DE1642596C3

DE1642596C3 - Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten Enzyms

Info

Publication number: DE1642596C3
Application number: DE19681642596
Authority: DE
Inventors: Takuya R. Pasadena Calif. Sato (V-StA.)
Original assignee: Beckman Instruments Inc., Fullerton, Calif. (V.StA.)
Priority date: 1967-04-20
Filing date: 1968-01-24
Publication date: 1977-03-31

Description

welche die immobilisierten Enzyme einwirken sollen.

C₆H₁₂O, -f O₂ + CH₃CH₂OH Gleichzeitig wird trotz der hohen Durchflußgeschwin-

-> C_eH_JSO₇ + H₂O + CH₃CHO digkeit eine sehr wirksame Umwandlung der Mate-

40 nahen erreicht.

Die Glucosemenge in einer gegebenen Blutprobe Der Schaumstoff ist porös oder netzartig und gewird bestimmt, inoem beispielsweise polarographisch stattet den schnellen Durchgang einer Flüssigkeit, insdie Sauerstoffmenge gemessen wird, die im Reagens besondere einer wäßrigen Lösung,
vor der Zugabe des Blutes und nach der Vollendung Polyurethan-Schaumstoffe, z. B. Polyesterpolyure-

der Reaktion gemäß der vorstehenden Gleichung; 45 than-Schaumstoffe, sind besonders geeignet.
vorhanden ist, weil die verbrauchte Sauerstoffmenge Die Diazoniumverbindung muß eine Carboxyl-

die Glucosemenge anzeigt, die für die Reaktion mil gruppe enthalten. Geeignet sind beispielsweise p-Ami-

! dem Sauerstoff unter Bildung von Gluconsäure ver- nohippursäure, p-Aminophenylessigsäure, p-Amino-

fügbar ist. Diese Reaktion findet in einer Strömungs- 4-phenylbuttersäure, p-Aminobenzoesäure, p-Aminokammer statt, in der Blut, Enzyme und Lösungsmittel 50 phenoxyessigsäure oder p-Aminophenylalanin.
zusammengegeben werden. Da die Enzyme an der Zu den Proteinen, die sich als besonders geeignet

Reaktion nicht teilnehmen, können sie vom Reak- erwiesen haben, gehören menschliches Serumalbumin, tionsprodukt abgetrennt und wiederverwendet werden. Rinderovalbumin, Rinderkollagen und Casein, aber Mit der vorstehend beschriebenen Analysenmethode die gleichen Proteine aus anderen Quellen und andere werden zwar äußerst zuverlässige Analysenergebnisse 55 Proteine, die reaktionsfähige Stellen für das zu immoerhalten, jedoch hat sie den Nachteil der Abhängig- bilisierende Enzym aufweisen, können ebenfalls verkeit von der Verwendung von »freien« Enzymen, d. h. wendet werden.

Enzymen, die sich im Reaktionssystem lösen. Die Auf- Immobilisierte Enzyme sind besonders vorteilhaft

bewahirung solcher Enzyme ist äußerst schwierig, und bei biochemischen Analysen der vorstehend beschrieverhältnismäßig umständliche Systeme sind erfor- 60 benen Art. Bei Verwendung von immobilisierten derlich, um geeignete Reaktionskammern zu bilden. Enzymen, die nach dem Verfahren gemäß der Erfin-Ferner ist der Verlust einer gewissen Enzymmenge dung hergestellt worden sind, ergibt sich eine Einunvermeidlich, wenn das Enzymrengens vom Reak- sparung hinsichtlich der erforderlichen Enzymmenge, tionsprodukt für die Rückführung in das Reaktions- Diese Einsparung wird vergrößert durch die lange system abgetrennt wird. Alle diese Nachteile werden 65 Zeit, während der diese immobilisierten Enzyme aktiv durch die hohen Kosten der Enzyme noch verstärkt. bleiben. Ferner ergibt sich eine wesentliche Verringe-

Die britische Patentschrift 9 12 897 beschreibt die rung der Größe, des Gewichts und der Kompliziert-Herstellung von hochmolekularen Verbindungen, die heit des Analysensystems, weil Enzymlösungsbehälter,

Trennvorrichtungen und Kreislaufvorrichtungen nicht bis 5000 Einheiten) enthielt, wurde zur Tränkung der mehr erforderlich sind. Da Enzyme mit höherer Scheibe aus Albumin-Polyurethan-Diazohippurat verspezifischer Aktivität verfügbar gemacht werden wendet Eine Lösung von DCC (1 g in 10 ml Tetrakönnen, werden die Reaktionszeiten verkürzt. Bei- hydrofuran) bei etwa 0°C wurde zugesetzt, wobei die spielsweise hat sich bei Anwendung der Immobili- 5 Scheibe wiederholt ausgedrückt wurde, um die erhalsierungsmethode gemäß der Erfindung gezeigt, daß tene Lösung in der ganzen Scheibe zu verteilen. Glucoseoxydase und -katalase ihre Aktivität bis zu Die Scheibe wurde dann in einem Glasgefäß 48 Stunden behalten. 48 Stunden bei 5°C mit dem Enzymgemisch kräftig

Die nach dem Verfahren gemäß der Erfindung her- geschüttelt. Nach dem Schütteln wurde das Gemisch

gestellten immobilisierten Enzyme können auch in io 16 Stunden gerührt, um etwaiges nicht umgesetztes

anderen Analysensystemen verwendet werden. Immo- DCC zu hydrolysieren. Nach Filtration in einem

bilisierte Enzyms eignen sich zur Messung von Re- Büchner-Trichter wurde die Scheibe auf dem Filter

aktionsgeschwindigkeiten, beispielsweise der Geschwin- reichlich mit einem Gemisch von Tetrahydrofuran

digkeit von elektrochemischen Reaktionen, die an und Wasser gewaschen, um etwaiges nicht umgesetztes

Elektroden stattfinden. Ferner sind die immobili- 15 DCC und eine gewisse Menge des durch Hydrolyse

sierten Enzyme gemäß der Erfindung überaus gute des DCC gebildeten Bicyclohexylhamstoffs zu lösen.

Medien für die Untersuchung von immobilisierten Nach der Wäsche wurde die Scheibe in eine verdünnte

Enzymen selbst. Natriumbicarbonatlösung gehängt und durch FiI-

Beispiel 1 tration vom Lösungsmittel abgetrennt. Hierauf folgte

ao eine Spülung mit destilliertem Wasser, bis keine

Eine 3,2 mm dicke Scheibe eines Polyesterpoly- Glucoseoxydase-FAD mehr nachgewiesen wurde.

urethan-Schaumstoffes wurde mit Aceton gewaschen, Das gleiche Verfahren wurde bei weiteren PoIy-

um Fettstoffe zu entfernen. Die Scheibe wurde dann esterpoiyurethanscheiben angewendet, wobei jedoch

zur Entfernung von restlichen Aceton mit destilliertem jeweils p-Aminophenylessigsäure, p-Amino-4-phenyl-

Wasser gespült. Die Netzbildung, d. h., die Entfernung 25 buttersäure und p-Aminobenzoesäure anstelle von

der Membranen und Ausbildung einer Skelettstruktur p-Aminohippursäure verwendet wurden,

wurde vorgenommen, indem die Scheibe 5 bis 10 Mi- Die Produkte wurden auf ihre enzymatische Akti-

nuten mit 0,5 n-Natriumhydroxyd bei 60^r C behandelt vität untersucht und mit Produkten verglichen, die

und anschließend mit destilliertem Wasser gespült nach anderen Verfahren hergestellt worden waren. Es

wurde. 30 wurde gefunden, daß das unter Verwendung von

Das so erhaltene netzartige Polyurethan wurde dann p-Aminohippursäure hergestellte Produkt eine GIu mit diazotierter p-Aminohippursäure zur Reaktion coseoxydase-Anfangsaktivität von 1120 Einheiten und gebracht. 4 ml (3 Mol) Natriumnitrit wurden tropfen- nach 24 Stunden eine Aktivität von 920 Einheiten weise zu einer eiskalten Lösung von Ig p-Amino- und nach 48 Stunden eine Akti\ität von 760 Einheiten hippursäure in 15 ml 3 η-Salzsäure gegeben, bis die 35 hatte. Ein in der gleichen Weise, jedoch ohne Serum-Lösung auf Jodstärkepapier positiv reagierte. Die albumin hergestelltes Produkt hatte eine Anfangs-Temperatur wurde mit Hilfe eines Eis-Salzwasser- aktivität von 51 Einheiten und nach 24 und 48 Stunbades bei etwa O⁰C gehalten. Der pH-Wert der den keine Aktivität, während ein unter Verwendung Diazoniumsalzlösung wurde mit Natriumhydroxyd von Albumin, aber ohne Diazotierung hergestelltes auf 7,0 eingestellt. Die Diazoniumsalzlösung wurde 40 Produkt eine Anfangsaktivität von 170 Einheiten und dann sofort zur netzartigen Polyurethanscheibe ge- nach 24 und 48 Stunden keine Aktivität hatte. Ein geben, die ausgedrückt wurde, damit die Lösung vom Produkt, das durch Umsetzung von Glucoseoxydase Polyurethan aufgesaugt werden konnte. Nach 12 Stun- mit der Polyurethanscheibe hergestellt wurde, hatte den wurde die so behandelte Polyurethanscheibe gut eine Anfangsaktivität von 34 Einheiten und nach gespült und in destilliertem Wasser aufbewahrt. 45 24 und 48 Stunden keine Aktivität.

Kristallisiertes Rinderserumalbumin wurde dann Das Produkt, bei dem p-Aminophenylessigsäure

an das Polyurethan-Diazohippurat in Gegenwart bei der Diazotierung verwendet wurde, hatte eine

von N^'-Dicyclohexylcarbodiimid gekuppelt. Die Anfangsaktivität von 905 Einheiten and nach 24 Stun-

Scheibe wurde zu 25 ml einer Lösung eines Borat- den eine Aktivität von 751 Einheiten und nach

puffers (pH 8,5) gegeben, die 0,5 g kristallisiertes 50 48 Stunden eine Aktivität von 624 Einheiten, während

Rinderserumalbumin enthielt und eine Temperatur das gleiche, jedoch ohne ein Protein hergestellte Pro-

von 0⁰C hatte. Dann wurden 10 ml einer Lösung (O⁰C) dukt eine Anfangsaktivität von 0,45 Einheiten und

von Tetrahydrofuran, die 0,5 g Ν,Ν'-Dicyclohexyl- nach 24 und 48 Stunden keine Aktivität hatte,

carbodiimid (nachstehend als DCC bezeichnet) ent- Das erfindungsgemäß hergestellte Produkt, bei dem

hielt, zu der mit dem Serumalbumin getränkten 55 die Diazotierung mit p-Amino-4-phenylbuttersäure

Scheibe gegeben. Die Scheibe wurde dann in der vorgenommen wurde, hatte eine Anfangsaktivität von

DCC-haltigen Lösung mehrmals ausgedrückt, um 952 Einheiten und nach 24 Stunden eine Aktivität

vollständige Durchdringung der Scheibe durch das von 790 Einheiten und nach 48 Stunden eine Aktivität

Albumin sicherzustellen. von 656 Einheiten, während das gleiche, jedoch ohne

Die Scheibe wurde in einem Becherglas mit dem 60 Protein hergestellte Produkt eine Anfangsaktivität

vorstehend genannten Gemisch 24 Stunden bei 5°C von 42 Einheiten und nach 24 und 48 Stunden keine

gerührt und dann in einem Büchner-Trichter ausge- Aktivität hatte.

drückt, um die Lösung zu entfernen. Sie wurde dann Das Produkt gemäß der Erfindung, das unter Ver-

mit einem Gemisch von Tetrahydrofuran und Wasser wendung von p-Aminobenzoesäure hergestellt wurde,

gut gewaschen. 65 hatte eine Anfangsaktivität von 810 Einheiten und

10 ml einer Lösung (0° C) eines Boratpuffers (pH 8,5), nach 24 Stunden eine Aktivität von 672 Einheiten und

die gereinigte Glucoseoxydase (mit einer enzymatischen nach 48 Stunden eine Aktivität von 558 Einheiten,

Aktivität von 25 000 Einheiten) und Katalase (3000 während das gleiche, jedoch ohne Protein hergestellte

Produkt eine Anfangsaktivität von 39 Einheiten und nach 24 und 48 Stunden keine Aktivität hatte.

In allen vorstehend genannten Fällen wurde das Produkt gemäß der Erfindung unter Verwendung von Rinderserumalbumin hergestellt. Das Polyurethan war das Produkt der Reaktion eines aus Adipinsäure, Diäthylenglykol und Trünethylolpropan kondensierten, endständige Hydroxylgruppen enthaltenden PoIy-■ esterharzes mit Toluylendiisocyanat und Wasser.

Beispiel 2

Aus dem gemäß Beispiel 1 verwendeten Polyurethan wurden Scheiben hergestellt, die einen Durchmesser von etwa 12,7 mm und eine Dicke von etwa 3,2 mm aufwiesen. Die Scheiben wurden mit Aceton gewaschen und mehrere Male mit destilliertem Wasser gewaschen, um das Aceton zu entfernen. Dann wurden sie mit 5,0 n-Natriumhydroxyd bei 60⁰C 5 bis 10 Minuten behandelt. Es -vurde eine Diazoniumsalzlösung hergestellt, indem man 0,5 n-NaNO₂ (6 m!) tropfenweise einer eisgekühlten Lösung p-Aminohippursäure (1 g) In 0,5 n-HCl (30 ml) zugibt, bis die Lösung mit einem äußerlich angewandten Indikator (feuchtes Kaliumjodid-Stärkepapier) positiv reagierte als Anzeichen für einen Überschuß von salpetriger Säure. Die Temperatur wurde mit Hilfe eines Eis-Salzwasserbades bei etwa 4 C gehalten. Nach 1,5 Stunden wurde eine 10%ige Natriumacetatlösung (100 ml) zugegeben und der pH-Wert mit 2 n-NaOH auf 7,5 eingestellt. Die erhaltene Lösung wurde zu den Polyurethanscheiben gegeben, die gelegentlich mit Pinzetten ausgedrückt wurden. Nach 12 Stunden wurden die Scneiben gründlich 3- bis 4mal mit 150 ml Portionen von kaltem 10%igem Natriumacetat gewaschen. Die in der nachstehenden Tabelle 1 genannten verschiedenen Proteine wurden dann mit den Polyurethan-Diazohippurat-Scheiben gekuppelt. In jedem Fall wurde 0,5 g des Proteins in 35 ml 0,10 m-Boratpufferlösung bei pH 8,5 gelöst und damit die Scheiben in einem 125 ml Erlenmeyerkolben getränkt. Eine eisgekühlte Lösung von 0,5 g DCC in 25 ml 1,2-Dimethoxyäthan wurde zu den mit dem Protein getränkten Scheiben gegeben, die dann mehrmals ausgedrückt wurden, um die Mischung innerhalb der Scheiben zu verteilen. Die Glaskolben wurden dann während 12 Stunden bei 3⁰C heftig geschüttelt. Danach wurden die Scheiben auf ein Büchner-Filter gegeben und mehrere Male mit verdünnter Natriumcarbonatlösung, mehrere Male mit 0,1 n-HCl und schließlich mehrere Male mit Wasser gewaschen. Die erhaltenen proteinhaltigen Träger wurden dann zur Immobilisierung von Urease verwendet. Für jedes verwendete Protein wurde eine 25-ml-Lösung, die 0,5 g Urease (pH 3,5 bis 4,5) enthielt, verwendet, um 50 der proteinhaltigen Scheiben zu tränken. Eine Lösung von 0,5 g DCC in 25 ml 1,2-Dimethoxyäthan wurde bei 0°C zu den mit Enzym getränkten Scheiben gegeben, worauf bei 3⁰C für etwa 360 Minuten heftig geschüttelt wurde. Die Scheiben wurden dann wie oben geschildert auf einem Büchner-Trichter gewaschen. Die Ureaseaktivität wurde nach der Methode von Sumner, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 22, 504, 1925, bestimmt sowonl unmittelbar als auch nach Lagerung (4⁰C unter 0,1 n-Tris-sulfatpuffer) während 2 Monaten. Wie man aus der Tabelle 1 ersehen kann, verlieren die gelagerten Scheiben nar wenig von ihrer Aktivität während der Lagerung.

Tabelle 1

5	Protein	Anfängliche Aktivität (in Sumner- Einheiien SE)	Aktivität nach 2 Monaten (Sumner- Eiaheiten SE)
10	Serum-albumin (Mensch)	0,85	0,68
	Serum-albumin (Rinder)	0,84	0,62
15	Ovalbumin (Hühner)	0,82	0,60
	Collagen (Rinder)	0,51	0,40
20	Gelatine (Schweinehaut)	0,63	0,49

Um die Verwendung von gebundener Urease in der Harnstoffbestimmung in menschlichem Serum und Urin zu zeigen, wurde eine Ureasesäule von 1,25 cm Durchmesser und 2,5 cm Höhe (totale Aktivität 9,60 SE) hergestellt, indem man in einem Glasrohr Scheiben übereinander schichtet, die, wie oben beschrieben, durch Bindung der Urease an Rinderserumalbumin-Polyurethan-Hippurat hergestellt worden sind. Vor Gebrauch wurde die Säule mit 50 ml Tris-sulfatpuffer gewaschen. Serum, das 2,5 mg/ml Harnstoff und Urin, der etwa 25 mg/ml Harnstoff erhielt, wurden jeweils mit 0,1 m-Tris-sulfatpuffer (pH 7) zu einer Konzentration von etwa 1,0 mg Harnstoff/ml verdünnt Aliquote Teile von 0,5 ml der verdünnten Probe wurden über die Kolonne gegeben und mit 15 ml Tris-sulfatpuffer eluiert. Eine bekannte Probe, die 1,5 mg/ml Harnstoff enthält, wurde ebenfalls über die Säule gegeben. Nesslerisierung der von der Säule abfließenden Flüssigkeit ergab die in der nachstehenden Tabelle 2 angegebenen Werte, die mit solchen verglichen wurden, die bei langen klinischen Testen erhalten worden waren. Wie man aus Tabelle 2 ersieht, war die Hydrolyse von Harnstoff praktisch quantitativ, obwohl der ganze Test mit der Säule nicht mehr als etwa 15 Minuten pro Probe benötigte.

Tabelle 2

Test auf Harnstoff gehalt

Methode	Serum	Urin	Bekanntes
	Harnstoff	Harnstoff	Reagenz
			1,5 mg
	(mg/ml)	(mg/ml)	Harnstoff/ml

Säule
Klinischer Test

2,1
2,4

24,3
24,9

1,44
1,48

Außer dem in den Beispielen eingesetzten DCC-Kupplungsmittel waren am Anmeldetag eine Reihe weiterer üblicher Kupplungsmittel bekannt, welche für die Kupplungen in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden konnten (vgl. z. B. «The Peptides«, VoI 1, Academie Press, New York, 1965, S. 110 und 111).

Claims

enzymatische Wirkung haben, durch Umsetzung eines

Patentansoruch- Copolymeren aus Methacrylsäure-3-nuoranilid und

i-atentansprucn. ^ anderen polymerisierbaren Verbindung, wobei

Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten das Copolymer nitriert ist und einem Enzym
Enzyms, dadurch gekennzeichnet, daß 5 Die HersteUung des Tragers ist umständlich,
man einen Polyuiith^schaumstoff von poröser Die britische Patentschrift 916 931 beschreibt

oder netzartiger Struktur, welcher den schnellen wasserunlösliche enzymatisch aktive Substanzen, die Durchgang einer Flüssigkeit gestattet, mit einer aus Enzymmolekulen und einem polymeren wassereine Carboxylgruppe enthaltenden Diazonium- unlöslichen Träger bestehen, der aus Aminosäuren Verbindung zur Reaktion bringt, daß man an den io hergestellt werden muß.

in dieser Weise behandelten Polyurethanschaum- Die in den beiden britischen Patentschi rften ge-

stoff ein Protein kuppelt und daß man sodann an nannten Trägermatenahen sind in ihrer Struktur und das Protein ein Enzym kuppelt. ihrem Aufbau auch völlig,verschieden von porösen

bzw. netzartigen Polyurethanschaumstonen, die im 15 Verhältnis einfacher herstellbar sind.

Die deutsche Auslegeschrift 12 27 955 beschreibt Enzymkörper, die aus mindestens einem Enzym und

einer Lösung eines semipermeablen Materials wie

Polyamid, Polyvinylacetat, Cellulosenitrat, Cellulose-30 acetat, Äthylcellulose, Kautschukchlorid oder Lipoiden besteht, wobei die entstandene Lösung anschließend getrocknet wird. Demgegenüber ist der Träger in der

Die AnwenduEg enzymatischer Reaktionen in der vorliegenden Erfindung ein Polyurethanschaumstoff chemischen Analyse ist in den letzten Jahren immer mit poröser oder netzartiger Struktur, der sich beim wichtiger geworden, insbesondere für die Analyse 15 Auflösen und anschließendem Abdampfen des Lövon biochemischen Substanzen, z. B. Blut und anderen sungsmittels und Trocknen nicht wieder als Schaum-Körperflüssigkeiten. Die Analyse von Körperflüssig- stoff zurückbilden würde. Diese semipermeablen keiten unter Verwendung von Enzymen ergibt sehr Materialien besitzen beispielsweise nur eine geringe schnelle Resultate und ist von großer Wichtigkeit Durchlässigkeit für Flüssigkeiten. Außerdem besteht beispielsweise für die Festlegung der richtigen Behänd- 3° die Gefahr, daß die extrem kleinen Poren sehr leicht lung eines Patienten. Ein Beispiel einer solchen Ana- von den zu untersuchenden Flüssigkeiten (z. B. Blut lysenmethode ist beschrieben. Danach können Enzyme, oder Urin) verstopft werden.

z. B. Glucoseoxydase und Katalase, als Katalysatoren Gegenstand der Erfindung ist nun das im Patent-

bei Analysenmethoden, z. B. bei der Überwachung des ansprach definierte Verfahren.
Blutes auf den Glucosegehalt gemäß der folgenden 35 Die offenzellige, netzartige Struktur ermöglicht eine Reaktion verwendet werden: hohe Durchflußgeschwindigkeit der Materiahen, auf