리카 캡슐화 효소나노입자의 제조

도 1과 같은 방법으로 알파-키모트립신(CT)을 이용하여 실리카 캡슐화 효소나노입자를 제조하였다. 구체적으로 실리카 캡슐화 효소나노입자의 합성은 수용액상의 효소를 유기용매상으로 가용화하는 것으로부터 시작하였다. CT는 1 % 아이소프로판올과 2 mM 염화칼슘을 포함하는 10mM 비스-트리스 프로페인 (pH 7.8) 버퍼에 농도를 1 mg/ml로 맞추어 용해시켰다. 이어서 같은 부피의 헥세인에 2 mM의 NaAOT를 첨가하고 효소가 있는 용액과 혼합하였다. 상온에서 15분간 교반시키고 원심분리하여 상분리를 시켰다. 여기서 효소가 가용화된 헥세인 층만 분리시키고 질소 가스를 이용하여 헥세인을 휘발시켜 1 mg/ml를 만들어 주었다.

다음, TMOS : hexane의 비율을 1:1로 섞어준 용액을 효소가 들어있는 헥세인 부피의 1 %만큼 첨가하여 주고 4℃에 17시간 동안 보관하였다.

그 뒤 1.5시간 동안 상온에 보관한 후 헥세인 부피의 두 배에 해당하는 양의 200 mM 인산나트륨 버퍼(pH 7.8)를 넣어주고 250 rpm으로 10분간 교반시켰다. 원심분리로 상을 분리가 일어난 후에 수용액층만 분리시켰다. 이후 불순물을 100 nm 여과장치로 걸러주었다.

다음, 수용액상으로 추출된 효소를 4℃에서 3일간 더 보관하였다. 3일이 경과 후에 초미세여과 장치를 통해 10mM 인산나트륨 버퍼로 바꾸어 주면서 동시에 미반응된 TMOS 및 NaAOT 분자를 제거하였다. 이것으로 실리카 캡슐화 효소나노입자의 합성이 완료되었고 사용시까지 4℃에 보관하였다.

<비교예 1> 역미셀 방법을 이용한 역미셀-실리카 캡슐화 효소나노입자 제조

100mM 농도의 계면활성제 NaAOT를 포함하는 헥세인과 효소를 포함한 소량의 10mM 비스-트리스 프로페인버퍼를 넣어 주는데, 이때 첨가해주는 수용액의 양은 NaAOT의 몰(Mole) 농도의 20배 몰 농도가 되어주도록 첨가해 준다. 이후 10분간 교반을 통해 효소를 헥세인으로 가용화한다. 헥세인으로 효소 가용화 이후의 실험 과정은 상술한 실시예 1의 실리카 캡슐화 나노효소입자 방식과 동일하다.

역미셀 방법은 실리카 캡슐화 효소나노입자와 비교하기 위해 사용된 방법은 효소 주변에 많은 물분자를 포함하기 때문에 실리카 전구체의 응축반응이 더 빠르게 진행되어 결과적으로 두꺼운 실리카 네트워크를 형성하게 되고 미카엘리스 상수을 초래할 수 있게 된다.

<실시예 2> 반응속도 상수 측정에 의한 실리카 네트워크 형성 확인 및 물질전달에 미치는 영향 확인

상기 실시예 1의 SEEN-CT, 비교예 1의 RM-SEEN-CT와 유리효소(Free CT)의 반응속도상수는 MUTMAC의 가수분해를 통해 측정되었다. 반응속도상수를 측정하여 표 1에 나타내었다. 이 값들은 최소제곱법에 근거한 비선형 회기법에 의해 구하였다.

[표 1]

표 1에 따르면, SEEN-CT의 Km값은 Free CT와 매우 유사하다. 반면 RM-SEEN-CT는 증가된 Km값을 가지는 결과를 얻었다. 효소 주위의 실리카 네트워크는 효소 활성부위와 기질의 미카엘리스 상수을 유발한다. 대게 졸-젤 캡슐화는 효소의 안정성을 향상시키지만 Km값의 증가를 유발한다. 하지만 Free CT(유리효소)와 유사한 SEEN-CT(실시예 1)의 Km값은 실리카 네트워크가 미카엘리스 상수을 일으키지 않음을 뜻한다. 반면 다수의 물분자를 포함하는 RM-SEEN-CT(비교예 1)는 응축반응이 더 많이 일어나 더 두꺼운 실리카 네트워크가 형성되어 약간의 미카엘리스 상수을 일으키게 되고 증가된 Km값을 보여주었다. 촉매효율을 의미하는 kcat/Km 값은 Free CT와 비교하여 SEEN-CT의 경우 21%가 감소하였고, RM-SEEN-CT의 경우 약 48%가 감소하였다. 한편, 작은 kcat 값은 개개의 효소마다 실리카 네트워크가 형성되어 효소의 유연성이 감소하였음을 의미한다.

<실시예 3> 실리카 캡슐화 효소나노입자 형성 확인을 위한 TEM 사진 및 Tapping mode AFM을 통한 입자 크기 확인

도 2의 TEM 사진 및 Tapping mode AFM을 통한 크기 확인은 실리카 캡슐화 효소나노입자의 형성을 확인해준다. 표 2를 통해 이를 정리하면 개별 입자들은 Tapping-mode AFM에 의해 Free CT의 경우 3.9nm, SEEN-CT의 경우 6.9nm, RM-SEEN-CT의 경우 9.0 nm의 평균 직경을 가지는 것으로 밝혀졌다. 이 결과로 미루어 보아 SEEN-CT의 경우 표면에 평균 1.5nm의 두께의 실리카 매트릭스를 가지는 것임을 알 수 있었고, 또한 이 결과는 실리카 매트릭스의 형성이 졸-젤 방법에 의한 것임에도 불구하고 응집이 생기지 않음을 알 수 있었다.

[표 2]

<실시예 4> 실리카 네트워크에 의한 효소의 안정성 향상 확인

SEEN-CT, RM-SEEN-CT, Free CT의 활성은 N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilide의 가수분해에 의해 측정되었다. 도 3은 SEEN-CT, RM-SEEN-CT, Free-CT의 안정성을 보여준다. SEEN-CT, RM-SEEN-CT, Free CT를 포함하는 용액은 상온에서 200 rpm의 교반 상태(도 3)에서 보관되었다. SEEN-CT(실시예 1)의 경우는 교반 조건에서 4일 지난 후에 90% 이상의 초기활성을 유지한 반면 RM-SEEN-CT(비교예 1)는 교반 조건에서 4일이 지난후 47%의 초기활성을 보여주었고, Free CT(유리효소)는 교반 조건에서 4일이 지난 후 7%의 초기활성을 보여주는데 그쳤다. 이 결과는 실리카 캡슐화는 전단응력에 의한 효소의 비활성화를 방지해 주는 역할을 하는 것을 의미한다. 다만, RM-SEEN-CT와 같이 실리카의 두께가 두꺼울 경우는 응집 현상에 의해 뭉침이 심해져 활성이 감소하게 된다.

<실시예 5> 실리카 캡슐화 효소나노입자의 메조포러스 실리카 내부 고정화

담체에 물리적, 화학적 결합을 이용한 효소의 고정화 방법은 효소의 안정성을 향상시키기 위하여 널리 사용되어왔다. 많은 담체 물질들이 효소 고정화에 사용되어왔고, 이 중에 다공성 물질은 넓은 표면적 때문에 많은 양의 효소를 담지 할 수 있는 이점이 있다.

도 4는 평균 공극의 크기가 25nm인 메조포러스 실리카 물질인 MSU-F인데 기존에 알려진 합성 방법을 이용하여 합성되었다. 여기에 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소입자를 실리카 응축반응을 통해 고정화 함으로써 안정성을 더 높이는 연구를 진행하였다. 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소입자의 응축반응을 통한 고정화는 MSU-F에 제한되지 않고 MCM-41, MCM-48, FSM-16, SBA-1, SBA-15, SBA-16, MCF, HMS, MSU-X, IBN-X, PMOs 등 실리카 기반의 메조포러스 물질이면 모두 가능하다. 메조포러스 물질은 내부에 실리카 잔기가 있고, 이 잔기들은 SEEN-CT의 실리카 네트워크와 화학적 결합을 이룰 수가 있다. 하지만 Free-CT의 경우에는 단순한 물리적 흡착에 의해서만 고정화가 가능하다.

도 5에서 MSU-F에 고정화는 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소입자와 MSU-F를 혼합하고 일정시간 교반시켜 주면 MSU-F 내부로 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소입자가 들어가게 된다. 이후 교반을 멈추고 낮은 온도에서 일정시간 보관을 하면 MSU-F 내부의 실리카 잔기와 SEEN-CT의 실리카 잔기가 응축반응을 통해 화학 결합을 이루게 된다. 이렇게 형성된 구조는 MSU-F의 외부 구조가 실리카 캡슐화된 나노효소입자를 보호해 주어 안정성을 향상시켜 준다. 안정성 측면에서 5일이 지난 후 교반 조건에서 SEEN-CT는 각각 92%의 초기활성을 나타내었다. 반면에 MSU-F에 흡착된 Free CT는 교반조건에서 5일이 경과한 후 20%의 초기활성을 나타내었다.

<실시예 6> 리파아제의 실리카 캡슐화

본 발명에서 실리카 캡슐화 합성 방식을 키모트립신(CT) 이외의 효소에도 적용 가능성을 살펴보고자, 효소를 리파아제(LP)로 변경하여 적용시켰다. 버퍼 pH는 6.5로 변경하였고 염의 종류는 50mM 염화나트륨으로 변경한 것 이외에는 상술된 CT에 사용된 방식과 동일하다. 도 6은 상온 교반 조건에서 SEEN-LP와 Free LP의 안정성을 보여준다. SEEN-LP와 Free LP는 5일이 경과한 후 각각 98%, 12%의 활성을 나타내었다. SEEN-CT의 경우에는 키모트립신의 자가분해에 의해 활성이 점차 감소하는 모습을 보인 반면에 리파아제의 경우는 자가분해가 없기 때문에 더 좋은 안정성을 보여주는 것으로 해석된다. 리파아제의 안정성을 연구함에 따라 실리카 캡슐화 효소나노입자는 여러가지 효소에 적용될 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 실리카 캡슐화를 통한 단분자 나노효소입자 제조방법 및 이를 통해 제조된 단분자 나노효소입자는 바이오 센서, 바이오 연료전지, 바이오정화, 오염방지코팅 및 효소면역분석법 (ELISA) 등에 사용되어 안정성을 향상시키고 종래의 단분자 효소나노입자보다 대량생산을 가능하게 한다.

Claims

(1) 수용액상의 효소를 유기용매상으로 가용화(solubilization) 시키는 단계;
(2) 유기용매상에서 실리카를 첨가하고, 상기 실리카를 효소표면의 물분자와 반응시켜 1차 응축시키는 단계;
(3) 유기용매상의 효소를 수용액상으로 역추출하는 단계; 및
(4) 수용액상에서 실리카를 2차 응축시키는 단계;를 포함하고,
상기 (1) 단계는 한계미셀농도 이하의 계면활성제를 첨가하여 수행하는 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소입자 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 수용액은 비스-트리스 프로페인 수용액, 인산나트륨 수용액, 트리스 수용액, 탄산수소나트륨 수용액으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이고, 유기용매는 소수성 유기용매인 것을 특징으로 하는 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소입자 제조방법.
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 (2) 단계의 실리카는 테트라메톡시실란, 트리메톡시실란, 디메톡시실란, 테트라에톡시실란, 트리에톡시실란, 디에톡시실란으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징을 하는 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소입자 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 (3) 단계는 역추출 용액을 첨가하여 수행되는 것을 특징으로 하는 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소입자 제조방법.
제6항에 있어서,
상기 역추출 용액은 비스-트리스 프로페인 수용액, 인산나트륨 수용액, 트리스 수용액, 탄산수소나트륨 수용액으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소입자 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 (3) 단계와 (4) 단계 사이에 교반 및 원심분리를 거쳐 수용액층을 분리수득하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소입자 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 (4) 단계는 1 ~ 40℃에서 반응을 수행하는 것을 특징으로 하는 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소입자 제조방법.
단분자 효소 및 단분자 효소를 감싸며 공극을 갖는 실리카 캡슐을 포함하며,
단분자 효소와 실리카 캡슐 사이에 공유결합을 포함하지 않고,
미카엘리스 상수(Km) 값이 유리효소대비 20% 이내의 오차범위를 갖는 것을 특징으로 하는 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소.
삭제
제10항에 있어서,
상기 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소는 미카엘리스 상수(Km) 값이 유리효소대비 10% 이내의 오차범위를 갖는 것을 특징으로 하는 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소.
제10항에 있어서,
상기 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소는 미카엘리스 상수(Km) 값이 유리효소대비 3% 이내의 오차범위를 갖는 것을 특징으로 하는 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소.
제10항에 있어서,
상기 실리카 캡슐의 두께는 0.5 ~ 2.5㎚인 것을 특징으로 하는 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소.
제10항에 있어서,
상기 공극의 크기는 0.1 ~ 2㎚인 것을 특징으로 하는 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소.