DE2822842C2

DE2822842C2 - Verfahren zur Herstellung von CoA-SPC Bäckerhefeextrakt sowie Reagenz zum Nachweis von Krebs beim Menschen

Info

Publication number: DE2822842C2
Application number: DE2822842A
Authority: DE
Inventors: Edsel Tony Bucovaz; John Coulter Morrison; Stanely Joseph Memphis Tenn. Tarnowski jun.; Walter David Whybrew
Original assignee: Research Corp
Current assignee: Research Corp
Priority date: 1978-04-26
Filing date: 1978-05-24
Publication date: 1982-11-11
Also published as: LU79828A1; ES470603A1; NL7806621A; GB1602949A; SE7806030L; GB1602950A; IT7826418A0; BE868253A; US4261967A; AU517496B2; DE2822842A1; IT1099584B; FR2424284A1; JPS54143515A; AU3624078A; FR2424283A1; DK233978A; ATA437978A; DD143629A5; CA1117879A

Description

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die überstehende flüssige Fraktion aus Stufe b) wärmedenaturiert.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die wärmedenaturierten Proteine entfernt

4 Verfahren nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß man die Stufe bl) mit 0.01 bis 2,0 N anionenhaltigem wäßrigem Medium herauslöst

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die überstehende flüssige Fraktion aus Stufe b) im wesentlichen von Bäckerhefekomponenten mit einem Molekulargewicht von mehr als 1000 und weniger als 400 befreit.

6. Reagenz zum Nachweis von Krebs beim Menschen, das eine aus Bäckerhefe extrahierte, einen Coenzym A synthetisierenden Proteinkomplex enthaltende Proteinfraktion (CoA-SPC Bäckerhefeextrakt) und die Substrate ATP oder dessen Salz, D-Pantothensäure oder deren Salz und/oder L-Cystein oder dessen Salz enthält, dadurch gekennzeichnet, daß als CoASPC Bäckerhefeextrakt der nach den Ansprüchen 1 bis 5 Hergestellte enthalten ist.

7. Reagenz nach Anspruch 6, dadurrh gekennzeichnet, daß es einen pH-Wert von 6,2 bis 7.6 besitzt.

8. Reagenz nach Anspruch 6 oder 7. dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eines der Substrate radioaktiv markiert ist.

9. Reagenz nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Puffer in einer zur Aufrechlerhaltung des pH-Wertes wirksamen Menge enthält.

10. Reagenz nach einem der Ansprüche 6 bis 9. dadurch gekennzeichnet daß es 0.01 bis lOmmol ATP oder dessen Salz; 0.01 bis l.Ommol D-Pantothensäure oder deren Salze und/oder 0.01 bis 0,6 mmol L-Cystein oder dessen Salze enthält

11. Reagenz nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß es 0,01 bis 0,1 ml des Extfaktes'und bis zu 0,8 ml des Puffers je ml Reagenz enthält. es

12. Reagenz nach einem der Ansprüche 6 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß es als radioaktives Substrat [³⁵S]- oder ['⁴C-U]-L-Cystein oder [¹⁴C]-

D-Pantothensäure enthalt

13. Reagenz nach einem der Ansprüche 6 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß es pro ml Lösung 0,04 bis 0,06 ml CoA-SPC Bäckerhefeextrakt, 1,5 bis 5 mmol ATP oder dessen Salze, 0,5 bis 0,6 mmol D-PantGihensäure oder deren Salz, 0,05 bis 0,15 mmo! L-Cystein oder dessen Salze und bis zu 0,8 ml eines Puffers, der den pH-Wert des Reagenz im Bereich von 6,5 bis 7,2 hält, und als Rest destilliertes Wasser enthält, wobei das L-Cystein in radioaktiver [³⁵S]- oder [¹⁴C- U]-Form und/oder die D-Pantothensäure in radioaktiver [^HC]-Form vorliegt.

14. Reagenz nach einem der Ansprüche 6 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß ATP als Dinatriumsalz und D-Pantothensäure als Halbcalciumsaiz vorliegt und ein Puffer vorhanden ist, der 0,001 bis 250 mmol Tris-acetat 0,01 bis 50 mmol Magnesiu,.racetat und 0,001 bis 250 mmol KCI enthält

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von CoA-SPC Bäckerhefeextrakt, der praktisch frei von proteolytischen Enzymen ist sowie ein Reagenz zum Nachweis von Krebs beim Menschen.

Gemäß einem älteren Vorschlag ist ein Verfahren zum Nachweis eines im Serum von Krebspatienten vorkommenden, spezifischen Proteins durch Zugabe eines bindefähigen Proteins zu einer Serumprobe vorgesehen, bei dem als bindefähiges Protein ein solches verwendet wird, das durch Einwirkung einer aus Bäckerhefe extrahierten, einen Coenzym A synthetisierenden Proteinkomplex (CoA-SPC) enthaltenden Proteinfraktion auf die drei Substrate ATP oder dessen Salz, D-Pantothensäure oder deren Salz und L-Cystein oder dessen Salz gewonnen wird (DE-OS 26 48 458). Dieses Verfahren gestattet den Nachweis von Krebs in frühen Entwicklungsstadien, bevor irgendwelche leicht sichtbar beobachtbaren Symptome aufgetreten sind. Es wurde gefunden, daß das Blutserum von Krebspatienten ein spezifisches Protein (B-Protein) enthält das beim Krebspatienten modifiziert ist und mit Krebs in Zusammenhang gebracht werden kann. Durch eine einfache Analyse des Blutserums auf B-Protein ist es möglich, festzustellen, ob ein Patient Krebs hat oder nicht, bevor irgendwelche sichtbaren Symptome auftreten.

Nach dem älteren Vorschlag reagiert das Reagenz, das CoA-SPC Bäckerhefeextrakt und die vorstehend erwähnten Substrate enthält, mit Protein im Blutserum von Menschen unter Bildung eines Komplexes. Die Eigenschaften dieses Komplexes hängen davon ab, ob das B-Protein anwesend ist oder nicht. Die Anwendung dieses Reagenzes bietet somit eine einfache Möglichkeit für Kontrolluntersuchungen für den Nachweis von Krebs beim Menschen.

Nach der älteren Anmeldung wird CoA-SPC Bäckerhefeextrakt erhalten, der eine erhebliche Menge Verunreinigungen, insbesondere andere Proteine, enthäli, die in der Bäckerhefe Vorhanden sind, wobei die beschriebenen Reinigungsverfahren zeitaufwendig und kostspielig sind. Die Lagerungseigenschaften, des so hergestellten CoA-SPC sind unbefriedigend. Wenn das CoA-SPC gefriergetrocknet und gelagert wird, verliert es einen erheblichen Anteil seiner Aktivität Im übrigen sinkt die Aktivität von CoA-SPC, das auf -20°C

eingefroren gelagert wird, im Verlaufe der Zeit unannehmbar ab.

In einer beim 174. American Chemical Society Meeting vom 28. August bis 3. September 1977 verteilten Zusammenfassung mit dem Titel »Preparation of the Yeast Component of the B-Protein Assay«, ist ein Verfahren zur Herstellung von CoA-SPC-Bäkkerhefeextrakt beschrieben, der noch proteinartige Verunreinigungen enthält, die aus der festen Fraktion der lysierten Bäckerhefezellen durch eine Komponente der überstehenden Fraktion herausgelöst wurden. Der nach dieser Technik hergestellte CoA-SPC Bäckerhefeextrakt enthält neben CoA-SPC auch andere proteinartige Verunreinigungen, die die Lagerungseigenschaften der bekannten Extrakte empfindlich beeinträchtigen.

Aufgabe der Erfindung ist demgemäß ein Verfahren zur Herstellung von CoA-SPC-Bäckerhefeextrakt mit hoher Reinheit, der praktisch frei von proteolytischen Enzymen ist und der mit nur einem minimalen Aktivitätsverlust gefriergetrocknet und gelagert werden kann.

Die Lösung dieser Aufgabe ist in den Patentansprüchen definiert.

Der erfindungsgemäß hergestellte CoA-SPC-Bäckerhefeextrakt enthält weit weniger zusätzliche proteinartige Materialien, so daß er über lange Zeitspannen ohne Aktivitätsverlust stabil gelagert und auch gefriergetrocknet werden kann.

Die in der Stufe b) gebildete überstehende flüssige Fraktion enthält niedermolekulare Komponenten, die aus der in Stufe b2/ verbleibenden festen Fraktion in Gegenwart von Nitrat oder Chlori "'.onen CoA-SPC herauslösen.

Die niedermoleku.are Komponente -"sr Bäckerhefe, welche das in den Bäckerhefezellen befindliche CoA-SPC löslich macht und im nachfolgenden als »t-Faktor« bezeichnet wird, kann nach irgendeiner der herkömmlichen Verfahrensweisen erhalten werden, die zur Lysis von Bäckerhefezellen bestimmt sind oder nach Verfahrensweisen, mit denen Zellmaterialien aus Hefezellen extrahiert werden, wie Schallbehandlung, Homogenisierung, Flügelpresse (French Press), lytische Enzyme mit nachfolgendem osmotischen Schock als auch Behandlung der Hefe in siedendem Wasser.

Handelsüblich erhältliche Hefen wurden mit Erfolg angewandt.

Vorzugsweise wird der t-Faktor entweder (1) durch Einfrieren der Hefe in einer ÄtherCO^-Mischung, wie es in der älteren DE-OS 26 48 458 für die Herstellung von CoA-SPC beschrieben ist oder (2) durch Einfrieren von vorzugsweise zerbrökelter Bäckerhefe in flüssigem N; zum Einfrieren der Zellen und nachfolgendes Auftauen erhalten. Bei beiden Verfahrensweisen (I) oder (2) müssen die festen und flüssigen Fraktionen μ getrennt wi-rden. wenn gereinigter CoA SPC Bäckerhefeextrakt gewünscht wird.

Wenn die Verfahrensweise (1) angewandt wird und auch ein COA SPC liäckerhefeextrakt gewonnen werden soll, muß der t-Faktor. der in der flüssigen Fraktion eo vorliegt, von der festen Fraktion, welche das unlösliche CoA-SPC und andere unlösliche proteinartige Materialien enthält, wirksam abgetrennt werden, so daß eine CoA-SPC enthaltende Fraktion erzeugt wird, die im wesentlichen frei vom t-Faktor ist. Zu geeigneten Trenntechniken gehören Zentrifugieren, Ultrafiltration, Säulenchromatographie und dergleichen. Nach Wunsch, kann die aufgetaute Hefeprobe einer ersten Trennung zur Entfernung von intakten Hefezellen durch eine geeignete Technik unterworfen werden, wozu Dekantieren, Zentrifugieren mit geringer Geschwindigkeit und dergleichen gehören. Die bevorzugte Trenntechnik umfaßt ein relativ hochtouriges Zentrifugieren, zweckmäßigerweise mit mindestens 4000 bis 5000 g, vorzugsweise mindestens 10 000 g und insbesondere etwa 105 000 g oder mehr. Es sollte ausreichend lange zentrifugiert werden, um die notwendige Trennung zu erreichen. Bei höheren Zentrifugiergeschwindigkeiten ist die Trennung natürlich schneller zu erreichen als bei niedrigen Zentrifugierbedingungen. Die Zentrifugierdauer beträgt 10 Minuten bis 2 Stunden, wobei auch längere Zentrifugierzeiten angewandt werden können, jedixh keinen Vorteil bieten. Im allgemeinen wird das Zentrifugieren etwa 1 Stunde lang durchgeführt.

Die überstehende Fraktion des Zentrifugiervorgangs kann, wie sie ist, als Quelle für den t-Faktor zum Löslichmachen des CoA-SPC dienen. Vorzugsweise wird jedoch der t-Faktor vor der Verwendung weiter gereinigt Die zusätzliche Reinigung kann eine Denaturierung mit nachfolgendem Dekantieren und zusätzlichem Zentrifugieren umfassen. Die Denaturierung wird gemäß einer bevorzugten Ausführungsform durch Erhitzen der den t-Faktor enthaltenden überstehenden Fraktion auf eine ausreichende Temperatur zur Denaturierung der wärmedenaturierbaren Komponenten der Fraktion erreicht. Temperatur und Zeitdauer der Denauturierung sind nicht kritisch, wobei höhere Temperaturen kürzere Erhitzungszeiten zulassen. Typischerweise wird die Denaturierung bei 50 bis 100⁰C 3 Minuten bis 24 Stunden lang durchgeführt Temperaturen von etwa 80° C für Behandlungszeiten von etwa 5 Minuten ergeben zufriedenstellende Resultate. Vorzugsweise kann die den t-Faktor enthaltende denaturierte überstehende Flüssigkeit zentrifugiert und dann gesammelt werden. Die Zentrifugiergeschwindigkeit ist nicht kritisch und kann von 5000 g bis 105 000 g reichen, wobei sich ein Zentrifugieren bei 105 000 g oder darüber als zufriedenstellend erwiesen hav. Die i-eitrifugierdauer ist nicht kritisch und beträgt 10 Minuten bis 2 Stunden. Eine Zentrifugierdauer von etwa 1 Stunde ergibt zufriedenstellende Ergebnisse. Die resultierende überstehende Flüssigkeit enthält einen t-Faktor, der im wesentlichen frei von wärmedenaturierbaren Proteinen ist.

Vorzugsweise, kann die überstehende Fraktion weiteren Behandlungen zur Steigerung der Reinheit des t-Faktors unterworfen werden. Zu solchen Behandlungen können Filtrieren und Ultrafiltration. Dialyse. Papier- oder Säulenchromatographie. Ausfällung oder irgendeine Kombination derselben gehören, /ur Erzielung jiner Fraktion, dip praktisch frei von Material mit einem Molekulargewicht über 25 000 ist und vorzugsweise im wesentlichen frei von Material mit einem Molekulargewicht über 1000. insbesondere im wesentlichen frei von Material mit einem Molekulargewicht von mehr aK 1000 und weniger als 400. Der t-Faktor selbst hat ein Molekulargewicht von veniger als 1000. Bezüglich der Ultrafiltration erweist sich das Molekulargewicht als geringer als 500_: Gemäß einer Sephadex-Chromatographie liegt das Molekulargewicht zwischen 400 und 1000. Die Diskrepanz resultiert wahrscheinlich daher; daß die benutzte Ultrafiltrationsmembran auch Moleküle mit einem höheren Molekulargewicht als 500 durchläßt.

Es wurde gefunden, daß die Membran CoA mit einem Molekulargewicht von etwa 800 mit gleicher Geschwin*

digkeit durchläßt wie eine Verbindung mit einem Molekulargewicht von 500 oder weniger. Demgemäß liegt das Molekulargewicht des t-Fakiors sehr wahrscheinlich zwischen 400 und 1000.

Das von der einleitenden Trennung der flüssigen und festen Phase der aufgetauten Hefe aufgesammelte feste Material wird nun zur Gewinnung von CoA-SPC weiter behandelt. Diese Gewinnung wird nachfolgend im einzelnen beschrieben.

Die zwjte Verfahrensweise zur Erzielung des t-Faktors umfaßt ein Einfrieren der Hefe auf tiefe Temperaturen, wie den die Bäckerhefe (vorzugsweise in zerkrümelter Form) in flüssigen Stickstoff zum Einfrieren der Zellen eingebracht wird Die Eintauchdauer in flüssigen Stickstoff ibt nicht kritisch, solange sie zum Einfrieren der Zellen ausreicht Sie kann von 5 Minuten bis zu einer Stunde reichen, obgleich längere Zeiten angewandt werden können, die jedoch keinen Vorteil bringen. Kürzere Zeiten können vorgesehen werden, wenn die Zellen gefroren sind.

Die gefrorenen Zellen werden nachfolgend aufgetaut. Die aufgetaute Mischung enthält »aufgelöste« Zellen, intakte Zellen und lösliche Zellkomronenten von beiden. Die festen und flüssigen Fraktionen werden voneinander getrennt, da der t-Faktor prinzipiell in der flüssigen Phase vorhanden ist, wobei herkömmliche Techniken wie Zentrifugieren, Filtrieren, Dialyse und dergleichen angewandt werden. Vorzugsweise wird die Trennung durch Zentrifugieren mit ausreichender Geschwindigkeit und Zeitdauer zur Erzielung der Trennung erreicht Die Zentrifugiergeschwindigkeit liegt zweckmäßigerweise bei mindestens 4000 g, vorzugsweise bei mindestens 10 000 g und insbesondere uei etwa 105 000 g. Die Zentrifugierdauer hängt von der Intensität ab. Generell wird mindestens 10 Minuten lang zentrifugiert, vorzugsweise mindestens 30 Minuten lang. Ein einstündiges Zentrifugieren mit 105 000 g hat sich als zufriedenstellend erwiesen, obgleich längere oder kürzere Zeitdauern vorgesehen werden können.

Die so gesammelte flüssige Fraktion kann direkt als Quelle ^rjr den t-Faktor zum Löslichmachen des CoA-SPC in den Hefezellen dienen. Vorzugsweise wird jedoch die den t-Faktor enthaltende überstehende Fraktion weiteren Reinigungen wie Denaturierung, Dialyse. Filtrieren, Ultrafiltration, Ausfällung und Chromatographie unterworfen. Kombinationen dieser Reinigungsverfahren können ebenfalls angewandt werden. Die Reinigung muß derart durchgeführt werden, daß die die niedermolekularen Bestandteile enthaltende Fraktion zurückgehalten bzw aufbewahrt wird, da sich der t-Faktor als vergleichsweise niedermolekular erweist mit einem Molekulargewicht von wahrscheinlich 1000 oder darunter.

Die bevorzugte Reinigungsweise umfaßt als erstes eine Denaturierung der denaturierbaren Proteine in der t-faktorhaltigen überstehenden Flüssigkeit. Die Denaturierung erfolgt insbesondere durch Heizen auf eine Temperatur und für eine Zeitdauer die ausreichen, die wärmedenaturierbaren Proteine zu denaturieren. Allgemein können Temperaturen von 50 bis 100°C, vorzugsweise 75 bis 85°C vorgesehen werden. Die Zeitdauer, für welche die Mischung aufgeheizt wird hängt von der Temperatur ab; sie reicht jedoch allgemein von 3 Minuten bis 24 Stunden. Die Erhitzungsdauer wird derart gewählt, daß die gewünschte Denaturierung erzielt wird. Bei Temperaturen von etwa 8O⁰C haben sich Heizbehandlungszeiten von 5 bis 10 Minuten als zufriedenstellend erwiesen. Die resultierende Mischung kann als t-Faktorquelle zum Löslichmachen des CoA-SPC dienen. Vorzugsweise wird die Mischung jedoch zur Entfernung der wärmedenaturierten Proteine behandelt.

Die denaturierten Proteine können durch Anwendung herkömmlicher Verfahrensweisen wie Zentrifugieren, Filtrieren, Dialyse und dergleichen entfernt werden. Ein Zentrifugieren wird wegen seiner Einfacnheit bevorzugt. Die anwendbare Zentrifugierbehandlung entspricht derjenigen, die zuvor zur Trennung der flüssigen und festen Phasen beschrieben wurde. Ein 30minütiges Zentrifugieren mit etwa 105 000 g hat sich als zufriedenstellend erwiesen.

Die resultierende überstehende Flüssigkeit kann direkt als die t-Faktorquelle für die CoA-SPC Auflösung angewandt werden. Vorzugsweise werden jedoch irgendwelche hochmolekularen Komponenten entfernt, bevor die überstehende Flüssigheit als t-Faktorquelle benutzt wird. Vorzugsweise werden solche Komponenten mit einem Molekulargewicht von mehr als 25 000 entfernt und insbesondere solchp -Tiit einem Molekulargewicht über etwa !000. Das hei> <1, die Fraktionen mit Komponenten mit Molekulargewichten von gleich oder weniger als 25 000, vorzugsweise etwa 1000 oder weniger und insbesondere mit einem Molekulargewicht von 400 bis 1000 werden als Quelle für den t-Faktor benutzt Solche Fraktionen können unter Anwendung herkömmlicher Techniken wie Filtrieren, Dialyse, Ultrafiltration, Chromatographie, Ausscheidung und Kombinationen derselberi erhalten werden. Die genaue Verfahrensweise ist nicht kritisch.

Eine typische Verfahrensweise umfaßt eine Dialyse gegen verminderten Druck unter Anwendung einer Membran, die die meisten Komponenten mit einem Molekulargewicht von mehr als 15 000 bis 20 000 zurückhält Der verminderte Druck ist nicht kritisch und kann von 16 bis 931 mbar reichen. Die t-Faktoraktivität findet sich im Dialysat. Alternativ kann die überstehende Flüssigkeit unter Anwendung eines Mediums filtriert werden, welches Materialien mit einem Molekulargewicht von 25 000 oder mehr zurückhält. Der t-Faktor 'indet sich im Filtrat Das Dialysat oder das Filtrat können direkt als Quelle für den t-Faktor zum Löslichmachen des CoA-SPC dienen.

Vorzugsweise wird das Dialysat oder Filtrat einer Ultrafiltration und Chromatographie unterworfen, um Materialien mit einem Molekulargewicht von mehr als 1000 oder weniger als 400 abzutrennen. Das Filtrat wird dann als Quelle für den t-Faktor zum Löslichmachen des CoA-SPC angewandt. Durch Anwendung der beschriebenen Techniken ist es möglich, einen t-Faktor von gewünschter Reinheit zu erzielen. Nach einer simplen Denaturierung durch Aufwärmen der t-faktorhaiiigen überstehenden Flüssigkeit, wie weiter oben beschrieben, wird eine 1,5-fache Reinigung erzielt. Ein Filtrieren zur Entfernung der Fraktion mit einem Mitekulargewicht über 25 000 vom denaturierten Material führt zu einem t-Faktor mit einer etwa 3-fachen Reinheit. Nichtgereinigter t-Faktor kann zum Löslichmachen des CoA-SPC von den Hefez'.ilen dienen, jedoch wird ein t-Faktor mit zumindest 1,5-facher Reinheit bevorzugt und insbesondere wird ein t-Faktor mit einer zumindest 3-fachen Reinigung angewandt. Es ist möglich, einen t-Faktor mit einer bis zu 900-fachen Reinheit, nach Wunsch, herzustellen, der zum Löslichmachen von CoA-SPC dienen kann. Ein t-FaktOf mit einer 540- bis 625-fachen Reinheit kann ohne weiteres erhalten werden. Ein t-Faktor mit so hoher Reinheit ist jedoch für die

Herstellung von CoA-SPC von hoher Reinheit gemäß der Erfindung nicht erforderlich.

Die t^Faktorreinheit wird wie folgt berechnet: Gesamtfeststoffgewicht in der zur Erzielung von 1 ml gereinigtem t-Faktor ausreichenden rohen überstehenden Flüssigkeit

Reinigungsfaktor

Gesamtfeststoflgewicht in 1 ml aufgesammeltem gereinigten t-Faktor

IO

Der CoA-SPC Bäckerhefeextrakt wird durch Einfrieren der Bäckerhefe in einer CO>Äther Mischung, wie in der DE-OS 26 48 458 beschrieben oder in einer Flüssigstickstoff-Äther Mischung hergestellt. Bei diesen Verfahrensweisen können andere organische Lösungs· mittel, welche CoA-SPC nicht inaktivieren, angewandt werden. Vorzugsweise sind diese Lösungsmittel leicht von den »lysierten« Zellen nach dem Auftauen ci'iiief i"iuäf. vjccigncic i^OäüügSiTiiiiGi, Zu uC"Cn γλΟΟιΟΓι, Toluol, Chloroform. Butanol und dergleichen gehören. können an Stelle von Äther benutzt werden. Die Temperaturen, denen die Hefe ausgesetzt wird, sind solche, bei denen Hefe gefriert und vorzugsweise liegt die Temperatur der Mischung bei -70 bis -195⁰C. insbesondere -72 bis - 77°C. Die Zeitdauer, für welche die Hefe diesen Temperaturen ausgesetzt wird, hängt von der Temperatur und der Hefemenge ab. Die Zeitdauer muß nur zum Einfrieren der Hefezellen ausreichen, wobei längere Perioden, nach Wunsch, angewandt werden können. Die gefrorene Hefe wird dann aufgebaut. Wenn eine Äthermischung zum Einfrieren der Hefe benutzt wurde, wird der restliche Äther entfernt. Das unlösliche CoA-SPC ist in der festen Fraktion enthalten, während der t-Faktor in der flüssigen Fraktion enthalten ist. Die beiden Fraktionen werden unter solchen Bedingungen abgesondert, daß die feste Fraktion im wesentlichen frei von t-Faktor ist. Geeignete Trenntechniken sind solche, wie sie vorstehend ?ur Her ellung des t-Faktors nach der Technik (1) angegeben wurden.

Das aufgesammelte Zellmaterial enthält nicht nur unlösliche-, CoA-SPC, sondern auch andere unlösliche proteinartige Materialien sowie andere Verunreinigun gen. Da die Anwesenheit des t-Faktors zum Löslichmachen des CoA-SPC. jedoch nicht der anderen unlöslichen proteinartigen Materialien notwendig ist besteht die Möglichkeit zu einer selektiven Auflösung dieser anderen unlöslichen proteinartigen Komponenten der Hefe. Dieses Löslichmachen kann durch simples Rühren. Rühren in einem wäßrigen Medium und dergleichen durchgefühi ι werden. Geschwindigkeit und Ausmaß des Löslichmachens können durch die Zugabe von Salzen wie von Chloriden, Nitraten, Acetat und dergleichen erhöht werden. Vorzugsweise wird ein Chloridionen enthaltendes wäßriges Medium angewandt Der kationische Anteil des Salzes könnte durch irgendein Kation gebildet werden, das die CoA-SPC Aktivität inhibiert So sollten die Salze von Quecksilber, Blei, Zink, Eisen und Lithium vermieden werden. Andere Salze können jedoch angewandt werden. Salze von Kalium, Natrium, Magnesium, Calcium und Mangan wurden mit Erfolg benutzt Insbesondere können KCl, NaAc, Tris-puffer und dergleichen angewandt wer Jen. Durch geeignete Auswahl der Rührzeit und Anionenkonzeniration kann die Entfernung von soviel oder es sowenig von diesen anderen proteinartigen Materialien, wie erwünscht sein mag, erreicht werden. Allgemein haben sich Konzentrationen an Anionen und vorzugsweise Chlofidionen von 0,01 bis 2,0 N als zufriedenstellend erwiesen, und bevorzugt werden Konzentrationen von 0,026 bis 1,ON und insbesondere 0,47 bis 0,73 N. Höhere Anionenkonzentrationen können vorgesehen werden, jedoch bieten sie keinen besonderen Vorteil. Unabhängig vöii der lottertkonzeniration geht aktives CoA-SPC in Abwesenheit von t-Faktor nicht in Lösung.

Der pH-Wert des Mediums während der Auflösung dieser anderen unlöslichen proteinartigen Materialien kann im sauren, basischen oder neutralen pH^Bereich liegen. Bevorzugte pH-Bereiche liegen bei 5,0 bis 8 und insbesondere 5,6 bis 5,9.

Der pH-Wert kann durch Zugabe von praktisch irgendeinem Säure- oder Basenpuffer wie Tris-acetat und NaAc (Acetat) aufrechterhalten werden.

Das so löslich gemachte proteinartige Material wird vom Zellmaterial, welches das unlösliche CoA-SPC enthält, durch herkömmliche Techniken wie Zentrifu-

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glCICIf (litt IUUUIi UO l\t-J UUU 5 IUI JU ITirilUll,!! UIIU Dekantieren der das zusätzliche Protein enthaltenden überstehenden Flüssigkeit, Filtrieren und dergleichen abgetrennt.

Das gewonnene Zellmaterial kann nach Wunsch mit Wasser gewaschen werden, um irgendwelche Restverunreinigungen oder löslichen proteinartigen Materialien, die durch das Trennverfahren nicht eliminiert wurden, abzutrennen. Das gewaschene Zellmaterial wird dann a. ein wäßriges Medium eingeführt das Chlorid- oder Nitrationen enthält Die Chlorid- oder Nitrationenquelle isi nicht kritisch und umfaßt solche Materialien, wie sie weifer oben erwähnt wurden. Die Konzentrationen an Chlorid- oder Titrationen beeinflußt die Geschwindigkeit, mit welcher der t-Faktor das CoA-SPC löslich macht. Demgemäß ist es erwünscht daß eine minimale Chlorid- oder Nitrationenkonzentration von 0,02 N λ orhanden ist Geringere Konzentrationen werden zwar eine Durchführung gestatten, jedoch wird die Aufiösungsrate niedrig sein. Die maximale Chlorid- oder Nitrationenkonzentration liegt bei etwa 2 N (75 mg/ml). Da das CoA-SPC oder die t-Faktorquelle oder beide wahrscheinlich einige endogene Chloridionen enthalten werden, ist es nicht wesentlich, daß Chlorid- oder Nitrationen zum wäßrigen Medium zugesetzt werden. Vorzugsweise wird jedoch die Chloridionenkonzentration auf zumindest 0.40 N eingestellt oder es werden ausreichend Nitrationen zur Erzielung dieser Konzentration zugegeben, um eine zufriedenstellende Auflösungsrate zu erreichen. Besonders bevorzugt werden Chlorid- oder Nitrationenkonzentrationsbereiche von 0,47 bis 0,73 N.

Der pH-Wert des wäßrigen Mediums während der Auflösung des CoA-SPC liegt zweckmäßigerweise bei 5 bis 8, vorzugsweise bei 5 bis 6 und insbesondere bei 5,6 bis 5,9. Der pH-Wert kann durch Zugabe von geeigneten Säuren, Basen oder Puffern wie Natriumacetat und Tris-Acetat eingestellt werden. Der pH-Wert muß jedoch nicht eingestellt werden, und man kann allein Wasser beim Lösüchmachen anwenden.

Die Menge des t-Faktors oder t-faktorhaltigen Extrakts, die zugesetzt wird, bestimmt die Geschwindigkeit mit der das CoA-SPC löslich gemacht wird. Die zum Löslichmachen des CoA-SPC angewandte t-Fakionnerige kann diejenige sein, wie während oei" einleitenden Verarbeitung der Bäckerhefe gewonnen wurde. Der t-Faktor kann in Form der überstehenden Flüssigkeit zugesetzt werden, die ursprünglich von dem aufgetauten Zellmaterial abgesondert wurde. Die Gesamtmenge dieser überstehenden Flüssigkeit kann

hinzugegeben werden oder auch nur eine Fraktion derselben wie 1/8, 1/4, 1/2, 3/4 etc. Zur Gewinnung von CoA-SPC mit einer hohen Reinheit wird die Anwendung einer t-faktorhaltigen Mischung bevorzugt, die durch irgendeine der vorstehend beschriebenen Verfahrensweisen gereinigt wurde.

Der t-Faktor kann vom löslich gemachten CoA-SPC d;!fch Dialyse oder Filtrieren durch eine Membran, welche Komponenten mit einem Molekulargewicht von mehr als 100 000 zurückhält, wiedergewonnen werden. Das Filiräl oder Dialysat kann dann mir Erzielung von gereinigtem t-Faktor durch Anwendung der vorstehend beschriebenen Verfahrensweisen behandelt werden. Nach Wunsch, kann gereinigter t-Faktor direkt durch Dialyse oder Filtrieren durch eine Membran erzielt werden, welche solche Komponenten zurückhält, die ein Molekulargewicht von mehr als 1000 aufweisen. Durch Rückgewinnung und Wiederverwendung des t-Faktors ist es tncgüch,größer? !-Fak''>rrn?pg^|?n 7>im I-nsliphmnchen von CoA-SPC anzuwenden, als in der ursprünglichen Probe vorhanden sind, aus der das CoA-SPC gewonnen wird. So kann der t-Faktor von so vielen Hefeproben, wie man wünscht, zurückgehalten und zum Löslichmachen von CoA-SPC aus irgendeiner Hefemenge benutzt werden. Diese Verfahrensweise stellt eine wirtschaftliche Technik zur Erhöhung der Lösungsrate dar. Der zum Löslichmachen des CoA-SPC angewandte t-Faktor kann derjenige sein, der durch die vorstehend beschriebene Verfahrensweise (2) erhalten wurde.

Der gemäß dieser bevorzugten Verfahrensweise erzeugte CoA-SPC Bäckerhefeextrakt ist im wesentlichen frei von proteolytischen Enzymen. Die Gegenwart von proteolytischen Enzymen in nach dem älteren Verfahren hergestellten CoA-SPC Bäckerhefeextrakten führt zu Produkten mit unbefriedigenden Lagerungseigenschaften. Der erfindungsgemäß hergestellte CoA-SPC-Bäckerhefeextrakt verliert wegen seines verminderten Gehalts an proteolytischen Enzymen bei Gefriertrocknen und Lagerung wesentlich weniger Aktivität. Der erfindungsgemäß hergestellte Extrakt zeigt auch überlegene Lagerungseigenschaften bei Aufbewahrung im gefrorenen Zustand bei - 20° C.

Außerdem erfordert der erfindungsgemäß hergestellte CoA-SPC-Bäckerhefeextrakt weniger ATP Substrat zur Bildung des beim Krebsnachweisverfahren gemäß der älteren DE-OS 26 48 458 angewandten Bindungsproteins. Im übrigen hat der erfindungsgemäß hergestellte CoA-SPC-Bäckerhefeextrakt eine verbesserte CoA-SPC Aktivität pro mg Protein im Vergleich zu dem bislang verfügbaren Extrakt. CoA-SPC-Bäckerhefeextrakt hat ein Molekulargewicht von etwa 200 000 und wird zusammen mit den Substraten L-Cystein, D-Pantothensäure und ATP als Reagenz zum Nachweis von Krebs beim Menschen verwendet. Durch die Wechselwirkung von CoA-SPC-Bäckerhefeextrakt mit L-Cystein, D-Pantothensäure und ATP wird ein Bindungsprotein gewonnen, das zur Komplexbildung mit Blutserumprotein befähigt ist, wie es in der älteren DE-OS 26 48 458 beschrieben ist

Die Erfindung wird unter Bezugsnahme auf die nachfolgenden Beispiele erläutert

Beispiel 1
Prüfung der CoA-SPC Aktivität

Die CoA-SPC Aktivität wurde durch Verwendung von L-Cystein, D-Pantothensäure oder ATP mit

65 radioaktiver Markierung ermittelt. Eine typische Reaktionsmischung enthielt: 4,70 mmol Dinatrium-ATP, 0,5 ml Puffer A (mit 0,10 mol Tris-acetat; pH 7,2; 0,02 mol Magnesiumacetat; 0,05 M KCl); 0,50 mmol Calciumsalz von D-Pantothensäure; 0,50 mmol [³⁵S]-L-Cystein (18 000 lpm); 0,05 ml der zu prüfenden überstehenden Fraktion und Wasser für ein Gesamtvolumen von 1 ml. Reaktionsmischung ohne ATP dienten zur Bestimmung des Nullwerts der Aktivität.

Die Reaktionsmischung enthaltende Röhrchen wurden 1 Stunde lang bei 36°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 2 ml 1O°/oiger TCA und 5 Minuten langen Erhitzen der Röhrchen in einem siedenden Wasserbad beendet. Die Röhrchen wurden abgekühlt und die CoA-SPC enthaltenden denaturierten Proteinausscheidungen wurden durch Filtrieren gesammelt unter Verwendung eines Millipore Filtergeräts und von Whatman No. 3 MM Papierscheiben. Die auf den Filtern gesammelten Ausscheidungen wurden 4mal mit je etwa 2 rnl Wasser gewaschen. Die Scheiben wurden getrocknet und dann in Szintillationsampullen überführt; die vorhandene Radioaktivität wurde in einem Nuclear Chicago Flüssigkeitszintillationszähler unter Anwendung der von Hoskonson und Khorona in J. Biol. Chem. 240 (1965) Seiten 2129-35 beschriebenen Szintillationsflüssigkeit ermittelt.

Prüfung der t-Faktoraktivität

Das angewandte Prüfverfahren zum Nachweis der Anwesenheit von t-Faktor war wie folgt:

Die auf ihre t-Faktoraktivität zu prüfende Fraktion wurde ti Stunden bei 4°C mit vom rohen Hefezellysat durch einstündiges Zentrifugieren mit 105 000 g gewonnenem, gewaschenem Bodensatzmaterial gerührt und außerdem mit soviel KCl versetzt, daß eine Endkonzentration von 5 mg/ml resultiert. Anschließend an die Rührstufe wurde die Mischung mit 105 000 g eine Stunde lang zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit, wie oben beschrieben, auf ihre CoA-SPC Aktivität hin geprüft. Für Kontrollproben wurde Bodensatzmaterial 17 Stunden lang mit 0,05 mol Tris-acetat bei ph 7,2 mit einem Gehalt von 5 mg/ml KCl und mit der überstehenden Fraktion von 105 000 g bei Abwesenheit von außen zu geführtem KCl gerührt.

Herstellung von CoA-SPC-Bäckerhefeextrakt

Etwa 454 g frische Bäckerhefe wurden in einen geeigneten Behälter mit 0.7 kg wasserfreiem Äthyläther zerkrümelt Zum Einfrieren der Hefe wurden 3 kg Trockeneis zugesetzt Die gefrorene Hefe wurde 7 Stunden lang auf 23 bis 24° C aufgetaut Restlicher Äther und CO2 wurden von dem aufgetauten Hefezellysat durch Unterdruck, wie in der DE-OS 26 48 458 beschrieben, entfernt

Das Hefezellysat wurde in drei gleiche Teile unterteilt und gemäß der folgenden Verfahrensweisen behandelt: Ein Drittel des Lysats verblieb als rohes Lysat (Verfahren I); das zweite Drittel Lysat wurde (Verfahrensweise II) mit 105 000 g eine Stunde lang zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit gesammelt; der dritte Teil des Hefezellysats wurde (Verfahrensweise III) mit 1000 g 10 Minuten lang bei 4° C zentrifugiert, um intakte Hefezellen zu entfernen. Die Zellen wurden verworfen und die verbleibende Suspension 20 Minuten lang bei 4° C mit 105 000 g zentrifugiert Sowohl der Bodensatz als auch die überstehende Fraktion wurden gesammelt Letztere wurde 5 Minuten lang auf 8O⁰C erhitzt 1 Stunde fang mit 105 000 g zentrifugiert und

durch ein Käsetuch dekantiert und aufgesammelt. Der Bodensatz wurde zum Auswaschen des Materials erneut 2mal in 0,05 mol Tris-acetat bei pH 7,2 suspendiert und nachfolgend eine Stunde lang mit 105 000 g zentrifugiert. Eine Portion des gewaschenen Bodensatzmaterials wurde (Verfahrensweise lila) erneut in der erhitzten überstehenden Fraktion, die durch Zentrifugieren auf 105 000 £ wie bei der Verfahrensweise III suspendiert. Eine weitere Portion des gewaschenen Bodensatzmaterials wurde (Verfahrensweise 11 Ib) in 0,05 mol Tris-acetat bei pH 7,2 suspendiert. Eine Endkonzentration von näherungsweise 5 mg von außen zugeführten (exogenem) KCI pro ml wurde zu den Proben der Verfahrensweisen I₁ II, IHa und 1Mb zugesetzt, wonach ein mechanisches Rühren aufgenommen und 17 Stunden lang bei 4° C fortgesetzt wurde.

Anschließend an den 17stündigen Rührvorgang, durch den CoA-SPC allmählich in Lösung geht, wurden die Mischungen der Verfahrensweisen I. II. IHa und IHb eine Stunde lang mit 105 000 g zentrifugiert und Bodensatz und überstehende Fraktion abgesondert. Jede überstehende Fraktion wurde bezüglich der CoA-SPC Aktivität unter Verwendung von L-Cystein, D-Pantothensäure oder ATP als radioaktives Spurenelement getestet.

Die Proben der Verfahrensweise I und Verfahrensweise HIa enthielten eine CoA-SPC Aktivität, wie durch das Ausmaß an meßbarer Radioaktivität in den TCA Ausscheidungen oder Niederschlägen ermittelt wurde. Die Proben der Verfahrensweise IHb (die gewaschenen Bodensatz gemischt mit 0,05 mol Tris-acetat bei pH 7,2 enthielt) und gemäß Verfahrensweise II waren frei von CoA-SPC Aktivität. Mithin scheint eine Komponente (t) in der überstehenden Fraktion zum Löslichmachen von CoA-SPC erforderlich zu sein.

Dieses Ergebnis läßt zwei wichtige Eigenschaften von CoA-SPC erkennen: (1) CoA-SPC scheint an außerordentlich schwere, unlösliche Hefezellkomponenten bzw. eine solche Komponente gebunden zu sein und bleibt in diesem Zustand, wenn nicht Bedingungen, wie sie für die Verfahrensweise I und die Verfahrensweise IHa beschrieben wurden, auftre'.^n; (2) Eine lösliche Komponente der Hefezelle ist für die Freigabe oder das Löslichmachen von CoA-SPC wesentlich. Da diese lösliche Zellkomponente nicht identifiziert worden ist, wurde sie im vorstehenden t-Faktor genannt.

Beispiel 2

454 g Bäckerhefe wurde zum Einfrieren der Zellen in flüssigen Stickstoff gekrümelt. Die gefrorenen Zellen wurden dann aufgetaut — die aufgetaute Mischung enthielt Iysierte Zellen, intakte Zellen und lösliche Zellkomponenten von beiden. Die Mischung wurde 1 Stunde lang bei 4°C mit 105 000 g zentrifugiert Die flüssige Fraktion wurde in ein anderes Gefäß dekantiert und 10 Minuten lang auf 8O⁰C erhitzt zur Entfernung wärmedenaturierbarer Proteine aus der Mischung. Nach der Hitzebehandlung wurde die Mischung erneut 30 Minuten lang mit 105 000 g zentrifugiert Die erhaltene überstehende Flüssigkeit wurde unter Anwendung von No. 8 Schlauch unter verminderten Druck von 931 bis 16mbar dialysiert Die gesamte nachweisbare t-Faktoraktivität war im Dialysat anwesend Bei einigen Präparationen wurde ein zur Dialyse alternativer Schritt angewandt Die erhitzte überstehende Fraktion wurde filtriert, und zwar durch Amicon Cenfriflo Filterkegel (CF 25), die Materialien mit einem Molekulargewicht von 25 000 oder mehr zurückhalten.

In diesem Falle erscheint der t-Faktor im Filtrat. Das t-faktorhaltige Dialjöat oder Filtrat wurde zwei aufeinanderfolgenden Ultrafiltrationsschritten unterworfen. Bei der erstell Ultrafiltration wurde ein Amicon UM-2 Filter (Riickhaltevermögen für Materialien mit einem Molekulargewicht von mehr als 1000) angewandt. Bei der zweiten Ultrafiltration wurde das t-faktorhaltige LJM-2 Filtrat durch (Rückhaltevermögen für Materialien mit einem Molekulargewicht von mehr als 500) geschickt. Der t-Faktor war im UM-05 Filtrat anwesend. In Anbetracht der Ultrafiltrationsschritte scheint der t-Faktor ein Molekulargewicht von 500 oder weniger zu haben, jedoch ist es bekannt, daß gewisse Verbindungen wie CoA mit einem Molekulargewicht von 800 durch dieses Filter hindurchgehen. Die Säulenchromatographie besagt, daß der t-Faktor ein Molekulargewicht zwischen 400 und 1000 hat.

Die CoA-SPC Aktivität wurde vor dem Löslichmachen nicht aufgezeigt; die Ermittlung der t-Faktoraktivität basiert daher gemäß indirekter Prüfung auf der Anwesenheit von CoA-SPC Aktivität nach dem Löslichmachen. Das Ausmaß der nach 17 Stunden laufenden Rühren vorhandenen CoA-SPC Aktivität scheint in direkter Beziehung zur in der geprüften Fraktion anwesenden t-Faktorkonzentration zu stehen.

Beispiel 3
Trypsin- und Pmteasebehandlungdes t-Faktors

Die offensichtliche CoA-SPC Lösefähigkeit des t-Faktors läßt t-Faktorfunktionen als proteolytisches Enzym erscheinen. Eine Portion des Amicon UM-5 Filtrats wurde in 4 ml aliquoten Teilen gefriergetrocknet. Ein aliquoter Teil des Filtrats wurde in 10 ml 0,13 M Ammoniumbicarbonatlösung aufgelöst und mit 100 ]ig Trypsin (zweimal umkristallisiert) versetzt. Der pH-Wert der Lösung wurde mit INNH₄OH auf 8,0 eingestellt. Eine Kontrollprobe wurde in ähnlicher Weise hergestellt, nur daß das Trypsin durch 2 Minuten langen Sieden vor seiner Zugabe zum gefriergetrockneten UM-05 Filtrat inaktiviert wurde. Zwei weitere aliquote Teile wurden einer Zersetzung durch Protease (Sigma, Strep, griscus: wiedergereinigter Typ VI) ausgesetzt. Zu einem aliquoten Teil des gefriergetrockneten Filtrats, gelöst in 10 ml 0,13 molarer Ammoniumbicarbonatlösung, wurden 100 μg Protease zugesetzt und der pH-Wert mit IN HCl auf 72 eingestellt. Eine Kontrolle für Protease wurde in identischer Weise hergestellt, nur daß das Enzym vor seiner Zugabe zum gefriergetrockneten UM-05 Filtrat 2 Minuten zum Sieden erhitzt wurde. Alle vier Proben wurden 6 Stunden lang bei 36°C inkubiert und der pH-Wert überwacht Nach der Inkubation wurden die enzymatischen Reaktionen durch 3 Minuten Sieden beendet Denaturierte proteolytische Enzyme wurden durch Zentrifugieren entfernt und die überstehenden Flüssigkeiten bei 4°C unter verminderten Druck durch No. 8 Schlauch dialysiert Die Dialysate wurden bis zur Trockne gefriergetrocknet und in 4 ml H₂O aufgelöst Der pH-Wert wurde bei Bedarf mit INHCl auf 5,8 eingestellt Kaliumchlorid wurde für eine Endkonzentration von 5 mg/ml zugesetzt und die Dialysate wurden mit gewaschenem Bodensatzmaterial vermischt das von der CO2-Äther Präparationsmethode erhalten wo^en war. Eine Prüfung der CoA-SPC Aktivität ergab, daß Trypsin- und Proteasekontrollen eine Aktivität aufwiesen. Zusätzlich hatten die Reaktionsmischungen, bei denen Trypsin und Protease nicht

inaktiviert worden waren, den gleichen Pegel an CoA-SPC Aktivität. Diese Ergebnisse sprechen in hohem Maße dafür, daß der t-Faktor keine Peptidbindungen enthält.

Wärmebehandlung des t-Faktors

Das UM-05 Filtrat wurde auch bezüglich der Wärmestabilität überprüft. Dabei wurde weniger als eine 10%ige Abnahme der t-Faktoraktivität nach 24 Stunden Erwärmen auf 80°C beobachtet. Mithin scheint der t-Faktor unter diesen Bedingungen stabil zu sein, Insbesondere da der nachweisbare Verlust an t-Faktoraktivität während der ersten 10 Minuten Hitzebehandlung auftritt. Irgendwelche beobachteten Verluste der t-Faktoraktivität scheinen auf spezifische Eigenheiten der Verfahrensweise zurückzugehen.

Tabelle ί

Einfluß unterschiedlicher Salze auf das Inlösiinggeheri von CoA-SPC

zugesetzte Komponenten')
t-Faktor

ρ«»,Λ*ίίτιΐΓ»ίτί wnn K f*\ rvrlpr ("""hlnriHinnpn

Von lußen zugeführte (exogene) Chlorid- oder Nitrationen und t-Faktor scheinen für ein maximales Inlösunggehen von CoA-SPC wesentlich zu sein (Tabelle I). Wegen der Anwesenheit von endogenen Chloridionen in den t-faktorhaltigen Fraktionen wurde eine gewisse CoA-SPC Aktivität ohne die Zugabe von Chlorid zum Rührkolben nachgewiesen. KCl in H2O oder in 0,05 M Tris-acetat bei pH 7,2 in Abwesenheit von t-Faktor setzt dagegen kein CoA-SPC frei. Es wird angenommen, daß der t-Faktor für die Freigabe von CoA-SPC spezifisch notwendig ist, jedoch ist die anschließend an das Rühren von Bodensatzmaterial mit t-Faktor und KCl in der überstehenden Fraktion anwesende Proteinmenge größer als die Proteinmenge, die auf CoA-SPC allein zurückgehen könnte. Das heißt, es wird auch zusätzliches Protein löslich gemacht. Es ist bekannt, daß viel des zusätzlichen löslich gemachten Proteins auf mechanisches Rühren und Salzkonzentration zurückgeht.

Wie aus Tabelle I hervorgeht, scheint gerade das Chlorid- oder Nitration für das Inlösunggehen von CoA-SPC wesentlich zu sein und nicht das Kation. Mono- und Dichloridsalze mit äquivalenten Chloridionenkonzentrationen erwiesen sich als gleich gut für das Löslichmachen von CoA-SPC. Die Zugabe von Salzen, welche kein Chlorid oder Nitrat enthalten (wie z. B. KAc NaAc, Na₂SO₄), erhöhen das Niveau der CoA-SPC Aktivität nicht über das für endogenes Chlorid angegebene Maß. Mithin scheinen die geprüften Salze, die keine Chlorid- oder Nitrationen enthalten, keine Funktion bezüglich der Auflösung von CoA-SPC zu besitzen. Die Chlorid- oder Nitrationen können in irgendeiner herkömmlichen Form zugesetzt werden, wie in Form von Salz. Allerdings scheinen Kationen wie Li, Hg, Pb, Zn und Fe die katalytische Aktivität von CoA-SPC zu inhibieren. Kationen wie K, Na, Mn, Mg und Ca haben sich insgesamt als geeignet erwiesen.

Bei weiteren Untersuchungen wurden Versuche mit [³⁶Cl]-NaCl durchgeführt, um festzustehen, ob das Ch'oridion seine Wirkung durch Bindung an CoA-SPC, schwere Komponenten des Hefezellysats oder den t-Faktor ausübt Die Ergebnisse dieser Versuche geben keinen Hinweis für eine ³⁶Cl--Bindung an irgendeine dieser Fraktionen. Das heißt falls eine ³⁶C1--Bindung stattfindet wird die Bindung zwischen ³⁶Cl- und seinen Bindungszeniren während der Gewinnung bzw. Isolierung von CoA-SPC, anderen Zellkomponenten oder des t-Faktors für die Untersuchung aufgebrochen.

	CoA-SPC
Salz	Aktivität
	rpi· Mol
	5,2
KCl	19,8
KCl²	0,5
NaCl	18,2
MgCl₂	19,3
CaCl₂	25,0
MnCI₂	29,3
LiCl'	0.3
KC₂H₃O₂	7,6
NaC₂H₃O₂	4,9
KJ	3,1
Na₂SO₄	5,2
KNO₃	18,9
Ca₃(PO₄),	0,1
CaCI₂	0,2

Ij (+) bedeutet zugesetzten t-Faktor; (-) besagt daß entwederder t-Faktor oder das Salz von der Mischung weggelassen wurde. Die mittlere endogene Cl-Konzentration (von verschiedenen Hefeansätzen) lag bei 0,92 mg/ml derüberstehenden Fraktion des Zellysats bei 105000 g. Die zugesetzten 5 mg/ml exogenes KCl sind auf das gesamte Hefezellvolumen bezogen. Dies entspricht 25 mg/ml exogenen KCl für die überstehende Fraktion bei 105 000 g. Andere geprüfte Salze wurden näherungsweise auf die KCl-Konzentration eingestellt.

2) KCl in Abwesenheit des t-Faktors wurde in 4 ml Wasser gelöst und dann mit dem Bodensatzmaterial gemischt, wie es bei der „Prüfung der t-Faktoraktivität" beschrieben ist.

3) Anionen die mit Kationen wie Li, Hg, Pb, Zn, Fe assoziiert sind, scheinen die katalytische Aktivität von CoA-SPC zu inhibieren.

Darüber hinaus scheint der t-Faktor seine Wirkung nicht durch Bildung einer stabilen Bindung mit CoA-SPC oder anderen Zellkomponenten auszuüben, da der t-Faktor nach dem Inlösunggehen -^n CoA-SPC mehrere Male durch Dialyse rückgewonnen und ohne offensichtlichen Aktivitätsverlust wieder verwendet werden kann.

Bäckerhefezellen enthalten proteolytische Enzyme und andere Enzyme, die für CoA-SPC, sein Substrat oder Produkt, das heißt, das Bindungsprotein schädl: ■'· sein können. Das CoA-SPC, wie es gemäß der älteren DE-OS 26 48 458 erhalten wird, enthält wesentliche Mengen von diesen Enzymen und nachweisbare Konzentrationen an Protease A, B und C. Die maximale Reinheit die mit dem in der älteren Anmeldung beschriebenen Verfahren erzielt werden kann, ist etwa 36fach. Das erfindungsgemäß hergestellte CoA-SPC wird zumindest 45fach gereinigt und im allgemeinen zumindest 50fach. Reinheiten von 50fach sind ohne weiteres erhältlich und ergeben ein CoA-SPC, das frei von nachweisbaren Konzentrationen ar Protease A, B und C ist Ferner werden die meisten der anderen proteo'ytischen und hydrolytischen Enzyme — unabhängig davon, ob sie in Vakuolen oder in periplasmi·· sehen Räumen löslich sind — durch die erfindungsgemäße Verfahrensweise zur Erzielung von CoA-SPC entfernt. Der erfindungsgemäß hergestellte CoA-SPC-Bäckerhefeextrakt kann somit als frei von nachweisba-

ren Konzentrationen an Proteasen A, B und C charakterisiert werden.

Die Reinheit des CoA-SPC wird wie folgt berechnet:

Reinheitszahl =

Zählwert pro rain pro mg

gebilligtes Lösucgsprotein

Zählwert pro min pro mg

rohes Lösungsprotein

wobei der Zählwert pro min pro mg Proteinlösung, wie in Beispiel 1 beschrieben, ermittelt wird, und zwar gemäß:

Zähl« ert/min/mg
Lösungsprotein

Zählwert/min/ml Lösung mg Protein/ml Lösung

15

Nach Wunsch, kann der t-Faktor in einer sehr hoch gereinigten Form hergestellt werden, so daß er im wesentlichen frei von allen proteinartigen Materialien ist. Folglich wurden alle nachweisbaren proteolytischen und anderen Enzyme im löslichen Anteil des Zellysats, aus dem der t-Faktor gereinigt wurde, entfernt. Zusätzlich werden durch die erfindungsgemäßen Verfahrensweisen vom t-Faktor das endogene Substrat D-Pantothensäure und L-Cystein ebenso wie alle anderen löslichen Komponenten mit einem Molekulargewicht über 1000 und weniger als 400 abgetrennt.

Das Auswaschen des Feststoffs, der sich durch Lysis der Hefezellen mit nachfolgender Salzextraktion, wie vorstehend beschrieben, ergibt, entfernt unerwünschte proteinartige Materialien, so daß CoA-SPC mit hoher Reinheit, erhalten wird. Dieses hochreine CoA-SPC hat sich ais gefriertrocknungs- und lagerungsstabil sowie als stabil bei einer Lagerung in Lösungen bei — 20⁰C erwiesen. Nach einer Aufbewahrungsdauer von 4 Monaten hat die Aktivität des CoA-SPC praktisch nicht abgenommen. Dies stellt eine bedeutende Verbesserung gegenüber dem in der älteren Anmeldung (DE-OS 26 48 458) beschriebenen CoA-SPC dar. Das gemäß dieser älteren Anmeldung hergestellte CoA-SPC verliert 25 bis 100% der Aktivität nach einer Lagerung von etwa 4 Monaten.

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Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von CoA-SPC Bäckerhefeextrakt, der praktisch frei von proteolytisehen Enzymen ist, wobei man

a) Bäckerhefezellen Iysiert

b) das Bäckerhefe-Zellysat in feste und überstehende flüssige Fraktionen trennt,

dadurch gekennzeichnet, daß man,

bl) aus der festen Fraktion aus Stufe b), von CoA-SPC verschiedene, proteinartige Materialien herauslöst,

b2) die in Stufe bl) gelösten proteinartigen Materialien von der verbleibenden festen Fraktion abtrennt und

el) aus der in Stufe b2) verbleibenden festen Fraktion mit der überstehenden flüssigen Fraktion aus Stufe b), in Gegenwart von Nitrat- oder Chloridionen, CoA-SPC herauslöst