JPS6042800B2 - 強心剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 衰弱した心臓を刺激するために広く使用される薬剤は、
心臓での毒性作用または末梢循環での有害な副作用によ
つて限定される。

例えば、強心剤配糖体は心筋興奮剤であり、衰弱した心
臓を回復させることができるが、それらは心臓の不整脈
、嘔気および嘔吐の中毒症状を生じる服用量に極めて近
い用量でそのように作用する。交感神経興奮剤の使用は
、関連した不整脈、頻脈、過耐性または変質末梢耐性に
よつて限定される。本発明の化合物は、価値のある薬学
特性を示す。

主として心筋の収縮力に作用する。特に、生体内および
試験管内においてさまざまな動物の心筋に効力のある強
心作用を有するが、血圧心梼度数および血管平滑筋には
、はつきりと示し得るいかなる効果もない。また化合物
は厳しい温度強制、酸素欠乏および低Ｃａ＋８濃度の存
在下で心房に陽性の変力効果（ＩｎＯｔｒＯｐｉｃｅｆ
ｆｅｃｔ）を生じさせる。強心剤配糖体は、これらのス
トレスの多い条件下では効力はない。ＡＰ−Ａの特定の
陽性変力特性およびそれに伴う心臓血液搏出量における
増加は、腎血性心臓機能不全の治療に有用にする。イソ
ギンチヤクアントプロイラキサントグラミカは著るしい
強心剤効果を有することが発見された。

従つて、本発明の目的はこの新規なペプチドを記述する
ことにある。更に、本発明の目的は、イソギンチヤクか
ら該新規ペプチドを得る方法を記述することにある。な
お更に、目的は該ペプチドを利用する心臓機能不全の治
療用組成物および治療方法を記述することである。さら
に目的は、次の説明および特許請求の範囲を読むことか
ら明白になるであろう。本発明の新規ペプチドアントプ
ロイリンーＡ（ＡＰ−Ａ）は、ボデガベイ（ＢＯｄｅｇ
ａＢａｙ）、カリフォルニアから収集されたイソギンチ
ヤク、アントプロイラキサントグラミカ（ＡｎｔｈＯｐ
ｌｅｕｒａｘａｎｔＦｌＯｇｒａｍｍｉｃａ）から得ら
れる。

イソギンチヤクは均質化して、水または水と水と混和で
きる有機溶媒との溶液で抽出される。アントプロイリン
ーＡを含有する粗抽出物は、ゲル酒過にかけ、純度が旬
倍に増加したアントプロイリンーＡが得られる。別法と
して、半透膜をゲル泊過によつて得られた生成物を完全
にするために使用することができる。カチオン交換クロ
マトグラフィーは特定のイソギンチヤクの採集に依存す
る純度約３０〜８０％のアントプロイリンーＡの優れた
分離を提供する。バランスは生物学的に不活性なペプチ
ドおよび緩衝塩とである。分析的に純粋な塩を含まない
物質を得るために上記の物質は、さらにゲルろ過、カチ
オン交換クロマトグラフィーおよび脱塩化によつて精製
される。本発明における分離操作は、すべて生物検査（
ＢｉＯａｓｓａｙ）の冒頭部分に記載された操作を使用
する陽性変力作用の同定のために分離したラットの心房
を使用する生物検査によつて監視される。アントプロイ
リンーＡを得る好ましい方法は、採集した湿潤イソギン
チヤクアントプロイラキサントグラミカを水、アルコー
ルまたは水−アルコール混合液（ＡｑｕｅＯｕｓ−ＡＩ
ｃＯｈＯＩｉｃｍｉｘｔｕｒ′ｅ）で抽出し、粗抽出物
をＮＩｉｌＨＣＯ３水溶液または他の揮発性塩溶液で溶
離される架橋結合デキストランを詰めたカラムのゲル淵
過クロマトグラフィーにかけることによる。

活性留分を凍結乾燥し、力チオンー交換樹脂を詰め、緩
衝液または緩衝液及びイオン化可能塩溶液勾配（Ｇｒ′
Ａｄｉｅｎｔ）で溶離されるカラムでクロマトグラフ処
理する。カチオン交換樹脂を溶離する好適な溶液は、リ
ン酸塩緩衝液またはＮａＣｌ溶液の勾配を有するリン酸
塩緩衝液である。活性留分は精製アントプロイリンーＡ
を得るために凍結乾燥される。凍結乾燥物質は、１．４
〜１．０％アントプロイリンーＡであり、バランスは０
．２〜２．０％不活性ポリペプチドであり、緩衝塩およ
びイオン化可能塩である。塩を含まない物質を得るため
に乾燥物質を塩溶液で溶離される架橋結合デキストラン
を詰めたカラムでクロマトグラフィーをうけしめ、リン
酸塩を除去する。活性留分を収集し、低級有機酸剤例え
は酢酸の稀釈溶液で溶離される架橋結合デキストランを
詰めたカラムのクロマトグラフィーによつて脱塩する。
分析的に純粋なＡＰ−Ａを得るために、脱塩物質を水で
溶離される架橋結合デキストランを詰めたカラムのゲル
ろ過クロマトグラフィーおよびピリジンアセテート緩衝
液で溶離されるスルホエチルセルロースを詰めたカラム
のイオン交換クロマトグラフィーにかける。アントプロ
イラキサントグラミカからアントプロイリンーＡを得る
更に好ましい方法において、湿潤イソギンチヤクを約２
ｃｍの寸法の切片に力ソートし、均質化し、そして３０
％エタノール水で抽出する。

粗抽出物を水溶液に濃縮され、固形分を除去するために
遠心分離し、クロロホルムで分配される。クロロホルム
抽出水溶液を凍結乾燥し、残渣を球状蛋白質の除外限度
３００００を有するセフア。デツクス（Ｓｅｐｈａｄｅ
ｘ）Ｇ５Ｏ〔フアーマシア●ファイン ケミカルス（Ｐ
ｈａｍｌａｃｉａＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ）ボック
ス１７飄Ｓ＝７５１０４、アツプサラ１、スウエーデン
（Ｕｐｐｓａｌａｌ、Ｓｗｅｄｅｎ）により製造〕のよ
うな架橋結合デキストランを詰！め、０．１ＭＮＨ４Ｈ
Ｃ０３で溶離されるカラムのゲル？過クロマトグラフィ
ーにかけた。Ｖｅ／ＶＯｌ．８４〜２．５７を有する留
分は、４皓に精製したアントプロイリンーＡを含有する
。Ｖｅ／ＶＯｌ．８４〜２．５７留分を凍結乾燥し、更
にＣＭ−セフアデツクスＣ−・２５のような弱酸性カチ
オン交換樹脂を詰め、０．５ＮＮａＣ１までの勾配溶離
を有する０．０３Ｍ，．ＰＨ７．５リン酸塩緩衝液で溶
離されるカラムのクロマトグラフィーによつて精製する
。アントプロィリンーＡはＶｅ／ＶＯ２．９９〜３．３
９で溶離し、凍結乾燥される。Ｖｅ／ＶＯ２．９９〜３
．３９留分は除外限度３００００を有するセフアデツク
スＧ−５０を留め、ＮａＣＩ中０．０３Ｍである０．０
１７Ｍ酢酸で溶離されるカラムで再クロマトグラフィー
される。Ｖｅ／■０１．６６〜２．１６に溶離した留分
は、実質的にリン酸塩を含まないアントプロイリンーＡ
を得るために凍結乾燥される。ｌ塩化ナトリウムは除外
限度７００を有するセフアデツクスＧ−１０のような架
橋結合デキストラン樹脂を詰めたカラム上に試料を入れ
、続いて約３倍の試料容積の２０％塩化ナトリウム溶液
を入れ、０．０１７Ｍ酢酸で溶離することによつて除去
される。純粋な（３０〜８０％ＡＰ．Ａ）、塩を含まな
いアントプロイリンーＡは、■ｅ／■００．９３〜１．
１２で溶離する。関連ポリペプチドが不活性であること
が見出されていることから、本物質は薬学的研究に適し
ている。関連した不活性ペプチドのないＡＰ−Ａを得る
ためＶｅ／ＶＯＯ．９３〜１．１２留分は蒸溜水で溶解
され、セフアデツクスＧ−２５ファインで蒸溜中でクロ
マトグラフ処理される。

蒸溜水による、Ｖｅ／■０１．３〜１．７で７５％純粋
な活性ペプチド（９０％）のバルクを生成し、一方、活
性ペプチドの残部は０．２ＭＮＨ４０ＡＣで純粋に溶離
される。Ｖｅ／ＶＯｌ．３〜１．７留分は凍結乾燥され
、蒸溜水で再溶解され、酢酸でＰＨ２．７に調整した０
．０５Ｍピリジンで平衡化したセレツクスーＳＥ−セル
ロース（Ｃｅｌｌｅｘ一ＳＥｃｅｌｌｕｌＯｓｅ）〔バ
イオ・ラット・ラボラトリーズ、リツチモンド、カリフ
ォルニア（ＢｉＯＲａｄＬｌｂＯｒａｔＯｒｉｅｓ．．
ＲｉｃｈｍＯｎｄ．ｓＣａｌｌｆＯｍｉａ）〕でクロマ
トグラフ処理した。ＡＰ−Ａは０．１Ｍペプチドアセテ
ートに相当する範囲において線状勾配を有する各々等容
積の０．０５ＭピリジンアセテートＰＨ２．７および０
．２ＭピリジンアセテートＰＨ３．ｌによつて純粋に溶
離される。ここで本物質はアミノ酸分析及び順序決定に
よる判定による判定の通り分析的に純粋である。純粋な
アントプロイリンーＡを得るための好ましい方法は、次
の図解１によつて説明される。

本発明はの新規ペプチドＡＰ−Ａは、当業者によつて決
定される通り注入または単一の服用のいずれかで、時間
当り約０．０１〜５μＦｌｌｋ９体重の割合で心臓機能
不全の患者に投与される。かかる用法として本発明の化
合物は、それだけで、または通常の製薬上の担体と混和
した経口的に投与されることがてきる。

非経口経路が好ましい。経口的には錠剤、分散末、顆粒
剤、カプセル剤、シロツプ剤およびエリキシル剤のよう
な形状τ：ｈ土γメ非経口的には無菌の注射し得る水溶
液等の溶液、懸濁液、分散液、エマルジョン等のような
形状で投与されることができる。化合物はまた、アシル
化およびエステル化のごとく化学的に、また消化性の破
壊を減じるため、人工的に細胞内脂肪粒子（１ｉｐ０ｓ
０ｍｅ）を製造するなど物理的に変えられることができ
る。投与の好ましい経路は注射によるものである。ＡＰ
−Ａの好ましい製薬組成物は、ゼラチンおよびフェノー
ル防腐剤中の活性成分からなるものてある。

注射薬として構成する更に好ましい製薬組成物は、乾燥
状態で室温で安定な無菌凍結乾燥書−Ａである。凍結乾
燥粉末は加水分解ゼラチンを含有するヴアイアルに包装
することができる。ＡＰ−Ａは個々の服用量が１〜２ｍ
１の溶液で含有されるような方法で、通常容量の注射用
無菌水または注射用塩化ナトリウム溶に溶解することに
よつて使用時に再び復元されねばならない。復元溶液は
、冷凍されるべきであり、分解前に、または好ましくは
２＠間以内に使用されるべきである。これらの製剤は、
担体または佐薬とともに約９０％までの活性成分を含有
することができる。

「血性心臓不全の治療として使用される活性成分の強心
剤に有効な用量は、治療される条件の苛酷さに依存して
変化することができる。しかし、一般的には、１時間毎
の服用量約０．０１μｙ〜約５μＹＩｋ９動物体重で、
または当業者によつて決定される期間持続放出形状て投
与されるときに満足な結果が得られる。内服用として好
適な服用形は、固体または液体の製薬的に認められる担
体または稀釈剤との本質的な混和物中、活性化合物約２
〜３６０ｐｆを含む。

調製および投与の容易さの観点からの好ましい製薬組成
物は、特に約０．０５μｙ〜１０ｐｙＩｍ１を含有する
注射可能な組成物てある。変力作用陽性効果を同定する
生物検査 アントプロイリンーＡを含有する溶液の生物検査は、ラ
ットの心臓の分離した心房で実施される。

心房は残りの心臓から分離され、脱イオン蒸溜水中（ミ
リモル中）次の組成物：Ｎａｌ４５；Ｋ＋６．０２Ｃａ
＋２１．２２Ｍｇ＋２１．３３Ｃ１−１２６ＨＣ０３−
２５．３；ＰＯ４−３１．２；ＳＯ４−２１．３３およ
びグルコース５．５のクレブスリンゲル（ＫｒｅｂｓＲ
ｉｎ？ｒ）重炭酸塩媒質（ＰＨ７．４）を含有する分離
臓器浴（２０．２５または５０ｍ１）中で懸濁される。
臓器浴の温度は３０℃に維持し、クレブス−リンゲル媒
質は９５％０２−５％ＣＯ２で連続して通気される。自
然に鼓動する心房の標本は、細い絹糸によつてフオース
ーデイスプレースメント・トランスデューサー（グラフ
モデルＦＴ．Ｏ３）へ接続され、収縮運動は６−チャン
ネルポリグラフ・グラスモデル７に記録される。標本は
試験を始める前に６扮間７５０ｍ９張力で平衡化する。
この平衡化の後、標本が３吟毎に洗浄される間、心房の
自然鼓動速度は一定のままであり、１０分間観察の変化
は５鼓動／分以下である。アントプロイリンーＡを含有
する試験溶液によつて生じる収縮力および収縮速度にお
ける変化は、比較用ベースラインとしての組織浴への試
験溶液の添加に先行する期間につき張力およびリズムの
百分率増減として表わされる。沖−Ａの物理的及び化学
的特性 電気泳動およびアミノ酸分析を得る目的のために、実施
例１で得たアントプロイリンーＡをそれぞれ実施例１、
段階Ｃ，．ｄおよびｅで述べる方法に従つてＣＭセフア
デツクスＣ−２＼セフアデツクスＧ−５０およびＧ−１
０で再クロマトグラフ処理をした。

２倍に精製した精製物質を市販のプレカースト１２％ア
クリルアミドゲルおよびバイオ・ラット●ラボラトリー
ズ、サーテイセカンドおよびグリフイン・リツチモンド
・カリフォルニアから得られた適合緩衝液系を使用して
電気泳動分析処理をした。

等電集束（ＩｓＯｅｌｅｃｔｒｉｃｆＯＣＬｌＳｉｎｇ
）は、ＰＨ＝８．２．で等電点を示す。

ＰＨ３．６で１２％ポリアクリルアミドゲルでのディス
クゲル電気泳動はメチルグリーントラッキングダイ（Ｔ
ｒａｃｋｉｎｇｄｙｅ）に対してＲｆ値０．４６を示し
た。ＡＰ−ＡはＰＨ８．９で塩基性ゲルにならず多分有
効なりルボキシル基が欠乏していることを示す。１０％
ゲルを使用するドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のデ
ィスクゲル電気泳動は、比較のためにＲＮアーゼＡおよ
びパンクレアチントリプシン阻害剤（ＰＴＩ）を使用し
、ジチオエリスリトールでインキュベートしたのち、分
子量（Ｍ．ｗ．）約４７００を示した。

分子量はあまり低いので、これらの値は近似に過ぎない
。ＡＰ−Ａは蛋白質分解酵素で処理後、生物学的活性の
減少に基づいてペプチドであることが決定された。分析
上純粋なＳ−カルボキシメチル化アントプロイリンーＡ
のアミノ酸連鎖は、次の順序を示した（加水分解物のア
ミノ酸分析で一致）。

Ｇｌｙ一Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ上Ｅｕ−Ｃｙｓ−Ａｓ
ｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ一Ｇｌｙ−ＰｒＯ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ
−Ａｒｇ−ＧＩｙ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ一？ｕ−Ｓｅｒ−Ｇ
Ｉｙ−Ｔｈｒ上Ｅｕ−Ｔｒｐ−？ｕ−Ｔｙｒ一ＰｒＯ−
Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰｒＯ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔ
ｒｐ一Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ上Ｙｓ−Ａｌａ−Ｈｉｓ
−Ｇｌｙ−ＰｒＯ一′ｎ−１ｒ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒ
ｐ−Ｃｙｓ−Ｃｙａ上Ｙｓ−ＧｌｎＯこの連鎖は分子量
５１８３ドールトン（ＤａｌｔＯｎｓ）に相当する。ア
ミノ酸成分としてここで使用される略号を用いた名称は
次の通りである。

アントプロイリンーＡは、中性および低ＰＨ値で比較的
安定であり、脱イオン水に極めて溶解性である。

アントプロイリンーＡは、さらに薬学的特性によつて特
徴付けられることができる。

薬学特性が示すアントプロイリンーＡは、分離したモル
モツトの心房で１．１×１０−３Ｍで、ＥＤ５Ｏを示し
、陽性変力作用においてウーアバイン（０ｕａｂａｉｎ
）の効力の約２００−１００＠である。マウスのＬＤ５
Ｏ（１．ｐ．腹腔内）は約０．２〜０．３ｍ９１ｋ９で
ある。それはいかなる周期変動作用をも示さない。アン
トプロイリンーＡの３Ｘ１０−８Ｍ濃度では、次の酵素
：Ｎａ．Ｋ−ＡＴＰアーゼ、モノアミンオキシターゼ、
カテコ−ルー０−メチルトランスフェラーゼ、サイクリ
ツク３″・５″−ヌクレオチドホスホジエステラーゼは
阻害されず、また、モルモツトの心臓の３″・５″−サ
イクリツクＡＭＰ含有量にも影響しない。アントプロイ
リンーＡはウーアバインほどにＣａ＋＋濃度に敏感では
ない。ＡＰ−Ａは低Ｃａ＋＋濃度・の存在下で心房の陽
性変力作用を示す。低められた外部のＫ＋はウーアバイ
ンほど薬剤毒性を増大しない。アントプロイリンーＡは
、ラット、モルモツト、ウサギ、ネコおよびイヌの分離
した心臓において、そしてイヌおよびネコの正常所在の
心臓において有効な強心剤であることを示している。そ
れは血圧には無視し得る影響を有し分離した血管筋肉に
ははつきりと示し得る機械的影響は有しない。実施例１ アントプロイラキサントグラミカからアントプＯ ロイ
リンーＡの分離段階ａ一抽出 アントプロイラキサントグラミカ（プラント）標本を集
め、９５％エタノールで保護し抽出前４℃で貯蔵した。

湿つた流出させたイソギンチヤク５（５．５ｋ９）を２
Ｃ７ｎより小さい切片にカットし、３０％エタノール２
７ｅで５分間ブレンダーにおいてバッチで均質化した。
このエタノール量は、標本を防腐するために用いたエタ
ノールを含有する。混合液を時折攪拌しながら２０℃で
１週間放置させたままにし、次いで６層のチーズクロス
で枦過した。淵過を４０゜Ｃ以下で約２．５′にフラッ
シュ蒸発させ、バッチで充分な攪拌によりクロロホルム
１２．５ｅで分配し、続いて３紛２７０００×ｙで遠心
分離した。これはクロロホルム溶解物１３ｙ１界面固形
物１９．５ｙおよびアントプロイリンーＡを含有する水
溶解物２５６ｇ（凍結乾燥重量）を生成した。段階ｂ−
ゲル透過クロマトグラフイーアントプロイリンーＡを含
有する粗水溶性抽出物２５６ｙを除外限度３００００（
フアーマシア・ファイ）ン・ケミカルスから得られた）
を有するセフアデツクスＧ−５０でクロマトグラフ分離
するために４０等分に分けた。

湿潤セフアデツクスＧ−５０（ＶＯ．＝８２５ｍｔ）２
６００瓦Ｌを含有するカラム５３×８．３ｃ７ｎをクロ
ロホルム（微生物の増殖を防ぐため）で飽和した０．１
ＭＮＩ（１ＨＣ０３で平衡を保つた。アントプロイリン
ーＡを含有する粗水溶性抽出物６．４ｑを含有する水５
０ｍｔをカラムに入れ、０．１ＭＮＨ４ＨＣ０３により
室温下８〜９ｍ１／分で溶離した。次の表１は収集した
各留分のＶｅ／ＶＯ値の範囲を第１欄において、各留分
の凍結乾燥から生じた残渣量を第２欄において示すもの
である。前述の生物検査の部分で述べたとおり実施した
分離ラット心房の収縮力生物検査の結果は、表１の第４
欄に示される。

切片ＡＮＥおよびＦにおいては、活性がないことを結果
は示した。留分Ｃは強心活性約９９％を含有した。従つ
て、留分Ｃの６．４ｙのすべては、段階ａで得られた粗
水溶物２５６ｙから製造された。段階ｃｍイオン交換ク
ロマトグラフィー 段階ｂて得た留分ｃの６１０ｍ９部をＰＨ７．５の０．
０３ｒ！４Ｎａ×（ＰＯ４）ｙ緩衝液５ｍ１に溶解し、
クロロホルムて飽和した同様の緩衝液で平衡にした湿潤
カチオン交換樹脂ＣＭ−セフアデツクスＣ−２５（フア
ーマシア・ファイン・ケミカルから得た）６００ｍ１を
含有する４８×４ｃｍカラム（ＶＯ＝２０５ｍ１）に装
填した。

緩衝液１５００ｍ１（７）攪拌貯蔵器をカラムに接続さ
せ、緩衝液１１０ＴｒＬ１がカラム中に流れたのち、貯
蔵器の容積を勾配溶離のため、ＰＨ７．５に調節した０
．０３ＭＮａ×（ＰＯ４）ｙ緩衝液（イ）．５ｒ！４Ｎ
ａＣ１中）を供給することによつて一定に維持した。両
溶液一をクロロホルムで飽和した。流出速度約３ｍ１１
ｍｉｎを維持し、操作を室温で行なつた。流出液をイン
スツルメント●スペシヤルテイーズ●カンパニー、Ｐ．
Ｏ．ボックス５２４７４７００スーペリアストリート、
リンカーン、ネブラスカ６８５０５から得たモデ．ルＵ
Ａ−５アブソーバンス●モニター（ＡＭｃｄｅｌＵＡ−
５Ａｂｓ０ｒｂａｎｃｅＭ０ｎｊｔ０ｒ）により２８０
ｒ１７ｎ，におけるＵ．Ｖ．吸収を使用して監視した。
２．９９〜３．３９のＶｅ／ＶＯ範囲を有し、Ｖｅ／Ｖ
Ｏ３．ｌ７が中心の留分を留分Ｇと称し、前述の生物検
査で示した生物検査に従つて活性であることを見出した
。

留分Ｇを凍結乾燥し、塩と混和したアントプロイリンー
Ａを含有する物質６１０ｍｇを得た。留分Ｇを−２０℃
で保持し、薬学研究のすべてに使用した。アントプロイ
リンーＡは、段階ｂで得た凍結乾燥留分Ｃとして、また
は凍結乾燥留分Ｇとして１年間−２０℃に保つた場合、
劣化の徴候は示さなかつた。留分Ｇの場合、ＰＨ４．５
５〜７．８０の１０−７Ｍ溶液中２０．５℃で少なくと
も２肴間安定であるが、ＰＨＩｌ以上では約９０％強心
活性の低下を示した。段階ｄ一分析用精製段階ｃで得た
留分Ｇをさらに除外範囲３００００を有するセフアデツ
クスＧ−５０のゲル淵過クロマトグラフィー（フアーマ
シア・ファイン・ケミカルス）によつて精製した。

湿潤Ｇ−５０５２ｍ１を含有する５０ｍ１ビユレツト（
５４×１．２ｃｍ）（■ｏ＝２１．１ｍ１）をクロロホ
ルムで飽和した０．０１７ＭＣＨ３Ｃ００Ｈ（ＮａＣｌ
中０．０３Ｍ）で平衡にした。１０２．６ｍｇ留分Ｇ溶
液は０．４７７！ｌに溶解した。

Ｈ２Ｏをカラムに装填し、平衡溶液て室温下に溶離した
。留分ＨをＶｅ／ＶＯｌ．８６が中心のＶｅ／ＶＯｌ．
６６〜２．１６に収集した。２８０ｒ１Ｔ１．でＵ．Ｖ
．吸収物質は、留分Ｈの前には現われなかつたが、わず
かに痕跡がそれ以後現われたに過ぎない。

留分Ｈを凍結乾燥し、アントプロイリンーＡ２Ｏｍ９（
ＮａＣｌ含有）を得た。段階ｅ一説塩塩を除外範囲７０
０を有するセフアデツクスＧ−１０（フアーマシア・フ
ァイン・ケミカルスから得た）を詰めたカラムを用いて
除去した。

段階ｄで得た留分Ｈ２Ｏｍ９を、１０％ＮａＣｌＯ．３
ｍｌに溶解し、クロロホルムで飽和した０．０１７Ｈ酢
酸で平衡にした５４ｍ１湿潤セフアデツクスＧ−１０を
詰めた５９×１．２礪カラムに装填した。試料に１０％
ＮａＣｌＯ．５ｍｔ次いで平衡溶液を続けて加えた。ア
ントプロイリンーＡはボイド容積（Ｖｅ／ＶＯＯ．９３
〜１．１２）に完全に、そしてはつきりと現われ塩を含
まなかつた。これを直ぐ凍結乾燥し、３０〜８０％純度
アントプロイリンーＡｌ．４ｍ９を得た。段階ｆ一連合
した不活性ポリペプチドの除去段階（ａ）〜（ｅ）で示
した方法で得たペプチド（２００ｍｇ）を蒸溜水１０ｍ
１に溶解し、蒸溜水中セフアデツクスＧ−２５ファイン
のカラム（３４×２．０ｃｒｆｔ）に置いた。

蒸溜水での溶離はＶｅ／ＶＯｌ．３〜１．７で７５％純
粋な活性ペプチド（９０％）のバルクを製造し、一方、
活性ペプチドの残部を０．？ＮＨ４ＯＡｃで純粋に溶離
した。凍結乾燥ペプチド（１１３ｍｇ）を蒸溜水に再溶
解させ、酢酸でＰＨ２．７に調節した０．０５Ｍピリジ
ンで平衡にしたセレツクスーＳＥセルロース（バイオ・
ラット●ラボラトリーズ、リツチモンド、カリフォルニ
ア）のカラム３０×１．５ｄに入れた。活性ペプチドを
０．１Ｍピリジンアセテートに相当する範囲で０．０５
ＭピリジンアセテートＰＨ２．７および０．？ピリジン
アセテートＰＨ３．ｌの各３００ｍｔの線状勾配によつ
て純粋に溶離し、凍結乾燥し、純度９５％より大のアン
トプロイリンーＡ８Ｏｍ９を得た。実施例２ 注射用却−Ａの無菌懸濁液 実施例１で得たアントプロイリンーＡを約１０ｍｇ加水
分解ゼラチンに対しアントプロイリンーＡ３．５μダの
範囲に無菌加水分解ゼラチンと混合し、無菌ヴアイアル
に詰め、通常の技術を用いて窒素雰囲気下で封じた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ アミノ酸連鎖： Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ａ
   ｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｖａ
   ｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ
   −Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−
   Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇ
   ｌｙ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌ
   ａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ
   −Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎを有するアントプロ
   イリン−Ａと呼ばれるペプチド。 ２（ａ）イソギンチヤクを水または水−アルコール性混
   合液で抽出し、（ｂ）抽出物をＮＨ＿４ＨＣＯ＿３で溶
   暗される架橋結合デキストランカラムのゲル濾過クロマ
   トグラフィーをうけしめ活性留分を収集して凍結乾燥し
   、（ｃ）活性留分をＮａＣｌ勾配を有するリン酸塩緩衝
   液で溶離されるカチオン交換樹脂カラムのクロマトグラ
   フィーをうけしめ、活性留分を収集、凍結乾燥すること
   を特徴とするイソギンチヤクからアントプロイリン−Ａ
   を製造する方法。 ３（ｄ）（ｃ）において得た活性留分をＮａＣｌ溶液で
   溶離される架橋結合デキストランカラムのクロマトグラ
   フィーをうけしめ、活性留分を収集して凍結乾燥し、（
   ｅ）（ｄ）において得た活性留分を稀酢酸で溶離される
   架橋結合デキストランカラムのクロマトグラフィーによ
   つて脱塩し、活性留分を収集し、凍結乾燥することを特
   徴とする特許請求の範囲第２項の方法。 ４ イソギンチヤクがアントプロイラキサントグラミカ
   である特許請求の範囲第２項の方法。 ５ 次の段階： （ａ）イソギンチヤクアントプロイラキサントグラミカ
   を３０％エタノール水で抽出し、（ｂ）抽出物を０．１
   ＭＮＨ＿４ＨＣＯ＿３溶液で溶離される除外限度３００
   ００を有する架橋結合カルボキシメチルデキストランカ
   ラムのゲル濾過クロマトグラフ処理をうけしめ、活性留
   分を収集して凍結乾燥し、（ｃ）活性留分をｐＨ７．５
   および０．５ＮＮａＣｌの勾配を有する０．０３Ｍリン
   酸塩緩衝液で溶離される弱酸性カチオン交換樹脂カラム
   のクロマトグラフィーをうけしめ、活性留分を収集し凍
   結乾燥することからなることを特徴とする特許請求の範
   囲第４項の方法。 ６（ｄ）（ｃ）において得た活性留分をＮａＣｌ中で０
   ．０３Ｍである０．０１７Ｍ酢酸で溶離される除外限度
   ３００００を有する架橋結合デキストランカラムのクロ
   マトグラフ処理をうけしめ、活性留分を収集して凍結乾
   燥し、（ｅ）（ｄ）において得た活性留分を除外限度７
   ００を有する架橋結合デキストランカラムに該活性留分
   溶液を入れ、続いて２０％塩化ナトリウム溶液を入れ、
   ０．０１７Ｍ酢酸で溶離することによつて脱塩し、活性
   留分を収集し、凍結乾燥することを特徴とする特許請求
   の範囲第５項の方法。 ７ 製薬上認められる担体と混合または併用したアミノ
   酸連鎖：Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｃ
   ｙｓ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅ
   ｒ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ
   −Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−
   Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓ
   ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｌｙ
   ｓ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ
   −Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎを
   有するアントプロイリン−Ａと呼ばれるペプチドからな
   ることを特徴とする鬱血性心臓不全治療用製剤。