FR2927820A1 - Procede pour separer une proteine fluorescente d'un echantillon contenant une pluralite de proteines. - Google Patents
Procede pour separer une proteine fluorescente d'un echantillon contenant une pluralite de proteines. Download PDFInfo
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Abstract
L'invention concerne un procédé pour séparer une protéine fluorescente d'un échantillon contenant une pluralité de protéines.Il comprend la préparation d'une solution d'échantillon, l'introduction de cette solution dans l'espace de remplissage (20) contenant un adsorbant (3) d'un appareil d'adsorption (1), l'introduction d'un tampon d'élution au phosphate pour obtenir un éluant contenant la protéine fluorescente, et le fractionnement de l'éluant déchargé en une portion contenant la protéine fluorescente et d'autres portions contenant les autres protéines.Application : séparation d'une grande quantité d'une protéine fluorescente de grande pureté d'un échantillon contenant une pluralité de protéines.
Description
La présente invention concerne un procédé de séparation, en particulier un procédé pour séparer une protéine fluorescente d'un échantillon contenant une pluralité de protéines.
Comme méthode pour détecter un objet à détecter avec une grande sensibilité en utilisant une réaction antigène-anticorps, une analyse par immunosorbant lié à une enzyme (ELISA) ou une analyse similaire est utilisée. Une telle analyse par immunosorbant lié à une enzyme utilise un réactif obtenu, par exemple, en préparant un anticorps qui peut être lié spécifiquement à un objet à détecter (c'est-à-dire un antigène) et en laissant une matière fluorescente servant de marqueur être fixée sur (ou liée à) l'anticorps.
Ces dernières années, l'utilisation de protéines fluorescentes (protéine fluorescente verte ; GFP) dérivées d'Aequorea coerulescens qui est un type de cnidaire, comme matières fluorescentes, a été envisagée. Par exemple, un procédé pour séparer une protéine fluorescente des fils formant un cocon de ver à soie en utilisant une colonne d'affinité pour le Ni est décrit dans l'article de M. Tomita et coll., Transgenic Res., 16, 449-465, 2007. Le procédé est mis en œuvre en transférant un acide nucléique comprenant un gène correspondant à la protéine fluorescente, à un acide nucléique du ver à soie pour parvenir ainsi à l'expression de la protéine fluorescente dans les fils formant le cocon de ver à soie. Cependant, puisqu'un adsorbant (agent de séparation) utilisé dans la colonne d'affinité pour le Ni est constitué de résines en tant que constituant principal de cet adsorbant, l'adsorbant remplissant une partie inférieure d'un espace de remplissage de la colonne d'affinité pour le Ni est déformé ou détruit sous l'action de son propre poids lors de l'utilisation répétée de l'adsorbant. En conséquence, il se pose un problème d'apparition d'une obturation dans la partie inférieure de l'espace de remplissage de la colonne d'affinité pour le Ni. Un tel problème devient prononcé dans le cas où les dimensions de la colonne sont augmentées pour séparer une grande quantité d'une protéine fluorescente en une seule fois. En outre, puisque le Ni, qui est un métal dangereux, remplit l'espace de remplissage de la colonne d'affinité pour le Ni, il n'est pas apprécié d'utiliser la colonne d'affinité pour le Ni afin de séparer la protéine fluorescente, du point de vue de l'environnement. Un objectif de la présente invention consiste à proposer un procédé de séparation permettant de séparer une grande quantité d'une protéine fluorescente d'un échantillon (solution d'échantillon) contenant une pluralité de protéines contenant la protéine fluorescente, avec une grande pureté par une opération simple. Cet objectif est atteint par les présentes inventions (1) à (14) décrites ci-dessous. (1) Un procédé pour séparer une protéine fluorescente d'un échantillon contenant une pluralité de protéines contenant la protéine fluorescente est proposé. Le procédé comprend les étapes consistant : à préparer une solution d'échantillon en ajoutant l'échantillon à un liquide ; à préparer un appareil d'adsorption comportant un espace de remplissage pour le remplissage avec un adsorbant ayant une surface, dans lequel au moins la surface de l'adsorbant est constituée d'un composé à base de phosphate de calcium et au moins une partie de l'espace de remplissage est remplie de l'adsorbant ; à introduire la solution d'échantillon dans l'espace de remplissage de l'appareil d'adsorption de telle sorte que la pluralité de protéines soit adsorbée par l'adsorbant ; à introduire un tampon d'élution au phosphate pour éluer la protéine fluorescente présente dans la pluralité de protéines de l'adsorbant dans l'espace de remplissage de l'appareil d'adsorption pour obtenir ainsi un éluant contenant la protéine fluorescente ; et à fractionner l'éluant qui est déchargé de l'espace de remplissage de l'appareil d'adsorption en une partie du tampon d'élution au phosphate contenant la protéine fluorescente et d'autres parties de celui-ci pour séparer ainsi la protéine fluorescente de la pluralité de protéines Suivant le procédé décrit ci-dessus, il est possible de séparer une grande quantité de la protéine fluorescente de l'échantillon (solution d'échantillon) contenant la pluralité de protéines contenant la protéine fluorescente, avec une grande pureté par une opération simple. (2) Dans le procédé décrit dans le paragraphe (1) précité, dans l'étape consistant à introduire le tampon d'élution au phosphate, le pH du tampon d'élution au phosphate est compris dans la plage de 6 à 8. Cela permet d'éviter à la protéine fluorescente qui est séparée d'être altérée et d'éviter une modification de la propriété de fluorescence de cette protéine. En outre, il est possible d'éviter de manière fiable à l'adsorbant d'être altéré (dissolution ou phénomène similaire), ce qui fait qu'il est possible d'éviter une modification de la capacité de séparation de l'adsorbant dans l'appareil d'adsorption. (3) Dans le procédé décrit dans le paragraphe (1) précité, dans l'étape d'introduction du tampon d'élution au phosphate, la température du tampon d'élution au phosphate est comprise dans l'intervalle de 30 à 50 °C.
Cela permet d'éviter une altération de la protéine fluorescente à séparer. (4) Dans le procédé décrit dans le paragraphe (1) précité, dans l'étape d'introduction du tampon d'élution au phosphate, la concentration en sel du tampon 35 d'élution au phosphate est égale ou inférieure à 500 mM.
Suivant le procédé décrit ci-dessus, il est possible d'éviter que la protéine fluorescente soit soumise à des effets néfastes par les ions métalliques présents dans le tampon d'élution au phosphate. (5) Dans le procédé décrit dans le paragraphe (1) précité, dans l'étape d'introduction du tampon d'élution au phosphate et l'étape de fractionnement de l'éluant, le débit du tampon d'élution au phosphate s'écoulant dans l'espace de remplissage de l'appareil d'adsorption est compris dans l'intervalle de 0 à 10 ml/min. Suivant le procédé décrit ci-dessus, il est possible de séparer de manière fiable une protéine fluorescente cible sans qu'une longue période de temps soit requise pour les opérations de séparation. Cela signifie que la protéine fluorescente de grande pureté peut être obtenue. (6) Dans le procédé décrit dans le paragraphe (1) précité, la protéine fluorescente consiste en au moins une des protéines choisies entre une protéine fluorescente dérivée d'un cnidaire et une entité modifiée de celle-ci. Le procédé décrit ci-dessus peut être appliqué à un procédé de séparation de divers types de protéines fluorescentes provenant d'un échantillon. En particulier, le procédé décrit ci-dessus peut être appliqué à un procédé pour séparer la protéine fluorescente dérivée du cnidaire et/ou son entité modifiée d'un échantillon. (7) Dans le procédé décrit dans le paragraphe (1) précité, l'entité modifiée est obtenue en ajoutant au moins un des composés consistant en histidine, lysine et arginine à la protéine fluorescente dérivée du cnidaire. Parmi divers types d'aminoacides, l'histidine, la lysine et l'arginine ont une grande affinité pour les ions métalliques. En conséquence, si l'entité modifiée de la protéine fluorescente est produite en ajoutant au moins un des composés consistant en histidine, lysine et arginine à une protéine fluorescente naturelle, il devient possible de recueillir la protéine fluorescente en un haut rendement. (8) Dans le procédé décrit dans le paragraphe (1) précité, la protéine fluorescente est exprimée dans les fils formant un cocon de ver à soie en transférant un acide nucléique comprenant un gène correspondant à la protéine fluorescente et un acide nucléique du ver à soie. Suivant le procédé décrit ci-dessus, il est 10 possible d'obtenir une protéine fluorescente ayant une structure simple. En conséquence, il est possible d'éviter une modification de la propriété d'adsorption de la protéine fluorescente à l'adsorbant. Cela signifie que le procédé décrit ci-dessus, conforme à la présente invention, 15 est optimal pour séparer une telle protéine fluorescente de la solution d'échantillon. (9) Dans le procédé décrit dans le paragraphe (1) précité, le composé à base de phosphate de calcium est constitué d'hydroxyapatite comme constituant principal de 20 ce composé. Puisque l'hydroxyapatite est une substance similaire à des constituants d'un organisme vivant, il est possible d'éviter de manière fiable l'altération (désactivation) d'une telle protéine fluorescente lorsque 25 la protéine fluorescente est séparée de l'échantillon. En outre, en modifiant la concentration en sel du tampon d'élution au phosphate comme éluat, le procédé décrit ci-dessus a pour avantage le fait que la protéine fluorescente peut être désorbée aisément de l'adsorbant au tampon 30 d'élution au phosphate pour obtenir l'éluant. (10) Dans le procédé décrit dans le paragraphe (9) précité, l'hydroxyapatite possède des groupes hydroxyle et l'hydroxyapatite est amenée à réagir avec les molécules de fluorure d'hydrogène comprenant des atomes de fluor pour 35 obtenir une fluoroapatite, au moins un des groupes hydroxyle de l'hydroxyapatite étant substitué par les atomes de fluor des molécules de fluorure d'hydrogène. L'hydroxyapatite dont les groupes hydroxyle sont substitués par les atomes de fluor des molécules de fluorure d'hydrogène, c'est-à-dire la fluoroapatite, possède des atomes de fluor (ions fluorure) dans sa structure chimique. En conséquence, il est possible d'éviter que les atomes de calcium (ions calcium) soient éliminés de la fluoroapatite. (11) Dans le procédé décrit dans le paragraphe (10) précité, la fluoroapatite est produite en préparant une suspension contenant l'hydroxyapatite, en préparant une solution contenant du fluorure d'hydrogène, qui contient les molécules de fluorure d'hydrogène, en mélangeant la suspension et la solution du fluorure d'hydrogène pour obtenir un mélange de celles-ci, et en faisant réagir l'hydroxyapatite présente dans la suspension et les molécules de fluorure d'hydrogène présentes dans la solution contenant du fluorure d'hydrogène dans le mélange pour substituer ainsi au moins un des groupes hydroxyle de l'hydroxyapatite par les atomes de fluor des molécules de fluorure d'hydrogène. Suivant le procédé décrit ci-dessus, puisque les molécules de fluorure d'hydrogène sont utilisées comme source de fluor, il est possible d'obtenir de la fluoroapatite ayant une forte cristallinité dans laquelle aucune impureté n'est présente ou bien une pureté est présente à un très faible taux. (12) Dans le procédé décrit dans le paragraphe 30 (11) précité, le pH du mélange est compris dans la plage de 2,5 à 5,0. Suivant le procédé décrit ci-dessus, il est possible d'obtenir de l'hydroxyapatite dont les groupes hydroxyle sont substitués par les atomes de fluor des 35 molécules de fluorure d'hydrogène, c'est-à-dire de la fluoroapatite ayant une forte cristallinité. (13) Dans le procédé décrit dans le paragraphe (10) précité, le fluoroapatite est produite en préparant un premier liquide contenant un composé à base de calcium, qui contient du calcium, un deuxième liquide contenant le fluorure d'hydrogène et un troisième liquide contenant de l'acide phosphorique, respectivement, et ensuite en obtenant un premier mélange en mélangeant le premier liquide, le deuxième liquide et le troisième liquide, puis en faisant réagir le composé à base de calcium, le fluorure d'hydrogène et l'acide phosphorique dans le premier mélange. Suivant le procédé décrit ci-dessus, puisque les molécules de fluorure d'hydrogène sont utilisées comme source de fluor, il est possible d'obtenir de l'hydroxy- apatite dont les groupes hydroxyle sont substitués par les atomes de fluor des molécules de fluorure d'hydrogène, c'est-à-dire de la fluoroapatite ayant une forte cristallinité, dans laquelle aucune impureté n'est présente ou bien une impureté est présente à un très faible taux. (14) Dans le procédé décrit dans le paragraphe (13) précité, l'étape d'obtention du premier mélange est mise en oeuvre en mélangeant le deuxième liquide et le troisième liquide pour obtenir un second mélange, puis en mélangeant le second mélange au premier liquide. Cela permet de mélanger uniformément le deuxième liquide et le troisième liquide au premier liquide pour produire ainsi de la fluoroapatite. En outre, les groupes hydroxyle de l'hydroxyapatite peuvent être substitués uniformément par les atomes de fluor des 30 molécules de fluorure d'hydrogène. En outre, il est également possible d'éviter ou supprimer de manière fiable la formation de sous-produits tels que le fluorure de calcium dans le second mélange. Conformément à la présente invention, il est 35 possible de séparer une grande quantité de la protéine fluorescente de l'échantillon (solution d'échantillon) 25 contenant la pluralité de protéines contenant la protéine fluorescente, avec une grande pureté par une opération simple. En choisissant de manière appropriée les conditions de séparation telles que la concentration en sel ou le débit du tampon d'élution au phosphate, bien que cela dépende du type de protéine fluorescente à séparer, il est possible d'améliorer la pureté de la protéine fluorescente à séparer et purifier.
D'autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description détaillée qui va suivre, faite en regard des dessins annexés sur lesquels : La figure 1 est une vue en coupe qui représente un exemple d'appareil d'adsorption destiné à être utilisé dans la présente invention. La figure 2 représente une courbe d'absorbance qui est établie lorsqu'une protéine fluorescente présente dans une solution d'échantillon est séparée en utilisant l'appareil d'adsorption.
Le meilleur mode de mise en pratique de l'invention est décrit ci-dessous. Ci-dessous, un procédé de séparation conforme à la présente invention est décrit en détail sur la base d'une forme de réalisation préférée représentée sur les dessins annexés. Tout d'abord, avant la description du procédé de séparation conforme à la présente invention, un exemple d'appareil d'adsorption (appareil de séparation) destiné à être utilisé dans la présente invention est décrit.
La figure 1 est une vue en coupe qui représente un exemple d'un appareil d'adsorption destiné à être utilisé dans la présente invention. Il faut noter que, dans la description suivante, la partie supérieure et la partie inférieure sur la figure 1 seront désignées respectivement sous le nom de côté d'entrée et côté de sortie .
Plus spécifiquement, le côté d'entrée désigne un côté par où des liquides tels qu'une solution d'échantillon (c'est-à-dire un liquide contenant un échantillon) et un tampon d'élution au phosphate (c'est-à- dire un éluat) sont introduits dans l'appareil d'adsorption pour séparer (purifier) une protéine fluorescente cible, et le côté de sortie désigne un côté situé à l'opposé du côté d'entrée, c'est-à-dire un côté par lequel les liquides décrits ci-dessus sont déchargés hors de l'appareil d'adsorption. Ci-après, la description est effectuée dans le cas où une protéine fluorescente dérivée d'un cnidaire et/ou une entité modifiée de celle-ci est/sont utilisée (s) comme protéine fluorescente à séparer en utilisant l'appareil d'adsorption à titre représentatif. La description est également effectuée dans le cas où la protéine fluorescente est séparée de la solution d'échantillon contenant une pluralité de protéines en utilisant l'appareil d'adsorption à titre représentatif. Â cet égard, l'entité modifiée de la protéine fluorescente dérivée du cnidaire consiste en une protéine ayant une propriété d'entrée en fluorescence (maintien de fluorescence) et une séquence d'aminoacides dans laquelle un ou plusieurs aminoacides présents dans la séquence d'aminoacides d'une protéine fluorescente dérivée d'un cnidaire naturel sont perdus et/ou substitués par un autre aminoacide et/ou l'autre aminoacide est ajouté à ce ou ces aminoacides. Une protéine fluorescente (protéine fluorescente verte : GFP) est une protéine présente dans Aequorea coerulescens qui est un type de cnidaire émettant une lumière verte fluorescente. Cependant, en modifiant une partie des aminoacides présents dans la séquence d'aminoacides de la protéine fluorescente, on sait qu'une protéine fluorescente qui émet une lumière rouge fluorescente, une lumière jaune fluorescente, une lumière cyan fluorescente ou une lumière similaire est obtenue. Des exemples de telles protéines fluorescentes comprennent la protéine fluorescente rouge (RFP), la protéine fluorescente jaune (YFP) et la protéine fluorescente cyan (CFP). Â cet égard, il faut noter que la protéine fluorescente dérivée d'Aequorea coerulescens peut être extraite en utilisant une technologie de recombinaison génétique décrite dans le document US-A-2008-0301823. Cela signifie que la protéine fluorescente est produite dans les fils formant un cocon de ver à soie en utilisant la technique de recombinaison génétique et de telles protéines peuvent être extraites en plongeant les fils dans une solution aqueuse. En outre, il faut noter qu'une entité modifiée de la protéine fluorescente dérivée d'Aequorea coerulescens peut également être obtenue en utilisant ces fils en association avec la technologie de recombinaison génétique décrite dans le document US-A-2008-0301823 et une technologie générale de recombinaison génétique. Ci-après, la protéine fluorescente dérivée du cnidaire et l'entité modifiée de celle-ci sont désignées simplement et collectivement sous le nom de protéine fluorescente dérivée du cnidaire . L'appareil d'adsorption 1 représenté sur la figure 1, qui est utilisé pour séparer la protéine fluorescente dérivée du cnidaire de la solution d'échantillon, comprend une colonne 2, un adsorbant granulaire (une charge granulaire) 3 et deux éléments filtrants 4 et 5. La colonne 2 est constituée d'un corps principal de colonne 21 et de bouchons 22 et 23 destinés à être fixés à l'extrémité du côté d'entrée et à l'extrémité du côté de sortie du corps principal de colonne 21, respectivement. Le corps principal de colonne 21 est formé, par exemple, d'un élément cylindrique. Des éléments d'un matériau constitutif de chacune des parties (chacun des membres) constituant la colonne 2, comprenant le corps principal de colonne 21, comprennent divers verres, diverses résines, divers métaux, diverses matières céramiques et diverses matières similaires.
Un orifice du corps principal de colonne 21 présent du côté d'entrée de ce corps est couvert de l'élément filtrant 4 et, dans cet état, le bouchon 22 est monté par des filets sur l'extrémité du côté d'entrée du corps principal de colonne 21. De manière similaire, un orifice du corps principal de colonne 21 présent du côté de sortie de ce corps est couvert de l'élément filtrant 5 et, dans cet état, le bouchon 23 est monté par des filets sur l'extrémité du côté de sortie du corps principal de colonne 21.
La colonne 2 ayant une structure telle que celle décrite ci-dessus comporte un espace de remplissage d'adsorbant 20 qui est défini par le corps principal de colonne 21 et les éléments filtrants 4 et 5, et au moins une partie de l'espace de remplissage d'adsorbant 20 est remplie de l'adsorbant 3 (dans cette forme de réalisation, pratiquement la totalité de l'espace de remplissage d'adsorbant 20 est remplie de l'adsorbant 3). La capacité volumétrique de l'espace de remplissage d'adsorbant 20 est choisie de manière appropriée en fonction du volume d'une solution d'échantillon à utiliser. Une telle capacité volumétrique n'est pas particulièrement limitée mais est comprise avantageusement dans l'intervalle d'environ 0,1 à 100 ml et plus avantageusement dans l'intervalle d'environ 1 à 50 ml pour 1 ml de la solution d'échantillon. En choisissant une valeur dans l'intervalle précité pour les dimensions de l'espace de remplissage d'adsorbant 20 et en choisissant une valeur dans un intervalle décrit ultérieurement pour les dimensions de l'adsorbant 3 (qui sera décrit plus loin), il est possible de séparer mutuellement de manière fiable la protéine fluorescente dérivée du cnidaire des protéines contaminantes (substances étrangères) autres que la protéine fluorescente dérivée du cnidaire présente dans la solution d'échantillon. À cet égard, il faut noter que des exemples de protéines contaminantes présentes dans la solution d'échantillon comprennent les protéines suivantes. Tout d'abord, une protéine fluorescente est exprimée dans les fils formant un cocon de ver à soie en transférant un acide nucléique comprenant un gène correspondant à la protéine fluorescente à un acide nucléique du ver à soie. Puis la protéine fluorescente exprimée est extraite (dissoute) dans une solution aqueuse pour obtenir une solution d'extraction qui est utilisée comme solution d'échantillon. Dans ce cas, des exemples de protéines contaminantes comprennent des protéines autres que la protéine fluorescente dérivée des fils formant le cocon de ver à soie, qui sont extraites dans la solution d'échantillon de la manière décrite ci-dessus.
En outre, l'étanchéité aux liquides entre le corps principal de colonne 21 et les bouchons 22 et 23 est garantie en fixant les bouchons 22 et 23 aux orifices du corps principal de colonne 21. Un conduit d'admission 24 est fixé de manière étanche aux liquides au bouchon 22 pratiquement en son centre, et un conduit de sortie 25 est également fixé de manière étanche aux liquides au bouchon 23 pratiquement en son centre. Les liquides décrits ci-dessus sont amenés à l'espace de remplissage d'adsorbant 20 par le conduit d'admission 24 et l'élément filtrant 4. Les liquides amenés à l'espace de remplissage d'adsorbant 20 passent à travers les espaces entre les particules de l'adsorbant 3 et sont ensuite déchargés hors de la colonne 2 à travers l'élément filtrant 4 et le conduit de sortie 25. À ce moment, la protéine fluorescente dérivée du cnidaire et les protéines contaminantes présentes dans la solution d'échantillon (échantillon) sont séparées les unes des autres d'après la différence de degré d'adsorption de chacune des protéines consistant en la protéine fluorescente dérivée du cnidaire et les protéines contaminantes à l'adsorbant 3 et la différence de degré d'affinité de chacune des protéines consistant en la protéine fluorescente dérivée du cnidaire et les protéines contaminantes pour un tampon d'élution au phosphate. Chacun des éléments filtrants 4 et 5 a pour fonction d'empêcher l'adsorbant 3 d'être déchargé hors de l'espace de remplissage d'adsorbant 20. En outre, chacun des éléments filtrants 4 et 5 est formé d'une étoffe non tissée, d'une mousse (un corps poreux analogue à une éponge ayant des pores communiquants), d'une étoffe tissée, d'une toile ou d'un élément similaire, qui est constitué d'une résine synthétique telle que le polyuréthanne, l'alcool polyvinylique, le polypropylène, le polyétherpolyamide, le poly(téréphtalate d'éthylène) ou le poly(téréphtalate de butylène).
Au moins la surface de l'adsorbant 3 est constituée d'un composé à base de phosphate de calcium. La protéine fluorescente dérivée du cnidaire et les protéines autres que la protéine fluorescente dérivée du cnidaire sont adsorbées spécifiquement à un tel adsorbant 3 avec une capacité d'adsorption (puissance de fixation) que ces protéines possèdent de manière inhérente. En conséquence, la protéine fluorescente et les protéines, c'est-à-dire les protéines contaminantes, sont séparées les unes des autres et purifiées sur la base de la différence entre la capacité d'adsorption de la protéine fluorescente à l'adsorbant 3 et la capacité d'adsorption des protéines à l'adsorbant 3. Des exemples de composés à base de phosphate de calcium comprennent, mais à titre non limitatif, l'hydroxyapatite (Calo(PO4)6(OH)2), TCP (Ca3 (PO4) 2 , Cal P2O7 , Ca(P03)2, DCPD (CaHPO4.2H2O), Ca4O (PO4) 2, des matières dans lesquelles une partie de ces matières est substituée par d'autres atomes ou d'autres groupes d'atomes et des matières similaires. Ces composés à base de phosphate de calcium peuvent être utilisés isolément ou sous forme d'une association de deux ou plus de deux d'entre eux. À cet égard, il faut noter que la protéine fluorescente dérivée du cnidaire est généralement une protéine acide contenant une quantité relativement grande d'un aminoacide acide comme aminoacide constitutif de celle-ci.
Le composé à base de phosphate de calcium comprend un grand nombre d'atomes de calcium dans sa structure cristalline. Un site de Ca, qui peut être chargé positivement, est formé dans la structure cristalline. Dans la protéine fluorescente dérivée du cnidaire, des liaisons ioniques sont formées entre le site de Ca présent dans le composé à base de phosphate de calcium et l'aminoacide acide présent dans la protéine fluorescente dérivée du cnidaire. En conséquence, la protéine fluorescente dérivée du cnidaire peut être liée (adsorbée) énergiquement au composé à base de phosphate de calcium, comparativement aux protéines contaminantes. Si l'adsorbant 3 dont au moins la surface est constituée du composé à base de phosphate de calcium est utilisé, il est possible de séparer aisément et de manière fiable la protéine fluorescente dérivée du cnidaire (protéine acide) des protéines contaminantes en utilisant la différence entre la capacité d'adsorption de la protéine fluorescente dérivée du cnidaire à l'adsorbant 3 et la capacité d'adsorption des protéines contaminantes à l'adsorbant 3. En outre, l'adsorbant 3 dont au moins la surface est constituée du composé à base de phosphate de calcium permet de parvenir à une grande résistance. En conséquence, il est possible d'éviter de manière fiable que l'adsorbant 3 soit déformé et détruit aisément sous son propre poids pendant une longue période de temps. Cela signifie qu'un tel adsorbant 3 permet d'éviter au phénomène suivant de se produire. L'adsorbant 3 remplissant la partie inférieure de l'espace de remplissage d'adsorbant 20 de l'appareil d'adsorption 1 est détruit, ce qui provoque son colmatage. En résultat, il est possible de traiter de manière fiable une grande quantité de la solution d'échantillon. En d'autres termes, il devient possible de séparer de manière fiable une grande quantité de la protéine fluorescente dérivée du cnidaire de la solution d'échantillon. Parmi les composés à base de phosphate de calcium mentionnés ci-dessus, un composé contenant de l'hydroxyapatite comme constituant principal de l'adsorbant 3 est préféré. En particulier, l'hydroxyapatite est une substance similaire aux constituants d'un organisme vivant. En conséquence, lorsque la protéine fluorescente dérivée du cnidaire est adsorbée à, et séparée (désorbée) de, l'adsorbant 3, il est possible d'éviter de manière fiable l'altération (dénaturation} d'une telle protéine fluorescente. En outre, si la concentration en sel du tampon d'élution au phosphate servant d'éluat est modifiée, le procédé conforme à la présente invention a pour avantage le fait que la protéine fluorescente dérivée du cnidaire est désorbée spécifiquement de l'adsorbant 3. Il est préférable qu'au moins une partie des groupes hydroxyle de l'hydroxyapatite soit substituée par des atomes de fluor, des molécules de fluorure d'hydrogène pour obtenir de la fluoroapatite. Les atomes de fluor existent dans la structure cristalline de la fluoroapatite. Cela permet d'éviter de manière fiable que les atomes de calcium (ions calcium} soient séparés ou éliminés de la fluoroapatite. En outre, un adsorbant 3 dont au moins la surface est constituée de la fluoroapatite permet d'améliorer davantage la résistance de l'adsorbant 3.
Ci-après, l'hydroxyapatite et la fluoroapatite sont désignées collectivement sous le nom de apatite . À ce propos, dans une protéine fluorescente dérivée d'Aequorea coerulescens appartenant aux cnidaires, un chromophore (fluorophore) est formé par liaison de trois aminoacides, à savoir la sérine, la tyrosine et la glycine, les uns aux autres. De la manière représentée dans la formule (1) suivante, le chromophore a une structure dans laquelle deux atomes d'azote sont adjacents l'un à l'autre.
En conséquence, si des ions métalliques (ions calcium) sont proches de la structure (deux atomes d'azote) du chromophore, une liaison de chélate est formée entre les ions métalliques et le chromophore. Il existe un risque que la propriété de fluorescence de la protéine fluorescente dérivée d'Aequorea coerulescens soit modifiée en raison de la liaison de chélate. Formule (1) tyrosine >te 30 serin (Sert) 35 En conséquence, il est nécessaire de fixer énergiquement les atomes métalliques à l'adsorbant 3. Cependant, l'adsorbant 3 dont au moins la proximité de la surface est constituée de fluoroapatite permet d'éviter de manière fiable que les ions calcium soient élués au tampon d'élution au phosphate qui a été utilisé comme éluat ou â. la solution d'échantillon. En résultat, il est possible d'éviter de manière fiable que la propriété de fluorescence de la protéine fluorescente séparée dérivée d'Aequorea coerulescens soit modifiée sous l'action des ions calcium. À cet égard, un procédé pour la production de la fluoroapatite décrite ci-dessus sera décrit en détail plus loin. En outre, de la manière représentée sur la figure 1, l'adsorbant 3 a de préférence une forme de particules (forme granulaire) mais peut avoir une autre forme telle qu'une forme de pastilles (petits blocs) ou une forme de bloc (par exemple un corps poreux dans lequel les pores adjacents communiquent les uns avec les autres) ou une forme en nid d'abeilles. Au moyen de l'adsorbant 3 mis sous forme de particules, il est possible d'augmenter la surface spécifique de cet adsorbant et d'améliorer ainsi les caractéristiques de séparation de la protéine fluorescente dérivée du cnidaire au niveau de l'adsorbant 3. La dimension moyenne de particules de l'adsorbant 3 n'est pas particulièrement limitée mais est comprise avantageusement dans l'intervalle d'environ 0,5 à 150 pm et plus avantageusement dans l'intervalle d'environ 10 à 80 pm. En utilisant l'adsorbant 3 ayant une telle dimension moyenne de particules, il est possible d'éviter de manière fiable le colmatage de l'élément filtrant 5 tout en garantissant une surface spécifique suffisante de l'adsorbant 3. Il faut noter que l'adsorbant 3 peut être constitué intégralement du composé à base de phosphate de calcium. En variante, l'adsorbant 3 peut être formé en revêtant la surface d'un support (d'une base) avec le composé à base de phosphate de calcium. Il est préférable que l'adsorbant 3 puisse être intégralement constitué du composé à base de phosphate de calcium. Cela permet d'améliorer davantage la résistance de l'adsorbant 3, en obtenant ainsi une colonne convenable pouvant être utilisée dans la séparation d'une grande quantité de la protéine fluorescente dérivée du cnidaire. L'adsorbant 3 constitué intégralement du composé à base de phosphate de calcium peut être obtenu de la manière suivante. Des particules du composé à base de phosphate de calcium {particules primaires) sont obtenues en utilisant un procédé de synthèse par voie humide ou un procédé de synthèse par voie sèche, une suspension contenant de telles particules du composé à base de phosphate de calcium est préparée, puis la suspension est déshydratée ou granulée pour obtenir des particules déshydratées. Puis les particules déshydratées sont frittées pour obtenir l'adsorbant 3 constitué intégralement du composé à base de phosphate de calcium.
D'autre part, l'adsorbant 3 formé en revêtant la surface du support avec le composé à base de phosphate de calcium peut être obtenu en utilisant un procédé dans lequel les particules déshydratées sont soumises à une collision (hybridation) avec le support constitué de résines ou d'une matière similaire. Dans le cas où pratiquement la totalité de l'espace de remplissage d'adsorbant 20 est remplie de l'adsorbant 3 comme dans le cas de cette forme de réalisation, l'adsorbant 3 a de préférence une composition pratiquement constante à chaque point dans l'espace de remplissage d'adsorbant 20. Cela permet d'obtenir un appareil d'adsorption 1 ayant une capacité particulièrement excellente de séparation (purification) de la protéine fluorescente dérivée du cnidaire. À cet égard, il faut noter que l'espace de remplissage d'adsorbant 20 peut être rempli partiellement de l'adsorbant 3 (par exemple, une partie de l'espace de remplissage d'adsorbant 20 située du côté où le conduit d'admission 24 est présent peut être remplie de l'adsorbant 3). Dans ce cas, la partie restant de l'espace de remplissage d'adsorbant 20 peut être remplie d'un autre adsorbant. Un procédé pour séparer la protéine fluorescente dérivée du cnidaire au moyen de l'appareil d'adsorption décrit ci-dessus (c'est-à-dire un procédé de séparation conforme à la présente invention) est décrit ci-dessous. (1) Étape de préparation Tout d'abord, une pluralité de protéines contenant une protéine fluorescente dérivée du cnidaire est extraite d'un échantillon pour préparer une solution d'échantillon. Des exemples d'échantillons à utiliser pour l'extraction de la protéine fluorescente dérivée du cnidaire comprennent des cnidaires tels qu'Aequorea victoria et Obelia qui appartiennent à la classe Hydrozoa, et des Porifera et Renilla qui appartiennent à la classe Anthozoa. Des exemples des autres échantillons utilisés pour extraire la protéine fluorescente dérivée du cnidaire comprennent : un mammifère tel qu'Ovis arien, des Leporidae et Gallus gallus domesticus ; un insecte tel que le ver à soie ; une cellule animale telle qu'une cellule CHO dérivée d'une cellule d'ovaire de hamster chinois ; des matières sécrétées par un micro-organisme tel que des bactéries du type E. coli ; leurs constituants cytoplasmiques ; etc. Dans ces autres échantillons, un acide nucléique comprenant un gène correspondant à la protéine fluorescente dérivée du cnidaire est transféré aux acides nucléiques de ces échantillons. Parmi les échantillons mentionnés ci-dessus, les autres échantillons sont préférables. Ces autres échantillons peuvent produire une grande quantité de la protéine fluorescente dérivée du cnidaire (protéine produite). En conséquence, après extraction de la protéine fluorescente dérivée du cnidaire des autres échantillons et son passage à une solution d'échantillon, la protéine fluorescente est séparée de la solution d'échantillon et est purifiée. Cela permet d'obtenir de manière fiable et aisée une grande quantité de la protéine fluorescente dérivée du cnidaire. Plus précisément, l'acide nucléique comprenant le gène correspondant à la protéine fluorescente dérivée du cnidaire est transféré à un acide nucléique du ver à soie pour produire le cocon. En conséquence, le cocon produit par le ver à soie est préférable comme échantillon. Si le cocon produit par le ver à soie est utilisé comme échantillon, il est possible d'obtenir une solution d'extraction, dans laquelle la protéine fluorescente dérivée du cnidaire est extraite (dissoute), par des opérations relativement aisées consistant à plonger le cocon (les fils de celui-ci) dans un tampon neutre tel que l'eau et le sérum physiologique normal. En résultat, la solution d'extraction peut être utilisée comme solution d'échantillon qui a été utilisée dans le procédé de séparation conforme à la présente invention. Il est difficile que la protéine fluorescente dérivée du cnidaire, qui est produite par le ver à soie, soit modifiée par des chaînes de sucre. En conséquence, il est possible d'obtenir relativement aisément une protéine fluorescente ayant une structure chimique simple (protéine de type non modifié). Cela permet d'éviter la modification de la capacité d'adsorption de la protéine fluorescente à l'adsorbant 3 décrit ci-dessus. Cela signifie que le procédé de séparation conforme à la présente invention est utilisé de manière optimale pour séparer la protéine fluorescente dérivée du cnidaire. Si l'acide nucléique comprenant le gène correspondant à la protéine fluorescente dérivée du cnidaire est transféré à un acide nucléique du ver à soie pour obtenir un cocon, puis la protéine fluorescente dérivée du cnidaire est séparée du cocon produit par le ver à soie par le procédé de séparation conforme à la présente invention, il devient possible de produire une protéine fluorescente pure dérivée du cnidaire à l'échelle commerciale. (2) Étape d' introduction Puis la solution d'échantillon qui a été préparée est introduite dans l'espace de remplissage d'adsorbant 20 par le conduit d'admission 24 et l'élément filtrant 4 de telle sorte qu'elle soit en contact avec l'adsorbant 3 et qu'elle passe à travers la colonne 2 (espace de remplissage d'adsorbant 20). La protéine fluorescente dérivée du cnidaire a une grande capacité d'adsorption à l'adsorbant 3. En outre, une partie des protéines contaminantes autres que la protéine fluorescente dérivée du cnidaire a une capacité d'adsorption relativement grande à l'adsorbant 3. En conséquence, la protéine fluorescente dérivée du cnidaire et les protéines contaminantes ayant la capacité d'adsorption relativement grande sont entraînées sur l'adsorbant 3 dans l'espace de remplissage d'adsorbant 20. Les protéines contaminantes ayant une faible capacité d'adsorption à l'adsorbant 3 et les substances étrangères autres que les protéines contaminantes et la protéine fluorescente dérivée du cnidaire sont déchargées de la colonne 2 à travers l'élément filtrant 5 et le conduit de sortie 25. (3) Étape de fractionnement Puis un tampon d'élution au phosphate, servant d'éluat, est introduit dans l'espace de remplissage d'adsorbant 20 (colonne 2) par le conduit d'admission 24 et l'élément filtrant 4 pour l'élution de la protéine fluorescente dérivée du cnidaire, et un éluant (éluat) contenant ainsi le tampon d'élution au phosphate et la protéine fluorescente dérivée du cnidaire peut être obtenue. Puis l'éluant déchargé de la colonne 2 à travers le conduit de sortie 25 et l'élément filtrant 5 est fractionné (recueilli) dans une partie du tampon d'élution au phosphate contenant la protéine fluorescente et les autres parties de celui-ci pour obtenir une fraction correspondant au tampon d'élution au phosphate, comprenant une quantité prédéterminée de l'éluant. De cette manière, la protéine fluorescente dérivée du cnidaire et les protéines contaminantes, qui sont adsorbées à l'adsorbant 3, sont recueillies (séparées les unes des autres) dans les fractions dans lesquelles elles sont éluées en fonction de la différence de capacité d'adsorption de la protéine fluorescente dérivée du cnidaire à l'adsorbant 3 et de la capacité d'adsorption des protéines contaminantes à l'adsorbant 3. Des exemples de tampon d'élution au phosphate comprennent des tampons au phosphate de sodium, au phosphate de potassium ou au phosphate de lithium et avec des composés similaires. Le pH du tampon d'élution au phosphate n'est pas particulièrement limité mais est compris avantageusement dans la plage d'environ 6 à 8 et plus avantageusement dans la plage d'environ 6,5 à 7,5. Cela permet d'éviter que la protéine fluorescente dérivée du cnidaire à séparer soit altérée, ce qui évite une modification de la propriété de fluorescence. En outre, il est également possible d'éviter de manière fiable que l'adsorbant 3 soit altéré (dissous), en évitant ainsi que la propriété de séparation de l'adsorbant 3 soit modifiée dans l'appareil d'adsorption 1. La température du tampon d'élution au phosphate n'est pas particulièrement limitée mais est comprise avantageusement dans l'intervalle d'environ 30 à 50 °C, plus avantageusement dans l'intervalle d'environ 35 à 55 °C. Cela permet d'éviter que la protéine fluorescente dérivée du cnidaire à séparer soit modifiée.
En utilisant le tampon d'élution au phosphate dont le pH et la température sont compris dans les intervalles mentionnés ci-dessus, il est possible d'améliorer la vitesse de séparation d'une protéine fluorescente cible dérivée du cnidaire. La concentration en sel du tampon d'élution au phosphate est avantageusement égale ou inférieure à 500 mM et plus avantageusement égale ou inférieure à 400 mM. La séparation de la protéine fluorescente dérivée du cnidaire en utilisant le tampon d'élution au phosphate ayant une telle concentration en sel permet d'éviter que la protéine fluorescente dérivée du cnidaire soit soumise à des effets néfastes en raison de l'existence des ions métalliques dans le tampon d'élution au phosphate. La concentration en sel du tampon d'élution au phosphate est comprise de préférence dans l'intervalle d'environ 1 à 400 mM. En outre, il est préférable que la concentration en sel du tampon d'élution au phosphate soit modifiée de manière continue ou par étapes lors de l'opération de séparation de la protéine fluorescente dérivée du cnidaire. Cela permet d'améliorer efficacement l'opération de séparation de la protéine fluorescente dérivée du cnidaire. Le débit du tampon d'élution au phosphate s'écoulant dans l'espace de remplissage d'adsorbant 20 est compris avantageusement dans l'intervalle d'environ 0,1 à 10 ml/min et plus avantageusement dans l'intervalle d'environ 1 à 5 ml/min. En séparant la protéine fluorescente dérivée du cnidaire de la solution d'échantillon à un tel débit, il est possible de séparer de manière fiable une protéine fluorescente cible dérivée du cnidaire de la solution d'échantillon sans qu'une longue période de temps soit requise pour l'opération de séparation. Cela signifie qu'il est possible d'obtenir une grande quantité de la protéine fluorescente dérivée du cnidaire, ou bien d'obtenir la protéine fluorescente dérivée du cnidaire avec une grande pureté.
Au moyen des opérations décrites ci-dessus, la protéine fluorescente dérivée du cnidaire est recueillie dans des fractions prédéterminées. Parmi divers types d'aminoacides, un aminoacide basique tel que l'histidine, la lysine ou l'arginine présente une grande affinité pour les ions métalliques. En conséquence, si l'entité modifiée de la protéine fluorescente dérivée du cnidaire est obtenue en ajoutant au moins un des composés consistant en histidine, lysine et arginine à une protéine fluorescente dérivée d'un cnidaire naturel, la protéine fluorescente dérivée du cnidaire naturel peut être recueillie avec une plus grande vitesse de séparation (un plus haut rendement) en utilisant le procédé de séparation conforme à la présente invention.
En outre, l'aminoacide basique a une grande affinité pour un atome de zinc (l'ion zinc), un atome de nickel (l'ion nickel), un atome de cobalt (l'ion cobalt) et un atome de cuivre (l'ion cuivre). En conséquence, au moins une partie des ions calcium d'une apatite telle que l'hydroxyapatite et la fluoroapatite décrites ci-dessus peut être substituée par ces atomes (ions). Cela permet d'améliorer l'affinité de la protéine fluorescente dérivée du cnidaire pour l'adsorbant 3. Des exemples de procédés de substitution d'au moins une partie des atomes de calcium de l'apatite par les atomes (ions) comprennent un procédé consistant à mettre un liquide contenant un halogénure, un hydroxyde, une matière sulfatée, une matière carbonatée ou une matière similaire, dans lequel les atomes sont présents, en contact avec l'apatite. Suivant un tel procédé, les atomes peuvent être substitués aux atomes de calcium relativement aisément. Dans la description précitée, la protéine fluorescente dérivée du cnidaire (ou une entité modifiée de cette protéine) a été décrite à titre d'exemple de protéine fluorescente. Cependant, le procédé de séparation conforme à la présente invention permet également de séparer une protéine fluorescente présente chez un poisson tel qu'Anguilla japonica de manière aisée avec une grande pureté. Â ce propos, la fluoroapatite décrite ci-dessus peut être produite en utilisant n'importe quel type de procédé. Il est préférable que la fluoroapatite soit produite en utilisant le procédé (I) ou (II) suivant. Le procédé (I) est un procédé de substitution d'au moins une partie des groupes hydroxyle de l'hydroxyapatite par les atomes de fluor de molécules de fluorure d'hydrogène. Un tel procédé est mis en oeuvre en faisant réagir de l'hydroxyapatite et les molécules de fluorure d'hydrogène dans un mélange qui est obtenu en mélangeant une suspension contenant de l'hydroxyapatite et une solution contenant du fluorure d'hydrogène, qui contient les molécules de fluorure d'hydrogène, pour obtenir ainsi de la fluoroapatite. Le procédé (II) est mis en oeuvre de la manière suivante. Un premier liquide contenant un composé à base de calcium, qui contient du calcium, un deuxième liquide contenant les molécules de fluorure d'hydrogène et un troisième liquide contenant de l'acide phosphorique sont préparés respectivement. Puis le premier liquide, le deuxième liquide et le troisième liquide sont mélangés pour obtenir un premier mélange. Le composé à base de calcium, les molécules de fluorure d'hydrogène et l'acide phosphorique sont ensuite amenés à réagir dans le premier mélange pour obtenir ainsi de la fluoroapatite. Dans un procédé classique de synthèse de fluoroapatite, de la fluoroapatite est synthétisée en ajoutant du trifluorure d'ammonium comme source de fluor à une suspension contenant de l'hydroxyapatite. Cependant, suivant ces procédés (1) et (II), puisque les molécules de fluorure d'hydrogène sont utilisées comme source de fluor, il est possible d'obtenir de la fluoroapatite dans laquelle aucune impureté n'est présente ou bien une impureté est présente à un très faible taux. En conséquence, il est possible d'obtenir une fluoroapatite ayant une forte cristallinité. En outre, il est possible d'améliorer la résistance aux acides de la fluoroapatite produite en raison de la forte cristallinité. En conséquence, l'adsorbant 3 constitué d'une telle fluoroapatite peut être utilisé pour séparer une protéine fluorescente d'une solution d'échantillon avec un éluat ayant un pH relativement bas. Dans ce cas, le procédé de séparation peut être mis en œuvre sans dissolution de l'adsorbant 3. En conséquence, il devient possible de séparer de manière fiable une telle protéine fluorescente de la solution d'échantillon.
En outre, puisque la fluoroapatite obtenue a une grande surface spécifique, l'utilisation de l'adsorbant 3 constitué d'une telle fluoroapatite permet d'améliorer la vitesse de séparation de la protéine fluorescente.
Les procédés (1) et (II) sont décrits ci-après. <Procédé I> Al : Tout d'abord, une suspension contenant de l'hydroxyapatite est préparée. Un procédé pour préparer des particules primaires d'hydroxyapatite et une suspension dans laquelle des agrégats des particules primaires d'hydroxyapatite sont dispersés est décrit ci-dessous. Les particules primaires d'hydroxyapatite peuvent être obtenues par divers procédés de synthèse, mais sont de préférence synthétisées par un procédé de synthèse par voie humide dans lequel au moins une des sources consistant en une source de calcium (un composé de calcium) et une source d'acide phosphorique (un composé d'acide phosphorique) est utilisée sous forme de solution.35 En outre, les particules primaires d'hydroxyapatite ainsi produites ont de petites dimensions et sont donc extrêmement réactives avec le fluorure d'hydrogène. Des exemples de la source de calcium â utiliser dans la synthèse par voie humide de la présente invention comprennent l'hydroxyde de calcium, l'oxyde de calcium, le nitrate de calcium et des composés de calcium similaires. Des exemples de la source d'acide phosphorique à utiliser dans la synthèse par voie humide de la présente invention comprennent l'acide phosphorique, le phosphate d'ammonium et des composés similaires. Parmi ces sources, une source contenant principalement l'hydroxyde de calcium ou l'oxyde de calcium est particulièrement appréciée comme source de calcium, une source contenant principalement l'acide phosphorique est particulièrement appréciée comme source d'acide phosphorique. Plus spécifiquement, de telles particules primaires d'hydroxyapatite et une telle suspension peuvent être obtenues en ajoutant goutte à goutte une solution d'acide phosphorique (H3PO4) à une suspension d'hydroxyde de calcium (Ca(OH)2) ou d'oxyde de calcium (CaO) présente dans un récipient et en les mélangeant par agitation. La quantité de particules primaires d'hydroxyapatite présentes dans la suspension est comprise avantageusement dans l'intervalle d'environ 1 à 20 % en poids et plus avantageusement dans l'intervalle d'environ 5 à 12 en poids. A2 : D'autre part, une solution contenant du fluorure d'hydrogène est préparée séparément de la 30 suspension contenant l'hydroxyapatite. Le solvant pour la dissolution du fluorure d'hydrogène n'est pas particulièrement limité et n'importe quel solvant peut être utilisé du moment qu'il n'inhibe pas une réaction entre l'hydroxyapatite et le fluorure 35 d'hydrogène.
Des exemples d'un tel solvant comprennent l'eau, un alcool tel que le méthanol et l'éthanol, et des solvants similaires. Ces solvants peuvent être utilisés sous forme d'une association de deux ou plus de deux d'entre eux. Cependant, parmi ces solvants, l'eau est particulièrement appréciée. La quantité de fluorure d'hydrogène présente dans la solution contenant du fluorure d'hydrogène est comprise avantageusement dans l'intervalle d'environ 1 à 60 % en poids et plus avantageusement dans l'intervalle d'environ 2,5 à IO % en poids. A3 : Puis la suspension préparée et la solution préparée contenant du fluorure d'hydrogène sont mélangées l'une â l'autre pour faire réagir les particules primaires d'hydroxyapatite avec le fluorure d'hydrogène dans la suspension (liquide réactionnel) contenant la solution contenant du fluorure d'hydrogène pour obtenir des particules primaires de fluoroapatite. Plus spécifiquement, de la manière représentée dans la formule suivante, en mettant les particules primaires d'hydroxyapatite en contact avec le fluorure d'hydrogène, il est possible de substituer au moins une partie des groupes hydroxyle de l'hydroxyapatite par les atomes de fluor des molécules de fluorure d'hydrogène pour convertir l'hydroxyapatite en fluoroapatite et obtenir les particules primaires de fluoroapatite.
Calo (PO4) 6 (OH) 2 - Calo (PO4)6(OH)2-2xF2x (dans laquelle 0 < x S 1) De la manière décrite ci-dessus, en faisant réagir les particules primaires d'hydroxyapatite avec du fluorure d'hydrogène dans la suspension contenant les particules primaires d'hydroxyapatite, il est possible de produire aisément les particules primaires de fluoroapatite.
En outre, puisque les groupes hydroxyle de l'hydroxyapatite sont substitués par les atomes de fluor des molécules de fluorure d'hydrogène au cours de l'étape de traitement des particules primaires d'hydroxyapatite, les particules primaires de fluoroapatite obtenues ont un taux particulièrement élevé de substitution des groupes hydroxyle par les atomes de fluor. En outre, puisque du fluorure d'hydrogène (HF) est utilisé comme source de fluor, aucun sous-produit n'est formé ou bien la quantité de sous-produit formé est extrêmement réduite comparativement au cas où du bifluorure d'ammonium (NH4F), du fluorure de lithium (LiF), du fluorure de sodium (NaF), du fluorure de potassium (KF), du fluorure de magnésium (MgF2), du fluorure de calcium (CaF2) ou un composé similaire est utilisé comme source de fluor. Plus spécifiquement, la teneur en impuretés de la fluoroapatite est de préférence aussi réduite que possible. Par exemple, elle est avantageusement égale ou inférieure à 300 millionièmes et plus avantageusement égale ou inférieure à 100 millionièmes. Cela permet d'éviter ou de supprimer l'élimination des atomes de fluor de la fluoroapatite en raison de la basse teneur en impuretés de cette fluoroapatite, en améliorant ainsi la résistance aux acides des particules primaires de fluoroapatite.
Conformément à la présente invention, en ajustant les conditions réactionnelles (par exemple le pH, la température, le temps) de la réaction entre l'hydroxyapatite (particules primaires) et le fluorure d'hydrogène, il est possible de permettre à la teneur en impuretés présente dans les particules primaires de fluoroapatite d'être comprise de manière fiable dans l'intervalle précité. En outre, il est possible de permettre à une concentration des ions fluor présents dans un surnageant d'être comprise de manière fiable dans un intervalle prédéterminé.
En particulier, conformément à la présente invention, le pH de la suspension est ajusté de manière à être compris dans la plage de 2,5 à 5 en mélangeant la solution contenant du fluorure d'hydrogène à la suspension et, dans cet état, l'hydroxyapatite (particules primaires) réagit avec le fluorure d'hydrogène. Cela permet à la concentration d'ions fluorure et à la teneur en impuretés d'être comprise de manière fiable dans les intervalles précités. À cet égard, il faut noter que, dans le présent mémoire, le pH de la suspension correspond à une valeur de pH au moment où la quantité totale de la solution contenant du fluorure d'hydrogène est mélangée à la suspension. Si le pH de la suspension est ajusté à une valeur inférieure à 2,5, il existe une tendance à la dissolution de l'hydroxyapatite proprement dite et, en conséquence, il devient difficile de convertir l'hydroxyapatite en fluoroapatite pour obtenir des particules primaires de fluoroapatite. En outre, dans ce cas, il existe également un problème consistant en le fait que les matériaux constitutifs d'un dispositif destiné à être utilisé dans le mélange des particules primaires d'hydroxyapatite à la solution contenant du fluorure d'hydrogène sont élués dans la suspension, ce qui fait que des particules primaires de fluoroapatite ayant une faible pureté sont obtenues. En outre, il est techniquement très difficile d'ajuster le pH de la suspension à une valeur basse inférieure à 2,5 en utilisant la solution contenant du fluorure d'hydrogène. D'autre part, afin d'ajuster le pH de la suspension à une valeur supérieure à 5 en utilisant la solution contenant du fluorure d'hydrogène, une grande quantité d'eau doit être ajoutée à la suspension. Dans ce cas, la quantité totale de la suspension devient extrêmement grande et, en résultant, le rendement en particules primaires de fluoroapatite sur la base de la quantité totale de la suspension est réduit. Cela est industriellement désavantageux. À l'opposé aux deux cas précités, dans le cas où le pH de la suspension est ajusté de manière à être compris dans la plage de 2,5 à 5, la fluoroapatite (particules primaires) produite par la réaction tend alors à se dissoudre et est ensuite recristallisée. En conséquence, les particules primaires de fluoroapatite ayant une forte cristallinité peuvent être obtenues.
La suspension et la solution contenant du fluorure d'hydrogène peuvent être mélangées l'une à l'autre en une seule fois, mais elles sont de préférence mélangées en ajoutant (addition au goutte à goutte) la solution contenant du fluorure d'hydrogène à la suspension, goutte à goutte. La vitesse d'addition au goutte à goutte de la solution contenant du fluorure d'hydrogène à la suspension est comprise avantageusement dans l'intervalle d'environ 1 à 100 1/h et plus avantageusement dans l'intervalle d'environ 3 à 100 1/h. En outre, la réaction entre les particules primaires d'hydroxyapatite et le fluorure d'hydrogène est de préférence conduite tout en agitant la suspension. En agitant la suspension, il est possible de mettre les particules primaires d'hydroxyapatite en contact uniforme avec le fluorure d'hydrogène et de permettre ainsi à la réaction entre les particules primaires d'hydroxyapatite et le fluorure d'hydrogène de s'effectuer efficacement. En outre, il est également possible d'obtenir des particules primaires de fluoroapatite plus uniformes en ce qui concerne le taux de substitution des groupes hydroxyle de l'hydroxyapatite par les atomes de fluor des molécules de fluorure d'hydrogène. En utilisant de telles particules primaires de fluoroapatite, il est possible de produire, un adsorbant (particules déshydratées ou particules frittées) ayant de moindres variations des caractéristiques et une grande fiabilité. Dans ce cas, la puissance pour l'agitation de la suspension est comprise avantageusement dans l'intervalle d'environ 0,1 à 3 W, et plus avantageusement dans l'intervalle d'environ 0,5 à 1,8 W pour 1 litre de la suspension. La quantité de fluorure d'hydrogène à mélanger est déterminée de telle sorte que la quantité d'atomes de fluor soit comprise avantageusement dans l'intervalle d'environ 0,65 à 1,25 fois, plus avantageusement dans l'intervalle d'environ 0,75 à 0,15 fois, la quantité des groupes hydroxyle de l'hydroxyapatite. La température de la réaction entre les particules primaires d'hydroxyapatite et le fluorure d'hydrogène n'est pas particulièrement limitée mais est comprise avantageusement dans l'intervalle d'environ 5 à 50 °C, plus avantageusement dans l'intervalle d'environ 20 à 40 °C.
Dans ce cas, le fluorure d'hydrogène est de préférence introduit au goutte à goutte (ajouté) dans (à) la suspension contenant les particules primaires d'hydroxyapatite pendant une période de temps d'environ 30 minutes à 16 heures et plus avantageusement pendant une période de temps d'environ 1 à 8 heures. <Procédé II> BI : Tout d'abord, un premier liquide contenant un composé à base de calcium, qui contient du calcium comme source de calcium, est préparé.
Des exemples de composés à base de calcium (source de calcium) à incorporer au premier liquide comprennent, mais à titre non limitatif, l'hydroxyde de calcium, l'oxyde de calcium, le nitrate de calcium et des composés de calcium similaires. Ces composés peuvent être utilisés isolément ou sous forme d'une association de deux ou plus de deux d'entre eux. Parmi ces composés, l'hydroxyde de calcium est particulièrement apprécié comme source de calcium. Une solution ou suspension contenant le composé à base de calcium comme source de calcium peut être utilisée comme premier liquide. Dans le cas où le composé à base de calcium est l'hydroxyde de calcium, une suspension d'hydroxyde de calcium dans laquelle l'hydroxyde de calcium est mis en suspension dans de l'eau est utilisée de préférence. La quantité du composé à base de calcium servant de source de calcium présente dans le premier liquide est comprise avantageusement dans l'intervalle d'environ 1 à 10 % en poids et plus avantageusement dans l'intervalle d'environ 5 à 12 % en poids. B2 : Puis un deuxième liquide contenant du 15 fluorure d'hydrogène (une solution contenant du fluorure d'hydrogène) est préparé. Le solvant utilisé pour la dissolution du fluorure d'hydrogène n'est pas particulièrement limité et n'importe quel solvant peut être utilisé du moment qu'il 20 n'inhibe pas la conduite d'une réaction dans l'étape B5, qui sera décrite plus loin. Des exemples d'un tel solvant comprennent l'eau, un alcool tel que le méthanol et l'éthanol ou un solvant similaire. Ces solvants peuvent être utilisés sous 25 forme d'une association de deux ou plus de deux d'entre eux. Cependant, parmi ces solvants, l'eau est particulièrement appréciée. B3 : Puis un troisième liquide contenant de l'acide phosphorique (une solution contenant de l'acide 30 phosphorique) est préparé. Le solvant utilisé pour la dissolution de l'acide phosphorique n'est pas particulièrement limité, et n'importe quel solvant peut être utilisé du moment qu'il n'inhibe pas la réaction à effectuer dans l'étape B5 qui 35 sera décrite plus loin. Le même solvant peut être utilisé comme solvant pour la dissolution du fluorure d'hydrogène dans l'étape B2 décrite ci-dessus. Il faut noter que le solvant utilisé pour la dissolution du fluorure d'hydrogène et le solvant utilisé pour la dissolution de l'acide phosphorique consistent de préférence en le même type de solvant ou le même solvant. Un premier mélange est obtenu en mélangeant les premier, deuxième et troisième liquides préparés de la manière décrite ci-dessus. L'ordre de mélange de ces liquides n'est pas limité du moment que le composé à base de calcium, le fluorure d'hydrogène et l'acide phosphorique peuvent être présents simultanément dans le premier mélange dans l'étape S5 décrite plus loin. Cependant, il est préférable que, après avoir mélangé le deuxième liquide au troisième liquide pour obtenir un second mélange, le second mélange soit ajouté au premier liquide pour obtenir le premier mélange. En mélangeant les premier, deuxième et troisième liquides dans cet ordre, le deuxième liquide et le troisième liquide peuvent être mélangés uniformément au premier liquide. En outre, les groupes hydroxyle de l'hydroxyapatite peuvent être substitués uniformément par les atomes de fluor des molécules de fluorure d'hydrogène. En outre, il est possible d'éviter ou supprimer de manière fiable la formation d'un sous-produit tel que le fluorure de calcium. À cet égard, il faut noter que des exemples d'un procédé d'obtention du premier mélange autre que le procédé décrit ci-dessus comprennent : un procédé consistant à ajouter pratiquement simultanément le deuxième liquide et le troisième liquide au premier liquide ; un procédé consistant à ajouter pratiquement simultanément le premier liquide et le troisième liquide au deuxième liquide ; et un procédé consistant à ajouter pratiquement simultanément le premier liquide et le deuxième liquide au troisième liquide.
Une description est présentée ci-après, à titre représentatif, en ce qui concerne le cas où, après la préparation du second mélange, le second mélange est mélangé au premier liquide pour obtenir le premier mélange, en produisant ainsi de la fluoroapatite. B4 : Puis le deuxième liquide et le troisième liquide, qui ont été préparés dans les étapes B2 et B3, respectivement, sont mélangés l'un à l'autre pour obtenir le second mélange.
La quantité de fluorure d'hydrogène présente dans le second mélange est comprise avantageusement dans l'intervalle d'environ 0,5 à 60 % en poids et plus avantageusement dans l'intervalle d'environ 1,0 à 10 % en poids.
La quantité d'acide phosphorique présente dans le second mélange est comprise avantageusement dans l'intervalle d'environ 1,0 à 90 % en poids et plus avantageusement dans l'intervalle d'environ 5,0 à 20 % en poids.
La quantité d'acide phosphorique présente dans le second mélange est comprise avantageusement dans l'intervalle d'environ 2,0 à 4,5 fois en quantité molaire, et plus avantageusement dans l'intervalle d'environ 2,8 à 4,0 fois, la quantité de fluorure d'hydrogène présente dans le second mélange, en quantité molaire. B5 : Puis le premier liquide (la solution contenant le composé à base de calcium) préparé dans l'étape B1 décrite ci-dessus est mélangé au second mélange obtenu dans l'étape B4 décrite ci-dessus pour obtenir le premier mélange. Puis le composé à base de calcium, servant de source de calcium, est ensuite amené à réagir avec le fluorure d'hydrogène et l'acide phosphorique dans le premier mélange pour obtenir ainsi des particules primaires de fluoroapatite.
Plus spécifiquement, dans le cas où de l'hydroxyde de calcium est utilisé comme source de calcium, en mettant l'hydroxyde de calcium en contact avec le fluorure d'hydrogène et l'acide phosphorique, il est possible d'obtenir des particules primaires de fluoroapatite de la manière représentée dans la formule suivante.
1OCa (OH) 2 + 6H3 (PO4) + 2HF - Calo (PO4) 6 (OH) 2-2xF2x + 18H2O + 2 (H2O) x + 2HF1_x (dans laquelle 0 < x 1) De la manière décrite ci-dessus, les particules primaires de fluoroapatite peuvent être produites de manière fiable en mettant le fluorure d'hydrogène et l'acide phosphorique en contact avec le composé à base de calcium (l'hydroxyde de calcium) servant de source de calcium, puis en faisant réagir le fluorure d'hydrogène, l'acide phosphorique et le composé à base de calcium par une manipulation simple consistant à mélanger le premier liquide au second mélange.
La fluoroapatite produite par la réaction représentée dans la formule ci-dessus a une grande surface spécifique. De la manière représentée dans la formule ci-dessus, il est supposé quela fluoroapatite est produite en substituant les groupes hydroxyle de l'hydroxyapatite par les atomes de fluor des molécules de fluorure d'hydrogène simultanément avec la production des particules primaires d'hydroxyapatite. En conséquence, il est possible d'atteindre un taux élevé de substitution des groupes hydroxyle de l'hydroxyapatite par les atomes de fluor des molécules de fluorure d'hydrogène. En outre, puisque le fluorure d'hydrogène (HF) est utilisé comme source de fluor dans la présente invention, aucun sous-produit n'est formé ou bien la quantité de sous-produit est extrêmement faible, comparativement au cas où du fluorure d'ammonium (NH4F), du fluorure de lithium (LiF), du fluorure de sodium (NaF), du fluorure de potassium (KF), du fluorure de magnésium (MgF2) , du fluorure de calcium (CaF2) ou un composé similaire est utilisé comme source de fluor. En conséquence, la quantité de sous-produit (d'impuretés) présente dans les particules primaires de fluoroapatite peut être réduite, ce qui fait que la résistance aux acides des particules primaires de fluoroapatite est améliorée. Tl faut noter que le terme impureté utilisé dans le présent mémoire désigne l'ammoniac, le lithium, le fluorure de calcium ou un composé similaire dérivant d'une matière première de la fluoroapatite. Plus spécifiquement, la teneur en impuretés de la fluoroapatite est de préférence aussi réduite que possible. Par exemple, elle est avantageusement égale ou inférieure à 300 millionièmes et plus avantageusement égale ou inférieure à 100 millionièmes. Cela permet d'améliorer davantage la résistance aux acides des particules primaires de fluoroapatite en raison de leur basse teneur en impuretés. Conformément à la présente invention, en ajustant les conditions (par exemple le pH, la température, le temps) de la réaction entre le composé à base de calcium (la source de calcium), le fluorure d'hydrogène et l'acide phosphorique, il est possible de parvenir à une teneur en impuretés présente dans les particules primaires de fluoroapatite comprise dans l'intervalle précité. Le premier liquide et le second mélange peuvent être mélangés l'un à l'autre en une seule fois pour obtenir le premier mélange, mais ils sont de préférence mélangés en ajoutant (addition au goutte à goutte) le second mélange au premier liquide, au goutte à goutte. En ajoutant au goutte à goutte le second mélange au premier liquide, il est possible de faire réagir relativement aisément le composé à base de calcium, le fluorure d'hydrogène et l'acide phosphorique.
Il est possible d'ajuster plus aisément et de manière plus fiable le pH du second mélange à une valeur comprise dans une plage appropriée. Pour ces raisons, la décomposition ou la dissolution de la fluoroapatite produite peut être évitée. En résultat, il est possible d'obtenir de la fluoroapatite (des particules primaires de fluoroapatite) ayant une grande pureté et une grande surface spécifique, en un haut rendement. La vitesse d'addition au goutte à goutte du second mélange au premier liquide est comprise avantageusement dans l'intervalle d'environ 1 à 100 1/h et plus avantageusement dans l'intervalle d'environ 10 à 100 1/h. En mélangeant (ajoutant) le second mélange avec le (au) premier liquide à une telle vitesse d'addition au goutte â. goutte, il est possible de faire réagir le composé à base de calcium, le fluorure d'hydrogène et l'acide phosphorique dans des conditions plus douces. En outre, la réaction entre le composé à base de calcium, le fluorure d'hydrogène et l'acide phosphorique est de préférence effectuée tout en agitant le premier mélange. En agitant le premier mélange, il est possible de mettre le composé à base de calcium en contact uniforme avec le fluorure d'hydrogène et l'acide phosphorique et de permettre ainsi à la réaction entre le composé à base de calcium, le fluorure d'hydrogène et l'acide phosphorique de s'effectuer efficacement. En outre, les groupes hydroxyle de l'hydroxyapatite sont substitués uniformément par les atomes de fluor des molécules de fluorure d'hydrogène. En utilisant de telles particules primaires de fluoroapatite, il est possible de produire, par exemple, un adsorbant (particules déshydratées ou particules frittées) 3 ayant de moindres variations des caractéristiques et une grande fiabilité. Dans ce cas, la puissance d'agitation du 35 premier mélange (de la suspension) est comprise avantageusement dans l'intervalle d'environ 0,5 à 3 W et plus avantageusement dans l'intervalle d'environ 0,9 à 1,8 W pour 1 litre de la suspension. La température de la réaction entre le composé à base de calcium servant de source de calcium, le fluorure d'hydrogène et l'acide phosphorique n'est pas particulièrement limitée mais est comprise avantageusement dans l'intervalle d'environ 5 à 50 0C et plus avantageusement dans l'intervalle d'environ 20 à 40 °C. Bien que le procédé de séparation conforme à la présente invention ait été décrit ci-dessus par référence à ces formes de réalisation préférées, la présente invention n'y est pas limitée. Par exemple, le procédé de séparation conforme à la présente invention peut comprendre en outre une ou plusieurs étapes à n'importe quelles fins.
EXEMPLES La présente invention est décrite ci-dessous par référence à des exemples spécifiques. (Exemple 1) -1- Tout d'abord, un cocon de ver à soie (fils du cocon} contenant une GFP recombinante (protéine fluorescente dérivée d'Aequorea victoria) a été transformé par broyage en une poudre en utilisant un broyeur afin d'obtenir une poudre du cocon de ver à soie. À cet égard, la GFP recombinante était une entité modifiée dans laquelle six résidus histidine étaient liés à la protéine fluorescente (GFP) dérivée de l'Aequorea victoria naturelle. Le cocon de ver à soie contenant la GFP recombinante a été obtenu auprès de NEO SILK Co., Ltd. -2- Puis une solution tampon au tris- chlorhydrate 50 mM (pH 7,5) contenant 150 mM de NaCl a été ajoutée à 120 mg de la poudre pour obtenir un mélange, puis le mélange obtenu a été agité. À cet égard, il faut noter que les conditions d'agitation ont été choisies de telle sorte que la vitesse d'agitation soit égale à 30 tr/min, la température de la solution tampon au tris-chlorhydrate soit égale à 4 °C et le temps d'agitation soit égal à 48 heures. -3- Puis le mélange sous agitation a été soumis à un traitement de séparation centrifuge (15 000 tr/min pendant 5 minutes à une température de 4 °C) afin d'obtenir un surnageant et le surnageant a été ensuite concentré en utilisant un procédé d'ultrafiltration. Ainsi, le surnageant concentré a été utilisé comme solution d'échantillon qui contenait la GFP recombinante et des protéines contaminantes dérivées du cocon de ver à soie. -4- Puis 50 pl de la solution d'échantillon ont été fournis (introduits) dans un espace de remplissage d'adsorbant d'un appareil d'adsorption pour adsorber la GFP recombinante et les protéines contaminantes à l'adsorbant. Un éluat A a été ensuite introduit dans l'espace de remplissage d'adsorbant pendant 5 minutes à un débit de 1 ml/min. Puis un mélange de l'éluat A et d'un éluat B a été introduit dans l'espace de remplissage d'adsorbant pendant 15 minutes à un débit de 1 m1/min de telle sorte que le rapport des quantités entre l'éluat A et l'éluat B soit modifié de manière continue dans l'intervalle de 0 à 100 L'éluat B a été ensuite introduit dans l'espace de remplissage d'adsorbant pendant 5 minutes à un débit de 1 ml/min. Par le procédé d'introduction décrit ci-dessus, la GFP recombinante et les protéines contaminantes ont été désorbées de l'adsorbant à l'éluat A, au mélange, ou à l'éluat B pour obtenir ainsi un éluant contenant la GFP recombinante et/ou les protéines contaminantes. Puis l'éluant contenant la GFP recombinante et/ou les protéines contaminantes a été déchargé de l'espace de remplissage d'adsorbant pour être évacué hors de l'appareil d'adsorption. L'éluant déchargé a été fractionné dans des récipients, en une quantité de 2 ml. Â cet égard, il faut noter qu'on a utilisé dans l'appareil d'adsorption une colonne (dimensions 4 mm x 100 mm) dont l'espace de remplissage d'adsorbant a été rempli avec 0,9 g de billes d'hydroxyapatite ( CHT Typell ), ayant un diamètre moyen de 40 um, produite par Pentax (HOYA Corporation). En outre, il faut noter qu'un tampon d'élution au phosphate 1 mM (pH 6,8) a été utilisé comme éluat A et un tampon d'élution au phosphate 400 mM (pH 6,8) a été utilisé comme éluat B. En résultat, la protéine fluorescente dérivée d'Aequorea victoria a pu être séparée des protéines contaminantes dérivées du cocon de ver à soie qui étaient présentes dans la solution d'échantillon. Ce résultat a été démontré par des pics parmi lesquels un pic à un temps de rétention d'environ 11 minutes sur la figure 2 représentait un pic de la GFP recombinante et les autres pics à des temps de rétention compris dans l'intervalle d'environ 8 à 10 minutes sur la figure 2 représentaient les pics des protéines contaminantes. Cela signifie que la protéine fluorescente dérivée d'Aequorea victoria a pu être recueillie dans les fractions (les récipients) contenant l'éluant qui a été déchargé de l'espace de remplissage d'adsorbant pour être évacués de l'appareil d'adsorption, dans l'intervalle d'environ 10 à 12 minutes. De manière similaire, les procédés précités ont été mis en œuvre 50 fois de manière répétée. Les résultats obtenus étaient identiques aux résultats précités.
Exemple comparatif Suivant un procédé décrit par M. Tomita et coll., Transgenic Res., 16, 449-465, 2007, une GFP recombinante qui a été identique à celle utilisée dans l'exemple 1 a été séparée des protéines contaminantes dérivées d'un cocon de ver à soie en utilisant une colonne d'affinité au Ni. En résultat, il a été possible de séparer et de recueillir la GFP recombinante. Cependant, un colmatage de la colonne d'affinité au Ni s'est produit au moment où des procédés identiques à ceux indiqués dans l'exemple 1 ont été répétés 30 fois.
Exemple 2 Une GFP naturelle extraite d'Aequorea victoria a été séparée des protéines contaminantes dérivées d'un cocon de ver à soie et a été recueillie dans des fractions de la même manière que dans l'exemple 1. Les résultats étaient identiques à ceux de l'exemple 1. En outre, suivant un procédé décrit dans le document US-A-2008-0301823, une GFP naturelle a été produite dans les fils formant un cocon de ver à soie, puis la GFP naturelle a été séparée des protéines contaminantes dérivées du cocon de ver à soie a été recueillie dans des fractions de la même manière que dans l'exemple 1. Les résultats étaient identiques à ceux de l'exemple 1. À cet égard, le nombre de résidus histidine dans la GFP naturelle était inférieur à celui des résidus histidine présents dans la GFP recombinante. En conséquence, il existait une tendance à la rétention de la GFP naturelle sur la courbe d'absorbante légèrement plus précoce que celle de la GFP recombinante en raison du nombre de résidus histidine présents dans cette GFP naturelle. En outre, la GFP naturelle a été séparée des protéines contaminantes dérivées du cocon de ver à soie et a été recueillie dans les fractions de la même manière que dans l'exemple 1 en utilisant les billes de fluoroapatite produites de la manière décrite ci-dessus comme adsorbant. Les résultats étaient identiques à ceux de l'exemple 1. A cet égard, il existait une tendance, au moyen d'un tel adsorbant, à l'amélioration du nombre d'opérations de séparation à effectuer de manière répétée. En outre, au moins un des atomes de calcium de l'hydroxyapatite a été substitué par au moins un des atomes consistant en des atomes de zinc (ions zinc), des atomes de nickel (ions nickel), des atomes de cobalt (ions cobalt) et des atomes de cuivre (ions cuivre) pour obtenir des billes d'hydroxyapatite comme adsorbant. Une GFP naturelle a été séparée des protéines contaminantes dérivées d'un cocon de 42 ver à soie a été recueillie dans les fractions de la même manière que dans l'exemple 1 en utilisant de telles billes d'hydroxyapatite. Les résultats sont identiques à ceux de l'exemple 1. À cet égard, il existait une tendance à la rétention de la GFP naturelle et des protéines contaminantes séparées au moyen de telles billes d'hydroxyapatite comme adsorbant plus tardives que la rétention de la GFP naturelle et des protéines contaminantes séparées en utilisant l'adsorbant dans l'exemple 1 en raison de l'affinité améliorée entre la GFP naturelle et l'adsorbant. Cette tendance s'est révélée prononcée dans le cas de l'utilisation de la GFP recombinante.
En outre, une GFP recombinante a été séparée des protéines contaminantes dérivées d'un cocon de ver à soie et a été recueillie dans les fractions de la même manière que dans l'exemple 1, sauf que la GFP recombinante a été remplacée par une protéine fluorescente dérivée d'Anguilla japonica. Les résultats sont identiques à ceux de l'exemple 1. En outre, ik1 convient également de noter que la présente description a trait à l'objet contenu dans la demande de brevet japonaise N° 2008- 042209 (déposée le 22 février 2008 qui est incorporée ici à titre de référence dans son intégralité. Sauf indication contraire, une référence à un composé ou à un constituant comprend la référence au composé ou au constituant proprement dit, et également à celui-ci en association avec d'autres composés ou constituants, tels que des mélanges de composés. De la manière utilisée dans le présent mémoire, les formes au singulier un , une , le et la comprennent les références au pluriel, sauf spécification 35 contraire nette d'après le contexte.
Sauf indication contraire, toutes les valeurs numériques exprimant des quantités d'ingrédients, des conditions réactionnelles et des conditions similaires utilisées dans le présent mémoire doivent être considérées comme étant modifiées dans tous les cas par le terme environ . En conséquence, sauf indication contraire, les paramètres numériques indiqués dans le présent mémoire sont des approximations qui peuvent varier en fonction des propriétés désirées que l'on cherche à obtenir au moyen de la présente invention. Dans tous les cas, chaque paramètre numérique doit être pris en considération à la lumière du nombre de chiffres significatifs et des conventions usuelles d'arrondissement. En outre, il est considéré que la mention d'un intervalle numérique dans le présent mémoire est une description de toutes les valeurs numériques et de tous les intervalles numériques figurant dans cet intervalle. Par exemple, si un intervalle va d'environ 1 à environ 50, il est considéré qu'il comprend, par exemple, 1, 7, 34, 46,1, 23,7 ou n'importe quelle autre valeur ou n'importe quel autre intervalle dans cet intervalle. il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre explicatif, mais nullement limitatif, et que de nombreuses modifications peuvent y être apportées sans sortir de son cadre.
Claims (14)
1. Procédé pour séparer une protéine fluorescente d'un échantillon contenant une pluralité de protéines contenant la protéine fluorescente, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant : à préparer une solution d'échantillon en ajoutant l'échantillon à un liquide ; à préparer un appareil d'adsorption (1) ayant un espace de remplissage (20) destiné à être rempli d'un adsorbant (3) ayant une surface, au moins la surface de l'adsorbant (3) étant constituée d'un composé à base de phosphate de calcium et au moins une partie de l'espace de remplissage (20) étant remplie de l'adsorbant (3) ; à introduire la solution d'échantillon dans l'espace de remplissage (20) de l'appareil d'adsorption (1), de telle sorte que la pluralité de protéines soient adsorbées par l'adsorbant ; à introduire un tampon d'élution au phosphate pour l'élution de la protéine fluorescente présente dans la pluralité de protéines de l'adsorbant dans l'espace de remplissage (20) de l'appareil d'adsorption (1), pour obtenir ainsi un éluant contenant la protéine fluorescente ; et à fractionner l'éluant qui est déchargé de l'espace de remplissage (20) de l'appareil d'adsorption (1) en une portion du tampon d'élution au phosphate contenant la protéine fluorescente et d'autres portions de ce tampon pour séparer ainsi la protéine fluorescente de la pluralité de protéines
2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que, dans l'étape d'introduction du tampon d'élution au phosphate, le pH du tampon d'élution au phosphate est compris dans la plage de 6 à 8.
3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que, dans l'étape d'introduction du 35 tampon d'élution au phosphate, la température du tampond'élution au phosphate est comprise dans l'intervalle de 30 à 50 °C.
4. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que, dans l'étape d'introduction du tampon d'élution au phosphate, la concentration en sel du tampon d'élution au phosphate est égale ou inférieure à 500 mM.
5. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que, dans l'étape d'introduction du tampon d'élution au phosphate et l'étape de fractionnement de l'éluant, le débit du tampon d'élution au phosphate s'écoulant dans l'espace de remplissage de l'appareil d'adsorption est compris dans l'intervalle de 0,1 à 10 ml/min.
6. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la protéine fluorescente est au moins une des protéines consistant en une protéine fluorescente dérivée d'un cnidaire et une entité modifiée de cette protéine.
7. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que l'entité modifiée est obtenue en ajoutant au moins un des résidus consistant en histidine, lysine et arginine à la protéine fluorescente dérivée du cnidaire. 25
8. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que la protéine fluorescente est exprimée dans les fils formant un cocon de ver à soie en transférant un acide nucléique comprenant un gène correspondant à la protéine fluorescente à un acide nucléique du ver à voie. 30
9. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le composé à base de phosphate de calcium est formé d'hydroxyapatite comme constituant principal de ce composé.
10. Procédé suivant la revendication 9, 35 caractérisé en ce que l'hydroxyapatite possède des groupes hydroxyle et l'hydroxyapatite est amenée à réagir avec des 20 5 10 15 25 30 35molécules de fluorure d'hydrogène ayant des atomes de fluor pour obtenir une fluoroapatite, au moins un des groupes hydroxyle de l'hydroxyapatite étant substitué par les atomes de fluor des molécules de fluorure d'hydrogène.
11. Procédé suivant la revendication 10, caractérisé en ce que la fluoroapatite est produite en préparant une suspension contenant l'hydroxyapatite, en préparant une solution contenant du fluorure d'hydrogène, qui contient les molécules de fluorure d'hydrogène, en mélangeant la suspension et la solution contenant du fluorure d'hydrogène pour obtenir un mélange de cette suspension et de cette solution, et en faisant réagir l'hydroxyapatite présente dans la suspension et les molécules de fluorure d'hydrogène présentes dans la solution contenant du fluorure d'hydrogène dans le mélange pour substituer ainsi au moins un des groupes hydroxyle de l'hydroxyapatite par les atomes de fluor des molécules de fluorure d'hydrogène.
12. Procédé suivant la revendication 11, caractérisé en ce que le pH du mélange est compris dans la plage de 2,5 à 5,0.
13. Procédé suivant la revendication 10, caractérisé en ce que la fluoroapatite est produite en préparant un premier liquide contenant un composé à base de calcium qui contient du calcium, un second liquide contenant le fluorure d'hydrogène et un troisième liquide contenant de l'acide phosphorique, respectivement, et en obtenant ensuite un premier mélange en mélangeant le premier liquide, le deuxième liquide et le troisième liquide, puis en faisant réagir le composé à base de calcium, le fluorure d'hydrogène et l'acide phosphorique dans le premier mélange.
14. Procédé suivant la revendication 13, caractérisé en ce que l'étape d'obtention du premier mélange est mise en œuvre en mélangeant le deuxième liquide et le troisième liquide pour obtenir un second mélange et en mélangeant ensuite le second mélange au premier liquide.
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