JPS6248391A - 脂肪酸エステル類の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ステロール類及び／又は特定の脂肪族アルコ
ール類と脂肪酸とのエステル類の新しい製造方法に関す
る。

え−呈−（１）’１５　　　ｉ ステロール類と脂肪酸とのエステルは、従来より、例え
ばコレステリック液晶（特開昭５２−２４９９２号公報
参照）や医薬化釘用親水性基材（特開昭５２−４１２１
５号公報、特開昭５２−７９０３０＠公報参照）等とし
て、各種分野で広く用いられている。

従来かかるステロール脂肪酸エステルは、専ら有機合成
法により製造されているが、一般に有機合成法では苛酷
な反応条件が採用され、しかも副反応等が惹起する弊害
は避けられず、反応及び引続く目的物の単離精製に繁雑
な操作、工程等を特徴とする特にステロール類の水酸基
はセカンダリ−であり、しかもこれはステロイド骨格に
近接しているために、通常の脂肪族セカンダリ−アルコ
ールと比較しても反応性が低下しており、そのためにこ
れに脂肪酸を反応させ、脂肪酸エステル類を製造する場
合、酸触媒を用いて高温で長時間反応させるか、脂肪酸
を一旦酸無水物、酸ハライド等に変換させた後、エステ
ル化反応を行なう必要がある。またステロイド骨格の４
位に２個のメチル基と１４位に１個のメチル基を持ち、
３位に水酸基を持つトリメチルステロール等を原料とす
る場合、該化合物はその４位の２個のメチル基の立体障
害のために更に反応性は低く、酸ハライドとしなければ
脂肪酸とのエステル化反応は困難である。しかるに各種
用途に有用なものとして所望されるステロールエステル
類は、一般に長鎖脂肪酸のエステルであり、かかるエス
テル合成のために原料とする長鎖脂肪酸のハライドは、
その入手が一般に困難であり、通常繁雑な工程を要して
別途合成せねばならず、非常に高価なものとなる不利が
ある。加えてかかる脂肪酸のハライドは、概して湿気に
より分解し易く不安定であり、しかも反応時に刺激性、
腐蝕性の生成物を副生ずるおそれがあり、特殊な反応装
置等を要する不利もある。

また、近年グリセライドやテルペンエステルの合成につ
いては、これを有機合成によることなく、リパーゼ等の
加水分解酵素の逆反応を利用して合成する方法が研究開
発されつつある。しかしながらかかる酸素を利用したス
テロールエステル類の合成例は未だ報告されておらず、
また知られている合成例はいずれもアルコール成分とし
て液状のものを用いており、常温で固形の高級アルコー
ル類を用いた例は皆無であり、しかも一般に酵素反応は
基質特異的であり、基質とする化合物が異なれば合成反
応の進行は予測できない。また通常、酵素による合成反
応の平衡は基質の方に大きく片寄ることが知られており
、上記開発された方法といえども、反応平衡を合成反応
側に移動させるために可及的に反応系内の水分を少なく
する等の特殊な手段が必要で、反応系の構築に制約があ
り、更に目的とするエステル類の合成率は通常低い。

発明が解決しようとする問題点 本発明者らは上記苛酷な反応条件を要し、高価で且つ不
安定な反応試薬等を必要とする有様合成によることなく
、所望のエステル類をより温和な条件下に有利に収率よ
く製造できる方法を提供することを目的として鋭意研究
を重ねた結果、先に特定の酵素がステロールエステル類
の合成を触媒することを見出し、この知見に基づ〈発明
を完成し、特許出願した（特願昭６０−４５１２８号）
。

上記方法はグリセライドやテルペンエステルの酵素的合
成とは異なって反応系の構築に制約を受けず、しかも高
収率・で目的とするエステル類を合成できる非常に優れ
たものであった。

本発明の目的は、先に開発した上記方法を工業的により
有利に実施できる改良された方法を提供することにある
。より詳しくは、比較的高価な触媒としての酵素を連続
して又は反復して使用し、目的物の合成を連続的乃至半
連続的に実施できる方法を提供することにある。

問題１１、を解決するための手段 本発明によればリパーゼ及びコしＩステロールエステラ
ーゼから選択される酵素類又は固定化された上記酵素類
を用いて、ステロール類及び／又は炭素数１４〜３２の
脂肪族アルコール類と脂肪酸とを接触反応させて脂肪酸
エステル類を製造する方法であって、上記酵素類又は固
定化酵素類を、反応混合物と分離するか分離することな
く、繰返し利用することを特徴とする脂肪酸エステル類
の連続的乃至半連続的製造方法が提供される。

本発明方法では、酵素を利用することによって、従来の
有機合成法に見られるごとき苛酷な反応条件を採用した
り、繁雑な操作等を要して原料を別途合成したり、特殊
な反応装置等を必要とすることなく、非常に温和な条件
下に容易にしかも収率よく目的とするエステル類を製造
できることは勿論のこと、更に上記酵素を繰返し利用し
て反応を連続的乃至半連続的に行なうものであるため、
自動化が容易で目的エステルの合成の省力化、製造コス
ト、設備コスト等の大巾な低減が可能である。

このように本発明方法は特に工業的実施に適している。

本発明方法において用いられる酵素類は、リパーゼ及び
コレステロールエステラーゼから選択される。ここでリ
パーゼとは、トリグリセライドを段階的にグリセリンと
脂肪酸に加水分解する反応を触媒する酵素であり、コレ
ステロールエステラーゼとは、コレステロールと脂肪酸
とのエステル結合を加水分解する酵素である。上記リパ
ーゼ及びコレステロールエステラーゼは、その起源に特
に制限はなく、各種微生物、動物、植物起源のいずれで
もよい。

リパーゼの起源微生物としては、例えばアクロモバクタ
−イオファーガス（Ａ　ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｏ
ｆｕｒｇｕｓ）　、アクロモバクタ−リボリテイカム（
Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ　　ｌｉｐｏｌｙｔｉｃｕ
ｍ　）等のアクロモバクタ−属、りＯモバクテリウム　
ビスコサム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　　ｖ
ｉｓｃｏｓｕｍ）等のクロモバクテリウム属、コリネバ
クテリウム　アクネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｊｅｒｉｕ
ｍ　　ａｃｎｅｓ　）等のコリネバクテリウム属、シュ
ードモナスエアルギノーサ（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　
　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）　、シュードモナスフラギ（
ＰＳ８ｕｄＯＩＩＩＯｎａＳ　　ｆｒａｇｉ　）　、シ
１−トモナス　フルオレスセンス（Ｐ　ｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ　）等のシュードモナス
属、スタフィロコッカス　アウレウス（Ｓ　ｔａｐｈｙ
＋ｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ＞等のスタフィロコッカ
ス属、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
　　ｎｉｇｅｒ　）等のアスペルギルス属、キャンディ
ダ　シリントラシア（Ｃａｎｄｉｄａ　　ｃｙｌｉｎｄ
ｒａｃｅａ　）等のキャンデイダ属、フミコーラ　ラン
ギノーサ（ＨｕｍｉｃｏｒａＩａｎｕｇｉｎｏｓａ）等
のフミコーラ届、ペニシリウム力セイコラム（Ｐｅｎｉ
ｃｉｌｌｉｕｍ　　ｃａｓｅｉｃｏｌｕｍ）　、ペニシ
リウム　クルストサム（ｐ　１ｉｃｉ　ｌ　Ｉ　ｉｌＪ
ｍｃｒｕｓｔｏｓｔ＋ｍ　）　、ペニシリウム　シクロ
ビウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　　ｃｙｃｌｏｐｉｕ
ｍ　）　、ペニシリウムロキュフオーテイ（Ｐｅｎｉｃ
ｉｌｌｉｕｍ　　ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）等のペニシリ
ウム属、トルロプシス　エノビ（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ
　　ｅｒｎｏｂｉｉ　）等のトルロプシス属、ムコール
　ミーヘイ（Ｍ　ｕｃｏｒ　　ｍ１ｅｈｅｉ　）等のム
コール属、バシラス　ズブチルス（３ａｃｉｌｌｕｓｓ
ｕｂｔｉｌｉｓ）等のバシラス属、アルカリゲネス　ｓ
ｐ（Ａ　Ｉｃａｌｉｇｅｎｅｓ　　ｓｐ）等のアルカリ
土類金属、サーモマイセス　イバダネンシス（Ｔ　ｈｅ
ｒｍｏｍｙｃｅｓｉｂａｄａｎｅｎｓｉｓ　）等のサー
モマイセス属等に属する各種の微生物を例示できる。

またコレステロールエステラーゼの起源微生物としては
シュードモナス属、例えばシュードモナス　エアルギノ
サ（Ｐ　ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　ａｅｒｕａｉｎｏｓ
ａ）、シュードモナス　フルオレスセンス （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ
　）　、シュードモナス　ノブエスピー、シュードモナ
ス　ディスモリティ力等、アクロモバクタ−属、例えば
アクロモバクタ−デリカチュラス（Ａ　ｃｈｒｏｍｏｂ
ａｃｔｅｒｄｅｌｉｃａｔｕｌｕｓ　）等、フザリウム
属、ノカルジア属、シュードモナス属、ストレプトミセ
ス瓜、キャンデイダ属、例えばキャンディダ　リボリテ
イ力、キャンディダ　トロピカリス、キャンデイダ　イ
ンターメディア、キャンディダ　シリントラシア等をそ
れぞれ例示できる。

上記各酵素の大部分は、精製された酵素として市販され
ており、本発明ではこれらの市販品をそのまま用いるこ
とができるが、特に精製された市販品を用いる必要はな
く、例えば目的とする酵素の生産能を有する微生物菌体
そのもの、その培養液、該培養液を処理して得られる粗
肝素液や酵素を含む組成物等を利用することもできる。

また本発明において固定化された上記酵素類としては、
上記酵素類を通常の方法により、適当な担体に固定化さ
せたものをいずれも用いることもできる。該固定化酵素
及びその調製の詳細については、後述する。

本発明において上記酵素類又は固定化酵素類を用いて合
成反応される一方の原料としてのステロール類とは、分
子内にステロイド骨格と水酸基とを有する化合物をいう
。ここでステロイド骨格とは、式 ％式％ で表わされる骨格であり、水酸基は上記骨格に直接結合
しているのが一般的である。本発明に用いられる上記ス
テロール類の具体例としては、例えばコレステロール、
７−デハイドロコレステロール、β−コレスタノール、
コブロスタノール、ラドステロール、チモステロール、
チモステノール、デスモスチロール、ブラシカステＣ１
−Ｊし、エルゴステロール、カンペステロール、β−シ
トステＯ−ル、γ−シトステロール、α−スピナステロ
ール、スティグマステロール等、トリメチルステロール
としてラノステロール、ジヒドロラノステロール、アグ
ノステロール、ジヒドロアグノステロール及び之等の混
合物としての羊毛ロウより分離精製して得られるイソコ
レステロール、シクロアルテノール等を例示できる。

また本発明では、上記ステロール類に代えて又はこれと
共に炭素数１４〜３２の脂肪族アルコール類が一方の基
質として利用できる。該アルコール類は飽和でも不飽和
でもよく、また直鎖でも分枝鎖状でもよく、更に１価で
も２価以上でもよく、之等の混合物でもよい。

直鎖飽和アルコールの具体例としては、ミリスチルアル
コール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、エ
イコサノール、ドコサノール、テトラコサノール、ヘキ
サコサノール、オクタコサノール、ノナコサノール、ミ
リシルアルコール、ペンタデカノール、ヘプタデカノー
ル、ノナデカノール、テトラデカノール−２、ペンタデ
カノール−２、ヘキサデカノール−２、ヘプタデカノー
ル−２、オクタデカノール−２、ノナデカノール−２、
エイコサノール−２等を例示できる。

分枝鎖状飽和アルコールとしては、一般式０式％ 及び一般式 ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ＋ＣＨ２＋ｎ−ＯＨＣＨ３（ｎ　
＝１０〜２８） で表わされるもの、例えば１４−メチルヘキサデカノー
ル−１，１６−メチルオクタデカノール−１，１８−メ
チルノナデカノール エイコサノール、２ｏ−メチルヘンエイコサノール、２
０−メチルドコサノール、２２−メチルトリコサノール
、２２−メチルテトラコサノール、２４−メチルペンタ
コサノール−１、２４−メチルへキサコサノール等及び
之等の混合物、例えばラノリンアルコールより溶剤分別
により誘導されるステロールを含まない脂肪族高級アル
コール−グリコール混合物で飽和の炭素数１８〜３２の
直鎖及び分校を主成分とするラノリンアルコール等を例
示できる。

不飽和の第１アルコールとしては、オレイルアルコール
、エライジルアルコール、リルイルアルコール、リルニ
ルアルコール等；α，ωージオール類、例えばテトラデ
カンジオール、ペンタデカンジオール、ヘキサデカンジ
オール、ヘプタデカンジオール、オクタデカンジオール
、ノナデカンジオール、エイコサンジオール、ヘンエイ
コサンジオール等；下式で示されるα，βージオール類
等を例示できる。

ＣＨ３→ＣＨ２÷ａ−Ｃ　Ｈ　Ｃ　Ｈ２−Ｏ　Ｈ０Ｈ　
　（ａ　＝１　１　〜２９） （ｂ＝９〜２７） （Ｃ＝８〜２６） 更に分校（合成）アルコール類としては、ヘキサデシル
アルコール（エッソスタンダード社）、エヌジエコール
１６０Ａ，１６０Ｂ１１８１Ａ。

２００Ａ、２００Ｃ　（いずれも新日本理化社）、ファ
インオキソコール１８００（日産化学社）、ダイヤドー
ル１８Ｇ（三菱化成社）、オクチルドデカノール（ヘン
ケル社）等を、また分校（合成）セカンダリ−アルコー
ルとしては、イソトリデシルアルコール（クラレ社）、
下式で表わされるもの等を例示できる。

本発明において他方の原料とする脂肪酸は、炭素数が２
〜３２の飽和もしくは不飽和の脂肪酸のいずれでもよく
、之等は直鎖でも分枝鎖でもよい。

飽和の直鎖脂肪酸としては、例えば酢酸、酪酸、カブ０
ン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチ
ン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸、ベヘ
ン酸、リグノセリン酸、セロチン酸、モンタン酸、メリ
シン酸、ｎ−ドトリアコンタン酸等の炭素数が偶数であ
る飽和直鎖脂肪酸、及び例えばプロピオン酸、ｎ−吉草
酸、エナント酸、ペラルゴン酸、ヘンデカン酸、トリデ
カン酸、ペンタデカン酸、ヘプタデカン酸、ノナデカン
酸、ヘンエイコサン酸、トリコサン酸、ペンタコサン酸
、ヘプタコサン酸等の炭素数が奇数である飽和直鎖脂肪
酸を例示できる。

飽和の分枝鎖脂肪酸としては、例えばイソ酪酸、イソカ
プロン酸、イソカプリル酸、イソカプリン酸、イソラウ
リン酸、１１−メチル−ドデカン酸、イソミリスチン酸
、１３−メチル−テトラデカン酸、イソパルミチン酸、
１５−メチル−ヘキサデカン酸、イソステアリン酸、１
７−メチル−オクタデカン酸、イソアラキン酸、１９−
メチル−エイコサン酸、α−エチル−ヘキサン酸、α−
へキシルデカン酸、α−へブチルウンデカン酸、２−デ
シルテトラデカン酸、２−ウンデシルテトラデカン酸、
２−デシルペンタデカン酸、２−ウンデシルペンタデカ
ン酸、式 で表わされるファインオキソコール１８０酸〔日産化学
社製〕等を例示できる。また上記飽和の奇数分枝鎖脂肪
酸には、例えば６−メチル−オクタン酸、８−メチル−
デカン酸、１０−メチル−ドデカン酸、１２−メチル−
テトラデカン酸、１４−メチル−ヘキサデカン酸、１６
−メチル−オクタデカン酸、１８−メチル−エイコサン
酸、２０−メチル−トコサン酸、２２−メチル−テトラ
コサン酸、２４−メチル−ヘキサコサン酸、２６−メチ
ル−オクタコサン酸等の末端がイソブチル基であるアン
チイソ系の脂肪酸が包含される。

不飽和の脂肪酸としては、例えばトウハク酸、カプロレ
イン酸、リンデル酸、ラウロレイン酸、ツヅ酸、フイセ
トレイン酸、ミリストレイン酸、パルミトオレイン酸、
ペトロセリン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン
酸、カドレイン酸、シス−１１−エイコセン酸、セトレ
イン酸、エルカ酸、セラコレイン酸、１７−へキサコセ
ン酸、６．９，１２．１５−へキサデカテトラエン酸、
リノール酸、リルン酸、α−エレオステアリン酸、β−
エレオステアリン酸、ブニカ酸、６，９゜１２．１５−
オクタデカテトラエン酸、パリナリン酸、アラキドン酸
、５，８．１１．１４．１７−ニイコサベンタエン酸、
７．１０，１３，１６゜１９−ドコサペンタエン酸、４
，７，１０，１３゜１６．１９−ドコサヘキサエン酸等
を例示できる。

また本発明に用いられる脂肪酸は、分子内に水酸基を有
するオキシ脂肪酸であってもよい。このオキシ脂肪酸と
しては、例えばα−ヒドロキシラウリル酸、α−ヒドロ
キシミリスチン酸、α−ヒトＯキシパルミチン酸、α−
ヒドロキシステアリン酸、ω−ヒドロキシラウリル酸、
α−ヒドロキシアラキン酸、９−ヒトＯキシー１２−オ
クタデセン酸、リシノール酸、α−ヒドロキシベヘニン
酸、９−ヒドロキシ−トランス−１０，１２−オクタデ
カジエン酸、カモレン酸、イブロリル酸、９．１０−ジ
ヒドロキシステアリン酸、１２−ヒドロキシステアリン
酸等を例示できる。

更に上記脂肪酸は、例えばシュウ酸、マロン酸、コハク
酸、ゲルタール酸、アジピン酸、ピメリン酸、セベリン
酸、アゼライン酸、セバシン酸、Ｄ。

し−リンゴ酸等のポリカルボン酸であってもよい。

上記脂肪酸は、その一種を単独で本発明の反応に利用し
てもよく、上記例示の同一群又は異なる群に匡する二種
以上を混合して本発明に用いることもできる。二種以上
を併用する場合には、脂肪酸原料として、例えば飽和の
直鎖及び分校脂肪酸並びにオキシ脂肪酸の混合物である
ラノリン脂肪酸等を有利に用いることができる。

本発明の反応は、上記ステロール類及び／又は特定の脂
肪族アルコール類と脂肪酸とを基質として、之等を前記
酵素類又は固定化酵素類の存在下に接触させることによ
り進行する。上記反応は、両基質と酵素とを単に接触さ
せるのみで行なうことができ、通常撹痒混合するのが好
ましい。本発明者らの研究によれば、特に上記反応は水
媒系、非水系、水−有機溶媒２相系のいずれでも容易に
進行し、しかも目的物の合成率はこの反応系に殆んど影
響を受けないことが見出された。

尚、上記水媒系とは、反応系の構成が、酵素、両基質及
び酵素を溶解する水及び／又は親水性物質からなる系を
言い、非水系とは反応系の構成が酵素、両基質及び少な
くとも一方の基質を溶解することのできる水不混和性有
機溶媒からなる系で、酵素が溶けずに反応系に分散して
いる系を言う。

また水−有機溶媒２相系とは、上記水媒系と非水系とを
組合せた系で、その構成は酵素、酵素を溶解する水及び
／又は親水性物質及び両基質又は少なくとも一方の基質
を溶解することのできる水不混和性有機溶媒からなる系
を言い、この系では静置、遠心分離等により酵素、親水
性物質を含む水相と基質及び有機溶媒を含む有機溶媒相
とを分離することができる。上記親水性物質とは、水と
自由に混合する物質であり、用いる酵素をできるだけ失
活させないものが望ましく、例えばグリセロール等を例
示できる。之等の用語は以下本明細書において同様の意
味で用いるものとする。また水不混和性有機溶媒につい
ては後述する。

酵素によるグリセライドの合成反応においては、反応系
の水分含量は非常に重要な因子であり、酵素の活性発現
に必要な最小限の水を除いて、反応系内の水を可及的に
少なくすることが、反応の平衡を合成側に移行させるた
めに必須の要件とされているが、本発明では通常の酵素
製剤中に含まれる程度の水分母が反応系内に存在するの
みで特に水を加えずとも合成反応が良好に進行し、また
驚くべきことに反応系内に多量の水もしくは親水性物質
例えばグリセロール等が存在する場合でも反応の平衡は
一方的に合成側に片寄るという事実及び水と不混和性の
有機溶媒系、特に好ましくは水飽和の上記有機溶媒系で
も合成反応は良好に進行するという事実を認めた。

上記非水系及び水−有機溶媒２相系に利用される有機溶
媒としては、用いる酵素をできるだけ失活させないもの
が望ましく、その具体例としては例えばｎ−ヘキサン、
ｎ−へブタン、ｎ−オクタン、イソオクタン、シクロヘ
キサン、ｎ−デカン、ｎ−トリデカン、ｎ−テトラデカ
ン、ｎ−ヘキサデカン、ポリブテン、ジイソブチレン、
流動パラフィン、スクワラン、スクワレン、ブリスタン
等の炭化水素系溶媒を例示することができる。勿論上記
各炭化水素の２種以上を混合するか又は之等を含有する
混合溶媒、例えば「アイビーソルベント１０１６Ｊ　　
（出光石油化学社製、Ｃａ＝６３％、Ｃ９＝３０％を主
成分とするイソパラフィン系混合物）や［アイソパーＥ
Ｊ　　（エクソン化学社製、Ｃａ＝２５〜３５％、Ｃ９
７５〜６０％を主成分とするイソパラフィン系混合物）
も同様に有利に使用することができる。

特に、上記水−有機溶媒２相系の利用によれば、反応終
了後、酵素は水相乃至水−有機溶媒界面に、目的とする
エステル及び未反応基質は有機溶媒相に分配することが
認められ、これにより、酵素と目的エステル及び未反応
基質とを容易に分離することができる。また有機溶媒の
利用によれば、通常固形であるステロール類及び脂肪族
アルコール類を該溶媒溶液の形態で反応に供することが
でき、反応液の性状を改善して酵素−基質の接触をより
有利に行なうことができる。

上記接触時の反応条件は、用いられる酵素の失活がない
かこれが最小限に抑制される条件であればよく、通常酵
素の最適ｐＨ及び最適温度条件が採用される。一般に上
記温度としては、約１０〜６０℃の範囲が好適であるが
、耐熱性リパーゼ等の耐熱性の酵素を用いる場合には、
該酵素に応じてより高温条件を採用することもできる。

ｐＨは、用いる酵素に応じてアルカリ性、中性及び酸性
のいずれかが採用され、このＩ）Ｈを調節するために適
当な酸やアルカリ、例えば塩酸、硫酸等や水酸化ナトリ
ウ゛ム、水酸化カリウム等及び例えばリン酸緩衝液等の
適当な緩衝液を、必要に応じて、反応系内に添加するこ
ともできる。更に用いる酵素の賦活因子として知られて
いる例えばカゼイン、アルブミン、カルシウムイオン、
胆汁酸及びその塩等を添加することもできる。

反応系内に存在させる酵素と両基質との比率は、本発明
方法が連続法乃至半連続法（反復法）であることを前提
として、特に制限はなく、それらの種類、反応条件等に
応じて適宜選択できる。通常１回当りの反応について検
討すれば、酵素はアルコール成分原料（ステロール及び
／又は脂肪族アルコール＞１（］当り、リパーゼでは、
約１〜１０万単位、好ましくは５００〜５万単位程度、
コレステロールエステラーゼでは約１〜１０万単位、好
ましくは５０〜５万単位程度とすることができる。両基
質の使用比率も任意に決定でき、いずれを過剰としても
よく特に制限はない。通常一方の基質に対して他方を約
０．１〜２０倍モル旦の範囲で用いるのが普通である。

なお、用いられる酵素の活性発現のためには、該酵素（
絶乾重量）１（Ｉに対して少なくとも約０．００１ｍＱ
の水の存在が必要である。一般に反応系を水媒系とする
時には、通常利用する酵素世に対して水を約０．００１
〜１００００倍重伍、好ましくは約２０〜７００倍重世
用いるのがよい。

また非水系では、酵素の活性発現のために必要な水分は
、通常市販の酵素、酵素製剤及び之等の固定化酵素剤中
に含まれており、特に添加する必要はないが、使用する
基質又はその有機溶媒溶液を、予め水飽和として用いる
のが酵素の活性が高くなることがあり好ましい。有機溶
媒は、用いる両基質が液体の場合は特に使用する必要は
なく、固体の基質を用いる場合には、その使用により反
応系の物理的性状を改善して接触反応をより容易にする
ことができる。基質濃度についても特に制限はなく、反
応系の物理的性状に応じて適宜選択できる。非水系の場
合、酵素は基質にも有機溶媒にも溶けないため粒子の形
で反応系に懸濁しており、精密濾過や遠心分離により簡
単に反応系より分離回収できる。更に水−有機溶媒２相
系の反応系を採用する場合、水と有機溶媒との使用比率
は、何ら限定はないが・、反応速度に多少の影響を与え
、用いる両基質、酵素及び溶媒の種類、之等の混合方法
、反応容器の形状、大きさ、反応液全体の体積、その他
の各種反応条件に応じて適宜決定することができる。

本発明方法は、上記接触反応の後、酵素類又は固定化酵
素類を反応混合物より分離するか分離しないかにより、
半連続法（回分法の繰返し反復法）と連続法とに大別さ
れ、之等各方法は更に固定化酵素を用いる場合と未固定
化酵素を用いる場合とで、各々以下の如く分けられる。

即ち、未固定化酵素を用いる本発明方法は、半連続法及
び連続法のいずれの場合でも、相分離を利用するか、適
当な濾過手段を採用するか、遠心分離を利用するか又は
分離膜を利用して実施される。

相分離を利用する本発明方法は、半連続法の場合、反応
系として非水系、水媒系及び水−有機溶媒２相系のいず
れかを採用し、１回の反応終了後、反応混合液に水又は
（及び）水不混和性有機溶媒を添加して水相−疎水性基
質相の２相系に転換しく水−有機溶媒２相系の場合はそ
のまま静置すればよい）、静置又は遠心分離により水相
と疎水性基質相との相分離を行ない、水相及び水−有機
溶媒界面に存在する酵素と、目的エステル及び未反応基
質を含む有機相とを分離し、かくして分離された酵素を
繰返し利用することにより行なわれる。

上記相分離の際、水媒系における有機溶媒の添加は、反
応液の乳化を破壊して相分離を促進する効果がある。ま
た分離された有機相は例えばこれをメタノール等の低級
アルコール水溶液で抽出することにより、極性の強い未
反応基質を低級アルコール水溶液中に抽出し、容易に収
率よくこれと目的エステルとに分離することができる。

濾過゛手段を採用する方法では、反応系が非水系の場合
、Ｖｆ素は非水性基質及び有機溶媒には溶けず粒子の形
で系内に懸濁しているため、例えば精密濾過、限外濾過
等の適当な濾過手段により分離することができる。上記
精密濾過としては、通常のか紙と濾過助剤とを組合せて
用いる方法を採用でき、この場合酵素は濾過助剤に吸着
された形で捕捉され、そのまま再使用できる。またメン
ブランフィルタ−等を用いた精密濾過も可能である。

該フィルターとしては特に約０．０２〜１０μｍの孔径
を有するものが好ましく、その材質はガラス、金属等の
無機物でも合成樹脂等の有機物でもよい。有機溶媒を利
用する系の場合、上記濾過は、耐薬品性に優れた無ｍｔ
Ｐ材や、例えば再生セルロース、テフロン、ポリプロピ
レン、ポリアミド、ポリイミド等のフィルターを用いて
実施できる。

また限外濾過は、通常市販の各種限外濾過膜を用いて実
施でき、特に有機溶媒を用いた系では、耐薬品性に優れ
たポリアミド、ポリイミド、高分子電解質複合体等を用
いるのが好ましい。

更に本発明方法では、水−油混合系又は水−有機溶媒混
合系の分離を、疎水性又は多孔質の分離膜の選択的透過
性を利用した膜分離により実施することができる。即ち
、疎水性の基質及び有機溶媒は、疎水性の分離膜にあい
た微細孔の中を浸透して透過できるが水及び酵素は、表
面張力が大きいため該疎水性膜の表面を濡らすことがで
きず、微細孔の中に浸透できない。このことより、酵素
と基質及び反応物との膜分離が可能である。上記方法に
利用できる疎水性の分離膜としては、臨界表面張力が透
過すべき疎水性物質より大きく、水より小さいもの、例
えば約３０〜５５ダイン／ｃｍのものを挙げることがで
きる。また上記膜の有する微細孔の径としては必ずしも
酵素より小さい必要はなく、約１０μｍ迄であればよく
、その例としては市販のマイクロ濾過用のメンブランフ
ィルタ−の内陣水性のテフロン、ポリプロピレン製のも
のを例示できる。

前記した相分離を利用する本発明方法を連続法により行
なう場合、該連続法は、例えば未固定化酵素を水溶液形
態又は前記した水溶媒系に用い得る親水性物質の水溶液
（以下、酵素につき水溶液という場合は、この親水性物
質の水溶液を含むものとする）で利用し、これと基質又
は基質の有機溶媒溶液とを接触反応させるための反応部
と相分離を行なうための分離部とを有する適当な反応装
置を利用して、反応及び相分離を連続的に行ない、酵素
水溶液を繰返し利用しつつ分離された有機相より連続的
に目的物を得、基質である油相又は有機溶媒相は連続的
に反応部に供給する。　上記連続法の実施に適した反応
器としては、公知の各種のものをいずれも使用できる（
化学工学ｍ１東京化学同人発行、１９６４年）。その代
表例としては、ミキサーセトラー型及びスプレー塔を例
示できる。

ミキサーセトラー型は、混合器（ミキサー）と、混合物
を比重差により分離する沈降器（セトラー）とを組合せ
たもので、その利用によれば混合器に酵素水溶液を満た
し、該水溶液中に基質又はその有機溶媒溶液を連続的に
供給しながら、混合器中で酵素水溶液と基質又はその有
機溶媒溶液とを撹拌混合して接触反応させ、反応混合液
を沈降器に送る。反応混合液は該沈降器内の滞留中に相
分離により水相と、目的物を含む基質相又はその有機溶
媒相（反応液）とに分離し、かくして分離された酵素を
含む重液を混合器に戻しながら、沈降器の上層の反応液
を系外に抜き出すことにより連続合成ができる。

スプレー塔を利用する方法では、例えば酵素水溶液と、
両基質又はその水不混和性有機溶媒溶液のいずれかの相
を分散相として塔中を上昇又は下降させて反応させるも
ので、特に上記基質相を分散相とするのが酵素を不必要
に循環させる必要がなく好ましい。この好ましい方法は
、より詳しくは酵素水溶液を塔中に連続相として入れて
おき、塁質相を塔下部ノズルより連続的に塔中に供給し
て分散相として該酵素水溶液の液柱中を接触反応させな
がら上昇させ、塔上部で相分離させる。塔上部で分離さ
れた基質相を連続的に又は逐次系外に抜き出すことによ
り実施される。連続相である酵素水溶液は、通常一度塔
内に仕込んだ後はその力価が低下する迄は取り替える必
要がなく、また力価の低下に応じて逐次新しい酵素水溶
液を追加補給することもできる。上記における接触反応
は塔内を上昇する基質相の液滴と酵素水溶液との界面で
行なわれるため、一般の液液抽出の場合と同様に液滴の
生成初期と凝集時の接触効果が大であり、この点から液
滴の生成と消滅とを多数回繰返すのが好ましく、従って
基質相を循環させるのが目的エステルの合成率の向上に
効果的であり、また該液滴の径を小さくしたり、酵素濃
度を高くしたり、液滴の上昇速度を遅クシて接触時間を
長くさせるのも反応速度向上に役立つ。

また上記スプレー塔利用による方法をより効率よく行な
う方法とし・では、例えば多孔板を備えた塔（多孔板塔
）を用いる方法が例示できる。これは塔の途中に多孔板
を設は段塔を構成させたもので、重い酵素水溶液が連続
相となり、軽い基質相は分散相となって、第１段目の多
孔板の孔より液滴となって酵素水溶液相中を上昇し接触
反応し、第２段目の多孔板の下部で液相をなし、次いで
再度液滴となって第２段目の板の孔を通過上昇し、これ
を繰返す。従って該多孔板塔の利用では、液滴の生成消
滅が何回も繰返されるためスプレー塔より効率が高く有
利である。

上記多孔板塔の代りに、例えば塔内の流路に多くの邪魔
板を設けて両相の接触時間を長くした邪魔根基、邪魔板
の代りに適当な充填物を充填した塔、塔内に円筒、円板
等の撹拌軸を設けて機械的撹拌を行なわせるべくした回
転円筒塔や回転円根基又は上記充填物とは拌手段とを交
互に積み重ねた塔（Ｓ　ｃｈｅｉｂｅｌ塔）等も有利に
利用でき、更に機械的撹拌による代りに脈動により撹拌
を行なう脈動抽出器の他高速回転による遠心力を利用し
たｐ　ｏｄｂｉｅｌｎｉａｋ抽出器、１　ｕｗｅｓｔａ
抽出器等の遠心抽出器も利用でき、之等を組合せること
もできる。

また、本発明方法は、多孔性の反応膜で界したいずれか
一方に親水性の酵素水溶液を、他方に疎水性の基質又は
その有Ｒ溶媒溶液を存在させ、上記反応膜を介して酵素
水溶液と基質又は基質溶液とを接触反応させ、酵素水溶
液を基質と混合させることなく目的エステルを合成し且
つ酵素を繰返し利用する方法を包含している。

この方法によれば、酵素と基質とは膜により隔てられて
いるため互いに混合されることなく、該膜を介して接触
するため、基質を膜で仕切られた一方側へ連続的に供給
しながら、反応液を連続的に系外へ抜き出すことができ
、反応系が乳化することもなく、基質相への酵素蛋白の
混入もなく、また基質による酵素の活性低下もなく、水
相に加えた酵素安定剤等による反応への悪影響もないと
いう利点がある。更にＶＷ、気密状態で反応を行ない得
るため、酸化安定性の低い基質に対しても自動酸化や二
重結合の異性化、位置移動等の副反応が起る心配もない
。

上記方法において用いられる多孔質反応膜の材質は、特
に限定はなく、例えばガラス１、セラミック、ステンレ
ス網、ポーラスステンレススチール等の無機物でもよく
、合成樹脂例えばテフロン、ポリプロピレン、ポリエチ
レン等のポリオレフィン、再生セロルース、ニトロセル
ロース、アセチルセルロース等のセルロース誘導体、ナ
イロン６６等のポリアミド、ポリカーボネート等の有機
物でもよい。その孔径は通常的０．０５μｍ〜１０μｍ
のものが適当であり、その代表例としては、市販の精密
濾過用のメンブランフィルタ−を例示できる。該メンブ
ランフィルタ−としては、アセチルセルロース、ニトロ
セルロース、再生セルロース製等の親水性のもの及びテ
フロン、ポリプロピレン製等の疎水性のものがよく知ら
れており、本発明ではそれらのいずれをも使用すること
ができる。

上記反応膜の他の好ましい性質としては、膜厚約１０〜
１００μｌ、より好ましくは約２０〜５０μｍ、空孔率
２０〜８０％、より好ましくは約４０〜６０％が挙げら
れ、之等の性質を有する限り本発明に有利に用いられる
。膜の形状は特に制限はなく、通常の平膜形状でもよい
が、例えば円筒状、スパイラル状、チューブラ−状、ホ
ローファイバー状等の形状とするのがよく、之等の形状
では、酵素と基質との接触面積を平膜に比し大きくする
ことができ、反応時間を短縮して合成率を高めることが
できる。

かかる反応膜利用による本発明方法では、酵素水溶液と
疎水性の基質が該膜を介して接触して反応が進行する。

膜が疎水性の場合、疎水性基質が膜の細孔を透過して酵
素水溶液側に侵入するのを防止するため、酵素水溶液に
圧力をかけておくのが好ましい。この圧力は、膜の材質
により異なり、通常その上限値は、水が膜との表面張力
による反発力に打ちかつて膜の微細孔に浸透していくの
に必要な圧力即ちウォーターイニシェーション値であり
、一般には約０．００１〜２０ｋｇ／ｃｍ２の範囲が好
ましい。また膜が親水性の場合、酸素水溶液が膜の孔を
透過して基質側に侵入するのを防止するため、基質側の
圧力を約０．００１〜２０ｋａ／　ｃｍ２の範囲として
おくのが望ましい。膜を介して一方に導入される酸素水
溶液は、通常その力価が低下するまでは入れ替えや補給
の必要はなく、攪拌や循環の必要もない。反対側に導入
される基質相は膜の細孔により酵素と接触反応し、この
時接触時間を長くすれば合成率は高くなる。また酵素と
基質との接触面積を大きくすることにより上記接触時間
を短縮して合成率を向上させ得る。

更に本発明は、固定化酵素を用いて実施する方法をも包
含している。ここで用いられる固定化酵素とは、上述し
たリパーゼ又はコレステロールエステラーゼを適当な固
定化用担体に固定化させたものであり、その固定化方法
は、従来公知の各秒方法により行なうことができる。代
表的固定化方法としては、例えば包括固定化法、無別担
体共有結合法、有機担体共有結合法、物理的吸着法等を
例示できる。以下之等各方法につき詳述する。

包括固定化法は、公知の各種担体を用いて実施できる。

該担体としては、本反応に利用する基質が疎水性である
ため特にゲル内に基質が浸透しやずく疎水性物質に対す
る分配係数の大きい担体が好ましい。その例としては、
例えば下記式（１）に示されるＥＮＴＰ等の疎水性光硬
化性樹脂［Ｅ　ｕｒｏｐｅａｎ　Ｊ　、　Ａ　ｐｐｌｉ
、　Ｍ　１ｃｒｏｂｉｏｌ。

Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、、　５．３２５　（１９７９）
及び特開昭５７−１１８７９２号公報参照］や下記式（
２）で示されるウレタンプレポリマーｐｕ ［８１ｏｔｅｃｈｎｏ１．Ｂ　１ｏｅｎａ、、　２０．
１４６５−１４６９　（１９７８）及びＥｕｒ、　Ｊ、
　Ａｐｐｌｎ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、、　８
．１４３−１５５（１９７９）参照１等を例示できる。

該ＥＮＴＰ樹脂は分子内のプロピレンオキサイド含量を
、ｐｕ樹脂はＥ○／Ｐ○含旦を、各々変化させることに
より樹脂の疎水性度を任意に変化させ得る。

上記ＥＮＴＰ等の疎水性光硬化性樹脂を用いる包括固定
化は、例えばｍ長４０ｎｍのＥＮＴＰ−４０００に重合
開始剤を加え、約６０℃にて溶解し、室温まで温度を下
げた後、酵素を粉末形態で又は予めセライト、シリカ等
の多孔質無機担体に吸着させた形態で添加混合（このと
き、適宜界面活性剤等を添加することもできる）し、そ
の後、混合物をガラス又はプラスチックの透明板上に拡
げ、その上をプラスチックのシートでカバーした後、近
紫外の光を数分間照射してゲル化させ、得られるシート
状の固定化酵素を小さく切って目的とする固定化酵素剤
を収得できる。

ウレタンポリマーを用いる包括固定化は、例えばｐｕｓ
＋脂中でもより疎水性の強いＰｕ　−３（平均分子ｆｆ
１２５２９、ＮＣ○含ｍ４．２％、エチレンオキサイド
含量５７％、上記文献参照）を、約６０℃に加熱して流
動性が出たところで、３０℃に冷却し、流動性のある間
に酸素水溶液を加え、数分練り合せた後、４℃で約３０
分間反応させ、その接水で洗浄して未反応のＮＣ０Ｉを
除去した後、適当な大きさに切って目的固定化Ｍ素剤と
することができる。上記反応の際温度が３０℃を越える
と酵素の失活を招くことがあるので注意する必要がある
。

無機又は有機担体を用いた共有結合法に用いられる担体
としては、マイクロポーラスな多孔性を有し、その細孔
表面が疎水性であるものが好ましい。通常その細孔平均
半径は約１０人〜１０００人であるのがよい。上記マイ
クロポーラスとは、通常担体粒子１個当りの酵素結合面
積が多くなるようなものであれば、孔の形状が縦長で細
孔半径が求められないようなものでもかまわない。上記
担体の好ましい具体例としては、例えば無機担体として
ポーラスガラス、ポーラスセラミック、セライト、チタ
ン酸化物等の多孔性金属粒子、アルミナ、多孔性シリカ
ゲル、モレキュラーシーブ、活性炭、白土、カオリナイ
ト、ベントナイト、ヒドロキシアパタイト、リン酸カル
シウムゲル及び之等のアルキルアミン誘導体等、及び有
機担体として例えばマイクロポーラスなスチレンやアル
キルアミン等の重合体を母体とする吸着樹脂、キレート
樹脂、イオン交換樹脂等、例えば［ダウエックスＭＷＡ
−ＩＪ　　（平均細孔半径１５０人、粒子サイズ２０−
５０メツシユのポリスチレン鎖をジビニルベンゼンで架
橋した母体を持つ第３級アミンを交換基とする弱塩基性
陰イオン交換樹脂、ダウケミカル社製）、親水性セルロ
ース樹脂、例えば「セルロファインＧＣ７００−ｍ　Ｊ
　　（粒径４５−１０５μｍ１チツソ社製）等のセルロ
ース系担体の親水基をマスクして調製したもの等を例示
できる。

上記無機担体を用いた共有結合法による酵素の固定化は
、例えば次のごとくして実施できる。即ち、上記例示の
無目担体のアルキルアミン誘導体を調製し、該担体の細
孔表面の疎水性度を高めた後、ゲルタールアルデヒド法
又はカルボジイミド法により酵素を固定化すればよい［
Ｈ，Ｈ。

Ｗｅｅｔａｌｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌＯｇＶ　、　４４゜１３４−１４８　（１９７
６）参照］。

また上記有機担体を用いた共有結合法は、疎水性の多孔
質樹脂の場合は、そのままこれに酵素を吸着させた後、
上記と同様にゲルタールアルデヒド法により固定化する
ことができるｆ　Ｒｅｖ。

Ｆｅｒｍｅｎｔ、　　Ｉ　ｎｄ、　Ａ　ｌｉｍｅｎｔ、
　　１１　、２３７（１９５６）参照］。より詳しくは
、例えばダウエックスＭＷＡ−１の１ｇを蒸留水及び１
／１５Ｍのマツクベインバツファ（ｏ　Ｈ５，０）で洗
浄後、酵素液０．２鵬（１５００Ｕ）を加え、８℃で一
夜振盪吸着させ、マツクルベインバッファ１ｍＱ及び２
５％ゲルタールアルデヒド溶液８０μＱをＩ）口え、８
°Ｃで１０分間振盪し、イオン交換樹脂に結合させ、最
後に２０％亜硫酸水素ナトリウムＯ１２醜を加えて、８
０℃で１０分間振盪し余分のゲルタールアルデヒドを除
去し、水で洗浄すればよい。

有機担体として、例えばセルロファインＧＣ７００−ｍ
等の親水性樹脂を用いる場合、固定化は、先ず上記樹脂
の表面に存在する親水性の水酸基をエポキシ化し、次に
このエポキシ化されたセルロファインをエチレンジアミ
ンでアミン化した後、ゲルタールアルデヒドで処理して
アルデヒド化セルロファインを調製し、これをリン酸バ
ッファ中で酵素と反応させることにより実施できる。

物理的吸着法は、担体として例えば親水性のアガロース
ゲル等の多糖類にアルキル基、フェニル基、トリチル基
等の疎水基を導入し、細孔表面を疎水性とした担体、具
体的には［オクチルセファロースＣＬ−４ＢＪ、［フェ
ニルセファロース０Ｌ−４ＢＪ　　（いずれもファルマ
シア社製）、ｉ〜リチルアガロースゲル算の有機担体や
ポーラスガラス、ポーラスセラミック、セライト、チタ
ン酸化物等の多孔性金属粒子、アルミナ、多孔性シリカ
ゲル、モレキュラーシーブ、活性炭、白土、カオリナイ
ト、ベントナイト、ヒドロキシアパタイト、リン酸カル
シウムゲル及び之等のアルキルアミン誘導体等の無機担
体を用いて実施される。上記有機担体における疎水性度
は水相性のない非極性のアルキル基等を多くするか、水
酸基等の水相性の親水基をアルキル基等で修飾すること
により増加させ得る。

上記有機担体を用いた物理的吸着法は、例えば担体をリ
ン酸バッファー等でよく洗浄した後、酵素水溶液とｔｇ
ｍしてこれに酵素を吸着させて調製できる。この物理的
吸着法によれば、共有結合法に比べ固定化時の酵素の活
性低下が少なく、しかも担体は親水性ゲルに疎水性のリ
ガントが付いたものであるため酵素の活性発現に必要な
充分量の水を保有、供給でき、更に疎水性の基質との親
和性も疎水基の導入により高められているため、本発明
方法に特に適している。

更に無機担体を利用する物理的吸着法は、単に担体と酵
素水溶液とを振盪するのみで実施でき、最も簡便で且つ
安価な固定化法であり、固定化時の活性低下も少なく、
物理的及び化学的にも安定なものである。

上記各種方法により固定化された固定化酵素を用いる本
発明方法は、これを半連続法で実施する場合には、例え
ば適当な反応容器に固定化酵素と基質とを入れ、非水系
、水媒系又は水−布間溶媒２相系で基質と酵素との接触
反応を行ない、次いで反応混合物より固定化酵素を通常
の方法、例えば濾過、遠心分離等により分離し、これを
再度基質と酵素との反応に繰返し利用する。上記接触反
応は、固定化酵素を物理的に破壊しない適当な条件下、
例えば擾虎条件又は通液条件下に実施できる。固定化酵
素を分離した反応混合物からの目的エステルの収得は、
前述した相分離を利用する方法と同様にして行なうこと
ができる。

また上記固定化酵素を用いる連続法は、例えば固定化酵
素を適当なカラムに充填し、このカラムに基質を連続的
に通過させて接触反応させ、目的エステル又はこれと未
反応基質とを連続的に回収し、これから目的エステルを
分濯収得することにより実施される。上記半連続法及び
連続法のいずれも固定化酵素の回収は容易で、目的エス
テルの精製段階での酵素蛋白の除去の必要はなく、しか
も回収した酵素は反復使用できる利点がある。加えて、
連続法では反応中、空気と接触することが少ないので基
質として不飽和脂肪酸等を用いる場合にもこれが空気酸
化をうけないという利点がある。

上記各種の方法により得られる目的エステルは、常法に
従い例えばカラムクロマトグラフィー等により更に精製
することができる。

かくして得られる目的エステル、例えばステロール脂肪
酸エステルは、この種エステルが従来利用されている各
種の広範な用途に利用できる。

実　　　施　　　例 以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる
。

尚、各側において酵素旦の表示は、以下に示す方法によ
り求められた国際単位を用いた。

〈リパーゼの活性測定〉 ポリビニルアルコールの溶液（［ポバール＃１１７Ｊ（
倉敷レーヨン社製）１８ｇと［ポバール＃２０５Ｊ　　
（同上社１７）　２ａ　トラ水８００ｍＱに懸濁し、７
５〜８０℃に加温撹拌して完全に溶かした後、冷却し、
これに水を加えて１０００ｍＱとしたもの）７５鵬に、
オリーブ油２２．９（＋をホモジナイザーにて乳化して
調製したオリーブ油乳化液５鵬と０．１Ｍリン酸緩衝液
４ｍとの混液に、試料酵素液１−を加え、マグネチツク
スタラ−Ｆ　５００　ｒｌ）ＩＩＩで撹拌しつつ３７℃
で２０分間反応させ、次いでこれにエチルアルコール４
０戒を注加して、０．０５Ｍ水酸化カリウム溶液で遊離
脂肪酸を滴定する。この条件で１分間に１μモル当量の
脂肪酸を遊離する酵素υを１国際単位（Ｕ）とする。

〈コレステロールエステラーゼの活性測定〉コレステロ
ールエステラーゼの１単位〈１Ｕ）とは、子牛血清を基
質として３７℃で１分間に１μモルのコレステロールを
遊離させる活性であり、以下の反応液、酵素溶液を用い
て遊離コレステロールをコレステロールオキシダーゼで
酸化し、生成する過酸化水素をパーオキシダーゼで比色
窓ｍすることにより求められる。

反応液組成 ｏＱ、２Ｍ！Ｊ：／酸緩衝液（ｐ　Ｈ６，５）　　０．
６ｍＱＯパーオキシダーゼ〔シグマケミカル 社製、タイプｌｌＮｏ、Ｐ−８２５０）　　　　０．３
ｍｉｌｌｏＱ、３５％４−アミノアンチピリン 水溶液　　　　　　　　　　　　　　０．３鵬ＣＩ０．
２Ｗ／Ｗ％フェノール水溶液　　０．３ｍ１２０コレス
テロールオキシダーゼ水溶液 〔東洋醸造社製、プロダクトＮｏ、Ｔ−０４を０．１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７，０，０，０５Ｗ／ｖ％のトリト
ンＸ−１００を含む）でＩＯＵ／ｍＱとする）　　　　
０．６ｍｆ２０子牛血清〔グランド　アイランド バイオロジカル（ＵＳＡ）社製〕　　０．３鵬０蒸　　
　　　留　　　　　水　　　　　　　　　　　　　０．
３−試料酵素溶液としては、酵素を１０ｍＭリン酸緩衝
液（ＥＩＨ７，５，０，１％アルブミンを含む）に溶か
して約ＩＵ／ｍ１２に調製して用いる。上記反応液３ｍ
２を比色用セルに入れ、３７℃で１０分間インキュベー
トし、０．０５−の試料酵素溶液を加え、静かに転倒混
合し、４９３　ｎｍで経時測定を行ない、吸収の増加率
（ΔＡｓ／分）を測定する。

同じことを試料酵素溶液の代りに、希釈用緩衝液を用い
て行ない増加率（ΔＡｂ／分）を求める。

上記吸収増加率の差（ΔＡ／分＝ΔＡｓ−ΔＡｂ）が０
．０５以下の時は、これが０．０５以上になるまで試料
酵素溶液の濃度を高くして操作を繰返す。酵素活性（Ｕ
／ＩＩＩ（１）は、次式により算出される。

酵素活性（Ｕ／ｎ＋ｏ）＝ また目的エステルの合成率は、次の方法により算出した
。即ち、反応終了後、反応液を水−有機溶媒２相系に転
換し、有機溶媒相を分離する。この有機溶媒相の濃度を
適当に調整後、クロマロッド（石英ロッドにシリカゲル
を溶着したもの、ヤトロン社製、クロマロッド５ＩＮ）
に脂質分として２０〜４０μｇ程度チャージし、目的エ
ステルと未反応基質が分離する適当な条件（例えばヘキ
サン／エーテル／蟻酸＝５６／１４１０．３）で展開す
る。展開後、数分乾燥し、展開溶媒を除去したクロマロ
ッドをイアトロスキャンＴＨ−１０（ヤトロン社製、Ｆ
ＩＤ水素炎イオン化方式）検出器にかけて、反応液中の
脂質成分のピーク面積を求める。この面積をもとに、次
式により目的エステルの合成率を算出する。

目的エステルビーク面積×１００ 合成率（％）−第１成分ピーク面積十 目的エステルビーク面積 但し第１成分とは、反応基質として仕込んだ両基質のう
ちの小モル数の成分を意味する。例えばアルコール１モ
ルに対して脂肪酸を３モル仕込んだ場合は、アルコール
が第１成分となる。上式によれば、小モル数の成分が反
応液中より消失した時点で、大過剰に仕込まれた成分が
残存していても、合成率は１００％となる。

各個では、特に断わらない限り、反応液の撹拌混合は、
２０　ｗａｘ　３００　ｃｐｓの振掃培ｉ！ＩＮ（いわ
しや生物科学社製、ＲＭＲ−８−２０）にて行ない、ま
た有機溶媒は水飽和のものを使用した。

実施例１ コレステロール０．１ｑ、オレイン酸０．２２９、イソ
オクタン８鵬、水８−及びキャンデイダ・シリントラシ
ア由来のリパーゼ（リパーゼＭＹ、２糖産業社製＞５０
０Ｕからなる反応液を３７℃にて３時間混合反応させた
後、上層よりサンプリングし、コレステロールオレイン
酸エステル合成率を測定する。

その後、静置し上層のイソオクタン層を水との界面部分
を残してとり除いた後、更にイソオクタン５纜を加え、
混合後、静置して再びイソオクタン層を除去し、界面部
分に残っている未反応基質及び反応生成物を洗浄除去す
る。上記洗浄操作を合計５回繰返した後、再度酵素を含
む水層にコレステロール０．１！＋、オレイン酸０．２
２ｇ及びイソオクタン８−を添加して３時間反応させる
。

上記のように、反応後リパーゼを含む水層及び界面層を
残して、上層の基質及び反応生成物を含むイソオクタン
層を取り、その後、新たに基質及びイソオクタンを加え
るという操作を繰返して本発明を実施した。

その結果を第１図に示す。第１図は縦軸にエステル合成
率（％）を、横軸に第１回目の反応開始時をゼロタイム
とする経過時間（ｈｒ）をとり、基質を新たに交換して
３時間反応させた時のエステル合成率を、基質交換時の
経過時間に対してプロットしたものである。なお、エス
テル合成率測定後、新たに基質を交換するまでは反応液
は酵素と基質とか混合接触された状懇のままに保持した
。

第１図より、３７°Ｃで１３０時間は、エステル合成率
が９０％以上を保持し、従って少なくとも１４回（１回
の合成反応を３時間サイクルで繰返すとすると約４３回
）の繰返し反復合成反応によっても酵素は何ら活性を失
わないことが判る。

実施例２ 実施例１において、反応液の組成をコレステロールｏ、
ｉｇ、オレイン酸０．２２０、イソオクタン２鵬、水８
鶴及びリパーゼＭＹ５００Ｕ（１６，７ｍ０）に変更し
た以外は、同様にして反応を行なった。

結果を第１図と同様にして第２図に示した。

第２図より、この例では、３７℃で１３０　Ｒ間前後迄
は３時間反応の繰返しで合成率９４％を保持し、約２８
回の反復合成反応が可能で、有別溶媒相の交換による酵
素の損失はないことが判る。

実施例３ コレステロール０．１ｇ及びオレイン酸０．２２ｇを用
い、これにリパーゼＭＹ５００Ｕ（１６，７ｍａ）の水
溶液０．５−を作用させると時、水を０．５〜１０．０
ｍｆ２の間で適宜添加した系でそれぞれ１８時間反応さ
せた。

反応後、反応液にイソオクタン１０ｍＱを加え、混合静
置して界面部分を残して上層のイソオクタン層をとり除
き、下層の酵素液に析だにコレステロール０．１ｇ及び
オレインｔｉｏ、２２ｇを加えて再度１８時間反応を行
なわせる操作を合ｆｆｔ　３回繰返した。

結果を下記第１表に示す。

第１表 試験　添加水母　　エステル合ｌｉ率（％）ＮＯｏ（噌
）　　　１回目　２回目　３回目１　　０　　　８７．
５　　８６．８　　８１．０２　　０．５　　　９７，
６　　９７，３　　９７．４３　　１．０　　　９７，
４　　９７．４　　９７．３４　　２．０　　　９８，
２　　９８，０　　９７．９５　　４．０　　　９７，
４　　９７．０　　９６，８６　　６．０　　　９６．
９　　９６．８　　９６．９７　１０．０　　　９２．
７　　９２．０　　９２．０この例は水系で反応させた
後、水−イソオクタン系に転換し、酵素を分離後、水媒
系で再使用したものであり、上記第１表より、反応系に
水が多量にあっても、反応の平衡は合成の方に進むこと
、反応後、水−有別溶媒２相系に転換することにより容
易に酵素の分離ができ、しがもこの分離された酵素は失
活がなく繰返し使用できることが明らかである。またこ
の結果より、系内にオレイン酸に未溶解のコレステロー
ルが存在していても合成反応は充分に進行することが判
る。

実施例４ コレステロール０．１ｇに対して、各種脂肪酸の０．２
２Ｊ、リパーゼＭＹ５００ｔＪ　（１６，７ｍｏ）及び
イソオクタン１０鵬となる反応系で、１８時間反応を行
ない、反応後、水３鵬を添加混合して水−イソオクタン
２相系として相分離を行なわせ、界面部分を残してイソ
オクタン層を除去し、残った酵素水溶液に再度コレステ
ロール０．１ｑ、各種脂肪８０．２２ｇ及びイソオクタ
ン１０ｄからなる基質溶液を加え、１８時間反応させた
。

上記操作を合計３回繰返した結果を下記第２表に示す。

第　　２　　表 試験　　脂肪酸　　　　エステル合成率（％）Ｎｏ、　
　　　　　　　　１回目　２回目　３回目１　オレイン
酸　　９８．９　　９８．６　　９８．７２　パルミチ
ン酸　９９，０　　９８．８　　９８．８３　　’：）
、テア　’）　ンＭ　　９８．５　　９８．０　　９８
．４この例は、非水系で反応後、水−有機溶！２相系と
して酵素を分離後、再使用したものであり、上記第２表
より、反応は系内に水を添加せずども容易に進行し、反
応後、水を加えて反応液を水−有医溶媒２相系に転換す
ることにより、容易に相分離がおこり、これにより酵素
を分離回収、再使用できることが判る。

実施例５ 実施例４において、１回目の反応終了後、水３話を加え
る代りに反応液をそのまま０．４５μｍのテフロンメン
ブランフィルタ−にて濾過した。

用いたリパーゼＭＹ（粉末）は、溶けずに反応容器壁に
付着したりブロックを作っていたが、イソオクタン１０
ｍ１で２回反応容器ごと洗浄濾過することにより回収で
きた。

同じ反応容器に、メンブランフィルタ−ごと回収した酵
素を移し、これに実施例４で用いた基質溶液を加え、再
度１８時間反応させ、この操作を３回繰返した。結果を
下記第３表に示す。

第　　３　　表 試験　　脂肪酸　　　　エステル合成ｆ！（％）ＮＯ９
１回目　２回目　３回目 １　オレイン酸　　９８，９　　９８，５　　９８．３
２　パルミチン酸　９９，０　　９８，７　　９８．９
３　ステアリン酸　９８，５　　９７．８　　９８．０
この例は、酵素をメンブランフィルタ−で分離後、再使
用したものであり、第３表より非水系でも、分散してい
る酵素を濾過により回収、再使用できることが判る。

実施例６ コレステロール０．１ｇ、オレイン酸０．２２Ｑ及びイ
ソオクタン１０噌からなる基質溶液に、リパーゼＭＹ５
００Ｕ　（１６，７ｍｑ）　を粉；ｌ）まま添加し、３
７℃で１８時間反応させた。反応液を８０００ｒｐｍｘ
１０分間遠心分離して懸濁していた酵素粒子を沈降分離
し、上澄をデカンテーションして除去後、酵素粒子を元
の反応容器に戻し、新たな基質溶液を加えて再び合成反
応を繰返した。

上記合成反応を合計３回繰返した結果、合成率は第１回
目９８．５％、第２回目９７．３％及び第３回目９６．
−８％であった。

この例は、非水系で合成反応を行ない、反応液より酵素
を遠心分離により分離し、再使用したものであり、反応
系に懸濁している酵素は、遠心分離により分離回収、再
使用できることが判る。

実施例７ コレステロールｏ、ｉｏ、α−ヒドロキシパルミチン酸
０．２（ｌ及びイソオクタン２ｍ１２からなる基質溶液
に、リパーゼＭＹ１００ＯＵ　（３３，３ｍｇ）を水８
鵬に溶かした酵素水溶液を加え、３７℃で７２時間反応
させた。反応後、反応液をポリプロピレン製疎水性多孔
質膜「ジュラガード＃２４００Ｊ　　（空孔率３８％、
最大孔径０．０２ＸＯ１２μｍ、臨界表面張力３５ダイ
ン／ａｍ、ポリプラスチック社製）を用いて、乳化した
上層部分を少しづつ濾過した。酵素水溶液は、表面張力
が上記膜の臨界表面張力より大きいため該膜の表面を濡
らすことができず、膜表面に存在する微細孔を通過でき
ないが、イソオクタンはこの微細孔を透過した。

透過しなかった酵素水溶液を反応容器に戻し、これに新
たに上記と同一の基質溶液を加えて再び７２時間反応さ
せた。

上記第１回目の反応の合成率は７３．２％及び第２回目
の反応の合成率は６９．５％であった。

上記例は、水−有機溶媒２相系で反応させ、反応液を疎
水性多孔質膜で濾過して選択的に石門溶媒を透過させた
ちのであり、少し乳化した反応液からの酵素水溶の分離
は、膜の表面張力による選択的透過性を利用しても実施
できることが判る。

実施例８ 第４表に示すアルコール成分（使用ｆｆ１ｏ、　ｌｑ　
）と共に、脂肪酸及び酵素のそれぞれ所定量を用い、同
表に示す反応系及び反応時間を採用し、実施例１と同様
にして酵素水溶液と目的エステル及び未反応基質を含む
有機溶媒相との分離を行ない、酵素を反復使用した合成
反応を繰返した。結果を第４表に併記する。

但し第４表における各試薬の略号は次の通りである。

〈酵　　素〉 Ｅ−１・・・リパーゼＭＹ（８糖産業社製、キャンディ
ダ　シリントラシア由来） Ｅ−２・・・リパーゼＴ−０１（東洋醸造社製、クロモ
バクテリウム　ビスコサム由来） Ｅ−３・・・リパーゼ「アマノＡＪ　　（天野製桑社製
、アスペルギルス属由来） Ｅ−４・・・リパーゼ「アマノＪＰ（同上社製、シュー
トモカス属由来） Ｅ−５・・・コレステロールエステラーゼＴ−１８（東
洋醸造社製） 〈アルコール成分〉 Ａ−１・・・コレステロール Ａ−２・・・β−シトステロール Ａ−３・・・スティグマステロール Ａ−４・・・β−コレスタノール △−５・・・エルゴステロール Ａ−６・・・イソコレステロール Ａ−７・・・ミリスチルアルコール Ａ−８・・・ステアリルアルコール Ａ−９・・・オレイルアルコール Ａ−１０・・・イソトリデシルアルコール（クラレ社製
） Ａ−１１・・・エヌジエコール２００Ａ　（新日本理化
社製） 八−１２・・・ラノリンアルコールＨ１−１（吉川製油
社製） 〈脂肪酸〉 Ｂ−１・・・オレイン酸 Ｂ−２・・・パルミチン酸 Ｂ−３・・・ステアリン酸 ３−４・・・リノール酸 Ｂ−５・・・カプリン酸 Ｂ−６・・・イソステアリンＭ（エメリー社製）Ｂ−７
・・・ラノリン脂肪酸（古川製油社製）Ｂ−ａ・・・Ｆ
ＡＩＰ（オレイン酸、リノール酸を主とするトール油脂
肪酸、播磨化成社製）３−９・・・プロピオン酸 く有機溶媒〉 Ｓ−１・・・ｎ−オクタン Ｓ−２・・・イソオクタン Ｓ−３・・・シクロヘキサン Ｓ−４・・・ｎ−ヘキサデカン Ｓ−５・・・［アイビーソルベント１０１６Ｊ（出光石
油化学社製、Ｃ３＝６３％、Ｃ９＝ ３０％を主成分とするイソパラフィン系混合溶媒） Ｓ−６・・・［アイソパーＥＪ　　（エクソン化学社製
、Ｃ３＝２５〜３５％、Ｃ９＝７５〜６０％を主成分と
するイソパラフィン系混合溶媒） ＰＢ７・・・０．０５Ｍリン酸バッファ（１）Ｈ７，０
） 第４表より、水−有機溶媒２相系において各種のアルコ
ール、脂肪酸、酵素及び有機溶媒のいずれの組合せにお
いても、酵素の分離及び反復使用が可能であり、しかも
反復使用による酵素損失が殆んど見られないことが判る
。

実施例９ 内径２ＣＩ、長さ２ｍのガラスカラム（Ｇ）、ポンプ（
Ｐｌ）及び受器（Ｔ１）を備えた第３図に示すフローチ
ャートの連続反応装置を用いて、そのカラム（Ｇ２）部
にリパーゼＭＹ１２５Ｕ／ｍ１２の０．０５Ｍリン酸バ
ッファ（ｐ　Ｈ７，０＞水溶液６００ｍｆ２を満たし、
受器（Ｔ１）よりコレステロール−オレイン酸−イソオ
クタン＝２．５ｇ／２．５ｇ／２５０１ＴＩＩ２の基質
溶液を、ポンプ（Ｐｌ）を用イテ、９．５ｍＱ／ｈｒの
速度でカラム（Ｇ）の下部ノズル（Ｎ１）を通じて小粒
径油滴として酵素水溶液層（Ｇ２）部に導入した。

導入された小粒径油滴は噴出された勢いと浮力とにより
酵素水溶液中を上昇しながら反応してガラスカラムの（
Ｇ１）部に反応生成物を含むイソオクタン層として分離
される。

このイソオクタン層を、ノズル（Ｎ２）よりオーバーフ
ローさせ、受器（Ｔ１）を経由してポンプ（Ｐｌ）より
再び酵素水溶液層（Ｇ２）部に供給した。

この様にして、基質溶液を酵素水溶液中に繰返し循環反
応させ、その時のエステル合成率の経時変化を測定した
結果を第４図に示す。−第４図は縦軸に合成率（％）を
、横軸に循環時間（ｈｒ）をとり、受器（Ｔ１）に流入
する反応溶液を経時的にナンブリングしてその合成率を
測定し循環時間に対してプロットしたものである。

第４図より、合成は約４時間で９５％となり、はぼ平衡
に達することが判る。カラムへの供給速度が９．５ｍ＋
２／分であるから２５０戒の基質全体が１回酵素水溶液
に接触するには約２６．３分を要し、約９回循環させれ
ば反応は平衡になることが判る。但しこの回数は酵素水
溶液中を基質が上昇する間での液滴の生成、消滅、滞留
時間等により当然変化し、この回数は、カラムの充填物
、邪魔板、撹拌等により変化させることができる。

実施例１０ 内径２ＣＩ１１．長さ２ｍのガラスカラム（Ｇ）、ポン
プ（Ｐｌ、Ｐ２、Ｐ３）、分配器（Ｂ）、オートサンプ
ラー（Ａ）、受器（Ｔ１）、混合器（Ｔ２）、原料タン
ク（Ｔ３）、反応液タンク（Ｔ４）及び反応停止液入試
験管〈Ｔ５）を備えた第５図に示すフローチャートの連
続反応Ｂ置を用いて、そのカラム（Ｇ２）部にリパーゼ
ＭＹ１２５Ｕ／鵬のリン酸バッファ（ｐＨ７，０）水溶
液６００鴫を満たし、コレステロール−オレイン酸−イ
ソオクタン＝２（＋　／３ｇ／６００−の基質溶液を、
ポンプ（Ｐｌ）を用いて、１５．５ｍ＋２／ｈｒの速度
でカラムの下部ノズル（Ｎ１）より小粒径油滴として酵
素水溶液層（Ｇ２）部に導入した。

導入された小粒径油滴は噴出された勢いと浮力とにより
酵素水溶液中を上昇しながら反応してガラスカラムの（
Ｇ１）部に反応生成物を含むイソオクタン層として分離
される。このイソオクタン層を、ノズル（Ｎ２）よりオ
ーバーフローさせ、受器（Ｔ１）に一時的に貯留させ、
その１部をポンプ（Ｐ２）により分配器（Ｂ）を経て、
０．２５鮫／分の速度で反応液タンク（Ｔ４）へ連続的
に扱き出す。

また受器（Ｔ１）よりオーバーフローしたイソオクタン
溶液は、混合タンク（Ｔ２）に入れ、そこで原料タンク
（Ｔ３）からポンプ（Ｐ３）にて０．２５＋ｎｉ２／分
の速度で供給された上記と同一組成の新しい基質溶液と
混合させ、この混合された基質溶液は、ポンプ（Ｐｌ）
より１５．５ｍ１２／分の速度で再度ノズル（Ｎ１）を
通してガラスカラムのＧ２部に供給する。

オートサンプラー（Ａ）は、分配器（Ｂ）より３時間毎
に反応液を抜ぎ出し、これを反応停止液（アセトン／エ
タノール＝１／１）の入った試験管（Ｔ５）にサンプリ
ングする。

この様にして、基質溶液を酵素水溶液中に繰返し循環反
応させ、オートサンプラー（Ａ）により３時間毎にサン
プリングした反応液におけるエステル合成率を測定した
結果を第６図に示す。

第６図は縦軸に合成率（％）を、横軸に反応開始ゼロタ
イムからの時間（ｈｒ）をとり、合成率を時間に対して
プロットしたものである。

なお、反応開始後２時間前後ではカラム上部（Ｇ１）の
イソオクタン層は乳化するが、反応の進行と共に分離し
始め５時間前後で完全に分離する。

第６図より、第５図に示す簡単なスプレー塔でも水−石
門溶媒系の反応系を採用すれば、乳化も起らず、酵素を
繰返し使用して連続的に目的エステルを合成でき、しか
も１５０時間以上も酵素の交換及び補給を行なうことな
く、９５％以上の合成率を維持できることが判る。

実施例１１ ポリプロピレン製の疎水性膜（［ジュラガード２５００
Ｊ　、ポリプラスチック社製、厚さ２５μｍ、平均細孔
０．１μ１１最大孔径０．０４ＸＯ，４μｍ、空孔率４
５％、有効面積（これは膜面積より膜の取付のために塞
がれた部分を除いた面積をいう）９．６０ｍ２）により
容器を上下に仕切り、該膜の下側部屋（体積５０ＣＩ０
３）にリパーゼＭＹ６２．５Ｕ／閾の水溶液５Ｑｃｍ３
を満たし、また該部屋に接続した連通管にも同酵素水溶
液を入れその液面を膜面よりも２０ｃｍ高くなるように
した。

上記容器の上側部屋にコレステロール０．０２σ、オレ
イン１０．０４４（＋及びイソオクタン１０鵬からなる
基質溶液を入れ、容器全体を振幅６ＣＩＩ１１振盪数１
２０ｃｐｍの振盪器にかけ、３７℃で反応を行なった。

１８時間反応後の合成率は９４，６％であり、反応系は
乳化せず、基質相への水の侵入も見られなかった。

以上のように多孔質の反応膜を介して酵素と基質とを接
触反応させる上記方法によれば、酵素水溶液は表面張力
が人前いため疎水性膜を濡らすことかでず線膜に存在す
る微細孔を通過できず、疎水性の基質とは混合されない
が、疎水性基質は疎水性膜の微細孔を透過して膜の下側
で該疎水性界面に吸着している酵素と接触反応するので
、反応時間は酵素と基質との接触頻度が大きくなれば短
くなる。従って上記の如き平膜型からクレープ型、スパ
イラル型、チューブラ−型、ホロファイバー型等に代え
れば反応時間はより短縮される。

実施例１２ 実施例１１において用いたＦジュラガード２５００Ｊに
代え、表面処理を施して親水性とした「ジュラガード３
５０１Ｊ　　（同上社製、厚み、孔径及び空孔率は同じ
）を用い、線膜の上下各部屋に同様に各々酵素水溶液及
び基質溶液を入れた。

但し連通管の液面は膜面と同じ高さとした。

実施例１１と同様の反応を１８時間行なった結果、反応
系は乳化せず、合成率は９２．０％であった。

この例のように親水性の膜を用いると、５？素水溶液は
膜の微細孔を浸透して膜の上側で基質と接触反応する。

実施例１３ 実施例１１において、膜として第５表に示す４種の膜を
用い、膜下側部屋の体積を４　ａｍ３として、同条件下
に反応を行なった。その結果を下記第５表に併記する。

第　　５　　表 試験Ｎｏ、　　　　、１　　　２　　　３　　　４膜の
材質　　　再生セル　テフ　ニトロセ　同左ロース　　
ロン　ルロース 平均孔径 ＜μｍ　）　　　　０．４５　　　０，５　０．４５　
　３．０連通管との膜 との水位差　　　０　　　　３０００ 反応時間 （ｈｒ）　　　　　　１２０　　　２３　　２３　　　
２３合成率（％）　　　６３，２　　８０，７　　７０
，２　　８５．ＩＩ乳化の有無　　　なし　　なし　　
なし　　なし第５表より、いずれの膜を用いる場合も合
成反応は良好に進行し、しかも反応系の乳化はないこと
が判る。

実施例１４ 実施例１１に用いたと同一の膜（但し有効面積は１０２
ｃｍ２とした）を用い、該膜下側部屋体積を８２ｃｍ３
としてこれにリパーゼＭＹ６２．５１Ｊ／鵬の水溶液を
満たし、連通管の液面は膜面より４１　ａｍ高くし、ま
た該膜上側部屋にはコレステロール０．４Ｑ　、オレイ
ン酸０．８８ｏ及びイソオクタン４０−からなる基質溶
液を入れ、線膜の上にマグネチツクスターラーを載せ回
転させ、基質相を撹拌した。容器全体は３７℃の恒温室
内に置き、反応は２４時間行なった。

結果を下記第６表に示す。

第　　６　　表 試験　反応時　合成率　試験　反応時　合成率ＮＯ，間
（ｈｒ）　（％）　　Ｎｏ０間（ｈｒ）　（％）１　　
　１１０．０　　　２　　　２２２，８３　　　３　３
８．７　　　４　　　４　−５１．２５　　　５６１．
７　　　６　　　６７０．８７　　　７７７．０　　　
’８　　　８８？、５９　　　９　８７．０　　１０　
　１０　９０．０１１　　１６　９５．４　　１２　　
２４　９６．２上記実施例１１〜１４より、膜面積が大
きくなる程、多量の基質をほぼ同時間でほぼ同合成率を
もって合成反応させ得ること、即ち膜の有効面積が合成
率を左右する因子であることが判る。

実施例１５ 実施例１１に用いたと同一のｇ！（但し有効面積は１０
．３ｃｍ２とした）を用い、該膜下側部屋体積を４．１
ｃｍ３とし、これに各種濃度のリパーゼＭＹ水溶液を満
たし、連通管の液面を膜面より４１０ｍ高くして、同様
にして反応を行なった。

３時間後の合成率を下記第７表に示す。

第　　７　　表 試験　リパーゼ水溶液濃度　合成率 Ｎｏ、　　　　（Ｕ／ｍ１２）　　　　　（％）１　　
　　６００　　　　　’６４．８２　　　　３００　　
　　　６５．３ ３　　　　２００　　　　　６５．２ ４　　　　１００　　　　　６３．２ ５　　　　　６２．５　　　４６．４ 第７表より、酵素の親水性−疎水性界面への吸着は、２
００Ｕ／ｍＱの付近で飽和に達していると考えられる。

実施例１６ 酵素としてリパーゼＭＹの６００Ｕ／−水溶液を用い、
第８表に示す各アルコール成分（０，１ｇ）に対して各
脂肪酸及び有機溶媒を組合せた基質溶液を用いて、ジュ
ラガード　２５００を利用した適当な反応容器で３７℃
下に、所定時間反応を行なった。反応時間と共に得られ
た結果を第８表に併記する。尚、第８表における試薬の
記号は第４表と同じである。

笛　　ｎ　　男 上記実施例１１〜１６に示す方法においては、基質（溶
液）を膜で仕切られた一方側に連続的に一供給し、反応
液を連続的に抜き出せば、連続合成が可能であることが
判る。

実施例１７ 先ず、リパーゼＭＹを、次の■及び■の方法で固定化用
樹脂と混合して固定化させた。

■　光硬化性樹脂ＥＮＴＰ−４０００（関西ペイント社
製）１９にベンゾイルエチルエーテル１０ｍｇ及びソル
ビタンモノオレート４０ｍＧを加え、６０℃にて加熱混
合溶解後、空温まで冷却し、これに酵素２０００ＬＩ　
（６６，７ｍｇ）を粉体で加え、よく練り込んだ後、イ
ソオクタン２戒で樹脂を希釈し、７ｃｍｘ１０ｃｍｘＱ
、５ｍｍの大きさでシート状に拡げ、その上をポリエス
テルの透明シートでカバーした後、光照射（東芝ケミカ
ルランプ使用、３分間）して硬化させた。

硬化後、樹脂を４〜５ｍｍ角の大きさに切り固定化酵素
剤とした。

■　上記■の方法において、ソルビタンモノオレートを
用いることなく、且つイソオクタンに代えてベンゼン−
ヘプタン（１：１）を用いて、同様にした。

上記■及び■で得た各々の固定化酵素に、コレステロー
ル０．１ｏ、オレイン酸０．２２（］及びイソオクタン
１５戒からなる基質溶液に０．０５Ｍリン酸バッファ（
１１Ｈ７，Ｏ）３ｍ１２を加え、３７℃で３時間反応さ
せた。

反応後、反応液を濾過して固定化酵素を回収し、これに
新しい上記基質溶液を加えて再び反応をｉテなった。

上記反応を合計５回繰返した結果を下記第９表に示す。

第　　９　　表 試験　使用　　　合　　成　　　率　（％）ＮＯ８′ｆ
ＩＩ素　１回　２回　３回　４回　５回１　　■　９７
，７　９４．８　９６．５　９５．４　９６．８２　　
■　９６．５　９７．０　９６．３　９４．８　９５．
４実施例１８ リパーゼＭＹ１０００Ｕを予めセライト１００ｍｇ及び
水０．１ｍＧと混合して、セライトに吸着させた後、実
施例１７の■の方法に従い固定化酵素剤を調製した。

上記固定化酵素剤を用い、コレステロール０．１ａ、オ
レイン酸０．２？をイソオクタン５ｍ１２に溶かした基
質溶液、イソオクタン１０鵬及び０．０５Ｍリン酸バッ
ファ（ｐ　Ｈ７，０）３較を反応液として３７°Ｃで４
詩間反応させ、合成率を測定した。

その後、反応液を濾過し固定化酵素を分離し、これを再
度固定化酵素として同一反応に利用した。

上記反応操作を１日に３回繰返しく３回目は４時間後の
合成率のみ測定し、反応液は濾過せず固定化酵素を基質
及び目的エステルと共に系内に存在させておき、翌日濾
過し、新しい反応操作を繰返した）、継続して１０日間
反応を行なった。結果を第７図に示す。

第７図は縦軸にエステル合成率を、横軸に固定化酵素調
製後の時間をとり、基質を新しく交換して４時間後の合
成率をプロットしたものである。

線図より固定化酵素の利用によれば、１０日間以上も酵
素活性は持続し、繰返し反応が実施できることが明らか
である。

実施例１９ コレステロールエステラーゼＴ−１８（東洋醸造社１７
）　２０００Ｕ　（１９，０ｍｇ）を実施例１７の■の
方法で固定化して固定化酵素剤を調製した。

この固定化酵素剤にコレステロール０．１（１、オレイ
ン？ｉ！２０．２２（］及びイイソオフ２１１５ｍ２を
加え、３７℃で１時間反応させた。

反応後、反応液を濾過して固定化酵素を回収し、これを
用いて第１回目と同じ反応系で１２日間合計３６回反応
を繰返した。

３６回目の合成率は９３．５％であった。

実施例２０ 実施例１８の方法に従い、クロモバクテリウム・ビスコ
サム由来のリパーゼ（「リパーゼＴ−０１」、東洋醸造
社製）２０００Ｕ　（７，１ｍｇ）を固定化して固定化
酵素剤を調製した。

得られた各固定化酸素剤に、コレステロール０．１（１
、オレイン酸０．２２（１、イソオ、クタン１５噌から
なる基質溶液及び０．０５Ｍリン酸バッファ（ｐ　Ｈ７
，０）３ｍＱを加えて３７℃で４８時間反応させ、反応
後、反応液を濾過して固定化酵素を回収し、これを用い
て第１回目と同じ反応系で反応を３回繰返した。その結
果、３回目の合成率は８７．８％であった。

実施例２１ ＥＮＴＰ−４０００の１ｇ当り、リパーゼＭＹ２０００
Ｕを、実施例１７の■の方法で固定化して固定化酵素剤
を調製した。

上記固定化酵素剤の所定量を用い、第１０表に示す各ア
ルコール成分、脂肪酸及び有機溶媒を組合せて反応を行
ない、反応後、反応液を濾過して固定化酵素を回収し、
これを再度用いて第１回目と同じ反応系で反応を繰返し
た。

結果を下記第１０表に示す。

第１０表 但し、第１０表中、反応系における注１は、該反応系が
イソオクタン１５ｍ１２と０．０５Ｍリン酸バッファ（
ｐ）−１７，０）３１１１１２とを溶媒とする系である
ことを示す。

実施例２２ セライトＮ０．５４５＜ジョンズ　マンビレ　セールズ
社（Ｊｏｈｎｓ　　Ｍａｎｖｉｌｌｅ　　５ａｌｅｓ　
　Ｃｏ、）製）４０ｇを電気炉中で５００℃で２時間加
熱し活性化した。次に２％アミノプロピルトリエトキシ
シランアセトン溶液中に５０℃で２０時間浸漬した。浸
漬後、アセトン４００閾で洗浄し濾過してシラン化セラ
イトを得た。

該シラン化セライト２０ａを１％ゲルタールアルデヒド
水溶液に浸漬し、４℃で一夜反応させた後、０．１Ｍリ
ン酸バッファ（ｐ）−１７，０＞にてよく洗浄、濾過し
てアルデヒド化セライトを得た。

該アルデヒド化セライト１ｇに対して酵素１５００Ｕ、
０．１Ｍリン酸バッファ２較を加え、４℃で一夜固定化
した後、濾過してグルタルアルデヒド−セライト固定化
Ｖｆ索を得た。

一方上記シラン化セライト１ｇに対して酵素１５００Ｕ
、Ｏ，１Ｍリン酸バッファ（ｐＨ７，０）５ｍＱ、カル
ボジイミド試薬（１−シクロヘキシル−３−（モルホリ
ノエチル ミドメト−ｐ−１−ルエンスルホン酸）５０ｍｇを加え
、４℃で一夜反応後、水洗、濾過してカルボジイミド−
セライト固定化酵素を得た。

また上記において、セライトに代え多孔質ガラス（ＣＰ
ＧＯＯ５００，平均細孔半径２５７．５人、粒子サイズ
１２０〜２００メツシユ、エレクトロヌクレオニクス社
製）を用い、同様にして、グルタルアルデヒド−ガラス
固定化酵素及びカルボジイミド−ガラス固定化酵素を得
た。

尚、酵素としてはリパーゼＭＹを用いた。

上記で調製した各固定化酵素剤にコレステロール０．１
０、オレイン酸０．２２ｏ，イソオクタン２ｍＱ及び０
．０５Ｍリン酸バッファ８鵬を加えて１８時間反応させ
、反応後、反応液を濾過し、固定化酵素をケーキとして
回収し、濾紙と共に反応容器に戻し、再度上記反応系で
反応を繰返した。

この操作を合計３回行なった。３回目の合成率を下記第
１１表に示す。

第　　１　１　　表 試験　使　用　酵　素　剤　　３回目の合成率Ｎｏ．（
％） １　グルタルアルデヒド− セライト固定化酵素剤　　　９３．５ ２　カルボジイミド−セラ゛ イト固定化酵素剤　　　　　９４．８ ３　グルタルアルデヒド− ガラス固定化酸素剤　　　　９５．６ ４　カルボジイミド−ガラ ス固定化酵素剤　　　　　　９７．４ 実施例２３ 実施例２２において、酵素としてリパーゼＭＹに代えて
リバーぜＴ−０　１を用いて同様にして各固定化酵素剤
を得た。

得られた４種の固定化酵素剤用いて、同様の反応系で４
８時間反応を行なった。その結果、それぞれ９２．４％
、８８．９％、９４．５％及び９２、４％の合成率が得
られた。

実施例２４ 水で洗浄濾過した湿った状態のセルロファインＧＣ−７
００−ｍ　　（チッソ社製）７５ｑに、１Ｎ水酸化ナト
リウム水溶液を２１．６ｍ１２及びエピクロルヒドリン
１２戒を加え、３０℃で４時間緩かにＩｉｆｌして細孔
表面に存在する親水性の水酸基をエポキシ化した。蒸留
水５００−で洗浄したエポキシ化セルロファインをエチ
レンジアミン６、７−及び１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液
１．０５−と共に６０℃で２．５時間反応させ、水洗、
濾過した。吸引濾過して集めたエチレンジアミンセルロ
ファイン１ｇに０．１Ｍリン酸バッファ（ｐｌ」７　、
　Ｏ　）　１　０ｍＱ及’Ｏ’２　５％クル’２　　）
Ｌｉ７）Ｌｔ７’ヒト溶液１溶液１含ｉ２、室温で一夜
振盪した後、リン酸バッファで洗浄、濾過してアルデヒ
ド化セルロファインを得た。

上記で得たアルデヒド化セルロファインとリパーゼＭＹ
１　５００Ｕとを、リン酸バッファ中、室温で一夜反応
させ、セロファイン固定化リパーゼ製剤を得た。

上記固定化酵素剤にコレステロール０．１ｇ、オレイン
［０．２２（ｌ及びイソオクタン２閾からなる基質溶液
とリン酸バッファ８鵬とを加え、３７℃で１８時間反応
させた。反応後、反応液を濾過して回収した固定化酵素
剤に上記と同一の基質溶液を加えて、再度反応を行なっ
た。

この操作を３回繰返した結果、３回目の合成率は９４．
０％であった。

実施例２５ ダウエックスＭＷＡ−１の１９を蒸留水及び１／１５Ｍ
マツクベインバッファ（ｐ　Ｈ５．０＞で洗浄後、リパ
ーゼＭＹ（１５００Ｕ）水溶液０、２−を加え、８℃で
一夜振盪して吸着させ、マツクルベインバッファ１１Ｔ
ＩＩ２及び２５％ゲルタールアルデヒド溶液８０μＱを
加え、８℃で１０分間Ｉｍし、イオン交換樹脂に結合さ
せ、最後に２０％亜１Ｍ水素ナトリウム０．２鵬を加え
て、８０℃で１０分間ＩＩして余分のグルタールアルデ
ヒドを除去し、水洗して固定化酵素剤を調製した。

上記固定化酵素剤を、コレステロール０．１ｇ、オレイ
ン酸０．２２ｇ及びイソオクタン１５−からなる基質溶
液に加え、３７℃で１８時間反応さけ、反応後、反応液
を濾過して固定化酵素を回収し、これを用いて第１回目
と同じ反応系で反応を３回繰返した。

その結果３回目の合成率は９６．５％であった。

実施例２６ アガロースに疎水基であるオクチル基をつけ、疎水性度
を高めたオクチルセファロースＣＬ−４Ｂ（ファルマシ
ア社製）１ｇを、０．１Ｍリン酸バッファ（ｐＨ７，０
）にてよく洗浄後、濾過した。これニリバーｔ’ＭＹ３
０００Ｕを０．０５Ｍリン酸バッファ５１ＴＩＩ２に溶
がして加え、０℃にて１時間緩かに振盪して、酵素をオ
クチルセファロースに吸着させた。１時間後、リン酸バ
ッファ１１ＴＩＱで洗浄し、濾過したものを反応に用い
た。

反応は、反応時間を１６時間とした他は、実施例２５と
同様とした。

上記反応を４回繰返した結果、４回目の合成率は９４．
８％であった。

実施例２７ セライト１ｇにリパーゼＭＹ２０００Ｕ又はコレステロ
ールエステラーゼＴ−１８（東洋醸造社製）１００ＯＵ
とリン酸バッファ（ｐ　Ｈ７，０）５−とを加え、空温
で１時間振盪し吸着させた。

１時間後、セライトを濾過し、リン酸バッファ１−で洗
浄後、濾紙と共に反応容器に戻し固定化酵素として再使
用した。

反応時間を１８時間として実施例２５と同様の反応を５
回繰返した結果、５回目の合成率は固定化リパーゼＭＹ
を用いた場合では、９４．１％であり、固定化コレステ
ロールエステラーゼを用いた場合では９４．５％であっ
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１に従い本発明方法を実施したときのエ
ステル合成率の経時変化を示ずグラフ、第２図は実施例
２に従う同エステル合成率を示すグラフ、第３図は本発
明方法の実施に適した装置の一概略図、第４図は第３図
に示す装置を用いて実施した本発明方法におけるエステ
ル合成率を示すグラフ、第５図は本発明方法の実施に適
した装置の他の一概略図、第６図は第５図に示す装置を
用いて実施した本発明方法におけるエステル合成率を示
すグラフ、及び第７図は実施例１８に従い本発明方法を
実施したときのエステル合成率の経時変化を示すグラフ
である。 （以　上） 匍イ・ｌ＋１−３ 第３図 第４図 楯擢峙閉（ｈ「） 頑　ｄｉ、傾←　Ｘ φ＜＋＃と 手　　続　　補　　正　　店　（自発）昭和６０年９月
１８日 特許庁長官　宇　賀　道　部　殿 １　事件の表示 脂肪酸エステル類の製造法 ３　補正をする者 事件との関係　特許出願人 古川製油株式会社 ４　　代　　理　　人 大阪市東区平野町２の１０　沢の鶴ビル自　　　　発 ６　補正の対象 明細１中発明の詳細な説明の項及び図面補　　正　　の
　　内　　容 １　明細書第７頁第１１行に「シュードモナスエアルギ
ノーサ」とあるを「シュードモナス　エアルギノーサ」
と訂正する。 ２　明ｍｌ第８頁下から第２行に「エアルギノサ」とあ
るを「エアルギノーサ」と訂正する。 ３　明細書第２０頁下から第２行に「有機溶媒」とある
を「水不混和性有機溶媒Ｊと訂正する。 ４　明細書第３０頁第１０行に「実施される」とあるを
「、この方法は実施される」と訂正する。 ５　明細書第３３頁第１３行に「ポリカーボネート」と
あるを「ポリカーボネート」と訂正する。 ６　明細書第３４頁第９〜１０行に「ホローファイバー
」とあるを「ホロファイバー」と訂正する。 ７　明細書第３０頁第１３行、同頁第１９行及び第３８
頁第１４行（２ケ所）に各々ｒＰＩＪＪとあるをｒＰＵ
Ｊと訂正する。 ８　明細書第４１頁第７行に「マツクベイン」とあるを
「マツクルベイン」と訂正する。 ９　明細書第４３頁第２行に「バッファー」とあるを「
バッファ」と訂正する。 １０　明細書第４６頁第５行にｒＯ，０５Ｍ、＊酸化」
とあるをｒｏ、０５Ｎ水酸化」と訂正する。 １１　明細書第４８頁第６行以降に記載の式を次の通り
訂正する。 ［酵素活性（Ｕ／ｍｃ＋）＝ １２、ＯＸ　Ｏ０５０，０５酵素濃度（ｍｑ／ｍＱ）Ｊ
１２　明細書第５２頁第９行に「作用させると」とある
を「作用させる」と訂正する。 １３　明細書第５３頁下から第９行に「水系」とあるを
「水媒系」と訂正する。 １４　明細書第６１頁に記載の第４表中、試験Ｎ０１４
及び５の項の４回目及び５回目のｆｆ１ｌｌ（空白）に
夫々「−」を加入する。 １５　明細書第６６頁第１０行に「９．５鵬／　ｈｒＪ
とあるをｒ９．５ｍ１２／分」と訂正する。 １６　明細書第６８頁第８行にｒｌ　５．５ｍＱ／ｈｒ
Ｊとあるをｒｌ５．５ｍ１２／分」と訂正する。 １７　明細書第８４頁及び第８５頁に記載の第１０表中
の項目の欄に「脂肪酸く対アルコールモル）」とあるを
「脂肪酸（対アルコール、モル）」と訂正する。 １８　［第１図］、「第２図Ｊ及び［第７図Ｊを別紙添
附の通り訂正する。 （以　上） 手　　続　　補　　正　　書　（自発）昭和６１年６月
２日 特許庁長官　　　宇　　賀　　道　　部　　殿　　　　
　・〉ハ１　事件の表示 昭和６０年特許願第１９０５４３号 ２　発明の名称 脂肪酸エステル類の製造法 ３　補正をする者 事件との関係　特許出願人 吉川製油株式会社 ４　　代　　理　　人 大阪市東区平野町２の１０　沢の鶴ビル６　補正の対象 補　　正　　の　　内　　容 １　明ａ書第６頁第１５〜１６行に［トリグリセライド
を段階的に］とあるを「グリセライドを」と訂正する。 ２　明細書８頁第１７行に「起源微生物」とあるを「起
源としては、哺乳動物の各種組織、例えば膵臓、肝臓、
脳、副腎、翠丸、卵巣等の他、微生物」と訂正する。 ３　明細書９頁第６行に「シュードモナス属、」とある
を削除する。 ４　明１１Ｉ書第１１頁第１３行に「でもよい。」とあ
るを「でもよいが、炭素数１４〜３２の分校脂肪族プラ
イマリ−もしくはセカンダリー−アルコールであるのが
好ましい。」と訂正する。 ５　明１Ｂ書第１９頁第１６行にＥ等により」とあるを
「、選択的濾過等により」と訂正する。 ６　明１ｉｌｌ！第２２頁第２０行に「等を」とあるを
［等や両基質と酵素との接触性を高めるための、酵素阻
害のない界面活性剤、例えば［ツイーン８０Ｊ　（花王
アトラス社製）、「トリトン×１００Ｊ　　（ロームア
ンドハース社製）等を」と訂正する。 ７　明細書第６３頁第５行に「活性発現」とあ。 るを「合成活性発現」と訂正する。 ８　明ＩＨ１ｌｌ第３８頁第４行に「室温」とあるを「
４℃」と訂正する。 ９　明Ｉｌｌ書第３８頁第１７行に「６０℃」とあるを
「５０℃」と訂正する。 １０　明細書第３８頁第１９行に「３０分間」とあるを
「６０分１１１Ｊと訂正する。 １１　明細書第５２頁最下行に「に示す。」とあるを次
の通り訂正する。 ［に示す。 また、上記においてリパーゼＭＹ５００Ｕに代え、リパ
ーゼＯＦ（キャンディダ　シリントラシア由来、３６０
Ｕ／ＩＩＩ（７，８糖産業社製）１０００Ｕを用い、且
つ水の添加量を２制（一定）として、同様の反応操作を
繰返した。この結果を同様に第１表に試験Ｎ００８とし
て示す。」 １２　明ｗＪ書第５３頁に記載の第１表中、試験Ｎ０１
７の項の次に下記試験Ｎ０１８の項を追加する。 ｒ　　８　２，０　　　９７．４　　９７．２　　９７
．６　　Ｊ１３　明細書第６３頁第５行に「由来）」と
あるを［由来、３０Ｕ／Ｉｌ＋（＋）Ｊと訂正する。 １４　明細書第６３頁第７行に「由来）」とあるを［由
来、２８０Ｌｌ／ｍｇ）Ｊと訂正する。 １５　明細書第６３頁第１１に「由来）」とあるを「由
来、４ｔＪ／１１０）Ｊと訂正する。 １６　明細書第６３頁第１１行に［由来）Ｊとあるを［
由来、３０Ｕ／ｍｇ）Ｊと訂正する。 １７　明細書第６３頁第１３行に「社製）」とあるを「
社製、１０５　Ｕ／ｍｇ）　Ｊと訂正する。 １８　明ｉｉｍ！第８２頁第１６行に「であった。Ｊと
あるを次の通り訂正する。 「であった。 上記反応後、反応液を休日を除いて１日１回濾過して固
定化酵素を回収し、上記と同じ反応系で基質溶液を毎日
取り替えつつ、更に１２０日間に亘って同一反応を繰返
した。 最終日の反応開始５時間後の合成率は、９５．０％であ
った。」 （以　上）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）リパーゼ及びコレステロールエステラーゼから選
   択される酵素類又は固定化された上記酵素類を用いて、
   ステロール類及び／又は炭素数１４〜３２の脂肪族アル
   コール類と脂肪酸とを接触反応させて脂肪酸エステル類
   を製造する方法であつて、上記酵素類又は固定化酵素類
   を、反応混合物と分離するか分離することなく、繰返し
   利用することを特徴とする脂肪酸エステル類の連続的乃
   至半連続的製造方法。