LU79828A1 - Complexe de coenzyme a et de proteine synthetisante sensiblement exempt d'enzymes proteolytiques et son procede de preparation - Google Patents

Description

* fi L’invention concerne un procédé perfectionné pour prépa-^ rer le CoA-SPC (complexe de coenzyme A et de protéine synthétisante) . Elle concerne en outre une substance à faible poids moléculaire qui solubilise le CoA-SPC contenu dans le lysat brut 5 de cellule de levure de boulanger.

La demande de brevet US 722.633 concerne un procédé de dépistage du cancer chez les individus. Ce test de dépistage est fiable et capable de détecter un cancer aux premiers stades du développement,avant l’apparition de tout symptôme facilement 10 observable et visible. Le demandeur du brevet précité a découvert que le sérum sanguin des individus atteints d’un cancer contenait « la protéine B associée au cancer. C’est ainsi qu'un^simple analyse de la protéine B dans le sérum sanguin permet de déterminer si un individu a ou n'a pas un cancer,et ce avant lfapparition de* 15 tout symptôme visible.

Une technique de détection décrite dans ce brevet est basée sur un réactif qui comprend le CoA-SPC ,extrait de la levure de boulanger et des substrats qui réagissent avec cet extrait en produisant une protéine de fixation. Cette protéine de fixation 20 est capable de se fixer sur une protéine dans le sérum sanguin des humains en formant un complexe. Les propriétés de ce complexe dépendent de la présence ou de l'absence de la protéine B. C’est ainsi que l’utilisation de ce réactif fournit une technique simple pour détecter un cancer chez les individus.

25 Les techniques décrites dans le brevet US précité pour la préparation de l'extrait de CoA-SPC de la levure du boulanger produisent un matériau contenant une quantité importante d’impuretés, en particulier d’autres protéines présentes dans la levure de boulanger. Les procédés de purification décrits sont longs et 30 coûteux.

Les caractéristiques de conservation du CoA-SPC préparé selon la technique antérieure ne sont pas satisfaisantes. Lorsque - le CoA-SPC est lyophilisé et stocké,il perd une partie importante de son activité. De plus,1'activité du CoA-SPC conservé à l'état 35 congelé à -20°C diminue de façon inacceptable avec le temps.

Tarnowski et eolljdans un résumé distribué au cours du 174ème congrès de la Chemical Society,tenu du 28 Août au 3 Septembre 1977 ,intitulé"Préparation du constituant de la levure pour l'essai de la protéine Bÿ mentionnent que le CoA-SPC et d'autres constituants de protéines insolubles des cellules de la levure de <5 2 ta boulanger sont solubilisés par un constituant de la fraction 4 surnageante. Cependant,1'extrait de CoA-SPC de la levure de boulanger, préparé selon cette technique,contient le CoA-SPC dans un mélange avec dfautres substances protéiniques.

5 En conséquence,on a besoin d'un procédé qui permette de préparer l'extrait de CoA-SPC de la levure de boulanger avec une · grande pureté,en utilisant des modes opératoires relativement simples.

En conséquence,1'invention concerne un procédé de préparait) tion de l’extrait de CoA-SPC de la levure de boulange:, ayant une teneur réduite en d’autres constituants de la levure de boulanger, en particulier en d’autres substances protéiniques.

L'invention concerne en outre un procédé de production de l'extrait de levure de boulanger ayant le taux désiré d'activité 15 du CoA-SPC,plus rapidement que ce n’était possible antérieurement.

L’invention a encore pour but de fournir un procédé d’isolement à partir de la levure de boulanger d’un ou de constituant (s) qui solubilise(nt) le CoA-SPC.

Un autre objet de l’invention est la caractérisation du ou 20 des constituantes) qui solubilise(nt) le CoA-SPC contenu dans les cellules de la levure de boulanger.

L'invention concerne également un extrait de CoA-SPC de la levure de boulanger ayant une grande pureté.

Un autre objet de l’invention est un extrait de CoA-SPC 25 de levure de boulanger qui est sensiblement exempt d’enzymes protéolytiques.

L’invention a encore pour objet de préparer un extrait de CoA-SPC de levure de boulanger,stable au stockage.

Enfin,un autre objet de l’invention est de préparer un ex-30 trait de CoA-SPC de levure de boulanger qui puisse être lyophilisé et conservé avec seulement une perte minimale d'activité.

Ces objets et d'autres encore ont été atteints par les * procédés suivants:

La demanderesse a maintenant découvert qu’il est possible 35 de préparer un CoA-SPC d'une pureté satisfaisante en congelant et en dégelant ensuite de la levure de boulanger. On sépare les phases liquide et solide ainsi obtenues. On soumet alors la phase solide à des conditions qui solubilisent de préférence les substances protéiniques insolubles autres que le CoA-SPC,qui sont fixées sur le matériau de levure en phase solide. Les substances protéiniques 3

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solubilisées résultantes sont séparées de la phase solide contenant le CoA-SPC insoluble. Le CoA-SPC est solubilisé en mettant en contact cette phase solide avec la phase liquide qui a été initialement formée en dégelant la levure. On sépare alors 5 le CoA-SPC solubilisé. Le CoA-SPC préparé de cette façon contient beaucoup moins de substance protéinique étrangère que le CcA-SPC préparé de façon classique.

Dans un autre mode de mise en oeuvre de 1*invention,les constituants à bas poids moléculaire de la phase liquide qui 10 résulte du dégèlement de la levure de boulanger sont séparés des constituants à haut poids moléculaire de cette phase. Ces consti-* tuants à plus faible poids moléculaire sont alors utilisés pour solubiliser le CoA-SPC contenu dans la phase solide après qu’elle a- été traitée pour éliminer d'autres substances protéiniques 15 insolubles. r .

Dans un autre mode de mise en oeuvre de l'invention, le constituant cellulaire à faible poids moléculaire de la levure de boulanger.qui solubilise le CoA-SPC,est appelé le facteur t.

Le constituant à faible poids moléculaire de la levure de 20 boulanger,qui solubilise le CoA-SPC trouvé dans les cellules de la levure de boulanger,appelé ci-après "facteur t", peut être préparé par l'un quelconque des procédés classiques conçus pour lyser les cellules de levure de boulanger ou par des procédés qui extraient les matériaux cellulaires à partir de cellule de levure ,tels que 25 la sonication, 1’homogénéisation,la presse hydraulique dénommée couramment en anglais "French Press", l'emploi d'enzymes lytiques suivi d'un choc osmotique.»et également l'ébullition de la levure dans 1’eau.

On a utilisé avec succès des levures commercialisées par 3° Federal Brand,Budweiser, Fleischmann et Kyowa Hakko Kogyo,Ltd Shizucka,Japon.

On prépare de préférence le facteur t soit (1) en conge-. lant la levure dans un mélange éther-C02,tel que décrit dans la demande de brevet US 727.633,pour la préparation du CoA-SPC, soit 35 (2) en congelant la levure de boulanger,de préférence désagrégée, dans N2 liquide pour congeler les cellules et en dégelant ensuite.

Dans l’une ou l’autre technique,(1) ou (2),il est nécessaire de séparer les phases solide et liquide,si on veut obtenir un extrait purifié de CoA-SPC de levure de boulanger. Si on ne 40 désire pas obtenir un produit purifié,le matériau dégelé de la 4 technique (2) peut être ajouté directement à la partie solide * obtenue dans la technique (1). Le mélange dégelé de la technique (1) peut être directement mis en oeuvre pour produire de l’extrait impur de CoA-SPC de levure de boulanger,mais cette technique 5 n’est pas préférée.

Lorsqu’on utilise la technique (1) et si on doit également récupérer l’extrait de CoA-SPC de levure de boulanger,la technique de séparation doit être capable de séparer le facteur t qui se trouve dans la phase liquide,à partir de la phase solide qui con-10 tient le CoA-SPC insoluble et d’autres substances protéiniques insolubles , afin de produire la phase contenant le CoA-SPC qui est v essentiellement exempte de facteur t. Des techniques de séparation appropriées comprennent la centrifugation,l’ultrafiltration, la désire chromatographie sur colonne et similaire. Si on le/ ,1'échantillon 15 de levure dégelée peut être soumis à une première séparation pour séparer les cellules de levure intactes par une technique appropriés comprenant la décantation,la centrifugation à faible vitesse et similaire. La technique de séparation préférée implique une centrifugation à vitesse relativement élevée,normalement à un minimum de 20 4 000 à 5 000 g, de préférence à au moins 10 000 g,et avantageu sement à environ 105 000 g et plus. La centrifugation doit être effectuée pendant une période de temps suffisante pour obtenir la séparation nécessaire. A des vitesses de centrifugation supérieures, ce temps est évidemment plus court qu’à des vitesses de centri-25 fugation inférieures. Le temps nécessaire peïit être compris entre 10 minutes et 2 heures»des durées de centrifugation plus longues peuvent naturellement être appliquées,mais elles n’offrent aucun avantage. De façon générale,une centrifugation d'une heure environ est suffisante. Si on ne cherche pas à produire d’extrait de 30 CoA^SPC de levure de boulanger ou si on ne désire pas produire d’extrait très pur, il n’est alors pas indispensable de préparer une phase contenant le CoA-SPC essentiellement exempte de facteur t. Dans ce cas,on peut alors avoir recours à des techniques de séparation moins vigoureuses.

35 La fraction surnageante de la centrifugation peut être utilisée comme source de facteur t pour solubiliser le CoA-SPC. Cependant,on préfère purifier encore le facteur t avant usage.

La purification supplémentaire peut comprendre une dénaturation i suivie d’une décantation et d’une centrifugation supplémentaire.

La dénaturation est réalisée de préférence en chauffant la frac- 5 tion surnageante contenant le facteur t à une température suffi-ΐ santé pour dénaturer les constituants de la fraction,dénatura-blés à la chaleur. La température et la durée de la dénaturation ne sont pas critiques,des températures plus élevées permettant 5 des durées de chauffage plus courtes. Une dénaturation typique est effectuée entre 50 et 100°C pendant des temps variant entre 3 minutes et 24 heures, Des températures d'environ 80°C appliquées pendant 5 minutes environ donnent d'excellents résultats. Selon désir,le produit surnageant contenant le facteur t peut 10 être centrifugé,puis récupéré.La vitesse de centrifugation n’est pas critique et peut-être comprise entre 5000 et 105,000 g,une centrifugation à 105 000 .g ou plus s'est avérée satisfaisante.

La durée de la centrifugation n'est pas critique et peut varier entre 10 minutes et 2 heures. Des durées de centrifugation d'une 15 heure environ se sont montrées satisfaisantes. Le produit surnageant ainsi obtenu contient le facteur t qui est essentiellement exempt de protéines dénaturables à la chaleur.

Si on le désire,la fraction surnageante peut être soumise à d'autres traitements pour augmenter la pureté du facteur t.

20 Ces traitements peuvent comprendre une filtration et une ultrafiltration, une dialyse,une chromatographie sur papier ou sur colonne, une précipitation ou toute combinaison de ces diverses techniques afin de donner une fraction sensiblement exempte de matière ayant un poids moléculaire supérieur à 25 000,de préférence sensiblement 25 exempte de matière ayant un poids moléculaire supérieur à 1 000, avantageusement essentiellement exempte de matière ayant un poids moléculaire supérieur à 1000 et inférieur à 400.Le facteur t lui-même a un poids moléculaire inférieur à 1000. D'après les résultats de l'ultrafiltration,le poids moléculaire du facteur t est 30 inférieur à 500. Par chromatographie sur colonne de Sephadex,le poids moléculaire est compris entre 400 et 1000.La différence est probablement due à la membrane d'ultrafiltration ayant un pouvoir de coupure supérieur à 500,On a trouvé que la membrane permettait le passage d'un CoA ayant un poids moléculaire d'environ 800,à la 35 même vitesse qu'un composé ayant un poids moléculaire de 500 ou moins. En conséquence,le poids moléculaire du facteur t est très probablement compris entre 400 et 1 000.

Lorsqu’on utilise cette technique pour préparer le facteur t,il est possible de traiter le matériau solide qu'on récupère 40 à partir de la séparation initiale des phases solide et liquide : 6 de la levure dégelée pour obtenir le CoA-SPC. La récupération sera ensuite décrite en détail.

Le second procédé pour préparer le facteur t consiste à congeler la levure dans des conditions cryogéniques telles que 5 l’introduction de la levure de boulanger,de préférence désagrégée, dans l’azote liquide pour congeler les cellules. La durée d’immersion dans l’azote liquide n’est pas critique dans la mesure où elle permet de congeler les cellules. Elle peut varier entre 5 minutes et 1 heure,bien que des durées plus longues 10 soient utilisables,mais sans apporter d’avantage. Si les cellules sont congelées,des durées plus courtes peuvent être appliquées .

Les cellules congelées sont ensuite réchauffées. Le mélange dégelé contient des cellules lysées,des cellules intactes 15 et des constituants cellulaires solubles de ces deux types. Les fractions solide et liquide sont séparées,car le facteur t est principalement dans la phase liquide,en utilisant des techniques classiques telles que la centrifugation,la filtration,la dialyse et similaire. De préférence,la séparation est effectuée par 20 centrifugation à une vitesse et selon une durée permettant d’obtenir la séparation. La vitesse de centrifugation est de préférence au moins de 4000 g, avantageusement d'au moins 10 000 g et encore plus avantageusement d’environ 105 000 g ,· La durée de la centrifugation dépend de la force.De façon générale,la centri-25 fugation dure au moins 10 minutes,de préférence au moins 30 minutes. Une centrifugation pendant une heure à 105 000 g s'est avérée satisfaisante,bien qu'il soit possible d’appliquer des durées plus longues ou plus courtes.

La fraction liquide ainsi récupérée peut être utilisée 30 directement comme source de facteur t pour solubiliser le CoA-SPC dans les cellules de levure. Mais,de préférence,la fraction surnageante contenant le facteur t est soumise à d’autres purifications telles qu'une dénaturation,une dialyse,une filtration,une ultrafiltration, une précipitation et une chromatographie. Des combinai-35 sons de ces procédés de purification peuvent également être utilisées . Le procédé de purification peut être appliqué de telle sorte que la fraction contenant les constituants à bas poids moléculaire soit retenue,car le facteur t semble avoir un poids moléculaire comparativement faible,probablement de 1000 ou moins.

7 « . Le procédé de purification préféré comprend d’abord une dénaturation des protéines dénaturables dans la fraction surnageante contenant le facteur t. La dénaturation est de préférence réalisée en chauffant à une température et pendant un temps suffi-5 santspour dénaturer les protéines dénaturables à la chaleur.

De façon générale,des températures de 50 à 100°C peuvent être utilisées,de préférence de 75 à 85°C. La période pendant laquelle le mélange est chauffé dépend de la température,mais elle est généralement comprise entre 3 minutes et 24 heures. La période de 10 chauffage est choisie de façon à obtenir la dénaturation désirée.

A des températures d’environ 80°C, des durées de traitement thermique de 5 à 10 minutes se sont avérées satisfaisantes. Le mélange . résultant peut être utilisé comme source de facteur t pour solubiliser le CoA-SPC. De préférence,le mélange est cependant 15 traité pour séparer les protéines dénaturées .

Les protéines dénaturées peuvent être séparées en appliquant des .techniques classiques telles que la centrifugation,la filtration,la dialyse et similaire. La centrifugation est préférée en raison de sa simplicité. La centrifugation qui peut être mise 20 en oeuvre est toute centrifugation utilisée précédemment pour séparer les phases liquide et solide. Une centrifugation à environ 105 000 g pendant environ 30 minutes s'est avérée satisfaisante.

La fraction surnageante résultante peut être utilisée directement comme source de facteur t pour la solubilisation du 25 CoA-SPC. Cependant,il est préférable d'éliminer tous constituants à haut poids moléculaire avant d'utiliser la fraction surnageante comme source de facteur t. De préférence,les constituants ayant un poids moléculaire supérieur à 25 000 sont éliminés,avantageusement ceux ayant un poids moléculaire supérieur à 1000.C'est ainsi que 30 les fractions contenant des constituants ayant des poids moléculaires égaux ou inférieurs à 25.000,de préférence d'environ 1000 ou moins et avantageusement ayant un poids moléculaire compris entre 400 et lOOOjsont utilisées comme source de facteur t. Elles peuvent être préparées en appliquant des techniques classiques telles 35 que la filtration,la dialyse,l’ultrafiltration,la chromatographie, la précipitation et leurs combinaisons. Le procédé exact n’est pas critique.

Un procédé typique pourrait impliquer une dialyse à pression réduite utilisant une membrane qui retient la plupart des constituants ayant un poids moléculaire supérieur à 15 000 à 1 8 » 20 000.La pression réduite n’est pas critique et peut être comprise ‘ entre 12 et 700 mm de Hg. L’activité du facteur t est recueillie dans le dialysat. Alternativement,la fraction surnageante peut être filtrée sur un milieu retenant les substances ayant un poids 5 moléculaire de 25 000 ou plus. Le facteur t est recueilli dans le filtrat. Le dialysat ou le filtrat peuvent être utilisés directement comme source de facteur t pour la solubilisation du CoA-SPC.

De préférence,on soumet le dialysat ou le filtrat à une ultrafiltration et à une chromatographie pour séparer les substan-10 ces ayant un poids moléculaire supérieur à 1000 et inférieur à 400. On utilise alors le filtrat comme source de facteur t pour solubiliser le CoA-SPC. En utilisant les techniques décrites ici,il est possible d’obtenir le facteur t ayant la pureté désirée. Après une simple dénaturation en chauffant la fraction surnageante conte-15 nant le facteur/tel que décrit préalablement,on obtient une purification de 1,5 fois supérieure. Une filtration pour éliminer du matériau dénaturé la fraction ayant un poids moléculaire supérieur à 25 000 permet d'obtenir un facteur t ayant une pureté environ 3 fois supérieure< Le facteur t non purifié peut être utili-20 sé pour solubiliser le CoA-SPC provenant des cellules de levure, mais il est préférable d’utiliser un facteur t ayant une pureté environ 1,5 fois supérieure et plus avantageusement un facteur t ayant une pureté au moins 3 fois supérieure. Il est possible de préparer un facteur t ayant une pureté environ 900 fois supérieure, 20 si désiré,qui peut être utilisé pour solubiliser le CoA-SPC. Un facteur t ayant une pureté environ 540 à 625 fois supérieure peut être facilement obtenu. Cependant, un facteur t aussi pur n’est pas indispensable pour préparer le CoA-SPC très pur selon l’invention.

La pureté du facteur t est calculée comme suit:

Poids de solides totaux dans la fraction surnageante brute, 30 suffisant pour fournir 1 ml de facteur t purifié

Poids de solides totaux dans 1 ml de facteur t purifié récupéré coefficient de multiplication de la pureté.

35 On prépare l’extrait de CoA-SPC de levure de boulanger en congelant la levure de boulanger dans un mélange C02-éther tel que 9 décrit dans la demande de brevet US 727.633 ou dans un mélange azote liquide-éther. Dans ces procédés,on peut utiliser d'autres solvants organiques à condition qu’ils se montrent inertes vis-à-vis du CoA-SPC. De préférence,ces solvants sont 5 facilement éliminables des cellules lysées après le dégèlement.

Des solvants appropriés comprenant l’acétone,le toluène,le chloroforme, le butanol et similaires peuvent remplacer l’éther. Les températures auxquelles la levure est exposée sont celles auxquelles la levure se congèle<de préférence la température 10 du mélange est comprise entre -70 et -195°C,avantageusement entre -72 et -77°C. La période de temps pendant laquelle la levure est * soumise à ces températures dépend de la température et de la quantité de levure . La durée ne doit être que le temps nécessaire pour congeler les cellules de levure,mais des durées 15 prolongées peuvent être éventuellement utilisées. On dégèle alors la levure congelée. Si on a utilisé un mélange d’éther pour congeler la levure,1’éther résiduel est éliminé. Le CoA-SPC insoluble est contenu dans la phase solide,alors que le facteur t est convenu dans la phase liquide. Les deux phases sont séparées dans 20 des conditions qui permettent d’obtenir la phase solide essentiellement exempte de facteur t. Des techniques de séparation appropriées sont celles décrites préalablement pour la préparation du facteur t selon la technique (1).

Le matériau cellulaire récupéré contient non seulement 25 le CoA-SPC insoluble,mais également d’autres substances protéiniques insolubles ainsi que d’autres impuretés. Comme la présence du facteur t est nécessaire pour solubiliser le CoA-SPC,mais non les autres substances protéiniques insolubles,il est possible de solubiliser sélectivement ces autres constituants protéiniques 30 insolubles,de la levure. Cette solubilisation peut être réalisée par simple agitation,agitation dans un milieu aqueux ou similaire. Le degré et la vitesse de solubilisation peuvent être augmentés par l’addition de sels tels que des chlorures,des nitrates,des acétates et similaires. On utilise de préférence un milieu aqueux 35 contenant des ions chlorure. La fraction cation du sel peut être tout cation qui n’inhibe pas l’activité du CoA-SPC. C'est ainsi qu’on doit éviter les sels de mercure,de plomb,de zinc,de fer et de lithium. Mais d’autres sels peuvent être utilisés. Les sels de potassium,de sodium,de magnésium,de calcium et de manganèse ont tous été utilisés avantageusement. En particulier,KCl,NaàC, 10 le tampon de Tris et similaire peuvent être utilisés. Un choix ; approprié de la durée de l'agitation et de la concentration de l'anion permet d'éliminer la quantité désirée de ces autres substances protéiniques, qtfelle soit faible ou importante. De façon 5 générale ,des concentrations en anion,de préférence l'ion chlorure, de 0,01 à 2,0 N se sont avérées satisfaisantes,de préférence de 0,026 à 1,0 N et avantageusement de 0,47 à 0,73 N. Il est possible d'utiliser des concentrations en anion plus élevées,sans que celà apporte d’ailleurs un avantage particulier. Quelle que 10 soit la concentration ionique,le CoA-SPC actif n’est pas solubilisé en l’absence du facteur t.

Le pH du milieu pendant la solubilisation de ces autres substances protéiniques insolubles n'est pas critique et peut être un pH acide,basique ou neutre. De préférence,le pH est compris 15 entre 5,0 et 8,avantageusement'entre 5,6 et 5,9.

Le pH peut être ajusté par addition de presque n'importe quel tampon,acide ou base,tels que le Tris acétate ou NaAc.

La substance protéinique ainsi solubilisée est séparée du matériau cellulaire contenant le CoA-SPC insoluble,par des 20 techniques classiques telles qu’une centrifugation entre 10 000 et 105 000 g pendant 30 minutes,et la décantation du liquide surnageant contenant la protéine étrangère,la filtration et similaire.

Le matériau cellulaire récupéré peut,selon le cas,être lavé à l’eau pour éliminer toute impureté résiduelle ou toute substance 25 protéinique soluble non séparée par le procédé de séparation précédent. Le matériau cellulaire lavé est alors introduit dans un milieu aqueux contenant des ions chlorure ou nitrate. La source d’ions chlorure ou nitrate n’est pas critique et comprend celles mentionnée précédemment. La concentration en ions chlorure ou nitrate influence 30 la vitesse à laquelle le facteur t solubilise le CoA-SPC. En conséquence, il est souhaitable d’avoir une concentration minimale „ de 0,02 N en ion chlorure ou nitrate. Des concentrations plus faibles sont encore valables,mais la vitesse de solubilisation est lente. La concentration maximale en ion chlorure ou nitrate est 35 d’environ 2N (75 mg/ml).

Comme la source de CoA-SPC ou de facteur t ou des deux contient probablement certains ions chlorure endogènes,il n'est pas essentiel d'ajouter des ions chlorure ou nitrate au milieu aqueux.

On préfère cependant ajuster la concentration en ion chlorure à au moins 0,40 N ou ajouter suffisamment d’ions nitrate pour obtenir 11 cette concentration et aboutir à une vitesse de solubilisation sa-; tisfaisante. Avantageusement,la concentration en ion chlorure ou nitrate est comprise entre 0,47 et 0,73 N.

Le pH du milieu aqueux pendant la solubilisation du CoA-SPC 5 n'est pas critique, La gamme de pH est de préférence comprise entre 5 et 8,avantageusement entre 5 et 6,et encore plus avantageusement entre 5,6 et 5,9. Le pH peut être ajusté par addition d’acides,de bases ou de tampons appropriés,tels que NaAc ou le tris acétate. Cependant,le pH n’a pas besoin d’être ajusté,et il 10 suffit d’ajouter simplement de l’eau lors de la solubilisation.

La quantité de facteur t ou d’extrait contenant le facteur * t qui est ajouté , n’est pas critique. Cependant la vitesse à laquelle le CoA-SPC est solubilisé est fonction de la quantité de facteur t présente. La quantité de facteur t utilisée pour solu-15 biliser le CoA-SPC peut être celle qui a été récupérée pendant les opérations de mise en oeuvre initiale de la levure de boulanger.Le facteur t peut être ajouté sous la forme de la fraction surnageante qui a été originellement séparée du matériau cellulaire dégelé,

La quantité totale de cette fraction surnageante peut être ajoutée, 20 ou bien une partie seulement,telle que 1/8, 1/4, 1/2, 1/3 etc.

Afin de recueillir un CoA-SPC ayant une grande pureté,il est préférable d’utiliser, un mélange contenant le facteur t,purifié par l’un quelconque des procédés préalablement décrits.

Il est possible de recueillir le facteur t du CoA-SPC 25 solubilisé par dialyse ou filtration à travers une membrane qui retient les constituants ayant un poids moléculaire supérieur à 100.000.Le filtrat ou le dialysat peut alors être traité pour obtenir le facteur t purifié,selon les procédés décrits ci-dessus. Selon le cas,un facteur t purifié peut être obtenu directement par 3Q dialyse ou filtration à travers une membrane qui retient les constituants ayant un poids moléculaire supérieur à 1000. En récupérant et en ré-utilisant le facteur t, il est possible d'utiliser de plus grandes quantités de facteur t pour solubiliser le CoA-SPC. que celles qui sont trouvées dans l’échantillon original à partir 35 duquel on a séparé le CoA-SPC. C'est ainsi que le facteur t provenant d’autant d’échantillons de levure que désiré,peut être retenu et utilisé pour solubiliser le CoA-SPC extrait de n’importe quelle quantité de levure. Ce procédé fournit une technique économique pour augmenter la vitesse de solubilisation.Le facteur t 40 utilisé pour solubiliser le CoA-SPC peut être celui obtenu par le 12 ' procédé (2) préalablement décrit.

L'extrait de CoA-SPC de levure de boulanger qui est produit par ce procédé préféré est essentiellement exempt d'enzymes protéolytiques. La présence d'enzymes protéolytiques dans les 5 extraits de CoA-SPC de levure de boulanger produits par le procédé de la technique antérieure.permet d'obtenir un extrait ayant de mauvaises caractéristiques de conservation. L'extrait de CoA-SPC de levure de boulanger selon l'invention perd beaucoup moins de son activité par lyophilisation et à la conservation que l'extrait . io d© la technique antérieure,en raison de sa teneur réduite en enzymes protéolytiques. L'extrait selon l'invention possède également des caractéristiques de conservation supérieures,lorsqu'il est stocké à l'état congelé à -20°C.

De plus,1'extrait de CoA-SPC de levure de boulanger selon 15 l'invention requiert moins de substrat d’ATP (ATP= acide adénosine triphosphorique) pour produire la protéine de fixation utilisée dans le procédé de détection du cancer décrit dans la demande de brevet US 727 633. L'extrait de CoA-SPC de levure de boulanger selon l'inve^ion possède également une activité en CoA-SPC supé-20 rieure par mg/protéine,par rapport à celui préalablement produit.

L’extrait de CoA-SPC de levure de boulanger a un poids moléculaire d'environ 200 000 et est caractérisé par son interaction avec les substrats de L-cystéine,d'acide D-pantothénique et d'ATP. Il se caractérise également par son interaction avec la L-cystéine,l'aci-2g de D-pantothénique et l'ATP pour produire la protéine de fixation qui est capable de former un complexe avec la protéine du sérum sanguin,tel que décrit dans la demande de brevet US 727.633.

On peut préparer ainsi un réactif utilisable pour détecter la présence d'un cancer chez les humains.

30 Ce réactif comprend l'extrait de CoA-SPC de levure de bou langer .sensiblement exempt d'enzymes protéolytiques,et des quantités . de substrat pour ledit extrait capables de réagir avec ledit extrait pour produire une protéine de fixation qui se fixe à la protéine dans le sérum sanguin des hommes pour former un complexe 35 protéine du sérum/protéine de fixation.

Les substrats utilisés sont l’ATP ou un de ses sels,l’acide D-pantothénique ou un de ses sels,et la L-cystéine ou un de ses s els.

13 ? sels. Le pH du réactif est compris entre 6,2 et 7,6 et au moins un des substrats est marqué radioactivement. Le réactif comprend en outre une quantité d'un tampon capable de maintenir ladite valeur du pH.

5 Le réactif selon l’invention comprend de 0,01 à 10 mM

d'ATP ou d’un de ses sels,de 0,01 à 1,0 mM d’acide D-pantothénique ou d’un de ses sels,et de 0,01 à 0,6 mM de L-cystéine ou d’un de ses sels.

Dans le réactif,la proportion d'extrait est comprise 10 entre 0,01 et 0,1 ml et la quantité de tampon est de 0,8 ml par ml de réactif.

Le substrat radioactif est la L-cystéine marquée 3¾ou _ . TT,ou l’acide D-pantothénique marqué au 14^,.

” u 14 ^ (la mention C-U signifie que tous les atomes de C de la molécule 14 ·* . - 14 15 de L-cystéine sont des atomes de C’ tandis que C signifie qu’un seul atome de C dans la molécule d’acide D-pantothénique 14 s est un atome de C).

Le réactif selon l’invention comprend de 0,04 à 0,06 ml d’extrait de CoA-SPC de levure de boulanger,sensiblement exempt 20 d’enzymes protéolytiques ; de 1,5 à 5 mM d’ATP ou d'un de ses sels,de 0,5 à 0,6 mM d’acide D-pantothénique ou d’un de ses sels; de 0,05 à 0,15 mM de L-cystéine ou d’un de ses sels;et jusqu’à 0,8 ml d’un tampon qui maintient le pH du réactif dans une gamme de pH de 6,5 à 7,2 ,par ml de solution,le reste étant de l’eau 35 25 distillée;où la L-cystéine est sous la forme radioactive S ou 14 14 C-U,ou l’acide D-pantothénique est sous la forme radioactive C.

Dans le réactifjl’ATP est présent sous forme du sel disodi- que, l’acide D-pantothénique est présent sous forme de l’hémi-sel de calcium et le tampon comprend de 0,001 à 250 mM de tris-acétate, 30 de 0,01 à 50 mM d’acétate de magnésium et de 0,001 à 250 mM de KC1.

L’invention ayant été décrite en détail,les exemples non * limitatifs suivants sont donnés à titre d’illustration.

EXEMPLE 1-

35 Détermination de l’activité du CoA-SPC

On a déterminé l’activité du CoA-SPC en utilisant la L-cystéine,l’acide D-pantothénique ou 1ΆΤΡ comme traceur radioactif. Un mélange réactionnel typique contenait : 4,70 mM d’ATP disodique,0,5 ml de tampon A (contenant 0,10 M de tris-acétate, 40 pH 7,2;0,02 M d’acétate de magnésium,*0,05 M de KC1),0,50 mM du 14 sel de calcium de l'acide D-pantothéniquesO,50 mM de L-cystéine 35 ' marquée au S (18 000 cpm)(cpm = coup par minute) , 0,05 ml de la fraction surnageante à examiner et de l’eau pour compléter le volume à 1 ml. Pour déterminer l'activité de base,on a utilisé 5 des mélanges réactionnels sans ATP.

On a incubé à 36°C pendant 1 heure des tubes contenant le mélange réactionnel. On a arrêté la réaction en ajoutant 2 ml de TCA (acide triehloroacétique) à 10% et on a chauffé les tubes dans un bain-marie à l'ébullition pendant 5 minutes. On a refroidi les 10 tubes et on a recueilli les précipités de protéine dénaturée contenant le CoA-SPC par filtration sur un appareil de filtration Millipore avec des disques de papier Wjiatman n°3 MM. On a lavé les précipités recueillis sur les disques avec 4 fois 2 ml d'eau environ. On a séché les disques et on les a transférés dans des fioles 15 à scintillation pour mesurer la' radioactivité présente dans un compteur à scintillation liquide de Nuclear Chicago en utilisant le liquide de scintillation décrit par Hoskinson et Khorana dans J. Biol. Chem. 240 , ,2129-2135 (1965).

Détermination de l'activité du facteur t 20 Le procédé utilisé pour détecter la présence du facteur t était le suivant:

On a agité pendant 17 heures à 4°C la fraction à examiner quant à son activité en facteur t avec une boulette lavée , récupérée à partir du lysat brut de cellule de levure obtenu par 25 centrifugation à 105 000 g pendant 1 heure,et on a ajouté du KC1 pour obtenir une concentration finale de 5 mg/ml. Après l'opéra tion d'agitation,on a centrifugé le mélange à 105 000 ig pendant 1 heure et,dans la fraction surnageante,on a déterminé l'activité du CoA-SPC tel que décrit ci-dessus. Pour des échantillons témoins, 30 on a agité la boulette pendant 17 heures avec 0,05 M de tris-acétate, pH 7,2,contenant 5 mg/ml de KC1 et avec la fraction surna geante provenant de la centrifugation à 105 000 ig,en l'absence de KC1 exogène.

Préparation du facteur t 35 On a désagrégé environ 454 g d'une levure de boulanger

fraîche dans un récipient approprié contenant 0,7 kg d'éther éthylique anhydre. On a ajouté du COg comprimé (3 kg) pour congeler la levure. On a dégelé la levure à 23-24°C pendant 7 heures.On a éliminé l'éther résiduel et COg du lysat des cellules de levure 40 dégelée,sous vide,tel que décrit préalablement dans le brevet US

15 précité.

On a divisé le lysat des cellules de levure en trois parties égales et on a traité selon les procédés suivants. Un tiers du lysat,procédé 1^est resté sous forme de lysat brut. Le second 5 tiers du lysat,procédé Il^a été centrifugé à 105 000 .g pendant 1 heure et on a recueilli la fraction surnageante. Le dernier tiers du lysat,procédé III, a été centrifugé à 1000 »g pendant 10 minutes à 4°C pour séparer les cellules de levure intactes.On a mis de côté les cellules et on a centrifugé la suspension res-10 tante à 105 000 .g pendant 20 minutes à 4°C. On a recueilli la * boulette et la fraction surnageante. On a chauffé la fraction surnageante à 80°C pendant 5 minutes,centrifugé à 105 000 .g pendant 1 heure et décanté sur une toile à fromage et recueilli.

,0n a remis la boulette en suspension 2 fois dans 0,05 M de Tris-15 acétate, pH 7,2,puis centrifugé à 105 000 .g pendant 1 heure pour laver la boulette. On a remis en suspension une partie de la boulette lavée, procédé Ilia, dans la fraction surnageante chauffée provenant de la centrifugation à 105 000 '.g selon le procédé III. Une autre partie de la boulette lavée,procédé IIIb,a été 20 mise en suspension dans 0,05 M de tris-acétate,pH 7,2. Dans les procédés I, II, Ilia et Illb ,on a ajouté du KC1 exogène afin d’avoir une concentration finale de 5 mg/ml,et on a agité mécaniquement à 4°C pendant 17 heures.

Après l’opération d'agitation de 17 heures pendant laquelle 25 le CoA-SPC s'est peu à peu solubilisé,on a centrifugé les mélanges des procédés I, II, III a et IIIb à 105 000 .g pendant 1 heure pour séparer la boulette et la fraction surnageante. On a déterminé l’activité en CoA-SPC dans chaque fraction surnageante en utilisant la L-cystéine,1’acide D-pantothénique ou l'ATP comme traceur 30 radioactif.

* Les procédés I et IIla fournissaient une activité en

CoA-SPC déterminée par la quantité de radioactivité mesurable incorporée dans les précipités de TCA.Le procédé Illb^qui concernait les boulettes lavées, mélangées avec 0,05 M de tris-acétate, 35 pH 7,2,et le procédé II,ne fournissaient aucune activité en CoA-SPC. En conséquence,il semblerait qu’un constituant (ou des constituants)présent(s) dans la fraction surnageante soit (ou soient) requis pour solubiliser le CoA-SPC.

Cette supposition met en évidence deux caractéristiques d importance vitale du CoA-SPC.(i) ig CoA-SPC semble être fixé 16 - à un ou des constituant(s) de la levure,insoluble(s),extrêmement lourd(s) et reste en cet état,à moins d'appliquer les conditions décrites dans les procédés I et Ilia ci-dessus ; (2) un constituant soluble de la cellule de levure est essentiel pour la libération 5 ou la solubilisation du. CoA-SPC. Comme ce constituant cellulaire soluble n'a pas été identifié,on l’a appelé facteur t.

EXEMPLE 2-

On a désagrégé 454g de levure de boulanger dans de l’azote liquide pour congeler les cellules. On a alors dégelé les 10 cellules congelées et le mélange dégelé contenait des cellules lysées,des cellules intactes et des constituants cellulaires solu- * blés des deux types. On a centrifugé ce mélange à 105 000 g à 4°C pendant 1 heure . On a décanté la fraction liquide dans un autre récipient et on a chauffé à 80°C pendant 10 minutes pour 15 éliminer du mélange les protéines dénaturables à la chaleur.

Après ce chauffage,on a centrifugé de nouveau le mélange à 105 000 g pendant 30 minutes. On a dialysé le liquide surnageant obtenu en utilisant une tubulure n°8 pour basse pression,soit de 700 à 12 mm de Hg. Toute l’activité du facteur t décelable était 20 présente dans le dialysat. Pour certaines préparations,on a remplacé la dialyse par une autre opération. Au lieu de la dialy-ser,on a filtré la fraction surnageante chauffée,sur des cônes filtrants d'Amicon Centriflo (CF25) qui retenaient les substances ayant un poids moléculaire supérieur ou égal à 25 000. Dans ce 25 cas,on recueillait le facteur t dans le filtrat. On a alors soumis le dialysat ou le filtrat contenant le facteur t à deux opérations d’ultrafiltration successives. Pour la première ultrafiltration, on a utilisé un filtre Amicon UM-2 (rétention des substances ayant un poids moléculaire de 1000). Pour la seconde ultrafiltra-30 tion,on a fait passer le filtrat d’UM-2 qui contenait le facteur t sur une membrane Amicon UM-05 (retenant les substances ayant un poids moléculaire de 500). Le facteur t était présent dans le filtrat d’UM~05. D’après ces opérations d’ultrafiltration,il ait semblerait que le facteur t / un poids moléculaire de 500 ou moins, 35 mais on sait que certains composés tels que le CoA ,ayant un poids moléculaire de 800>traversent ce filtre. La chromatographie sur colonne indiquait que le facteur t avait un poids moléculaire compris entre 400 et 1000.

On n’a pas mis en évidence l’activité de CoA-SPC avant sa 40 solubilisation;en conséquence,la détermination de l’activité du 17 facteur t était une mesure indirecte basée sur la présence de , l'activité de CoA-SPC après solubilisation. La quantité d'activité de CoA-SPC présente après 17 heures d'agitation paraissait être directement liée à la concentration en facteur t présent dans la 5 fraction examinée.

EXEMPLE 3-

Traitement du facteur t à la trypsine et à la protéase L’apparente aptitude du facteur t à solubiliser le CoA- SPC pouvait laisser supposer des fonctions du facteur t en tant qu’enzyme protéolytique. On a lyophilisé en fractions aliquotes de 4 ml une partie du filtrat d’Amicon UM-05. On a dissous une ‘ partie aliquote du filtrat dans 10 ml de bicarbonate d'ammonium 0,13 M et on a ajouté à cette solution 100μ§ de trypsine (Worthington,2 fois recristallisée). On a ajusté le pH de la 15 solution à 8,0 avec NH^OH 1 N. -On a préparé un échantillon témoin de la même façon,sinon qu’on a inactivé la trypsine par ébullition pendant 2 minutes avant son addition au filtrat d’UM-05 lyophilisé.

On a soumis deux parties aliquotes supplémentaires à une digestion

par une protéase (Sigma, Strep. griseus, type VI repurifié). A

2o une partie aliquote du filtrat lyophilisé,dissoute dans 10 ml de bicarbonate d'ammonium 0,13 Μ,οη a ajouté lOOpg de protéase et on a réglé le pH à 7,2 avec HCl 1 N. On a préparé de façon identique un témoin pour la protéase, si ce n'est qu'on a fait bouillir l'enzyme pendant 2 minutes avant son addition au filtrat d’UM-05 lyophilisé.

On a incubé les 4 échantillons pendant 6 heures à 36°C et on a 25 surveillé le pH . Après la période d'incubation,on a terminé les réactions enzymatiques en portant à l’ébullition pendant 3 minutes. On a séparé les enzymes protéolytiques dénaturées,par centrifugatio: et on a dialysé les liquides surnageants à 4°C à pression réduite par une tubulure n°8. On a lyophilisé à sec les dialysats et on a 30 dissous dans 4 ml d'eau. On a ajusté le pH à 5,8,si nécessaire, ‘ avec HCl 1 N. On a ajouté du chlorure de potassiuiÿpour avoir une concentration finale de 5 mg/ml et on a mélangé les dialysats avec la boulette lavée obtenue à partir du procédé de préparation avec C0o -éther. Une détermination de l'activité du CoA-SPC a révélé 2g que les témoins de trypsine et de protéase avaient une activité.

De plus,les mélanges réactionnels dans lesquels la trypsine et la protéase n’avaient pas été inactivées possédaient le même taux 18 d'activité de CoA-SPC. Ce fait met nettement en évidence que le facteur t ne contient pas de liaisons peptides.

Traitement thermique du facteur t

On a également vérifier la stabilité à la chaleur du fil-5 trat d’UM-05. Le tableau I montre qu'après un chauffage de 24 heures à 80°C,on a constaté une diminution d'activité du facteur t de 10%. En conséquence,il semblerait,en particulier puisque la perte décélable d'activité du facteur t avait lieu pendant les 10 premières minutes de chauffage,que le facteur t soit stable 10 dans ces conditions, Toute perte d'activité du facteur t observée semble être due aux caractéristiques inhérentes du procédé. Nécessité de la présence de KC1 ou d'ion chlorure:

Les ions chlorure ou nitrate exogènes et le facteur t semblent être essentiels pour une solubilisation maximale du 15 CoA-SPC (tableau I). En raison de la présence d'ions chlorure endogènes dans les fractions contenant le facteur t,on a détecté une certaine activité en CoA-SPC sans ajouter d'ion chlorure dans la fiole à agitation. Cependant,KC1 dans l’eau ou dans 0,05 M de tris acétate,pH 7,2,en l'absence de facteur ^n’a pas libéré 20 de CoA-SPC . On pense que le facteur t est spécifique pour la libération du Coa-SPC,mais la quantité de protéine présente dans la fraction surnageante après l’agitation de la boulette avec le facteur t et KC1 est supérieure à la quantité de protéine concernant le CoA-SPC seul. En conséquence, il y a donc également solubi-25 lisation de protéine étrangère. On sait qu’une grande partie de la protéine étrangère solubilisée est due à l’agitation mécanique et à la concentration en sel.

Tel que démontré dans le tableau I,c’est l'ion chlorure ou nitrate qui semble être essentiel pour la solubilisation du Co:A-30 SPC et non pas le cation. Des sels de mono- et dichlorures, à des concentrations en ion chlorure équivalentes, se sont avérés également efficaces dans la solubilisation du CoA-SPC. L'addition de sels ne contenant ni chlorure,ni nitrate (par exemple KaA«, NaAe, Na-gSOé)]!'augmente pas le taux d’activité de CoA-SPC au-delà de la 35 valeur indiquée pour le chlorure endogène. En conséquence,il semblerait que les sels essayés,ne contenant ni ions chlorure ni ions nitrate,n’étaient pas efficaces pour la solubilisation du CoA-SPC. Les ions chlorure ou nitrate peuvent être ajoutés sous une forme classique quelconque,telle que sous la forme d'un sel.Cepen 19 dant,des cations tels que Li, Hg, Pb, Zn et Fe, semblent inhiber ’ l’activité catalytique de CoA-SPC. Des cations tels que K, Na,

Mn, Mg et Ca se sont tous montrés appropriés.

Dans d’autres études,on a conduit des expériences en 36 5 utilisant NaCl marqué au Cl pour déterminer si l’ion chlorure exerce son action en se fixant sur le CoA-.SPC, sur les constituants lourds du lysat de cellules de levure ou sur le facteur t. Les résultats de ces expériences n’ont pas indiqué une fixation de 36 36

Cl sur l'une quelconque de ces fractions. Donc, si Cl ne se 3 6 10 fixe pas,la liaison entre °C1 et son site de fixation est rompue pendant la récupération du CoA-SPC, d’autres constituants cellulai- t res ou du facteur t pendant l'essai.

TABLEAU I

Effets de différents sels sur la solubilisation du CoA-SPC

15 -T}-;-

Constituants ajoutés · Activité en —- CoA-SPC mp moles

Facteur t Sel + — 5,2 + KC1 19,8 20 - KC12) 0,5 + NaCl 18,2 + MgClg 19,3 + CaCl2 25,0 + MnCl« 29,3 25 + LiCl^ 0,3 + KC2H3°2 7)6 + NaC2H302 4,9 + Kl 3,1 + Na2S0^ 5,2 + KNOg 18,9 30 + Ca3(P04)2 0,1

CaCl2 0,2 ^(+) indique une addition de facteur t, (-) indique une omission de facteur t ou de sel dans le mélange.

35 La concentration endogène moyenne en Cl basée sur plu sieurs lots de levure était de 0,92 mg/ml de la fraction surnageante du lysat cellulaire centrifugé à 105 000 *g. LesÆmg/ml de é 20 y KCl ajoutés sont basés sur le volume total de cellules de levure.

’ Cette quantité est équivalente à 25 mg/ml de KC1 exogène pour la fraction surnageante provenant de la centrifugation à 105 000 ' g. Les autres sels essayés ont été ajustés approximati-5 vement à la concentration de KC1.

4;ci en l'absence du facteur t était dissous dans 4 ml d’eau, puis mélangé avec la boulette,tel que décrit dans "L’essai de détermination de l’activité du facteur t".

^es anions associés avec des cations tels que Li, Hg ,Pb, Zn 10 et Fe semblent inhiber l’activité catalytique du CoA-SPC.

De plus le facteur t ne semble pas exercer son action en formant une liaison stable avec le CoA-SPC ou d’autres constituants cellulaires,car après la solubilisation du Coa-SPC, le facteur t peut être récupéré plusieurs fois par dialyse et 15 réutilisé sans perte apparente d’activité.

Les cellules de levure de boulanger contiennent des enzymes protéolytiques et d’autres enzymes qui peuvent nuire au CoA-SPC,à son substrat ou à son produit *la protéine de fixation.

Le CoA-SPC tel que préparé selon la demande de brevet US 727.633, 20 contient des quantités substantielles de ces enzymes et contient des taux décelables de protéases A, B et C. La pureté maximale qu’on peut atteindre avec le procédé décrit dans la demande de brevet US précitée est environ 36 fois supérieure. Le CoA-SPC selon l’invention est purifié au moins 45 fois plus,et de façon générale 25 au moins 50 fois plus. Des puretés 50 fois supérieures sont facilement obtenues et fournissent un CoA.-SPC qui est exempt de taux décelables de protéases A, B et C. De plus,la plupart des autres enzymes protéolytiques et hydrolytiques, qu’elles soient solubles dans des vacuoles ou dans des espaces périplasmiques 30 sont éliminées par le procédé de préparation du OoA-SPC selon l’invention. C’est ainsi que l’extrait de CoA-SPC de levure de boulanger selon l’invention peut être caractérisé comme exempt de taux décelables de protéases A, B et C.

La pureté du CoA-SPC est calculée comme suit: 35 coups/minute par mg de solution de protéine -y—,—t-purifiée ------- =facteur de multipli- coups/mxnute par mg de solution de protéine cation de la brute pureté.

* 21 où les coups/minute (cpm) par mg de solution de protéine sont ' déterminés tel que décrit dans l’exemple 1; où coups/minute par ml de solution = coups/minute par ml de solution mg de protéine/ml de solution de protéine 5 On peut éventuellement préparer le facteur t sous une forme très purifiée telle qu’il est essentiellement exempt de toute substance protéinique.En conséquence,toutes les enzymes protéolytiques décelables et les autres enzymes dans la partie soluble du lysat de cellules,à partir duquel le facteur t a été puri-10 fié,ont été éliminées. De plus,les procédés selon l'invention éliminent du facteur t le substrat endogène,1'acide D-pantothéni- * que et la L-cystéine ainsi que d'autres constituants solubles ayant un poids moléculaire supérieur à 1000 et inférieur à 400.

Le lavage du solide qui résulte de la lyse des cellules 15 de levure,suivi par une extraction du sel,tel que décrit ci- dessus , élimine les substances protéiniques indésirées et indésirables, de telle sorte qu'on obtient un CoA-SPC aussi pur que précédemment. On a vérifié que ce CoA-SPC très pur est stable à la lyophilisation et au stockage et à la conservation en solutions à 20 -20°C. Après un stockage de 4 mois,1’activité du CoA-SPC n'a pas varié par rapport à son taux d'origine. Ceci représente une amélioration importante par rapport au CoA-SPC décrit dans la demande de brevet US 727.633. Le CoA-SPC préparé selon le procédé décrit dans cette demande de brevet US perd de 25 à 100% de son activité 25 après stockage pendant des périodes de temps d'environ 4 mois* L’invention ayant été décrite en détail,il est évident s e que l’on peut y apporter des modifications sans/départir de son esprit,ni sortir de son cadre.

«

Claims (25)

1. Extrait de CoA-SPC de levure de boulanger,caractérisé en ce qu'il est pratiquement exempt d'enzymes protéolytiques.

2. Extrait de CoA-SPC selon la revendication 1,caractérisé en ce qu'il a une pureté d’au moins 45 fois supérieure.

3. Extrait de CoA-SPC selon la revendication ljcaractérisé en ce qu'il est exempt de taux décelables de protéases A, B et C.

4. Procédé de préparation d'un extrait de CoA-SPC de levure de boulanger,caractérisé en ce qu'il consiste à : lyser les cellules de levure de boulanger; IC» séparer le lysat des cellules de levure de boulanger en fractions solides et surnageantes, où la fraction solide est pratiquement exempte de facteur t; traiter ladite fraction solide pour solubiliser les substances protéiniques insolubles.autres que le CoA-SPC insoluble; 15 séparer les substances protéiniques solubilisées de la fraction contenant le CoA-SPC insoluble;et mettre en contact la fraction contenant le CoA-SPC insoluble avec la fraction surnageante contenant le facteur t pour obtenir un CoA-SPC soluble.

5. Procédé selon la revendication 4,caractérisé en ce que la fraction surnageante contenant le facteur t est dénaturée avant d'être mise en contact avec le CoA-SPC insoluble.

6. Procédé selon la revendication 5,caractérisé en ce que les protéines dénaturées sont séparées de la fraction surnageante 25 avant que celle-ci ne soit mise en contact avec le CoA-SPC insoluble.

7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que la substance protéinique insoluble est solubilisée par contact des fractions solides avec un milieu aqueux ,30 contenant un anion.

« 8. Procédé selon la revendication 7,caractérisé en ce que la concentration de 1'anion est d'au moins 0,01 N.

9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 8, caractérisé en ce que pratiquement la totalité des enzymes protéoly- 35 tiques est séparée du CoA-SPC avant de solubiliser le CoA-SPC.

10. Facteur t,caractérisé en ce qu'il est contenu dans la fraction de levure de boulanger ayant un poids moléculaire compris entre 400 et 1000 et en ce qu'il solubilise le CoA-SPC insoluble, 23 4 en présence d’ions chlorure. r

11. Facteur t selon la revendication 10,caractérisé en ce qu’il est essentiellement exempt de constituants de la levure de boulanger qui sont dénaturables à la chaleur.

12. Facteur t selon la revendication 10,caractérisé en ce qu'il est essentiellement exempt de constituants de la levure de boulanger qui ont un poids moléculaire supérieur à 100 000,

13. Facteur t selon la revendication 10,caractérisé en ce qu’il est essentiellement exempt de constituants de la levure de 10 boulanger qui ont un poids moléculaire supérieur à 1000.

14. Facteur t selon la revendication 13,caractérisé en ce qu’il est essentiellement exempt de constituants de la levure de boulanger.qui ont un poids moléculaire inférieur à 400.

15. Facteur t selon la revendication 10,caractérisé en ce 15 qu’il a une pureté d’au moins'1,5 fois supérieure.

16. Réactif utilisable pour détecter la présence d'un cancer chez les humains,caractérisé en ce qu’il comprend l’extrait de CoA-SPC de levure de boulanger sensiblement exempt d’enzymes protéolytiques ,et des quantités de substrat pour ledit extrait 20 capables de réagir avec ledit extrait pour produire une protéine de fixation qui se fixe à la protéine dans le sérum sanguin -humain pour former un complexe protéine du sérum/protéine de fixation.

17. Réactif selon la revendication 16,caractérisé en ce 25 que lesdits substrats sont l'ATP ou un de ses sels,l’acide D-panto-thénique ou un de ses sels,et la L-cystéine ou un de ses sels.

18. Réactif selon l’une des revendications 16 ou 17,caractérisé en ce que le pH est compris entre 6,2 et 7,6.

19. Réactif selon l’une quelconque des revendications 16 30 à 18^caractérisé en ce qu’au moins un des substrats est marqué radioactivement.

. 20.Réactif selon la revendication 19,caractérisé en ce qu’il comprend en outre une quantité d’un tampon capable de maintenir ladite valeur du pH. 35

21. Réactif selon la revendication 20,caractérisé en ce qu’il comprend de 0,01 à lOmM d’ATP ou d’un de ses sels,de 0,01 à 1,0 mM d’acide D-pantothénique ou d’un de ses sels,et de 0,01 à 0,6 mM de L-cystéine ou d’un de ses sels. i. 24 Z *

22. Réactif selon la revendication 21,caractérisé en ce * qu'il comprend de 0,01 à 0,1 ml dudit extrait et jusqu’à 0,8 ml dudit tampon par ml de réactif.

22 Λ 4 -REVEND! CATIQNS -

23. Réactif selon la revendication 19,caractérisé en ce 35 14 5 que le substrat radioactif est la L-cystéine marquée S ou OU, 14 ' ou l’acide D-pantothénique marqué au C.

24. Réactif utilisable pour détecter la présence d’un cancer chez les humains,caractérisé en ce qu’il comprend de 0,04 à 0,06 ml d’extrait de CoA-SPC de levure de boulanger sensi- 10 blement exempt d’enzymes protéolytiques ;de 1,5 à 5 mM d’ATP ou d’un de ses sels;de 0,5 à 0,6 mM d’acide D-pantothénique ou d’un de ses sels;de 0,05 à 0,15 mM de L-cystéine ou d’un de ses sels;et jusqu'à 0,8 ml d’un tampon qui maintient le pH du réactif dans une gamme de pH de 6,5 à 7,2,par ml de solution,le reste étant · 15 de l’eau distillée; où la L-cystéine est sous la forme radioactive 35 14 S ou C-U,ou l'acide D-pantothénique est sous la forme«radioactive 14c.

25. Réactif selon la revendication 24,caractérisé en ce que l’ATP est présent sous forme du sel disodique,1’acide D-pantothéni- 20 que est présent sous forme de l’hémi-sel de calcium et le tampon comprend de 0,001 à 250 mM de tris-acétate,de 0,01 à 50 mM d'acétate de magnésium et de 0,001 à 250 mM de KC1. *