DE1642596B2 - Verfahren zur herstellung eines immobilisierten enzyms - Google Patents
Verfahren zur herstellung eines immobilisierten enzymsInfo
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Description
Enzymkörper, die aus mindestens einem Enzym und
einer Lösung eines semipermeablen Materials wie
Polyamid, Polyvinylacetat, Cellulosenitrat, Cellulose-
20 acetat, Äthylcellulose, Kautschukchlorid oder Lipoiden
besteht, wobei die entstandene Lösung anschließend getrocknet wird. Demgegenüber ist der Träger in der
Die Anwendung enzymatischer Reaktionen in der vorliegenden Erfindung ein Polyurethanschaumstofi'
J chemischen Analyse ist in den letzten Jahren immer mit poröser oder neuartiger Struktur, der sich beim
|| wichtiger geworden, insbesondere für die Analyse 25 Auflösen und anschließendem Abdampfen des Loll
von biochemischen Substanzen, z. B. Blut und anderen sungsmittels und Trocknen nicht wieder als Schaump
Körperflüssigkeiten. Die Analyse von Körperflüssig- stoß" zurückbilden würde. Diese semipermeablen
I keiten unter Verwendung von Enzymen ergibt sehr Materialien besitzen beispielsweise nur eine geringe
§j schnelle Resultate und ist von großer Wichtigkeit Durchlässigkeit für Flüssigkeiten. Außerdem besteht
I beispielsweise für die Festlegung der richtigen Behänd- 30 die Gefahr, daß die extrem kleinen Poren sehr leicht
I lung eines Patienten. Ein Beispiel einer solchen Ana- von den zu untersuchenden Flüssigkeiten (z. B. Blut
fp lysenmethode ist beschrieben. Danach können Enzyme, oder Urin) verstopft werden.
I z. B. Glucoseoxydase und Katalase, als Katalysatoren Gegenstand der Erfindung ist. nun das im Patent-
I bei Acalysenmethoden, z. B. bei der Überwachung des anspruch definierte Verfahren.
$ Blutes auf den Glucosegehah gemäß der folgenden 35 Die offenzellige, netzartige Struktur ermöglicht eine
|· Reaktion verwendet werden: hohe Durchflußgeschwindigkeit der Materialien, auf
I welche die immobilisierten Enzyme einwirken sollen.
1 C6H12Oe + O2 + CH3CH2OH Gleichzeitig wild trotz der hohen Durchflußgeschwin-
I -> C6H12O7 + H2O + CH3CHO digkeit eine sehr wirksame Umwandlung der Mate-
I 40 rialien erreicht.
I Die Glucosemenge in einer gegebenen Blutprobe Der Schaumstoff ist porös oder netzartig und ge-
I wird bestimmt, indem beispielsweise polarographisch stattet den schnellen Durchgang einer Flüssigkeit, ins-
I die Sauerstoffmenge gemessen wird, die im Reagens besondere einer wäßrigen Lösung.
I vor der Zugabe des Blutes und nach der Vollendung Polyurethan-Schaumstoffe, z. B. Polyesterpolyure-
I der Reaktion gemäß der vorstehenden Gleichung 45 than-Schaumstoffe, sind besonders geeignet.
I vorhanden ist, weil die verbrauchte Sauerstoffmenge Die Diazoniumverbindung muß eine Carboxyl-
I die Glucosemenge anzeigt, die für die Reaktion mit gruppe enthalten. Geeignet sind beispielsweise p-Ami-
I dem Sauerstoff unter Bildung von Gluconsäure ver- nohippursäure, p-Aminophenylessigsäure, p-Amino-
I fügbar ist. Diese Reaktion findet in einer Strömungs- 4-phenylbuttersäure, p-Aminobenzoesäure, p-Amino-
I kammer statt, in der Blut, Enzyme und Lösungsmittel 50 phenoxyessigsäure oder p-Aminophenylalanin.
j; zusammengegeben werden. Da die Enzyme an der Zu den Proteinen, die sich als besonders geeignet
i Reaktion nicht teilnehmen, können sie vom Reak- erwiesen haben, gehören menschliches Serumalbumin,
I tionsprodukt abgetrennt und wiederverwendet werden. Rinderovalbumin, Rinderkollagen und Casein, aber
j Mit der vorstehend beschriebenen Analysenmethode die gleichen Proteine aus anderen Quellen und andere
; werden zwar äußerst zuverlässige Analysenergebnisse 55 Proteine, die reaktionsfähige Stellen für das zu immo-
erhalten, jedoch hat sie den Nachteil der Abhängig- bilisierende Enzym aufweisen, können ebenfalls ver-
keit von der Verwendung von »freien« Enzymen, d. h. wendet werden.
ig, Enzymen, die sich im Reaktionssystem lösen. Die Auf- Immobilisierte Enzyme sind besonders vorteilhaft
Sf bewahrung solcher Enzyme ist äußerst schwierig, und bei biochemischen Analysen der vorstehend beschrie-
|| verhältnismäßig umständliche Systeme sind erfor- 60 benen Art. Bei Verwendung von immobilisierten
fi derlich, um geeignete Reaktionskammern zu bilden. Enzymen, die nach dem Verfahren gemäß der Erfin-
ife Ferner ist der Verlust einer gewissen Enzymmenge dung hergestellt worden sind, ergibt sich eine Ein-
|fr unvermeidlich, wenn das Enzymreagens vom Reak- sparung hinsichtlich der erforderlichen Enzymmenge.
!§. tionsprodukt für die Rückführung in das Reaktions- Diese Einsparung wird vergrößert durch die lange
s| system abgetrennt wird. Alle diese Nachteile werden 65 Zeit, während der diese immobilisierten Enzyme aktiv
|S durch die hohen Kosten der Enzyme noch verstärkt. bleiben. Ferner ergibt sich eine wesentliche Verringe-
H Die britische Patentschrift 9 12 897 beschreibt die rung der Größe, des Gewichts und der Kompliziert-
Si Herstellung von hochmolekularen Verbindungen, die heit des Analysensystems, weil Enzymlösungsbehälter,
>« 3 4
l Trennvorrichtungen und Kreislaufvorrichtungen nicht bis 5000 Einheiten) enthielt, wurde zur Tränkung der
f mehr erforderlich sind. Da Enzyme mit höherer Scheibe aus Albumin-Polyurethan-Diazohippurat ver-
Ir spezifischer Aktivität verfügbar gemacht werden wendet. Eine Lösung von DCC (1 g in 10 ml Tetra-
% können, werden die Reaktionszeiten verkürzt. Bei- hydrofuran) bei etwa O0C vuurde zugesetzt, wobei die
I spielsweise hat sich bei Anwendung der Immobili- 5 Scheibe wiederholt ausgedrückt wurde, um die erhal-ψ*
sierungsmethode gemäß der Erfindung gezeigt, daß tene Lösung in der ganzen Sicheibe zu verteilen.
4~ Glucoseoxydase und -katalase ihre Aktivität bis zu Die Scheibe wurde dann in einem Glasgefäß
- , 48 Stunden behalten. 48 Stunden bei 5° C mit dem Enzymgemisch kräftig
$~ Die nach dem Verfahren gemäß der Erfindung her- geschüttelt. Nach dem Schütteln wurde das Gemisch
^ gestellten immobilisierten Enzyme können auch in xo 16 Stunden gerührt, um etwaiges nicht umgesetztes
anderen Analysensystemen verwendet werden. Immo- DCC zu hydrolysieren. Nach Filtration in einem
'i bilisierte Enzyme eignen sich zur Messung von Re- Büchner-Trichter wurde die Scheibe auf dem Filter
« aktionsgeschwindigkeiten, beispielsweise der Geschwin- reichlich mit einem Gemisch von Tetrahydrofuran
, ä digkeit von elektrochemischen Reaktionen, die an und Wasser gewaschen, um etwaiges nicht umgesetztes
Elektroden stattfinden. Ferner sind die immobili- 15 DCC und eine gewisse Menge des durch Hydrolyse
iierten Enzyme gemäß der Eifindung überaus gute des DCC gebildeten Bicyclohexylharnstoffs zu lösen.
Medien für die Untersuchung von immobilisierten Nach der Wäsche wurde die Scheibe in eine verdünnte
I Enzymen selbst. Natriumbicarbonatlösung gehängt und durch Fuji;''
B e i s ρ i e 1 1 tration vom Lösungsmittel abgetrennt. Hierauf folgte
II 20 eine Spülung mit destilliertem Wasser, bis keine
ξίί. Eine 3,2 mm dicke Scheibe eines Polyesterpoly- Glucoseoxydase-FAD mehr nachgewiesen wurde.
I urethan-Schaumstoffes wurde mit Aceton gewaschen, Das gleiche Verfahren wurde bei weiteren PoIyü
um Fettstoffe zu entfernen. Die Scheibe wurde dann esterpolyurethanscheiben angewendet, wobei jedoch
t* zur Entfernung von restlichen Aceton mit destilliertem jeweils p-Aminophenylessigsäure, p-Amino-4-phenylff"
Wasser gespült. Die Netzbildung, d. h., die Entfernung 25 buttersäure und p-Aminobenzoesäure anstelle von
^ der Membranen und Ausbildung einer Skelettstruktur p^minohippursäure verwendet wurden.
^ wurde vorgenommen, indem die Scheibe 5 bis 10 Mi- Die Produkte wurden auf ihre enzymatische Akti-
I^ nuten mit 0,5 n-Natriumhydroxyd bei 60' C behandelt vität untersucht und mit Produkten verglichen, die
sI und anschließend mit destilliertem Wasser gespült nach anderen Verfahren hergestellt worden waren. Es
K wurde. 30 wurde gefunden, daß das unter Verwendung von
I, Das so erhaltene netzartige Polyurethan wurde dann p-Aminohippursäure hergestellte Produkt eine GIu-
f* mit diazotierter p-Aminohippursäure zur Reaktion coseoxydase-Anfangsaktivität von 1120 Einheiten und
J gebracht. 4 ml (3 Mol) Natriumnitrit wurden tropfen- nach 24 Stunden eine Aktivität von 920 Einheiten
II weise zu einer eiskalten Lösung von 1 g p-Amino- und nach 48 Stunden eine Aktivität von 760 Einheiten
\ hippursäure in 15 ml 3 η-Salzsäure gegeben, bis die 35 hatte. Ein in der gleichen Weise, jedoch ohne Serum-
b Lösung auf Jodstärkepapier positiv reagierte. Die albumin hergestelltes Produkt hatte eine Anfangs-
J Temperatur wurde mit Hilfe eines Eis-Salzwasser- aktivität von 51 Einheiten und nach 24 und 48 Stun-
[t bades bei etwa OC gehalten. Der pH-Wert der den keine Aktivität, während ein unter Verwendung
s ! Diazoniumsalzlösung wurde mit Natriumhydroxyd von Albumin, aber ohne Diazotierung hergestelltes
i{ auf 7,0 eingestellt. Die Diazoniumsalzlösung wurde 40 Produkt eine Anfangsaktivität von 170 Einheiten und
§■ dann sofort zur netzartigen Polyurethanscheibe ge- nach 24 und 48 Stunden keine Aktivität hatte. Ein
\ geben, die ausgedrückt wurde, damit die Lösung vom Produkt, das durch Umsetzung von Glucoseoxydase
Polyurethan aufgesaugt werden konnte. Nach 12 Stun- mit der Polyurethanscheibe hergestellt wurde, hatte
«4 den wurde die so behandelte Polyurethanscheibe gut eine Anfangsaktivität von 34 Einheiten und nach
1 gespült und in destilliertem Wasser aufbewahrt. 45 24 und 48 Stunden keine Aktivität.
|| Kristallisiertes Rinderserumalbumin wurde dann Das Produkt, bei dem p-Aminophenylessigsäure
'l an das Polyurethan-Diazohippurat in Gegenwart bei der Diazotierung verwendet wurde, hatte eine
, von N^'-Dicyclohexylcarbodiimid gekuppelt. Die Anfangsaktivität von 905 Einheiten und nach 24 Stun-
Scheibe wurde zu 25 ml einer Lösung eines Borat- den eine Aktivität von 751 Einheiten und nach
puffers (pH 8,5) gegeben, die 0,5 g kristallisiertes 5° 48 Stunden eine Aktivität von 624 Einheiten, während
j Rinderserumalbumin enthielt und eine Temperatur das gleiche, jedoch ohne ein Protein hergestellte Pro-
J von O0C hatte. Dann wurden 10 ml einer Lösung (0 C) dukt eine Anfangsaktivität von 0,45 Einheiten und
j von Tetrahydrofuran, die 0,5 g Ν,Ν'-Dicyclohexyl- nach 24 und 48 Stunden keine Aktivität hatte.
j carbodiimid (nachstehend als DCC bezeichnet) ent- Das erfindungsgemäß hergestellte Produkt, bei dem
I hielt, zu der mit dem Serumalbumin getränkten 55 die Diazotierung mit p-Amino-4-phenylbuttersäure
; ■ Scheibe gegeben. Die Scheibe wurde dann in der vorgenommen wurde, hatte eine Anfangsaktivität von
J^, DCC-haltigen Lösung mehrmals ausgedrückt, um 952 Einheiten und nach 24 Stunden eine Aktivität
§§ vollständige Durchdringung der Scheibe durch das von 790 Einheiten und nach 48 Stunden eine Aktivität
Albumin sicherzustellen. von 656 Einheiten, während das gleiche, jedoch ohne
Die Scheibe wurde in einem Becherglas mit dem 60 Protein hergestellte Produkt eine Anfangsaktivität
vorstehend genannten Gemisch 24 Stunden bei 5°C von 42 Einheiten und nach 24 und 48 Stunden keine
gerührt und dann in einem Büchner-Trichter ausge- Aktivität hatte.
drückt, um die Lösung zu entfernen. Sie wurde dann Das Produkt gemäß der Erfindung, das unter Ver-
mit einem Gemisch von Tetrahydrofuran und Wasser wendung von p-Aminobenzoesäure hergestellt wurde,
gut gewaschen. 65 hatte eine Anfangsaktivität von 810 Einheiten und
10 ml einer Lösung (0° C) eines Boratpuffers (pH 8,5), nach 24 Stunden eine Aktivität von 672 Einheiten und
die gereinigte Glucoseoxydase (mit einer enzymatischen nach 48 Stunden eine Aktivität von 558 Einheiten,
Aktivität von 25 000 Einheiten) und Katalase (3000 während das gleiche, jedoch ohne Protein hergestellte
Produkt eine Anfangsaktivität von 39 Einheiten und nach 24 und 48 Stunden keine Aktivität hatte.
In allen vorstehend genannten Fällen wurde das Produkt gemäß der Erfindung unter Verwendung von
Rinderserumalbumin hergestellt. Das Polyurethan war das Produkt der Reaktion eines aus Adipinsäure,
Diäthylenglykol und Trimethylolpropan kondensierten, endständige Hydroxylgruppen enthaltenden Polyesterharzes
mit Toluylendiisocyanat unr1 Wasser.
Aus dem gemäß Beispiel ϊ verwendeten Polyurethan
wurden Scheiben hergestellt, die einen Durchmesser von etwa 12,7 mm und eine Dicke von etwa
3,2 mm aufwiesen. Die Scheiben wurden mit Aceton gewaschen und mehrere Male mit destilliertem Wasser
gewaschen, um das Aceton zu entfernen. Dann wurden sie mit 5,0 n-Natriumhydroxyd bei 600C
5 bis 10 Minuten behandelt. Es wurde eine Diazoniumsalzlösung hergestellt, indem man 0,5 n-NaNO2 (6 ml)
tropfenweise einer eisgekühlten Lösung p-Aminohippursäure (1 g) in 0,5 n-HCl (30 ml) zugibt, bis die
Lösung mit einem äußerlich angewandten Indikator (feuchtes Kaliumjodid-Stärkepapier) positiv reagierte
als Anzeichen für einen Überschuß von salpetriger Säure. Die Temperatur wurde mit Hilfe eines Eis-Salzwasserbades
bei etwa 43C gehalten. Nach 1,5 Stunden wurde eine 10%ige Natriumacetatlösung (100 ml)
zugegeben und der pH-Wert mit 2n-NrOH auf 7,5
eingestellt. Die erhaltene Lösung wurde zu den Polyurethanscheiben gegeben, die gelegentlich mit Pinzetten
ausgedrückt wurden. Nach 12 Stunden wurden die Scheiben gründlich 3- bis 4mal mit 150 ml Portionen
von kaltem 10%igem Natriumacetat gewaschen. Die in der nachstehenden Tabelle 1 genannten veischiedenen
Proteine wurden dann mit den Polyurethan-Diazohippurat-Scheiben gekuppelt. In jedem Fall
wurde 0,5 g des Proteins in 35 ml 0,10 m-Boratpufferlösung bei pH 8,5 gelöst und damit die Scheiben in
einem 125 ml Erlenmeyerkolben getränkt. Eine eisgekühlte Lösung von 0,5 g DCC in 25 ml 1,2-Dimethoxyäthan
wurde zu den mit dem Protein getränkten Scheiben gegeben, die dann mehrmals ausgedrückt
wurden, um die Mischung innerhalb der Scheiben zu verteilen. Die Glaskolben wurden dann während
12 Stunden bei 3°C heftig geschüttelt. Danach wurden die Scheiben auf ein Büchner-Filter gegeben und mehrere
Male mit verdünnter Natriumcarbonatlösung, mehrere Male mit 0,1 n-HCl und schließlich mehrere
Male mit Wasser gewaschen. Die erhaltenen proteinhaltigen Träger wurden dann zur Immobilisierung
von Urease verwendet. Für jedes verwendete Protein wurde eine 25-ml-Lösung, die 0,5 g Urease (pH 3,5
bis 4,5) enthielt, verwendet, um 50 der proteinhaltigen Scheiben zu tränken. Eine Lösung von 0,5 g DCC in
25 ml 1,2-Dimethoxyäthan wurde bei 0;C zu den
mit Enzym getränkten Scheiben gegeben, worauf bei 3 = C für etwa 360 Minuten heftig geschüttelt wurde.
Die Scheiben wurden dann wie oben geschildert auf einem Büchner-Trichter gewaschen. Die Ureaseaktiv: ·
tat wurde nach der Methode von S u m η e r, Proc.
Soc. Exp. Biol. Med. 22, 504, 1925, bestimmt sowohl
unmittelbar als auch nach Lagerung (40C unter
0,1 n-Tris-sulfatpuffer) während "2 Monaten. Wie man
aus der Tabelle 1 ersehen kann, verlieren die gelagerten Scheiben nur
während der Lagerung.
während der Lagerung.
wenig von ihrer Aktivität
S | Protein | Anfängliche | Aktivität nach |
Aktivität | 2 Monaten | ||
(in Sumner- | (Surnner- | ||
Einheiten SE) | Einheiten SE) | ||
Serum-albumin | 0,85 | 0,68 | |
IO | (Mensch) | ||
Serum-albumin | 0,84 | 0,62 | |
(Rinder) | |||
Ovalbumin | 0,82 | 0,60' | |
15 | (Hühner) | ||
Collagen | 0,51 | 0,40 | |
(Rinder) | |||
Gelatine | 0,63 | 0,49 | |
20 | (Schweinehaut) |
Um die Verwendung von gebundener Urease in der Hariistoffbestimmung in menschlichem Serum und
Urin zu zeigen, wurde eine Ureasesäule von 1.25 cm
Durchmesser und 2,5 cm Höhe (totale Aktivität 9,60 SE) hergestellt, indem man in einem Glasrohr
Scheiben übereinander schichtet, die, wie oben beschrieben,
durch Bindung der Urease an Rinderserumalbumin-Polyurethan-Hippurat hergestellt worden
sind. Vor Gebrauch wurde die Säule mit 50 ml Tris-sulfatpuffer gewaschen. Serum, das 2,5 mg/ml
Harnstoff und Urin, der etwa 25 mg/ml Harnstoff erhielt, wurden jeweils mit 0,1 m-Tris-sulfatpuffer
(pH 7) zu einer Konzentration von etwa 1,0 mg Harnstoff/ml
verdünnt. Aliquote Teile von 0,5 ml der verdünnten Probe wurden über die Kolonne gegeben
und mit 15 ml Tris-sulfatpuffer sluiert. Eine bekannte Probe, die 1,5 mg/ml Harnstoff enthält, wurde ebenfalls
über die Säule gegeben. Nesslerisierung der von der Säule abfließenden Flüssigkeit ergab die in der
nachstehenden Tabelle 2 angegebenen Werte, die mit solchen verglichen wurden, die bei langen klinischen
Testen erhalten worden waren. Wie man aus Tabelle 2 ersieht, war die Hydrolyse von Harnstoff praktisch
quantitativ, obwohl der ganze Test mit der Säule nicht mehr als etwa 15 Minuten pro Probe benötigte.
Test auf Harnstoff gehalt
50
50
Methode | Serum | Urin | Bekanntes |
Harnstoff | Harnstoff | Reagenz | |
1,5 mg | |||
(mg/ml) | (ng/ml) | Harnstoff/ml |
Säule 2,1 24,3 1,44
Klinischer Test 2,4 24,9 1,48
Außer dem in den Beispielen eingesetzten DCC-Kupplungsmittel waren am Anmeldetag eine Reihe
weiterer üblicher Kupplungsmittel bekannt, welche für die Kupplungen in der vorliegenden Erfindung
eingesetzt werden konnten (vgl. z. B. «The Peptides«, VoI 1, Academie Press, New York, 1965, S. 110 und
111).
Claims (1)
- I enzymatiiche Wirkung haben, durch Umsetzung einesit Patentanspruch: Copolymeren aus Methacrylsäure-3-fluoranilid undtf einer anderen polymerisierbaren Verbindung, wobeiζ Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten das Copolymer nitriert ist, und einem Enzym.Γ Enzyms, dadurch gekennzeichnet, daß 5 Die Herstellung des Trägers ist umständlich.I man einen Polyurethanschaumstoff von poröser Die britische Patentschrift 916 931 beschre.bt£ oder netzartiger Struktur, welcher den schnellen wasserunlösliche, enzymatisch aktive Substanzen, die£ ■ Durchgang einer Flüssigkeit gestattet, mit einer aus Enzymmolekülen und einem polymeren wasser-% eine Carboxylgruppe enthaltenden Diazonium- unlöslichen Träger bestehen, der aus AminosäurenI Verbindung zur Reaktion bringt, daß man an den io hergestellt werden muß.p in dieser Weise behandelten Polyurethanschaum- Die in den beiden britischen Patentschriften gell stoff ein Protein kuppelt und daß man sodann an nannten Trägermaterialien sind in ihrer Struktur und I das Protein ein Enzym kuppelt. ihrem Aufbau auch völlig verschieden von porösen I bzw. netzartigen Polyurethanschaumstoffen, die im f; i5 Verhältnis einfacher herstellbar sind.
I; Die deutsche Auslegeschrift 12 27 955 beschreibt
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C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
E77 | Valid patent as to the heymanns-index 1977 | ||
EHJ | Ceased/non-payment of the annual fee |