JP2012016351A - 蛋白質固定化用担体、固定化蛋白質及びそれらの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】内部に粒子間空隙構造を有する多孔質シリカ粒子からなり、該多孔質シリカ粒子が、特定の平均粒子径、比表面積、細孔容積、細孔径分布および空隙率を有し且つ表面に有機基又はアミノ基を含む置換基を有するものである、蛋白質固定化用担体、並びに、該蛋白質固定化用担体に固定化してなる固定化蛋白質。
【選択図】なし
Description
本発明に係る酵素固定化用担体は、前記問題点を解決するために開発されたものである。具体的には次の課題を解決したものである。
(3)酵素固定化用担体に固定化された酵素の基質に対する反応活性が、固定化前の反応活性に較べて、同等又はそれ以上となることを目的として、担体への酵素の固定化により、反応活性が低下する主原因となる酵素の立体構造の変化を抑制し、また、固定化酵素の反応活性向上に必要とされる微小な酵素反応空間を確保できるような酵素固定化用担体を設計することを課題とする。
[1] 内部に粒子間空隙構造を有する多孔質シリカ粒子からなり、
該多孔質シリカ粒子が、下記(1)〜(6)を満たし且つ表面にシラノール基、陰イオン交換基又は陽イオン交換基を有するものである
ことを特徴とする蛋白質固定化用担体:
(1) 平均粒子径(Da)が0.5〜100μmの範囲;
(2) 比表面積が10〜250m2/gの範囲;
(3) 細孔容積(Pv)が0.10〜0.32ml/gの範囲;
(4) 細孔径分布(X軸:細孔径[Ps]、Y軸:細孔容積を細孔径で微分した値)におけるピーク値の細孔径(Pms)が2〜200nmの範囲;
(5)(Pms)×0.75〜(Pms)×1.25nmの範囲内の細孔径を有する細孔の合計細孔容積が、全細孔容積の70%以上;
(6) 空隙率が5〜50%の範囲。
平均粒子径(Db)10〜500nm、真球度0.9〜1の範囲、粒子径変動係数(CV値)が2〜10%の範囲にある球状シリカ微粒子であって、粒子径分布が単分散相を示す球状シリカ微粒子が集合した球状集合体からなる前記[1]に記載の蛋白質固定化用担体。
該多孔質シリカ粒子が、下記(1)〜(6)を満たし且つ表面にシラノール基、陰イオン交換基又は陽イオン交換基を有するものである
ことを特徴とする蛋白質固定化用担体:
(1) 平均粒子径(Da)が0.5〜50μmの範囲;
(2) 比表面積が10〜250m2/gの範囲;
(3) 細孔容積(Pv)が0.10〜0.32ml/gの範囲;
(4) 細孔径分布(X軸:細孔径[Ps]、Y軸:細孔容積を細孔径で微分した値)におけるピーク値の細孔径(Pms)が2〜50nmの範囲;
(5)(Pms)×0.75〜(Pms)×1.25nmの範囲内の細孔径を有する細孔の合計細孔容積が、全細孔容積の80%以上;
(6) 空隙率が5〜50%の範囲。
平均粒子径(Db)10〜50nm、真球度0.9〜1の範囲、粒子径変動係数(CV値)が2〜10%の範囲にある球状シリカ微粒子であって、粒子径分布が単分散相を示す球状シリカ微粒子が集合した球状集合体からなることを特徴とする前記[3]に記載の蛋白質固定化用担体。
[6] 前記陽イオン交換基が、カルボキシル基、リン酸基及びスルホキシル基から選ばれる何れかの基を構造中に含む置換基であることを特徴とする前記[1]〜[4]の何れかに記載の蛋白質固定化用担体。
[8] 前記多孔質シリカ粒子が、アミノ基含有シランカップリング剤で処理された多孔質シリカ粒子を、さらに有機酸で表面処理したものであることを特徴とする前記[1]〜[7]の何れかに記載の蛋白質固定化用担体。
[10] 複合酵素の固定化に用いられる前記[1]〜[8]の何れかに記載の蛋白質固定化用担体。
[12] 前記蛋白質が酵素である、前記[11]に記載の固定化蛋白質。
[14] 前記酵素がデオキシリボアルドラーゼである前記[12]に記載の固定化蛋白質。
[16] 前記蛋白質が酵素である、前記[15]に記載の固定化蛋白質の製造方法。
(2)酵素の固定化方法が容易なものである。
(3)フリーの酵素と同等以上の反応活性を維持した状態で酵素を固定化することが可能である。
(5)固定化酵素の工業的な大量生産が可能である。
(7)固定化後の活性が高いため、固定化による酵素の損失を抑制できる。
(a)固定化酵素として用いたときに、フリーの酵素と同等又は同等以上の反応活性を示すことができる。
(c)工業的な大量生産が可能である。
(d)固定化酵素として用いたときに、活性が高いため、固定化による酵素のロスを抑制できる。
(f)特にラセマーゼ、グルコアミラーゼ、アミラーゼ又はラッカーゼから選ばれる酵素が固定化されてなる固定化蛋白質は、耐熱性に優れる。
本発明に係る蛋白質固定化用担体は、内部に粒子間空隙構造を有する特定の多孔質シリカ粒子からなるものである。ここで、本発明で用いられる多孔質シリカ粒子は、下記(1)〜(6)を満たし、且つ表面にシラノール基、陰イオン交換基又は陽イオン交換基を有するものである:
(1) 平均粒子径(Da)が0.5〜100μmの範囲;
(2) 比表面積が10〜250m2/gの範囲;
(3) 細孔容積(Pv)が0.10〜0.32ml/gの範囲;
(4) 細孔径分布(X軸:細孔径[Ps]、Y軸:細孔容積を細孔径で微分した値)におけるピーク値の細孔径(Pms)が2〜200nmの範囲;
(5) (Pms)×0.75〜(Pms)×1.25nmの範囲内の細孔径を有する細孔の合計細孔容積が、全細孔容積の70%以上;
(6) 空隙率が5〜50%の範囲。
本発明における多孔質シリカ粒子は、内部に粒子間空隙構造を有する多孔質シリカ粒子であって、
1)該多孔質シリカ粒子の平均粒子径(Da)が0.5〜100μmの範囲;
2)比表面積が10〜250m2/gの範囲;
3)細孔容積が0.10〜0.32ml/gの範囲;
4)細孔径分布(X軸:細孔径[Ps]、Y軸:細孔容積を細孔径で微分した値)におけるピーク値の細孔径(Pms)が2〜200nmの範囲;
5)(Pms)×0.75〜(Pms)×1.25nmの範囲内の細孔径を有する細孔の合計細孔容積が、全細孔容積の70%以上;
6)空隙率が5〜50%の範囲
の要件を満たし、且つ
表面にシラノール基、陰イオン交換基又は陽イオン交換基を有する
多孔質シリカ粒子である。
本発明に係る多孔質シリカ粒子は、前記の通り球状シリカ微粒子の球状集合体から構成される。ここで球状シリカ微粒子の平均粒子径(Db)としては、10〜500nmの範囲が好適である。平均粒子径が10nm未満の場合は、粒子径が小さすぎて無機シリカ微粒子の間隙による細孔容積が低下し、担持用粒子としては、実用性が低下する。平均粒子径が50nmを超える場合、特に平均粒子径が500nmを越えると、細孔容積は大きくなるものの、微粒子同士の結合力が弱く、球状シリカ微粒子の集合体が得られ難い。球状シリカ微粒子の更に好ましい平均粒子径は10〜300nmの範囲である。また、より好ましくは平均粒子径10〜50nmの範囲、特に好ましくは平均粒子径10〜48nmの範囲が推奨される。
また、後記の「球状シリカ微粒子(a)」および「球状シリカ微粒子(b)」の場合も同様である。画像解析法による平均粒子径測定方法については、実施例の[各種物性の測定方法]中「5.粒度分布の測定」にて記載した平均粒子径の測定方法により測定した。
本発明で用いられる多孔質シリカ粒子は、その表面の官能基として、シラノール基、陰イオン交換基又は陽イオン交換基を有している。
本発明で用いられる多孔質シリカ粒子は、上記「官能基」の導入とは別に、前記球状シリカ微粒子が集合してなる球状集合体が、所望により、さらに表面処理されていても構わない。表面処理については、前記細孔容積範囲、細孔径範囲を維持できる範囲で行われる必要がある。この様な表面処理により、粒子の強度を向上させることができる。担体として使用する場合には、担持する物質との親和性を高め、担持力を高める効果がある。
〔但し、RおよびR′は、炭素数1〜18のアルキル基、炭素数1〜18のアリール基、ビニル基またはアクリル基から選ばれる炭化水素基であり、nは0、1、2または3の整数である。〕
本発明で用いられる多孔質シリカ粒子の製造方法は、本発明の目的が達せられ、かつ所期の作用・効果を得ることができる限り特に制限されるわけではない。しかし、本発明で用いられる多孔質シリカ粒子は、球状多孔質粒子として製造されることが好ましく、これにあたり、通常、以下に述べる方法により製造される。
このような多孔質シリカ粒子の製造方法は、球状多孔質粒子の製造方法として、以下に述べる(A)、(B)および(C)の各工程を含むことを特徴とする。
平均粒子径10〜500nm、好ましくは平均粒子径10〜50nmの球状シリカ微粒子の分散液を調製し、遠心分離処理を行って、粗大粒子を分離し、粒子径変動係数(CV値)を2〜10%の範囲に調整することにより、粒子径分布が単分散相を示す球状シリカ微粒子分散液を調製する。
球状シリカ微粒子分散液を含む噴霧液を気流中に噴霧して球状シリカ微粒子集合体を調製する。該球状シリカ微粒子分散液の溶媒については、水または有機溶媒が使用される。有機溶媒としては、エタノール、プロパノール、ブタノールなどの1価アルコール、エチレングリコール等の多価アルコール等を用いることができる。
噴霧速度については、噴霧装置の形状またはスケールにも依存するが、例えば、0.1L/時間〜3L/時間の範囲で行われる。
(B)工程で得られた球状シリカ微粒子集合体を、球状シリカ微粒子同士またはゲル成分との結合力を高めるために、150〜600℃の温度範囲で加熱処理する。加熱処理温度が150℃未満では結合力の向上効果が認められない場合がある。一方、600℃を越えると球状シリカ微粒子集合体が収縮するおそれがあり、最終的に得られる球状多孔質粒子の空隙が小さくなる場合があり、好ましくない。
前記(A)、(B)および(C)工程に続いて、所望により以下の(D)、(E)および(F)工程による処理を行っても構わない。
(C)工程で得られた球状シリカ微粒子集合体を、室温〜40℃まで放冷または冷却し、水および/または有機溶媒に分散させてその分散液を調製する。有機溶媒としては、エタノール、プロパノール、ブタノールなどの1価アルコール、エチレングリコール等の多価アルコール等を用いることができる。分散液の濃度は、球状シリカ微粒子集合体を酸化物に換算した濃度で0.1〜40重量%、特に0.5〜20重量%の範囲にあることが好ましい。他方、濃度が40重量%を越えると(D)工程において集合体同士が凝集し易くなるので好ましくない。
(D)工程で得られた集合体分散液に、次のi)またはii)を添加して球状シリカ微粒子集合体の外表面の表面処理を行う。
ii) 酸またはアルカリと次の一般式で表される有機ケイ素化合物および/またはその部分加水分解物
一般式: RnSi(OR′)4-n
〔但し、RおよびR′は、炭素数1〜18のアルキル基、炭素数1〜18のアリール基、ビニル基またはアクリル基から選ばれる、イオン交換性基を含まない基で置換されていても良い炭化水素基であり、nは0、1、2または3の整数である。〕
さらに(E)工程で得られた球状シリカ微粒子集合体の分散液から、球状シリカ微粒子集合体分離し、乾燥した後、大気圧下または減圧下、100〜300℃で加熱処理して、多孔質シリカ粒子を得る。
シラノール基を表面に有する多孔質シリカ粒子からなる蛋白質固定化用担体は、上記1-2.で上述した方法により製造された多孔質シリカ粒子をそのまま使用することができる。このうち特に前記(A)、(B)及び(C)工程から得られた多孔質シリカ粒子が好ましい。このような多孔質シリカ粒子は、本来的にその表面にシラノール基を有するものである。言い換えれば、このような多孔質シリカ粒子は、本発明の蛋白質固定化用担体として、酵素などの蛋白質の固定化に用いることができる。
2-1.固定化蛋白質
本発明において、上記蛋白質固定化用担体は、蛋白質を固定化させて固定化蛋白質の形で用いられる。すなわち、本発明に係る固定化蛋白質は、上述した蛋白質固定化用担体に、蛋白質を固定化してなるものである。
本発明に係る固定化蛋白質に用いられる蛋白質は、特にその種類に限りがあるわけでない。ただ、触媒反応での使用など工業的な用途への適用という観点からは、好適な蛋白質として酵素が挙げられる。
また、本発明に係る蛋白質固定化用担体において固定化されている蛋白質は、上記酵素のほかに、抗体など他の種類の蛋白質であっても良い。また、複数のポリペプチド鎖から構成される複合酵素であっても良い。このような複合酵素の例としては、プロテアソーム、セルロソームなどを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
また、本発明に係る蛋白質固定化用担体又は酵素固定化用担体の表面が疎水性の有機基を有する場合は、疎水性の高い蛋白質又は酵素の固定化に好適である。
本発明に係る固定化蛋白質の製造方法としては、本発明の目的が達せられる限り、特に制限があるわけではないが、通常は、上記蛋白質固定化用担体に所要の蛋白質を固定化させることにより製造することができる。
ここで、本発明の固定化蛋白質においては、おそらく蛋白質固定化用担体表面のシラノール基と蛋白質との間に水素結合が介在するため固定化が行われていると考えられるが、陰イオン交換基または陽イオン交換基を表面に有する多孔質シリカ粒子からなる場合には、蛋白質の固定化にあたり静電的相互作用をも利用することができるので、有利である。
本発明の固定化蛋白質は、主として固定化酵素として使用されるものである。ここで、本発明の固定化蛋白質を固定化酵素として用いたときの利点としては、基質に対する、固定化された酵素の反応活性が、対応するフリーの酵素、すなわち、対応する担持されていない遊離型の酵素と同等であり、また、繰り返し使用による活性の低下が、対応するフリーの酵素と比べて少ないことが挙げられる。
例えば、上記記載のオキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼを固定化した固定化酵素として、工業的用途を含む各種用途に用いうる。例えば、ラセマーゼなどのイソメラーゼを固定化した固定化酵素として、アミノ酸などの異性化反応に用いることができるし、デオキシリボアルドラーゼなどのアルデヒドリアーゼを固定化した固定化酵素として、アルドール反応等に用いることができる。
1.平均粒径の測定方法
(A) 画像解析法による平均粒子径測定
球状シリカ微粒子の平均粒子径については、「5.粒度分布の測定」の項で後述するように、走査型電子顕微鏡及び画像解析装置を用いて測定した。
多孔質シリカ粒子の平均粒子径については、まず、多孔質シリカ粒子の分散液(水または40質量%グリセリン溶媒、固形分濃度0.1〜5質量%)を超音波発生機(iuch社製、US-2型)に5分間分散する。更に、水またはグリセリンを加えて適度に濃度を調節した分散液より、ガラスセル(長さ10mm、幅10mm、高さ45cmのサイズ)に当該分散液を取り、遠心沈降式粒度分布測定装置(堀場製作所製:CAPA−700)を用いて平均粒子径を測定した。
多孔質シリカ粒子の比重については、以下の要領で測定を行った。
まず、試料10gをルツボに採取し、110℃で2時間乾燥させた。次いで、この乾燥試料を、デシケーターにて冷却後、25mlピクノメーターに3〜4g入れ、蒸留水を加えて懸濁し、60mmHgにて1時間真空脱気を行った後に、25℃恒温槽にて温度調整した。ピクノメーターの標線まで蒸留水を加えて容量を調整し、ピクノメーターの容量(25ml)と蒸留水の容量(ml)の差から試料の容量(ml)を算出した。加えた試料の重量(g)とこのように算出された容量(ml)とから、比重を求めた。
多孔質シリカ粒子の空隙率については、前記2.で求めた比重と、シリカの比重(すなわち、内部にある空隙を考慮しない見かけ上のシリカの比重)とを用いて、以下の式から算出した。
100−[前記2.で求めた多孔質シリカ粒子の比重]/[シリカの比重]×100=空隙率(%)
透過型電子顕微鏡(株式会社日立製作所製、H−800)により、試料酸化物ゾルを倍率25万倍で写真撮影して得られる写真投影図における、任意の50個の粒子について、それぞれその最大径(DL)と、これと直交する短径(DS)との比(DS/DL)を測定し、それらの平均値を真球度とした。
走査型電子顕微鏡(日本電子株式会社製、JSM−5300型)を用いて粒子を撮影(倍率250,000倍)し、この画像の250個の粒子について、画像解析装置(旭化成株式会社製、IP−1000)を用いて、平均粒子径を測定し、粒子径分布に関する変動係数(CV値)を算定した。具体的には、粒子250個について、それぞれの粒子径を測定し、その値から平均粒子径および粒子径の標準偏差を求め、下記式から算定した。
変動係数(CV値)=(粒子径標準偏差(σ)/平均粒子径(Dn))×100(%)
多孔質シリカ粒子の細孔容積及び細孔径を測定する方法として、ガス吸着法と水銀圧入法を用いた。ここで、下記の各実施例、参考例および比較例において、特に別の記載がない限りガス吸着法を用いて測定を行った。
多孔質シリカ粒子の細孔容積については、試料10gをルツボに取り、300℃で1時間乾燥後、デシケーターに入れて室温まで冷却した。ガラスセルに0.15g採取し、Belsorp mini II(日本ベル株式会社製)を使用して真空脱気しながら試料に窒素ガスを吸着後、脱着させ、得られた吸着等温線から、相対圧0.990の点での細孔容積を求め、またBJH法により、細孔径(ピーク値)を算出した。
本発明の実施例では、酵素固定化用担体の原料である多孔質シリカ粒子(以下、「原料多孔質シリカ粒子」)P1,P2,P3およびP4として、それぞれ日揮触媒化成株式会社製 SILICA MICRO BEAD P−7H,P−12H,P−4H,P−20Hを使用した。
これらの原料多孔質シリカ粒子は、以下の手順により製造されたものである。
各原料多孔質シリカ粒子(P1〜P4及びG1)の特徴を表1に記す。
〔酵素固定化用担体(アミノ基修飾型)の調製〕
1.酵素固定化用担体P-3Nの調製
粉体状の多孔質シリカ粒子P3の40gを空気中にて、エタノール155gに分散させ5分間攪拌後、純水13gを加えてさらに30分攪拌した。
酵素固定化用担体P-1N、P-2N、P-4N及びG-1Nの調製は、上記多孔質シリカ粒子P3に代えて、多孔質シリカ粒子P1、P2、P4及びG1を原料としてそれぞれ用いたことを除き、上記酵素固定化用担体P-3Nの調製の場合と同様の方法によって行った。
調製した各酵素固定化用担体(P-1N,P-2N,P-3N,P-4N及びG-1N)の特徴を表1に記す。
〔酵素固定化用担体(カルボキシル基修飾型)の調製〕
1.酵素固定化用担体P-3Cの調製
粉体状の多孔質シリカ粒子P-3Nの40gを空気中にて、エタノール155gに分散させ5分間攪拌後、純水13gを加えてさらに30分攪拌した。
酵素固定化用担体P-1C、P-2C、P-4C及びG-1Cの調製は、上記多孔質シリカ粒子P3に代えて、多孔質シリカ粒子P1、P2、P4及びG1を原料としてそれぞれ用いたことを除き、上記酵素固定化用担体P−3Cの調製の場合と同様の方法によって行った。
調製した各酵素固定化用担体(P-1C,P-2C,P-3C,P-4C及びG−1C)の特徴を表1に記す。
〔酵素固定化用担体(フェニルアミノ基修飾型)の調製〕
1.酵素固定化用担体P-3Phの調製
粉体状の多孔質シリカ粒子P3の40gを空気中にて、エタノール155gに分散させ5分間攪拌後、純水13gを加えてさらに30分攪拌した。
酵素固定化用担体P-1Ph、P-2Ph、P-4Ph及びG-1Phの調製は、上記多孔質シリカ粒子P3に代えて、多孔質シリカ粒子P1、P2、P4及びG1を原料としてそれぞれ用いたことを除き、上記酵素固定化用担体P−3Phの調製の場合と同様の方法によって行った。
調製した各酵素固定化用担体(P-1Ph,P-2Ph,P-3Ph,P-4Ph及びG-1Ph)の特徴を表1に記す。
〔酵素固定化用担体(シラノール基未処理型)〕
シラノール基未処理型の酵素固定化用担体については、多孔質シリカ粒子P1、P2、P3、P4及びG1に対してシランカップリング剤等の薬剤による表面修飾処理を行うことなく、そのままの状態で、それぞれ酵素固定化用担体P-1、P-2、P-3、P-4及びG-1として用いた。
比較例として使用したFSM型多孔質シリカ粒子については、文献公知の方法(例えば、特開2004−83501号公報に記載の方法)を用いて、δ−Na2Si2O5(カネマイト)の水系分散液に適当な界面活性剤(膨潤剤)を加えて加熱下反応させ、濾過後水洗し、風乾後焼成することにより調製した。ここで、細孔径が4.0nm、4.2nm、7.5nm、8.0nm、8.5nm、9.2nmのFSM型多孔質シリカ粒子は、1, 3,5−トリイソプロピルベンゼンを膨潤剤として、それぞれ、0ml、0ml、4.5ml、5.5ml、6.0ml、11.2mlを用いることにより得られた。
1.固定化酵素(ラセマーゼ吸着型)の調製及び酵素吸着量の測定
バッファー溶液(20mMのリン酸カリウムと50mMの塩化カリウムの混合物、pH7.5)と、ラセマーゼをバッファー溶液に溶かしたラセマーゼ溶液(ラセマーゼ濃度は2mg/ml)を用意した。
この実験を実施例1〜3で調製した各酵素固定化用担体毎に行った。
ラセマーゼの定量は、市販の定量試薬キット(サーモフィッシャーサイエンティフィック社、「BCA PROTEIN ASSAY REAGENT」)を使用して行った。
〔試料〕
固定化酵素(酵素固定化用担体に2μgのラセマーゼを吸着してなる相当量)と、基質溶液(10mM L−アラニン、10mM リン酸カリウム、pH7.5)の2.5mlとを試験管中にて混合し、温度30℃の条件下で反応させ、透明な水溶液中にごく少量のシリカ粒子が浮遊している状態の懸濁液を得た。この懸濁液を試料とした。
前記懸濁液からなる試料を1cm角の石英セルに入れ、円二色性分散計(日本分光株式会社製、「J−820」)にセットした。セル中の懸濁液はマグネティックスターラーによって攪拌し、セルはペルチェ式温度制御装置により30℃に保った。
各固定化酵素(P-2、P-4、P-2N、P-4N、P-1N、P-3N及びG-1N)についての比活性を図1に示す。
1)ラセマーゼをイオン交換法で担体(「DEAE Sepharose」、GEヘルスケア・ジャパン社製)に固定化させた固定化酵素(「DEAE」)。
5)ラセマーゼを細孔径8.5nmのFSMに固定化させた固定化酵素(「FSM-8.5」)。
図1から、本発明に係る固定化酵素(P-2、P-4、P-2N、P-4N、P-1N、P-3N及びG-1Nは、何れも比較例の固定化酵素に比べて、同等又は同等以上の比活性を示していることがわかる。
(1)固定化酵素(酵素固定化用担体3gにラセマーゼ2μgを吸着させてなる)と、基質溶液(5mML−Ala、pH8.5)の1mlを試験管中にて混合し、温度30℃の条件下、DeepWell Maximizer(タイテック株式会社製)にて1800rpmで2分間懸濁反応させ、懸濁液を得た。
実施例4と同様に準備した担体に対して、デオキシリボアルドラーゼ(DERA)を固定化した。DERAは図4に示す反応を介在する酵素である。
バッファー溶液(50mMトリエタノールアミン、pH7.5)と、Klebsiella pneumoniae (Kp) 由来のデオキシリボアルドラーゼ(以下、「KpDERA」)をバッファー溶液に溶かしたKpDERA溶液(KpDERA濃度2mg/ml)を用意した。
また、FSM8.0、FSM8.5又はFSM9.2についても同様に固定化酵素を調製した。
上記1.で得られた各固定化酵素(懸濁液)を遠心処理装置[メーカー:エッペンドルフ社、品番:centrifuge5417R](21000G、1分間)にて遠心分離処理し、固定化酵素を沈殿させ、上澄液中のKpDERA量を[ビシンコニン酸(BCA)法]を用いて測定し、この値を未吸着のKpDERA量とした。ここで、最初に投入したKpDERA量(2mg)から未吸着のKpDERA量を差し引いた値を酵素固定化用担体に吸着したKpDERA量とした。
固定化酵素(KpDERAの5μgを酵素固定化用担体37.5μgに吸着させてなる)と、基質溶液(1mM 2−デオキシリボース−5−リン酸 [DR5P])の2.0mlを試験管中にて、温度30℃で反応させ、反応液を得た。
吸光度の測定には、UV−Vis分光光度計(メーカー:島津製作所、型番:UV−2450)を用いた。
固定化酵素(KpDERAの1.05μgを各酵素固定化用担体18.4μgに吸着させてなる)を、それぞれ350μlの基質溶液〔100mM トリエタノールアミン(pH7.5)、100mM DL-グリセロール三リン酸、300mMアセトアルデヒド〕と25℃で20分間反応させ、それぞれ反応液を得た。
上澄液20μlを新しいチューブに移し、8μlの60%過塩素酸を加え10分間氷上で処理した。
固定化したDERAのアセトアルデヒドに対する耐性の向上を確認するため、まず、担体に担持されていないフリーの酵素(「Free」)の順反応に対するアセトアルデヒドの影響を評価した。
図7に示すように、アセトアルデヒド濃度300mM以上では1時間でほぼ失活した。
固定化酵素の順反応におけるアセトアルデヒドの影響を評価した。
固定化酵素の逆反応におけるアセトアルデヒドの影響を評価した。
0.2ユニットのKpDERAを吸着させた本発明に係る固定化酵素を350μlの基質溶液(100mMのトリエタノールアミン[pH7.5]、100mMのDL−グリセロール三リン酸、300mMの アセトアルデヒド)と25℃で一定反応させた。
図8に示すように、逆反応に対してはP-4における耐性の向上が顕著であった。
ラクトンは医薬品中間体として重要な物質であり、合成ルート簡略化のため図2.2に示すDERAによるタンデムアルドール合成反応によるラクトン合成が期待されているが、アルデヒドによる失活のため実用化されていない反応である。そこで、アセトアルデヒドからのタンデムアルドール反応によるラクトン前駆体(2,4,6−トリデオキシ−D−エリスロ−ヘキサピラノシド)生成量を比較した。
1.固定化酵素の調製
バッファー溶液(20mMのリン酸カリウムと50mMの塩化カリウムの混合物、pH7.5)と、ニトリルヒドラターゼ(NHase)をバッファー溶液に溶かしたニトリルヒドラターゼ溶液(ニトリルヒドラターゼ濃度は2mg/ml)を用意した。
得られた固定化酵素を0.1Mのリン酸緩衝液(pH7.5)2mlに懸濁した。次にメタクリロニトリル20mMを含むリン酸緩衝液(活性測定溶液)の2mlを、石英製キュベットに入れ、紫外分光光度計にセットした。
実施例4〜6の酵素、およびこれらの実施例に記載の方法と同様の手法により固定化されたラッカーゼ、グルコアミラーゼ、アミラーゼおよびプロテアーゼについて、他の酵素とともに、酵素の特性を示す指標である分子量と等電点でマッピングした図を図11に示す。同図には酵素のサブユニットも数字で表現した。このように様々な酵素をすべて固定化し高い活性が得られることを確認できた。
一次粒子の平均粒子径の大きさを変えて、それぞれ合成した各蛋白質固定化用担体(多孔質シリカ粒子)の細孔径分布を測定した。
本実施例で細孔径分布の測定に使用した各蛋白質固定化用担体(多孔質シリカ粒子)の製造方法等を以下に記す。
得られた多孔質シリカ粒子X1、X2及びX3の特徴を表3に記す。
なお、前記多孔質シリカ粒子X1〜X3及び前記多孔質シリカ粒子P1〜P4は何れも粒子表面にシラノール基を有するものである。
上記蛋白質固定化用担体(多孔質シリカ粒子)X1〜X3及びP1〜P4について、それぞれ細孔径分布を測定した。ここで、細孔径が20nmまでの担体については窒素吸着法により細孔容積及び細孔径を測定し、細孔径が20nmより大きい担体については水銀圧入法により細孔容積及び細孔径を測定した。
大半の酵素分子は、細孔径20nm程度の細孔内に固定化することが可能である。しかし、多量体を形成して活性を発揮するタイプの酵素の中には、20nmを超える大きさのものもある。本発明の蛋白質固定化用担体は、上記のように、細孔径を20nmより大きくすることができるので、20nmを超える多量体を形成する酵素を固定化できる。したがって、上記結果は、本発明によって、これらの酵素の固定化に適した大きさの細孔を有する蛋白質固定化用担体(多孔質シリカ粒子)を提供できることを示すものである。
また、本発明に係る固定化蛋白質は、酵素を利用した合成反応、例えば、化学合成、ファインケミカルの合成、医薬品合成又は食品製造等の技術分野において、各種合成反応に適用した酵素の安定性又は耐久性の改善、目的生産物の生産性の向上、目的物質の連続生産の実現又は生産物からの酵素の分離工程の省略などを実現するものである。また、本発明に係る固定化蛋白質は、各種酵素に適用可能である。
Claims (17)
- 内部に粒子間空隙構造を有する多孔質シリカ粒子からなり、
該多孔質シリカ粒子が、下記(1)〜(6)を満たし且つ表面にシラノール基、陰イオン交換基又は陽イオン交換基を有するものである
ことを特徴とする蛋白質固定化用担体:
(1) 平均粒子径(Da)が0.5〜100μmの範囲;
(2) 比表面積が10〜250m2/gの範囲;
(3) 細孔容積(Pv)が0.10〜0.32ml/gの範囲;
(4) 細孔径分布(X軸:細孔径[Ps]、Y軸:細孔容積を細孔径で微分した値)におけるピーク値の細孔径(Pms)が2〜200nmの範囲;
(5)(Pms)×0.75〜(Pms)×1.25nmの範囲内の細孔径を有する細孔の合計細孔容積が、全細孔容積の70%以上;
(6) 空隙率が5〜50%の範囲。 - 前記多孔質シリカ粒子が、
平均粒子径(Db)10〜500nm、真球度0.9〜1の範囲、粒子径変動係数(CV値)が2〜10%の範囲にある球状シリカ微粒子であって、粒子径分布が単分散相を示す球状シリカ微粒子が集合した球状集合体からなる請求項1に記載の蛋白質固定化用担体。 - 内部に粒子間空隙構造を有する多孔質シリカ粒子からなり、
該多孔質シリカ粒子が、下記(1)〜(6)を満たし且つ表面にシラノール基、陰イオン交換基又は陽イオン交換基を有するものである
ことを特徴とする蛋白質固定化用担体:
(1) 平均粒子径(Da)が0.5〜50μmの範囲;
(2) 比表面積が10〜250m2/gの範囲;
(3) 細孔容積(Pv)が0.10〜0.32ml/gの範囲;
(4) 細孔径分布(X軸:細孔径[Ps]、Y軸:細孔容積を細孔径で微分した値)におけるピーク値の細孔径(Pms)が2〜50nmの範囲;
(5)(Pms)×0.75〜(Pms)×1.25nmの範囲内の細孔径を有する細孔の合計細孔容積が、全細孔容積の80%以上;
(6) 空隙率が5〜50%の範囲。 - 前記多孔質シリカ粒子が、
平均粒子径(Db)10〜50nm、真球度0.9〜1の範囲、粒子径変動係数(CV値)が2〜10%の範囲にある球状シリカ微粒子であって、粒子径分布が単分散相を示す球状シリカ微粒子が集合した球状集合体からなることを特徴とする請求項3に記載の蛋白質固定化用担体。 - 前記陰イオン交換基が、アミノ基又は第4級アンモニウム基を構造中に含む置換基であることを特徴とする請求項1〜4の何れかに記載の蛋白質固定化用担体。
- 前記陽イオン交換基が、カルボキシル基、リン酸基及びスルホキシル基から選ばれる何れかの基を構造中に含む置換基であることを特徴とする請求項1〜4の何れかに記載の蛋白質固定化用担体。
- 前記多孔質シリカ粒子が、シランカップリング剤又は有機酸で表面処理されたものであることを特徴とする請求項1〜6の何れかに記載の蛋白質固定化用担体。
- 前記多孔質シリカ粒子が、アミノ基含有シランカップリング剤で処理された多孔質シリカ粒子を、さらに有機酸で表面処理したものであることを特徴とする請求項1〜7の何れかに記載の蛋白質固定化用担体。
- 酵素の固定化に用いられる請求項1〜8の何れかに記載の蛋白質固定化用担体。
- 複合酵素の固定化に用いられる請求項1〜8の何れかに記載の蛋白質固定化用担体。
- 請求項1〜8の何れかに記載の蛋白質固定化用担体に、蛋白質を固定化してなる固定化蛋白質。
- 前記蛋白質が酵素である、請求項11に記載の固定化蛋白質。
- 前記酵素がラセマーゼである請求項12に記載の固定化蛋白質。
- 前記酵素がデオキシリボアルドラーゼである請求項12に記載の固定化蛋白質。
- 請求項1〜8の何れかに記載の蛋白質固定化用担体に、蛋白質を吸着させる工程を含む固定化蛋白質の製造方法。
- 前記蛋白質が酵素である、請求項15に記載の固定化蛋白質の製造方法。
- バッファー溶液中にて、4〜25℃の範囲で、蛋白質固定化用担体に蛋白質を吸着させることを特徴とする請求項15又は16に記載の固定化蛋白質の製造方法。
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