WO2012161502A2 - 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소입자 제조방법 및 이를 통해 제조된 단분자 나노효소입자 - Google Patents

실리카 캡슐화된 단분자 나노효소입자 제조방법 및 이를 통해 제조된 단분자 나노효소입자 Download PDF

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WO2012161502A2
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김정배
홍성길
이병수
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고려대학교 산학협력단
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    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y40/00—Manufacture or treatment of nanostructures

Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing monomolecular nanoenzyme particles through silica encapsulation, and to monomolecular nanoenzyme particles prepared by the same, and more particularly, to a simpler process than a conventional method for producing monomolecular enzyme nanoparticles.
  • the present invention provides a method for producing a large amount of silica encapsulated single molecule nanoenzyme particles and a single molecule nanoenzyme particles prepared through the same.
  • the murine sol-gel method is a method used to enhance stability in organic or aqueous solution by synthesizing solid particles containing enzymes.
  • the encapsulated silica is synthesized in two steps by the sol-gel method. The first is hydrolysis of silica monomer in aqueous solution and enzyme is added. Secondly, the hydrolyzed silica monomer causes condensation reaction and captures the appeal, and the silica network grows greatly. These two processes produce sol-gel matrices in which silica is expanded.
  • the sol-gel-gel matrix approach for enzymatic capture greatly increases the diffusion resistance of the substrate, which can only pass through very thin matrices.
  • Enzyme encapsulation is one of the high enzyme purification methods widely used for the entrapment of enzymes and the stabilization of activity. Most studies, however, have shown that the reaction between substrates and enzymes is on the order of micrometers or millimeters . Limited results were shown. Therefore, interest in encapsulation methods that can stabilize individual molecules of enzymes while enjoying the Mica Ellis constant has been greatly increased. A common method for this is to form reverse micelles, which are larger than 7 nm in size and difficult to control the number of encapsulated enzymes. Because of these features, the reverse micelle method not only captured one or more enzymes but also had a size of 7 nm or more.
  • SEN monomolecular enzyme nanoparticles
  • the present invention has been made to solve the above-described problem, the first problem to be solved of the present invention, encapsulated silica in the enzyme single molecule without the step of attaching the functional group on the surface of the enzyme and the polymerization step It is to provide a method for producing monomolecular nanoenzyme particles through silica encapsulation suitable for mass production by promoting the mass production and at the same time does not relatively affect the Michaelis constant (Km) compared to the free enzyme.
  • Km Michaelis constant
  • the second object of the present invention is to form an extremely thin silica network on the surface of the enzyme without attaching any functional groups or polymers to the surface of the enzyme, and the error range of the Michaelis constant (Km) It is to provide a very small silica encapsulated single molecule nano-enzyme particles.
  • solubilizing the enzyme in the aqueous phase to the organic solvent phase (2) adding silica in the organic solvent, and reacting the silica with water molecules on the surface of the enzyme to condense the primary; (3) back extracting the enzyme in the organic solvent phase into the aqueous phase; And (4) provides a method for producing silica encapsulated single molecule nanoenzyme particles comprising the step of secondary condensation of silica in an aqueous solution.
  • the aqueous solution is at least one selected from the group consisting of bis-tris propane aqueous solution sodium phosphate aqueous solution, tris aqueous solution, aqueous sodium hydrogen carbonate solution, the organic solvent is It may be a hydrophobic organic solvent.
  • step (1) may be performed by adding a solubilizer.
  • the additive solubilizer may be performed by adding a surfactant below the limit micelle concentration.
  • the silica of step (2) is .
  • step (3) may be performed by adding a back extraction solution.
  • the reverse extraction solution may be any one or more selected from the group consisting of bis- tris propane aqueous solution, sodium phosphate aqueous solution, tris aqueous solution, sodium bicarbonate aqueous solution. .
  • the method may further include separating and obtaining the aqueous solution layer through stirring and centrifugation between steps (3) and (4).
  • the step (4) may be performed at 1 ⁇ 4C C.
  • silica encapsulating a monomolecular enzyme and a monomolecular enzyme and having a pore, and not containing a covalent compound between the monomolecular enzyme and the silica capsule.
  • silica encapsulating a monomolecular enzyme and a monomolecular enzyme and having a pore, and not containing a covalent compound between the monomolecular enzyme and the silica capsule.
  • the silica encapsulated monomolecular enzyme has a Michaelis constant (Km) of less than 20%, more preferably less than 10%, more preferably less than the free enzyme. Within a range of 3% or less.
  • the thickness of the silica capsule is
  • the silica capsule may not include a vinyl polymer or the like on the surface of the enzyme.
  • the pore size is 0.1 to
  • the method for preparing monomolecular nanoenzyme particles through silica encapsulation of the present invention does not include the surface functionalization process and the polymerization process in the conventional monomolecular enzyme nanoparticle synthesis process.
  • the reaction conditions are mild and suitable for mass production.
  • the prepared silica encapsulated monomolecular nanoenzyme particles can form a very thin silica network on the surface of the enzyme without containing any functional groups and polymers for silica encapsulation.
  • silica has almost the same Km value as that of free enzyme without encapsulation. This has the advantage that it is easy to reach the maximum reaction speed.
  • the synthesis method using reverse micelles causes excessive silica expansion reactions over the entire surface of the enzyme due to excess water, resulting in thickening of the silica network and disappearing of pores that can act as pores. It becomes worse and the Km value increases significantly.
  • the silica network on the surface of the enzyme has the advantage of forming chemical bonds without the use of crosslinkers with other silica materials.
  • the -0H group of the enzyme surface silica can form chemical bonds by coaxial reaction at the surface of the -0H group of silica-based nanostructures such as mesoporous silica at weakly acidic, neutral and weakly basic pH.
  • the silica encapsulated single molecule nanoenzyme particles can be immobilized on the nanostructured material, and its stability is further improved, and the application fields can be diversified.
  • the silica encapsulated enzyme nanoparticles of the present invention are used in biosensors, biofuel cells, biopurification, Ant i fouling and quantitative analysis (ELISA) to improve stability and to improve the stability of conventional nanoparticle enzymatic nanoparticles. It is expected to show reality in industrial gender.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing silica encapsulation processes (SEENs) for monomolecular enzymes according to an embodiment of the present invention.
  • Example 2 is a TEM photograph of SEEN-CT (Example 1), and (b) shows RM-SEEN-CT (Comparative Example).
  • FIG. 3 is a graph showing the stability of SEEN-CT (Example 1), RM— SEEN-CT (Comparative Example 1), and Free CT (free enzyme) after a certain time has elapsed under a 200 rpm stirring condition.
  • . 4 is a TEM picture of the MSU-F.
  • 5 is a graph showing the stability over time of the Free CT and SEEN-CT immobilized on the MSU-F under 200 rpm stirring conditions.
  • FIG. 6 is a graph showing the stability of SEEN-LP over time under 200 rpm stirring conditions.
  • the conventional method for encapsulating silica on the surface of an enzyme is to encapsulate silica in a group of enzymes rather than a single enzyme, which means a material transfer resistance value .
  • Km Michaelis constant
  • the conventional method for preparing monomolecular nanoenzyme particles (SEN) has to undergo surface functionalization and high molecularization, so the process is too complicated and the conditions are sensitive so that mass production is almost impossible. There was an impossible problem.
  • silica encapsulated single-molecule nanoenzyme particles comprising a secondary condensation of silica in an aqueous solution to seek to solve the above problems.
  • the silica encapsulated monomolecular nanoenzyme particle production method of the present invention does not include the surface functionalization process and the polymerization process in the conventional monomolecular enzyme nanoparticle synthesis process, the reaction conditions are mild, suitable for mass production. The above process will be described with reference to FIG. 1.
  • step (1) the enzyme in aqueous solution is solubilized in an organic solvent phase.
  • silica encapsulation is advantageously performed on the organic solvent because the silica precursor is well dissolved and stable in the organic solvent.
  • an aqueous solution capable of maintaining a pH suitable for enzymes such as bis-tris propane aqueous solution, sodium phosphate aqueous solution, tris aqueous solution, aqueous sodium hydrogen carbonate solution, etc. may be used, and according to the type of enzyme It will be apparent to one skilled in the art to select the appropriate type and concentration of aqueous solution.
  • Organic solvents usable in the present invention can be used to solubilize the enzyme to perform the silica encapsulation process. Anything that can be done can be used without limitation, but preferably, hydrophobic organic solvents such as hexane, heptane octane and isooctane can be used alone or in combination.
  • the method of solubilizing the enzyme in the organic solvent phase in the aqueous solution may be used amphiphilic polyethylene glycol polymers and synthetic polymers based on polyethylene glycol (PEG 2 ), preferably the interface on the organic solvent
  • the solubilization process can be carried out by adding an active agent.
  • dioctyl-sulfur sulfosuccinate (A0T) which is an anionic surfactant, is used, but the type of the surfactant is not limited to A0T, and both cationic and nonionic surfactants may be used depending on the type of enzyme and its isoelectric point. All.
  • the concentration of the surfactant used is preferably used as a concentration below the critical micelle concentration so as not to form reverse micelles. Do. This results in the formation of ion pairs that adhere only a small number of surfactant molecules to the enzyme surface without forming reverse micelles. If the reverse micelles are formed, they contain a lot of water inside the reverse micelles, resulting in a thick silica network and a large Michaelis constant.
  • aqueous solution the enzyme is dissolved in a suitable buffer and its pH can be varied according to the isoelectric point of the enzyme.
  • any one or more salts selected from the group consisting of calcium chloride, sodium chloride, and magnesium chloride, methanol, ethanol, propane, butane, pentane, nucleic acidol, and heptane It may comprise small amounts of any one or more alcohols selected. Salt is basically added to the aqueous solution, alcohol can be appropriately used depending on the type of surfactant and organic solvent, hydrophilic alcohol can be added to the aqueous solution and hydrophobic alcohol can be added to the organic solvent.
  • silica is added on an organic solvent, and the silica is reacted with the water molecules on the surface of the enzyme to firstly expand.
  • the silica usable at this time is preferably May be used without limitation as long as it can be dissolved in an organic solvent, and preferably, may be a silica precursor or a silica powder.
  • methoxysilane series such as tetramethoxysilane, trimethoxysilane, and dimethoxysilane
  • ethoxysilane series such as tetraethoxysilane, triethoxysilane, and diepsicysilane, can be used.
  • the added silica may be added to 0.1 ⁇ 10wl3 ⁇ 4 with respect to the total organic solvent, but is not limited thereto.
  • the added silica precursor When stored, the added silica precursor reacts with a small amount of water molecules on the surface of the enzyme, causing a first condensation reaction in which the alkyl group at the end of the silica precursor is replaced with —0H group, forming a silica network on the surface of the enzyme.
  • step (3) the step of back-extracting the enzyme having the silica network formed on the surface of the organic solvent phase into the aqueous phase.
  • the enzyme since the content of water molecules is very small, silica network formation does not occur as much as to improve the stability of the enzyme. Therefore, the enzyme must be extracted into the aqueous phase and the secondary condensation reaction should be allowed to occur by the unreacted silica precursor extracted together in the aqueous phase.
  • the back extraction solution may be stirred for a predetermined time to perform the back extraction process of the enzyme onto the aqueous solution.
  • the reverse extraction solution is not limited as long as it can extract an enzyme having a silica network formed on the surface of the organic solvent in an aqueous phase, but preferably a biscutris propane aqueous solution, an aqueous sodium phosphate solution, a tris aqueous solution, Sodium bicarbonate aqueous solution or the like can be added alone or in combination to the organic solvent.
  • the enzyme and the unreacted silica precursor are extracted into the aqueous solution by the hydrophilic functional group of the silica network formed on the surface of the enzyme.
  • the organic solvent layer and the aqueous solution layer may be separated by centrifugation, and only the aqueous layer may be separated. The process of filtering out impurities may then be carried out.
  • the silica is secondaryly condensed in aqueous solution.
  • the enzyme extracted in the aqueous solution is stored at a low temperature (1-4 C C) for a predetermined time (1-5 days), so that the uncoated silica is subjected to secondary coarse reaction on the surface of the enzyme. After that, unreacted silica particles and surfactants are removed and finally monomolecular No enzyme particles can be prepared.
  • the method for preparing monomolecular nanoenzyme particles through silica encapsulation of the present invention does not include surface functionalization and polymerization in the conventional monomolecular enzyme nanoparticle synthesis, and the reaction conditions are relatively mild. It has the advantage that is suitable for mass production.
  • the silica encapsulated monomolecular enzyme prepared by the above-described method comprises a silica capsule having a pore and encapsulating the molecular enzyme and monomolecular enzyme, monomolecular enzyme It does not contain a covalent bond between and the silica capsule.
  • the monomolecular enzyme that can be used in the present invention can be used without limitation as long as it can be encapsulated silica, preferably trypsin, chymotrypsin, pepsin, lipase, glycosylase, horseradish peroxidase, Tyrosinase, carbonic anhydrase, formaldehyde dehydrogenase, formic acid dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, and cholester may be dehydrogenases.
  • silica preferably trypsin, chymotrypsin, pepsin, lipase, glycosylase, horseradish peroxidase, Tyrosinase, carbonic anhydrase, formaldehyde dehydrogenase, formic acid dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, and cholester may be dehydrogenases.
  • the monomolecular nanoenzyme particles through the silica encapsulation of the present invention prepared by the method described above is approximately 0.5 5nm thickness, preferably 0.5 ⁇ 2.5nm thickness, more preferably 0.5 on the surface of the enzyme Silicas with a thickness of 2.0 nm form a network.
  • the surface of the enzyme may not contain any functional groups and / or polymers, through which a single molecule enzyme can be encapsulated without forming a covalent bond between the enzyme and silica capsule.
  • the silica network will have a Si-0—Si structure due to the silica expansion reaction, and the end of the portion where no network is formed has a structure of Si-OH or Si-OR (R-alkyl group).
  • the part can act as a void. Through this, stability can be maintained even after a long time.
  • silica unlike conventional silica encapsulated enzyme particles, silica has a Km value almost equal to the Km value of the unencapsulated free enzyme. It has the advantage of easily reaching the maximum reaction speed from the reaction.
  • the Km value of the conventional silica encapsulated enzyme particles is significantly increased compared to the Km value of the free enzyme, but the silica encapsulated single molecule nanoenzyme particles of the present invention are preferred to the Km value of the free enzyme.
  • it may have a Km value within the error range of 20% or less, more preferably 10 or less, even more preferably 5% or less, most preferably May have a Km value within an error range of 33 ⁇ 4 or less.
  • free enzyme refers to an unencapsulated enzyme (monomeric enzyme), for example, if the ⁇ ( ⁇ ⁇ ) value of the free enzyme of lipase is 30, the silica encapsulated single molecule nanoenzyme particles of the present invention
  • the ⁇ ( ⁇ ) value may preferably have a value in the range of 30 ⁇ 6, more preferably in the range of 30 ⁇ 0.9.
  • Silica-encapsulated single-molecule nanoenzyme particles which have Km values very similar to free enzymes, do not interfere with the catalytic reaction between the enzyme and the substrate by the surface silica network, thus reaching the highest reaction rate even with a small amount of substrate. can do. Furthermore, the enzyme activity can be maintained even after a long time.
  • conventional encapsulated enzymes contain appropriate functional groups and / or polymers on the surface of the enzyme to encapsulate several non-molecular enzymes at once or to perform silica encapsulation on single molecule enzymes.
  • a covalent bond should be formed between the enzyme and the silica capsulfurization, the 3 ⁇ 4 sulfated enzyme of the present invention has only a single molecule enzyme, but no covalent bond exists between the silica capsulosic and the enzyme. As a result, the process is simplified and mass production is possible.
  • the silica network on the surface of the enzyme of the present invention has the advantage of being able to form chemical bonds without the use of crosslinking agents with other silica materials.
  • the silica encapsulated single molecule nanoenzyme particles can be immobilized on the nanostructure, and the stability thereof is further improved and the application fields can be diversified.
  • Silica encapsulation enzyme nanoparticles were prepared using alpha-chymotrypsin (CT) in the same manner as in FIG. 1. Specifically, the synthesis of silica encapsulating enzyme nanoparticles started from solubilizing enzyme in aqueous solution into an organic solvent. CT is 1% Dissolve at a concentration of 1 mg / ml in a 10 mM bis-tris propane (pH 7.8) buffer containing propanol and 2 ⁇ calcium chloride. 2 mM NaAOT was then added to the same volume of nuclein and mixed with a solution containing the enzyme. The mixture was stirred at room temperature for 15 minutes and centrifuged to separate phases. Here, only the nuclear soluble layer of enzyme was solubilized was separated and the nuclear hexane was volatilized using nitrogen gas to make 1 mg / ml.
  • CT alpha-chymotrypsin
  • nucleins and enzymes containing a surfactant NaAOT Small amounts of nucleins and enzymes containing a surfactant NaAOT at a concentration of 100 mM
  • the reverse mill method is used to compare the silica encapsulating enzyme nanoparticles, because it contains many water molecules around the enzyme, so that the condensation reaction of the silica precursor proceeds faster, resulting in a thick silica network. This can result in Michaelis constant.
  • the kcat / Km value which stands for catalytic efficiency, decreased by 21% for SEEN-CT and about 48% for RM-SEEN—CT compared to Free CT.
  • a small kcat value means that a silica network is formed for each enzyme, reducing the flexibility of the enzyme.
  • Example 3 TEM photographs to confirm the formation of silica encapsulated enzyme nanoparticles
  • the TEM image and Tapping mode AFM of FIG. 2 confirm the formation of silica encapsulated nanoparticles.
  • Table 2 shows that the individual particles have an average diameter of 3.9 nm for free CT, 6.9 nm for SEEN-CT, and 9.0 nm for RM-SEEN-CT by Tapping-mode AFM. These results indicate that SEEN-CT has a silica matrix with an average thickness of 1.5 nm on the surface, and this result indicates that the formation of the silica matrix does not occur despite the sol-gel method. It was found that. ⁇ Table 2>
  • Free CT free enzyme
  • Enzyme immobilization methods using physical and chemical bonds to carriers have been widely used to improve enzyme stability.
  • Many carrier materials have been used for enzyme immobilization, and porous materials have the advantage of supporting a large amount of enzyme due to the large surface area.
  • FIG. 4 was synthesized using a synthetic method known in MSU-F inte, which is a mesoporous silica material having an average pore size of 25 nm.
  • MSU-F inte is a mesoporous silica material having an average pore size of 25 nm.
  • a study was conducted to further enhance stability by immobilizing silica encapsulated single molecule nanoenzyme particles through silica condensation reaction.
  • Immobilization of silica encapsulated single molecule nanoenzyme particles through condensation reaction is not limited to MSU-F, but MCM-41, MCM-48, FSM-16, SBA-1, SBA-15, SBA-16, MCF, HMS, Any silica-based mesoporous material such as MSU-X, IBN-X, or PMOs can be used.
  • the mesoporous material has a silica residue therein, and these residues can form a chemical bond with the silica network of SEEN-CT. But in the case of Free-CT, simple physics Immobilization is possible only by adsorbed adsorption.
  • immobilization to MSU-F is performed by mixing the silica-encapsulated single molecule nanoenzyme particles with MSU-F and stirring for a predetermined time to enter the silica-encapsulated single molecule nanoenzyme particles into the MSU-F.
  • the silica residue in the MSU-F and the silica residue in SEEN-CT form a chemical bond through a coaxial reaction.
  • the structure thus formed protects the silica encapsulated nanoenzyme particles of the MSU-F external structure to improve stability.
  • SEEN-CT showed 92% of initial activity under stirring conditions.
  • Free CT adsorbed on MSU-F showed initial activity of 20% after 5 days under stirring condition.
  • a method for preparing monomolecular nanoenzyme particles through silica encapsulation of the present invention and the monomolecular nanoenzyme particles prepared therefrom are biosensors, biofuel cells, bio purification, antifouling coating and enzyme immunoassay (ELISA). Used to improve the stability and to enable mass production than conventional monomolecular enzyme nanoparticles. '

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Abstract

본 입자의 실리카 캡슐화를 통한 단분자 나노효소입자 제조방법은 종래의 단분자 효소 나노입자 합성과정에서 표면작용기화 과정과 고분자화 과정을 포함하지 않으며, 반응조건이 마일드하여 대량생산에 적합하다.

Description

【명세서】
【발명의명칭】
실리카 캡슐화된 단분자 나노효소입자 제조방법 및 이를 통해 제조된 단분자 나노효소입자
【기술분야】
본 발명은 실리카 캡술화를 통한 단분자 나노효소입자 제조방법 및 이를 통 해 제조된 단분자 나노효소입자에 관한 것으로， 보다 상세하게는 종래의 단분자 효 소 나노입자 제조 방법에 비하여 훨씬 단순한 공정에 의하여 실리카 캡슬화된 단분 자 나노효소입자를 대량으로 생산할 수 있는 제조방법 및 이를 통해 제조된 단분자 나노효소입자를 제공하는 것이다.
【배경기술】
전통적으로ᅤ 졸-젤 방법은 효소를포함하는 고체상태의 입자를 합성함으로써 유기 또는 수용액 상에서 안정성을 향상시키기 위하여 사용되는 방법이다. 대부분 의 응용에서 졸-젤 방법에 의해 효소가 포집된 실리카는 두 단계로 합성이 된다. 첫번째는 수용액상에서 실리카 모노머의 가수분해이고 효소가 첨가된다. 두번째로 가수분해된 실리카 모노머가 응축반응을 일으키며 호소를 포집하면서 실리카 네트 워크가 크게 성장을 하게 된다. 이 두 과정에 의해 실리카가 웅축된 졸-젤 매트릭 스가 만들어진다. 하지만 효소 포집을 위한 졸ᅳ젤 매트릭스 접근방식은 매우 얇은 매트릭스만을 통과할수 있는 기질의 확산저항을크게 유발한다.
효소캡술화는 효소의 포집 및 활성의 안정화를 위해 널리 사용되는 효소 고 정화 방법 중의 하나이다. 그러나 대부분의 연구들은 마이크로미터 흑은 밀리미터 수준의 크기로 기질과 효소 간의 반응을.제한하는 결과를 보여주었다. 따라서 미카 엘리스 상수을 즐이면서도 효소 개별 분자를 안정화 할 수 있는 캡슐화 방법에 대 한 관심이 크게 증대되고.있다. 그에 대한 일반적인 방법으로는 역미셀을 형성하는 것인데 이는 크기가 7nm 보다 클 뿐만 아니라 캡슐화되는 효소의 수를 조절하는 것 이 힘들다. 이러한 특징들 때문에 역미셀 방법은 하나 이상의 효소를 포집할 뿐만 아니라 7nm 이상의 크기를 가졌다. 최근 발표된 단분자 효소나노입자 (SEN) 복합체는 효소군집체를 전체적으로 캡술화하는 것이 아니라 개개의 효소 표면에 수십 나노미터 두께의 그물구조 네트 워크를 형성하였다. 구체적으로 SEN의 합성은 핵세인 (hexane) 용액에서 효소 분자 들을 가용화(30ᅵ1!1^112^1∞) 시키면서 시작된다. 이 가용화 기술은 역미셀 접근방 식보다 적은 양의 계면활성제를 사용하는 것으로 효소의 응집을 막으면서도 효소 개별 분자를 유기용매상으로 추출하는 것이다 . 게다가， 가용화된 효소의 표면은 최 소한의 물분자와 함께 유기용매에 노출되어 있다. 이러한 기술은 매우 얇은 두께의 네트워크를 가진 SEN의 성공에 매우 중요한 요소였다. 하지만， 이를 위하여 단분자 효소나노입자의 합성은 핵세인에서 효소 표면에 작용기를 부착하고， 비닐 그룹 등 을 이용한 고분자화 과정을 반드시 거쳐야 하는데， 이 고분자화 과정 등은 매우 복 잡할뿐만 아니라조건이 민감하여 대량생산이 아주 어려운 문제가 있었다.
【발명의 내용】
【기술적 과제】
<6> 본 발명은 상술한 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 첫번째 해결하려는 과제는, 효소 표면에 작용기를 부착하는 공정 및 고분자화 공정을 거치 지 않고서도， 효소 단분자에 실리카 캡슐화를 수행하여 대량생산을 도모하고 동시 에 유리효소와 대비하여 미카엘리스 상수 (Km)에 비교적 영향을 미치지 않는 대량생 산에 적합한 실리카 캡슐화를 통한 단분자 나노효소입자 제조방법올 제공하는 것이 다.
<7> 본 발명의 두번째 해결하려는 과제는 효소 표면에 어떠한 작용기 및 고분자 가 부착되지 않으면서 효소표면에 극히 얇은 실리카 네트워크가 형성되며， 유리효 소와 대비하여 미카엘리스 상수 (Km)의 오차범위가 매우 작은 실리카 캡슬화된 단분 자나노효소입자를 제공하는 것이다.
【기술적 해결방법】
<8> 상술한 본 발명의 과제를 해결하기 위하여， (1) 수용액상의 효소를 유기용매 상으로 가용화 (solubilization) 시키는 단계; (2) 유기용매상에서 실리카를 첨가하 고， 상기 실리카를 효소표면의 물분자와 반응시켜 1차 응축시키는 단계; (3) 유기 용매상의 효소를 수용액상으로 역추출하는 단계; 및 (4) 수용액상에서 실리카를 2 차 응축시키는 단계를 포함하는 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소입자 제조방법을 제공한다.
<9> 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 수용액은 비스—트리스 프로페 인 수용액 인산나트륨 수용액， 트리스 수용액， 탄산수소나트륨 수용액으로 구성되 는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이고, 유기용매는 소수성 유기용매일 수 있 다.
<ιο> 본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면， 상기 (1) 단계는 가용화제를 첨가하여 수행될 수 있다. <Π> 본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면， 상가 가용화제는 한계미샐 농도 이하의 계면활성제를 첨가하여 수행될 수 있다.
<12> 본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 (2) 단계의 실리카는.
테트라메톡시실란， 트리메특시실란， 디메특시실란, 테트라에특시실란， 트리에특시 실란， 디에록시실란으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특 징
<13> 본 발명의 바람직한또 다른 일실시예에 따르면， 상기 (3) 단계는 역추출 용 액을 첨가하여 수행될 수 있다.
<14> 본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면， 상기 역추출 용액은 비스- 트리스 프로페인 수용액， 인산나트륨 수용액, 트리스 수용액， 탄산수소나트륨 수용 액으로 구성되는군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
<15> 본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면， 상기 (3) 단계와 (4) 단계 사이에 교반 및 원심분리를 거쳐 수용액층을 분리수득하는 단계를 더 포함할 수 있 다.
<16> 본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 (4) 단계는 1 ~ 4C C 에서 반웅이 수행될 수 있다.
<17> 본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면， 단분자 효소 및 단분자 효 소를 감싸며 공극을 갖는 실리카 캡슐을 포함하며， 단분자 효소와 실리카 캡슐 사 이에 공유 합을 포함하지 않는 실리카 캡슐화된 단분자 효소를 제공한다.
<18> 본 발명의 바람직한또 다른 일실시예에 따르면， 상기 실리카 캡슐화된 단분 자 효소는 미카엘리스 상수 (Km) 값이 유리효소대비 20% 이내， 보다 바람직하게는 10% 이내， 더욱 바람직하게는 이내， 가장 바람직하게는 3% 이내의 오차범위를 가질 수 있다.
<19> 본 발명의 바람직한또 다른 일실시예에 따르면, 상기 실리카 캡슐의 두께는
0.5 ~ 2.5nm일 수 있다.
<20> 본 발명의 바람직한또 다른 일실시예에 따르면， 상기 실리카 캡슐은 효소의 표면에 비닐 고분자등을 포함하지 않을 수 있다.
<21> 본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면 상기 공극의 크기는 0.1 ~
2nm일 수 있다.
【유리한효과】
<22> 본 발명의 실리카 캡슐화를 통한 단분자 나노효소입자 제조방법은 종래의 단 분자 효소 나노입자 합성과정에서 표면작용기화 과정과 고분자화 과정을 포함하지 않으며， 반응조건이 마일드하여 대량생산에 적합하다. 이를 통해 제조된 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소입자는 효소의 표면에 실리카 캡술화를 위한 어떠 한 작용 기 및 폴리머를 포함하지 않으면서， 매우 얇은 실리카 네트워크를 형성할 수 있다 . 실리카 네트워크는 실리카 응축반웅으로 인해 Si-0-Si 구조를 이를 것 이며， 일부 네트워크가 형성 이 되지 않은 부분의 말단은 Si-OH 혹은 Si-O-R (R=alkyl group)의 구조를 가지고， 그 부분이 공극으로서의 작용을 할 수가 있다. 이를 통해 오랜 시 간이 경과한 뒤에도 안정성을 유지할 수 있으며 , 나아가， 종래의 실리카 캡슐화된 효소입자와는 달리 실리카가 캡슐화되지 않은 유리 효소의 Km 값과 거의 동일한 Km 을 가지므로 효소와 기질간의 촉매반응에서 최고반웅속도에 쉽 게 도달할 수 있는 장점이 있다 .
<23> 반면 , 역미셀을 통한 합성 방법은 과량으로 존재하는 물에 의해 실리카 웅축 반응이 효소 표면 전체에서 과도하게 일어나 , 실리카 네트워크의 두께가 두꺼워지 고 공극으로 작용할 수 있는 부분이 사라져 미카엘리스 상수이 심해지고 Km 값이 크게 상승하게 된다.
<24> 또한， 효소 표면의 실리카 네트워크는 다른 실리카 물질과 가교결합제를 사 용하지 않고도 화학적 결합을 형성 할 수 있는 이점을 가진다. 이는 약산성， 중성 , 약염기성 pH에서 효소 표면 실리카의 -0H기가 메조포러스 실리카와 같은 실리카 기 반의 나노구조물질의 표면 -0H기와 웅축반응을 통해 화학적 결합을 이를 수 있음을 의미한다 . 이를 통해 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소입자를 나노구조물질에 고정 화를 할 수 있고 그 안정성은 더욱 향상되며 응용분야 또한 다양해 질 수 있게 된 다.
<25> 따라서， 본 발명의 실리카 캡슐화 효소나노입자는 바이오 센서， 바이오 연료 전지， 바이오정화， Ant i foul ing 그리고 정량분석법 (ELISA) 등에 사용되어 안정성 을 향상시키고 종래의 단분자 효소나노입자보다 실제 산업적 웅용에 현실성을 보여 줄 것으로 판단된다.
【도면의 간단한 설명】
<26> 도 1은 본 발명의 바람직 한 일실시 예에 따른 단분자 효소에 대한 실리카 캡 슐화 공정 (SEENs)을 나타내는 모식도이다 .
<27> 도 2는 (a)는 SEEN-CT (실시 예 1)의 TEM 사진이며 (b)는 RM-SEEN-CT (비교예
1)의 TEM 사진이다.
<28> 도 3은 200 rpm 교반 조건 아래에서 일정 시간이 경과한 후의 SEEN-CT (실시 예 1)， RM— SEEN-CT (비교예 1)， Free CT (유리효소)의 안정성을 나타낸 그래프이다 . <29> 도 4는 MSU-F의 TEM 사진이다 .
<30> 도 5는 200 rpm 교반 조건 아래에서 MSU-F에 고정화한 Free CT와 SEEN— CT의 시간에 따른 안정성을 나타낸 그래프이다.
<3i> 도 6은 200 rpm 교반 조건 아래에서 SEEN-LP의 시간에 따른 안정성을 나타낸 그래프이다 .
【발명의 실시를 위 한 최선의 형 태】
<32> 이하， 본 발명을 보다 상세히 설명 한다.
<33> 상술한 바와 같이， 종래의 효소표면에 실리카를 캡슐화하는 방법은 단일효소 가 아닌 효소군집체에 실리카를 캡슐화하는 것이므로， 물질전달저항값을 의미하는. 미카엘리스 상수 (Km)가 현저하게 상승하는 문제가 발생하였다. 이를 극복하기 위하 여 제안된 , 종래의 단분자 나노효소입자 제조방법 (SEN)은 표면 작용기화 과정과 고 분자화 과정을 거 쳐야 하므로 공정이 지나치게 복잡할 뿐만 아니라 조건이 민감하 여 대량생산이 거의 불가능한 문제가 있었다.
<34>
<35> 이에 본 발명에서는 ( 1) 수용액상의 효소를 유기용매상으로 가용화
(solubi l izat ion) 시 키는 단계 ; (2) 유기용매상에서 실리카를 첨가하고， 상기 실리 카를 효소표면의 물분자와 반응시켜 1차 응축시키는 단계 ; (3) 유기용매상의 효소 를 수용액상으로 역추출하는 단계 ; 및 (4) 수용액상에서 실리카를 2차 응축시키는 단계를 포함하는 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소입자 제조방법을 제공하여 상술 한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해 본 발명의 실리카 캡슐화된 단분자 나노 효소입자 제조방법종래의 단분자 효소 나노입자 합성과정에서 표면작용기화 과정과 고분자화 과정을 포함하지 않으며， 반응조건이 마일드하여 대량생산에 적합하다. 상기 공정을 첨부된 도 1올 참조하여 설명한다 .
<36>
<37> 먼저 (1) 단계로서 수용액상의 효소를 유기용매상으로 가용화한다. 한편 , 실 리카 전구체는 유기용매에 잘 용해되고 안정하기 때문에 실리카 캡슐화는 유기용매 상에서 수행하는 것이 유리하다.
<38> 본 발명에 적용될 수 있는 수용액은 비스-트리스 프로페인 수용액， 인산나트 륨 수용액， 트리스 수용액， 탄산수소나트륨 수용액 등 효소에 적합한 pH를 유지할 수 있는 수용액을 이용할 수 있으며， 효소의 종류에 따라 적 절한 수용액의 종류 및 농도를 선택하는 것은 당업자에게 자명 한 것이다.
<39> 본 발명에 사용가능한 유기용매는 효소를 가용화하여 실리카 캡슐공정을 수 행할 수 있는 것이면 제한없이 사용될 수 있지만 바람직하게는 소수성 유기용매인 핵세인 (hexane), 헵테인 (heptane) 옥테인 (octane) 및 이소옥테인 (isooctane) 등을 단독 또는혼합하여 사용할수 있다.
<40>
<41> 한편, 수용액상에서 효소를 유기용매상으로 가용화하는 방법은 양친매성을 띄는 폴리에틸렌 글리콜 고분자 및 플리에틸렌 글리콜에 기반한 합성 고분자 (PEG2) 를 이용할 수 있지만， 바람직하게는 상기 유기용매상에 계면활성제를 첨가하여 가 용화 공정을 수행할 수 있다. 본 발명에서는 음이온 계면활성제인 디옥틸 소듬 설 포석시네이트 (A0T)를 사용하였지만 계면활성제의 종류는 A0T에 제한되지 않고 효소 의 종류와 그 등전점에 따라 양이온성, 비이온성 계면활성제가 모두 사용될 수 있 다.
<42> 또한, 본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면， 계면활성제를사용할 경우 사 용되는 계면활성제의 농도는 역미셀을 형성하지 않도록 한계미셀농도 (critical micelle concentration) 이하의 농도로서 사용하는 것이 바람직하다. 이를 통해 역미셀을 형성하지 않고 효소 표면에 소수의 계면활성제 분자만 달라붙는 이온쌍을 형성하게 한다. 만일 역미셀을 형성하게 되면 역미샐 내부에 물을 많이 함유하게 되어 실리카 네트워크가두꺼워지고 미카엘리스 상수값이 커지게 된다.
<43> 한편 유기용매상에 계면활성제 등의 가용화제를 첨가하고 교반둥을 통해 효 소가 유기용매상으로 가용화되면 원심분리 등을 통해 효소가 가용화된 유기용매층 만을 분리해낼 수 있다. 필요에 따라 농도를 조절하기 위해 질소가스로 유기용매를 휘발시키는 것도 가능하다.
<44> 한편 수용액상에서 효소는 적절한 버퍼에 용해되고 그 pH는 효소의 등전점 에 따라 다양하게 조절될 수 있다. 또한 가용화를 용이하게 하기 위하여 염화칼슘 염화칼륨， 염화나트륨, 염화마그네슘으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 염과 메탄올, 에탄올， 프로판을, 뷰탄을， 펜탄을, 핵산올， 헵탄을으로 구 성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 알콜을 소량 포함할 수 있다. 염은 기본적으로 수용액에 첨가하여 주며 , 알콜은 계면활성제와 유기용매의 종류에 따라 적절하게 사용될 수 있으며， 친수성 알콜은 수용액에 첨가하고 소수성 알콜은 유기 용매에 첨가하여 사용할수 있다.
<45>
<46> 다음. (2) 단계로서 유기용매상에서 실리카를 첨가하고， 상기 질리카를 효소 표면의 물분자와 반응시켜 1차 웅축시킨다. 이 때 사용가능한 실리카는 바람직하게 는 유기용매에 용해될 수 있으면 제한없이 사용할 수 있으며， 바람직하게는 실리카 전구체， 실리카 분말일 수 있다. 구체적으로 테트라메록시실란， 트리메톡시실란， 디메특시실란 등의 메특시실란 계열 및 테트라에특시실란 , 트리에특시실란， 디에특 시실란 등의 에록시실란 계열을 사용할 수 있다 .
<47> 효소의 표면에서 실리카 네트워크를 형성할 수 있는 것이면 제한없이 사용될 수 있다. 한편 , 첨가되는 실리카는 전체 유기용매에 대하여 0.1 ~ 10wl¾를 첨가할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
<48> 상기 유기용매상에 실리카를 첨가한 후 1 ~ 4C C의 낮은 온도에서 1 ~ 5일간
보관하면， 첨가된 실리카 전구체는 효소표면의 소량의 물 분자와 반웅하여 실리카 전구체의 말단에 포함된 알킬기가 — 0H 기로 치환되는 1차 응축반응을 일으키게 되 고 효소 표면에서 실리카 네트워크를 형성하게 된다.
<49>
<50> 다음 , (3) 단계로서 유기용매상의 표면에 실리카 네트워크가 형성된 효소를 수용액상으로 역추출하는 단계를 수행한다 . 유기용매상에서는 물분자의 함유량이 극미량이기 때문에 효소의 안정성을 향상시킬 만큼의 실리카 네트워크 형성이 일어 나지 않는다 . 따라서 수용액상으로 효소를 추출하고 이때 수용액상으로 함께 추출 된 미반응 실리카 전구체에 의해 2차 응축반응이 일어날 수 있도록 해주어야 한다 . 이를 위하여， 역추출 용액을 사용하여 일정시간 동안 교반을 하여 효소를 수용액 상으로 역추출 공정을 수행할 수 있다.
<51> 상기 역추출 용액은 유기용매상의 표면에 실리카 네트워크가 형성된 효소를 수용액상으로 추출할 수 있는 것이면 종류의 제한이 없지만 바람직하게는 비스ᅳ트 리스 프로페인 수용액， 인산나트륨 수용액， 트리스 수용액， 탄산수소나트륨 수용액 등을 단독 또는 흔합하여 유기용매상에 첨가할 수 있다 .
<52> 그 뒤 교반공정 둥을 거치게 되면은 효소 표면에 형성 된 실리카 네트워크의 친수성 작용기에 의해 효소 및 미반응된 실리카 전구체가 수용액상으로 추출된다. 원심분리로 유기용매층과 수용액 층을 분리시킨 후 수용액층만 분리시킬 수 있다 . 이후 불순물을 여과하는 공정을 수행할 수도 있다 .
<53>
<54> 다음， (4) 단계로서 수용액상에서 실리카를 2차 웅축시키 킨다. 바람직하게는 수용액상으로 추출된 효소를 낮은 온도 (1 ~ 4C C )에서 일정시간 ( 1 ~ 5일 ) 보관하여 미반웅된 실리카가 효소 표면에서 2차 웅축반웅이 수행된다 . 그 뒤 미반웅된 실리 카 입자 및 계면활성제 등을 제거하여 최종적으로 실리카 캡슐화를 통한 단분자 나 노효소입자를 제조할 수 있다.
<55>
<56> 결국， 본 발명 의 실리카 캡슐화를 통한 단분자 나노효소입자 제조방법은 종 래의 단분자 효소 나노입자 합성과정에서 표면작용기화 과정과 고분자화 과정을 포 함하지 않으며， 반응조건이 비교적 마일드하여 대량생산에 적합한 장점을 가진다 .
<57>
<58> 한편 , 본 발명의 바람직한 일실시 예에 따르면， 상술한 방법을 통해 제조된 실리카 캡슐화된 단분자 효소는분자 효소 및 단분자 효소를 감싸며 공극올 갖는 실 리카 캡슐을 포함하며， 단분자 효소와 실리카 캡슐 사이에 공유결합을 포함하지 않 는다.
<59> 먼저， 본 발명에 사용될 수 있는 단분자 효소는 실리카 캡슐화될 수 있는 것이면 제한없이 사용될 수 있으며， 바람직하게는 트립신 , 키모트립신 , 펩신 , 리파 아제 , 당산화효소 , 양고추냉이 과산화효소， 티 라시나아제， 탄산무수화효소， 포름알 데히드 탈수소효소， 포름산 탈수소효소， 알콜 탈수소효소， 콜레스테를 탈수소효소 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다 .
<60> 한편， 상술한 방법을 통해 제조된 본 발명의 실리카 캡술화를 통한 단분자 나노효소입자는 효소의 표면에 대략 0.5 5nm두께， 바람직하게는 0.5 ~ 2.5nm 두 께， 더욱 바람직하게는 0.5 ~ 2.0nm두께를 갖는 실리카가 네트워크를 형성하게 된 다. 이 때 상기 효소의 표면에는 어떠한 작용기 및 /또는 폴리머 등을 포함하지 않 을 수 있으며 , 이를 통해 효소와 실리카 캡술간에 공유결합이 형성되지 않으면서 단분자 효소를 캡슐화할 수 있다 .
<6i> 나아가， 실리카 네트워크는 실리카 웅축반응으로 인해 Si-0— Si 구조를 이를 것이며， 일부 네트워크가 형성 이 되지 않은 부분의 말단은 Si-OH 혹은 Si-O-R (R- 알킬기 )의 구조를 가지고 , 그 부분이 공극으로서의 작용을 할 수가 있다. 이를 통 해 오랜 시간이 경과한 뒤에도 안정성을 유지할 수 있으며， 나아가, 종래의 실리카 캡슐화된 효소입자와는 달리 실리카가 캡술화되지 않은 유리 효소의 Km 값과 거의 동일한 Km 올 가지므로 효소와 기질간의 촉매반웅에서 최고반웅속도에 쉽게 도달할 수 있는 장점이 있다 .
<62> 이를 통해， 통상의 실리카 캡슐화된 효소입자의 Km 값이 유리효소의 Km 값에 비하여 현저하게 상승하나， 본 발명의 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소입자는 유 리효소의 Km 값에 대하여 바람직하게는 20% 이하의 오차범위 내의 Km 값을 가질 수 있으며， 보다 바람직하게는 10 이하 , 더욱 바람직하게는 5% 이하， 가장 바람직하게 는 3¾ 이하의 오차범위 내의 Km 값을 가질 수 있다. 여기서 유리효소는 캡슐화되지 않은 하나의 효소 (단분자 효소)를 의미하는 것으로서， 예를 들어 리파아제의 유리 효소의 Κιη( μ Μ) 값이 30 이라면 , 본 발명의 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소입자 의 Κπι( μ Μ) 값은 바람직하게는 30 ± 6의 범위의 값을 가질 수 있으며， 보다 바람 직하게는 30 土 0.9의 범위의 값올 가질 수 있는 것 이다. 이와 같이 유리효소와 매 우 유사한 Km 값을 가지는 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소입자는 표면의 실리카 네트워크에 의해 효소와 기질간의 촉매 반웅에 아무런 방해를 받지 않아 적은 양의 기질에도 최고 반응속도에 빠르게 도달할 수 있다. 나아가 오랜 시간이 경과한 뒤 에도 효소의 활성을 유지할 수 있게 된다.
<63> 한편 종래의 캡술화된 효소는 단분자 효소가 아닌 여 러개의 효소들을 한꺼번 에 실리카 캡슐화하거나， 단분자 효소에 실리카 캡슐화를 수행하기 위하여 효소의 표면에 적절한 작용기 및 /또는 고분자를 포함하여 효소와 실리카 캡술간에 공유결 합을 형성하여야 하나 본 발명의 ¾술화된 효소는 단분자 효소만올 대상으로 하면 서도 실리카 캡술과 효소간에 공유결합이 존재하지 않는다 . 그 결과 공정 이 단순화 되면서 대량생산이 가능해진다 .
<64> 나아가， 본 발명의 효소 표면의 실리카 네트워크는 다른 실리카 물질과 가교 결합제를 사용하지 않고도 화학적 결합을 형성할 수 있는 이 점을 가진다. 이는 약 산성 , 중성， 약염기성 ρΗ에서 효소 표면 실리카의 0H기가 메조포러스 실리카와 같 은 실리카 기반의 나노구조물질의 표면 0H기와 웅축반응을 통해 화학적 결합을 이 를 수 있음을 의 미한다 . 이를 통해 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소입자를 나노구 조물질에 고정화를 할 수 있고 그 안정성은 더욱 향상되며 응용분야 또한 다양해 질 수 있게 된다 .
【발명의 실시를 위한 형 태】
<65> 이하 본 발명을 실시예를 중심으로 보다 상세히 설명한다. 이들 실시 예는 오 로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위 한 것으로서 , 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<66>
<67> <실시 예 1> 실리카 캡슐화 효소나노입자의 제조
<68> 도 1과 같은 방법으로 알파 -키모트립신 (CT)을 이용하여 실리카 캡슐화 효소 나노입자를 제조하였다 . 구체적으로 실리카 캡슐화 효소나노입자의 합성은 수용액 상의 효소를 유기용매상으로 가용화하는 것으로부터 시작하였다. CT는 1 % 아이소 프로판올과 2 ηιΜ 염화칼슘을 포함하는 10mM 비스-트리스 프로페인 (pH 7.8) 버퍼에 농도를 1 mg/ml로 맞추어 용해시켰다 . 이어서 같은 부피의 핵세인에 2 mM의 NaAOT 를 첨가하고 효소가 있는 용액과 흔합하였다. 상온에서 15분간 교반시 키고 원심분 리하여 상분리를 시켰다 . 여 기서 효소가 가용화된 핵세인 층만 분리시 키고 질소 가 스를 이용하여 핵세인을 휘발시켜 1 mg/ml를 만들어 주었다 .
<69> 다음, TM0S ： hexane의 비율을 1 : 1로 섞 어준 용액을 효소가 들어 있는 핵세인 부피의 1 ¾만큼 첨가하여 주고 4°C에 17시간 동안 보관하였다 .
<70> 그 뒤 1.5시간 동안 상온에 보관한 후 핵세인 부피의 두 배에 해당하는 양의
200 mM 인산나트륨 버피 (pH 7.8)를 넣어주고 250 rpm으로 10분간 교반시켰다. 원심 분리로 상을 분리가 일어난 후에 수용액층만 분리시켰다. 이후 불순물을 100 nm 여 과장치로 걸러주었다 .
<7i> 다음， 수용액상으로 추출된 효소를 4 °C에서 3일간 더 보관하였다. 3일이 경 과 후에 초미세여과 장치를 통해 10mM 인산나트륨 버퍼로 바꾸어 주면서 동시에 미 반웅된 TM0S 및 NaAOT 분자를 제거하였다. 이 것으로 실리카 캡슐화 효소나노입자의 합성이 완료되 었고 사용시까지 4°C에 보관하였다.
<72>
<73> <비교예 1> 역미 셀 방법을 이용한 역미 셀—실리카 캡술화 효소나노입자 제조
<74> lOOmM 농도의 계면활성제 NaAOT를 포함하는 핵세인과 효소를 포함한 소량의
10mM 비스—트리스 프로페인버퍼를 넣어 주는데， 이때 첨가해주는 수용액의 양은 NaAOT의 몰 (Mole) 농도의 20배 몰 농도가 되어주도록 첨가해 준다. 이후 10분간 교반을 통해 효소를 핵세인으로 가용화한다. 핵세인으로 효소 가용화 이후의 실험 과정은 상술한 실시 예 1의 실리카 캡슐화 나노효소입자 방식과 동일하다.
<75> 역미 샐 방법은 실리카 캡슐화 효소나노입자와 비교하기 위해 사용된 방법은 효소 주변에 많은 물분자를 포함하기 때문에 실리카 전구체의 응축반응이 더 빠르 게 진행되어 결과적으로 두꺼운 실리카 네트워크를 형성하게 되고 미카엘리스 상수 을 초래할 수 있게 된다.
<76>
<77> <실시 예 2> 반옹속도 상수 측정에 의한 실리카 네트워크 형성 확인 및 물질 전달에 미치는 영향 확인
<78> 상기 실시 예 1의 SEEN-CT, 비교예 1의 RM-SEEN-CT와 유리효소 (Free CT)의 반 응속도상수는 MUTMAC의 가수분해를 통해 측정되 었다. 반웅속도상수를 측정하여 표 1에 나타내었다ᅳ 이 값들은 최소제곱법에 근거한 비선형 회기 법에 의해 구하였다 . <79> [표 1]
Figure imgf000013_0001
<8i> 표 1에 따르면 , SEEN-CT의 Km값은 Free CT와 매우 유사하다. 반면 RM-SEEN-
CT는 증가된 Km값을 가지는 결과를 얻었다 . 효소 주위의 실리카 네트워크는 효소 활성부위와 기질의 미카엘리스 상수을 유발한다 . 대게 졸-젤 캡슐화는 호소의 안정 성을 향상시키지만 Km값의 증가를 유발한다 . 하지만 Free CT (유리효소)와 유사한 SEEN-CT (실시 예 1)의 Km값은 실리카 네트워크가 미카엘리스 상수을 일으키지 않음 을 뜻한다. 반면 다수의 물분자를 포함하는 RM-SEEN-CT (비교예 1)는 웅축반웅이 더 많이 일어나 더 두꺼운 실리카 네트워크가 형성되 어 약간의 미카엘리스 상수을 일 으키게 되고 증가된 Km값을 보여주었다. 촉매효율을 의미하는 kcat/Km 값은 Free CT와 비교하여 SEEN-CT의 경우 21%가 감소하였고， RM-SEEN—CT의 경우 약 48%가 감 소하였다 . 한편 , 작은 kcat 값은 개개의 효소마다 실리카 네트워크가 형성되어 효 소의 유연성이 감소하였음을 의미한다 .
<82>
<83> <실시 예 3> 실리카 캡술화 효소나노입자 형성 확인을 위한 TEM 사진 및
Tapping mode AFM을 통한 입자 크기 확인
<84> 도 2의 TEM 사진 및 Tapping mode AFM을 통한 크기 확인은 실리카 캡슐화 효 소나노입자의 형성을 확인해준다 . 표 2를 통해 이를 정리하면 개별 입자들은 Tapping-mode AFM에 의해 Free CT의 경우 3.9nm , SEEN-CT의 경우 6.9nm, RM-SEEN- CT의 경우 9.0 nm의 평균 직경을 가지는 것으로 밝혀졌다. 이 결과로 미루어 보아 SEEN-CT의 경우 표면에 평균 1.5nm의 두께의 실리카 매트릭스를 가지는 것 임을 알 수 있었고 , 또한 이 결과는 실리카 매트릭스의 형성 이 졸-젤 방법에 의한 것임에도 불구하고 응집 이 생기지 않음을 알 수 있었다. <85> [표 2]
Figure imgf000014_0001
<86>
<87>
<88> <실시예 4>실리카 네트워크에 의한효소의 안정성 향상확인
<89> SEEN-CT, RM-SEEN-CT, Free CT의 활성은 N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe p- nitroanilide의 가수분해에 의해 측정되었다. 도 3은 SEEN-CT, RM-SEEN-CT, Free- CT의 안정성을 보여준다. SEEN-CT, RM-SEEN-CT, Free CT를-포함하는 용액은 상은에 서 200 rpm의 교반 상태 (도 3)에서 보관되었다. SEEN-CT (실시예 1)의 경우는 교반 조건에서 4일 지난 후에 90% 이상의 초기활성을 유지한 반면 RM-SEEN-CT (비교예 1) 는 교반 조건에서 4일이 지난후 47¾의 초기활성을 보여주었고, Free CT (유리효소) 는 교반 조건에서 4일이 지난 후 7%의 초기활성을 보여주는데 그쳤다. 이 결과는 실리카 캡슐화는 전단웅력에 의한 효소의 비활성화를 방지해 주는 역할을 하는 것 을 의미한다. 다만， RM-SEEN-CT와 같이 실리카의 두께가 두꺼을 경우는 웅집 현상 에 의해 뭉침이 심해져 활성이 감소하게 된다.
<90>
<91> <실시예 5>실리카 캡슐화 효소나노입자의 메조포러스 실리카 내부 고정화
<92> 담체에 물리적， 화학적 결합을 이용한 효소의 고정화 방법은 효소의 안정성 을 향상시키기 위하여 널리 사용되어왔다. 많은 담체 물질들이 효소 고정화에 사용 되어왔고， 이 중에 다공성 물질은 넓은 표면적 때문에 많은 양의 효소를 담지 할 수 있는 이점이 있다.
<93> 도 4는 평균 공극의 크기가 25nm인 메조포러스 실리카물질인 MSU-F인테 기 존에 알려진 합성 방법을 이용하여 합성되었다. 여기에 실리카 캡슐화된 단분자 나 노효소입자를 실리카 응축반웅을 통해 고정화 함으로써 안정성을 더 높이는 연구를 진행하였다. 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소입자의 응축반응을 통한 고정화는 MSU-F에 제한되지 않고 MCM-41, MCM-48, FSM-16, SBA-1, SBA-15, SBA-16, MCF, HMS, MSU-X, IBN-X, PMOs 등 실리카 기반의 메조포러스 물질이면 모두 가능하다. 메조포러스 물질은 내부에 실리카 잔기가 있고， 이 잔기들은 SEEN-CT의 실리카 네 트워크와 화학적 결합을 이를 수가 있다. 하지만 Free-CT의 경우에는 단순한 물리 적 흡착에 의해서만 고정화가 가능하다.
<94> 도 5에서 MSU-F에 고정화는 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소입자와 MSU-F를 흔합하고 일정시간 교반시켜 주면 MSU-F 내부로 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소 입자가 들어가게 된다 . 이후 교반을 멈추고 낮은 온도에서 일정시간 보관을 하면 MSU-F 내부의 실리카 잔기와 SEEN-CT의 실리카 잔기가 웅축반응을 통해 화학 결합 을 이루게 된다. 이렇게 형성된 구조는 MSU-F의 외부 구조가 실리카 캡술화된 나노 효소입자를 보호해 주어 안정성을 향상시켜 준다. 안정성 측면에서 5일이 지난 후 교반 조건에서 SEEN-CT는 각각 92%의 초기활성을 나타내었다. 반면에 MSU-F에 흡착 된 Free CT는 교반조건에서 5일이 경과한 후 20%의 초기활성을 나타내었다 .
<95>
<96> <실시 예 6> 리파아제의 실리카 캡슐화
<97> 본 발명 에서 실리카 캡슬화 합성 방식을 키모트립신 (CT) 이외의 효소에도 적 용 가능성을 살펴보고자， 효소를 리파아제 (LP)로 변경하여 적용시켰다 . 버퍼 pH는 6.5로 변경하였고 염의 종류는 50mM 염화나트륨으로 변경한 것 이외에는 상술된 CT 에 사용된 방식과 동일하다 . 도 6은 상온 교반 조건에서 SEEN-LP와 Free LP의 안정 성을 보여준다. SEEN-LP와 Free LP는 5일이 경과한 후 각각 98¾， 12%의 활성을 나 타내었다 . SEEN-CT의 경우에는 키모트립신의 자가분해에 의해 활성 이 점차 감소하 는 모습을 보인 반면에 리파아제의 경우는 자가분해가 없기 때문에 더 좋은 안정성 을 보여주는 것으로 해석된다 . 리파아제의 안정성올 연구함에 따라 실리카 캡슐화 효소나노입자는 여 러가지 효소에 적용될 수 있음을 확인하였다.
<98>
【산업상 이용 가능성】
<99> 본 발명의 실리카 캡슬화를 통한 단분자 나노효소입자 제조방법 및 이를 통 해 제조된 단분자 나노효소입자는 바이오 센서， 바이오 연료전지， 바이오정화, 오 염방지코팅 및 효소면역분석법 (ELISA) 등에 사용되어 안정성을 향상시키고 종래의 단분자 효소나노입자보다 대량생산을 가능하게 한다. '

Claims

【청구의 범위】 【청구항 11
(1) 수용액상의 효소를 유기용매상으로 가용화 (solubi l izat ion) 시키는 단 계 ;
(2) 유기용매상에서 실리카를 첨가하고， 상기 실리카를 효소표면의 물분자와 반웅시켜 1차 응축시키는 단계 ;
(3) 유기용매상의 효소를 수용액상으로 역추출하는 단계 ; 및
(4) 수용액상에서 실리카를 2차 웅축시 키는 단계를 포함하는 실리카 캡슐화 된 단분자 나노효소입자 제조방법 .
【청구항 2】
제 1항에 있어서 ,
상기 수용액은 비스-트리스 프로페인 수용액， 인산나트륨 수용액， 트리스 수 용액， 탄산수소나트륨 수용액으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이 고 , 유기용매는 소수성 유기용매인 것을 특징으로 하는 실리카 캡슬화된 단분자 나 노효소입자 제조방법 .
【청구항 3】
제 1항에 있어서，
상기 (1) 단계는 가용화제를 첨가하여 수행되는 것을 특징 으로 하는 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소입자 제조방법 .
【청구항 4】
제 3항에 있어서，
상기 가용화제는 한계미 셀농도 이하의 계면활성제를 첨가하여 수행되는 것을 특징으로 하는 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소입자 제조방법 .
【청구항 5】
제 1항에 있어서 ,
상기 (2) 단계의 실리카는 테트라메록시실란, 트리메특시실란, 디메특시실 란， 테트라에록시실란 트리에록시실란， 디에록시실란으로 구성되는 군으로부터 선 택되는 어느 하나 이상인 것을 특징을 하는 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소입자 제조방법 .
【청구항 6)
제 1항에 있어서，
상기 (3) 단계는 역추출 용액을 첨가하여 수행되는 것을 특징으로 하는 실리 카 캡술화된 단분자 나노효소입자 제조방법 .
【청구항 7]
제 6항에 있어서，
상기 역추출 용액은 비스-트리스 프로페인 수용액， 인산나트륨 수용액， 트리 스 수용액 , 탄산수소나트륨 수용액으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소입자 제조방법 .
【청구항 8]
제 1항에 있어서，
상기 (3) 단계와 (4) 단계 사이에 교반 및 원심분리를 거쳐 수용액층을 분리 수득하는 단계를 더 포함하는 것올 특징으로 하는 실리카 캡슐화된 단분자 나노효 소입자 제조방법 .
【청구항 9】
제 1항에 있어서，
상기 (4) 단계는 1 ~ 40°C에서 반응을 수행하는 것을 특징으로 하는 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소입자 제조방법 .
【청구항 10]
단분자 효소 및 단분자 효소를 감싸며 공극을 갖는 실리카 캡술을 포함하며 , 단분자 효소와 실리카 캡슐 사이에 공유결합을 포함하지 않는 실리카 캡술화된 단 분자 나노효소 .
【청구항 11】
제 10항에 있어세 상기 실리카 캡슬화된 단분자 나노효소는 미카엘리스 상수 (Km) 값이 유리효소대비 20% 이내의 오차범위를 갖는 것을 특징으로 하는 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소 .
【청구항 12]
제 10항에 있어서 ,
상기 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소는 미카엘리스 상수 (Km) 값이 유리효 소대비 10% 이내의 오차범위를 갖는 것을 특징으로 하는 실리카 캡슐화된 단분자 나노효소 .
【청구항 13】
제 10항에 있어서 ᅳ
상기 실리카 캡술화된 단분자 나노효소는 미카앨리스 상수 (Km) 값이 유리효 소대비 3% 이내의 오차범위를 갖는 것을 특징으로 하는 실리카 캡슐화된 단분자 나 노효소 .
【청구항 14】
제 10항에 있어서，
상기 실리카 캡슐의 두께는 0.5 ~ 2.5ιιιη인 것을 특징으로 하는 실리카 캡슐 화된 단분자 나노호소 .
【청구항 15】
제 10항에 있어서，
상기 공극의 크기는 0.1 ~ 2nm인 것을 특징으로 하는 실리카 캡슐화된 단분 자 나노효소 .
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