DE112010003779T5 - Separationsverfahren - Google Patents

Separationsverfahren Download PDF

Info

Publication number
DE112010003779T5
DE112010003779T5 DE112010003779T DE112010003779T DE112010003779T5 DE 112010003779 T5 DE112010003779 T5 DE 112010003779T5 DE 112010003779 T DE112010003779 T DE 112010003779T DE 112010003779 T DE112010003779 T DE 112010003779T DE 112010003779 T5 DE112010003779 T5 DE 112010003779T5
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
phospholipid
filler
eluate
column
calcium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
DE112010003779T
Other languages
English (en)
Inventor
Ken Sugo
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hoya Corp
Original Assignee
Hoya Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoya Corp filed Critical Hoya Corp
Publication of DE112010003779T5 publication Critical patent/DE112010003779T5/de
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J7/00—Phosphatide compositions for foodstuffs, e.g. lecithin
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/42—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the development mode, e.g. by displacement or by elution
    • B01D15/424—Elution mode
    • B01D15/426—Specific type of solvent
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/02—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material
    • B01J20/04—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising compounds of alkali metals, alkaline earth metals or magnesium
    • B01J20/048—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising compounds of alkali metals, alkaline earth metals or magnesium containing phosphorus, e.g. phosphates, apatites, hydroxyapatites
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/282—Porous sorbents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B7/00—Separation of mixtures of fats or fatty oils into their constituents, e.g. saturated oils from unsaturated oils
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
    • B01J2220/50—Aspects relating to the use of sorbent or filter aid materials
    • B01J2220/54—Sorbents specially adapted for analytical or investigative chromatography

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
  • Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
  • Fats And Perfumes (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

Ein Verfahren zum wahlweisen Separieren eines Phospholipids aus einer das Phospholipid enthaltenden Probenlösung wird angegeben. Das Verfahren umfasst: Adsorbieren von Calciumionen an ein Füllmittel, wobei zumindest eine Oberfläche des Füllmittels aus einer Calciumphosphat-basierten Verbindung besteht; Einbringen der Probenlösung in eine Vorrichtung mit einem Füllraum, wobei der Füllraum mit dem Füllmittel gefüllt ist, sodass das in der Probenlösung enthaltene Phospholipid an dem Füllmittel durch die Calciumionen adsorbiert wird; Einleiten eines auf einem organischen Lösungsmittel basierten Eluats in den Füllraum der Vorrichtung, um eine Flüssigkeit zu gewinnen, die das Phospholipid enthält und aus der Vorrichtung ausgegeben wird; und Fraktionieren der gewonnenen Flüssigkeit in eine vorgegebene Menge, um dadurch das Phospholipid aus der Probenlösung zu separieren.

Description

  • GEBIET DER TECHNIK
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum wahlweisen Separieren eines Phospholipids aus einer Probenlösung.
  • TECHNISCHER HINTERGRUND
  • Ein Phospholipid ist ein Lipid, das Teile eines Phosphatesters in seiner chemischen Struktur enthält. Das Phospholipid bildet eine Doppellipidschicht, da es amphipathische Eigenschaften hat. Daher ist das Phospholipid nicht nur ein Hauptbestandteil einer Zellmembran mit einem Glycolipid und einem Cholesterol, sondern ist auch eine Komponente, die auf Signalisierungen in einem lebenden Körper wirkt.
  • Daher werden Phospholipide als Wirkstoffe in Ergänzungsmitteln und Kosmetika und als Drug Delivery Systeme (DDS) eingesetzt. Es ist zu erwarten, dass Anwendungsgebiete zum Einsatz des Phospholipids nach breiter werden.
  • Eine Reihe derartiger Phospholipide ist in Eigelb, Sojabohnen und dergleichen enthalten. In jüngster Zeit ist ein Verfahren zum effizienten Separieren und Aufreinigen der in derartigen natürlichen Materialien enthaltenen Phospholipide erforderlich. Als derartiges Verfahren findet ein Säulenchromatografie-Verfahren Beachtung. Beispielsweise versucht man, das Phospholipid unter Verwendung eines Kieselgel-Chromatografieverfahrens zu isolieren und aufzureinigen (siehe NPL-Dokument (NPL: Nichtpatentliteratur)).
  • Wird jedoch ein Kieselgel-Chromatografieverfahren zu diesem Zweck eingesetzt, ist zu befürchten, dass auf einer Oberfläche eines Kieselgelträgers (Füllmittels) vorhandene funktionale Gruppen und auf der Oberfläche verbleibende Silanolgruppen sich nachteilig auf das Adsorbieren des Phospholipids an den Träger und das Eluieren des Phospholipids aus dem Träger auswirken. Zudem ist es kompliziert, bei diesem Verfahren ein allgemein verwendbares Eluat zuzubereiten, da ein derartiges Eluat ein Gemisch aus Chloroform, Methanol, Hexan und dergleichen ist. Da das Phospholipid hohe Adsorbierbarkeit an dem Kieselgel hat, ist es zudem schwierig, den in einer Säule enthaltenen Kieselgelträger so zu waschen, dass das an dem Kieselgelträger adsorbierte Phospholipid entfernt wird. Daraus ergibt sich das Problem, das es schwierig ist, den Kieselgelträger wiederholt zu verwenden.
  • Daher versucht man auch ein Hydroxylapatit-Chromatografie-Verfahren als Alternative zu dem Kieselgel-Chromatrografieverfahren zu verwenden. Jedoch birgt die Verwendung des Hydroxylapatit-Chromatografie-Verfahrens noch immer Probleme dahingehend, dass ein Verfahren zum Adsorbieren eines Phospholipids an ein als Hydroxylapatit bestehendes Füllmittel (Träger), ein Verfahren zum Eluieren des adsorbierten Phospholipids in ein Eluat, ein Verfahren zum Erfassen des in das Eluat eluierten Phospholipids und dergleichen bisher noch nicht auf praktischer Ebene entwickelt wurden.
  • Bei dem NPL-Dokument handelt es sich um Hirotaka Ihara, „Function Design of Silica Coated with Polymer and Development of High Selectivity", 14. Adsorption Symposium in Kumamoto.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Separationsverfahren anzugeben, das in der Lage ist, ein Phospholipid mit einfachen Schritten aus einer das Phospholipid enthaltenden Probenlösung wahlweise zu separieren.
  • Diese Aufgabe lösen die nachstehend beschriebenen vorliegenden Erfindungen (1) bis (11).
    • (1) Verfahren zum wahlweisen Separieren eines Phospholipids aus einer das Phospholipid enthaltenden Probenlösung, wobei das Verfahren umfasst: Adsorbieren von Calciumionen an ein Füllmittel, wobei zumindest eine Oberfläche des Füllmittels aus einer Calciumphosphat-basierten Verbindung besteht; Einbringen der Probenlösung in eine Vorrichtung mit einem Füllraum, wobei der Füllraum mit dem Füllmittel gefüllt ist; Einleiten eines auf einem organischen Lösungsmittel basierten Eluats in den Füllraum der Vorrichtung, um eine Flüssigkeit zu gewinnen, die das Phospholipid enthält und aus der Vorrichtung ausgegeben ist; und Fraktionieren der gewonnenen Flüssigkeit durch eine vorgegebene Menge, um dadurch das Phospholipid aus der Probenlösung zu separieren. Gemäß dem oben beschriebenen Verfahren ist es möglich, das Phospholipid aus der das Phospholipid enthaltenden Probenlösung mit einfachen Verfahrensschritten wahlweise zu separieren.
    • (2) Bei dem unter vorstehendem Punkt (1) beschriebenen Verfahren sind die Calciumionen in einer Calcium enthaltenden Flüssigkeit enthalten und das Adsorbieren der Calciumionen wird ausgeführt, indem die Calcium enthaltende Flüssigkeit mit dem Füllmittel in Kontakt gebracht wird. Gemäß dem oben beschriebenen Verfahren ist es möglich, die Calciumionen mit einfachen Verfahrensschritten, bei denen die Calcium enthaltende Flüssigkeit in die Vorrichtung eingeleitet wird, verlässlich an dem Füllmittel zu adsorbieren.
    • (3) Bei dem unter vorstehendem Punkt (2) beschriebenen Verfahren umfasst die Calcium enthaltende Flüssigkeit eine wässrige Calciumchlorid-Lösung. Gemäß dem oben beschriebenen Verfahren ist es möglich, die Calciumionen ohne nachteilige Auswirkungen verlässlich an der Calciumphosphat-basierten Verbindung zu adsorbieren.
    • (4) Bei dem unter den vorstehenden Punkten (1) bis (3) beschriebenen Verfahren enthält das Phospholipid ein Phospholipid-Liposom, das ein Liposom bildet. Gemäß dem oben beschriebenen Verfahren ist es möglich, wenn die Probenlösung in die Vorrichtung eingebracht wird, die als Phospholipid-Liposom vorliegenden Phospholipide verlässlich an dem Füllmittel zu adsorbieren, da die Phospholipide eine chemische Struktur annehmen, bei der eine in dem Phospholipid enthaltene Phosphatgruppe aus dem Liposom freigelegt ist.
    • (5) Bei dem unter den vorstehenden Punkten (1) bis (4) beschriebenen Verfahren enthält beim Einleiten des auf einem organischen Lösungsmittel basierten Eluats das Eluat Isopropanol. Gemäß dem oben beschriebenen Verfahren ist es möglich, das Phospholipid in einem Zustand, in dem das Phospholipid von verunreinigenden Stoffen (Fremdstoffen), bei denen es sich nicht um das Phospholipid handelt, separiert ist, verlässlich in jede Fraktion zu eluieren, wobei das an dem Füllmittel adsorbierte Phospholipid verlässlich aus dem Füllmittel eluiert (entfernt) wird.
    • (6) Bei dem unter vorstehendem Punkt (5) beschriebenen Verfahren ist beim Einbringen des auf einem organischen Lösungsmittel basierten Eluats das Eluat eine Lösung mit linearem Gradienten ist, bei der sich ein Anteil an Isopropanol von 0 auf 80% ändert. Gemäß dem oben beschriebenen Verfahren ist es möglich, das Phospholipid in einem Zustand, in dem das Phospholipid von verunreinigenden Stoffen (Fremdstoffen), bei denen es sich nicht um das Phospholipid handelt, separiert ist, verlässlicher in jede Fraktion zu eluieren
    • (7) Bei dem unter den vorstehenden Punkten (1) bis (4) beschriebenen Verfahren liegt beim Einleiten des auf einem organischen Lösungsmittel basierten Eluats eine Strömungsgeschwindigkeit des Eluats im Bereich von 0,1 bis 10 mL/min. Durch Separieren des Phospholipids mit einer derartigen Strömungsgeschwindigkeit ist es möglich, ein vorgegebenes Phospholipid zu separieren, also das Phospholipid mit hohem Reinheitsgrad zu gewinnen, ohne dass lange Zeit für die Separationsschritte notwendig ist.
    • (8) Bei dem unter den vorstehenden Punkten (1) bis (7) beschriebenen Verfahren wird beim Fraktionieren der gewonnenen Flüssigkeit das Phospholipid durch Betrachten von Absorptionen der fraktionierten Flüssigkeiten in einer Wellenlänge im Bereich von 190 bis 230 nm nachgewiesen. Da die Wellenlänge innerhalb eines derartigen Bereichs eine Wellenlänge ist, deren Licht durch eine in dem Phospholipid enthaltene Phospatgruppe adsorbiert wird, ist es möglich, das Phospholipid in der Flüssigkeit verlässlich nachzuweisen, indem seine Absorptionen in der Wellenlänge dieses Bereichs betrachtet werden.
    • (9) Bei dem unter vorstehendem Punkt (8) beschriebenen Verfahren umfasst das Verfahren ferner das vorherige Erhalten einer Absorption des Eluats, wobei beim Fraktionieren der gewonnenen Flüssigkeit das Phospholipid durch Subtrahieren der vorher erhaltenen Absorption von der Absorption jeder der zu betrachtenden fraktionierten Flüssigkeiten nachgewiesen wird. Gemäß dem vorliegenden Verfahren ist es möglich, die von dem Eluat stammende Absorption zu kompensieren. Mit anderen Worten: Es wird möglich, das Phospholipid in der Flüssigkeit mit hoher Empfindlichkeit nachzuweisen, da von dem Eluat stammende Störungen entfernt werden können.
    • (10) Bei dem unter den vorstehenden Punkten (1) bis (9) beschriebenen Verfahren besteht die Calciumphosphat-basierte Verbindung aus Hydroxylapatit als Hauptbestandteil. Da Hydroxylapatit insbesondere ein Stoff ist, der den Bestandteilen des lebenden Körpers ähnlich ist, ist es möglich, verlässlich zu verhindern, dass ein solches Phospholipid verändert (deaktiviert) wird, wenn das Phospholipid adsorbiert und separiert wird.
    • (11) Bei dem unter vorstehenden Punkten (1) bis (10) beschriebenen Verfahren umfasst das Verfahren ferner das vorherige Präparieren der Vorrichtung. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es möglich, das in einer Probenlösung enthaltene Phospholipid an dem Füllmittel zu adsorbieren und das adsorbierte Phospholipid wahlweise in das Eluat zu eluieren. Daher ist es möglich, das Phospholipid mit hohem Reinheitsgrad aus der das Phospholipid enthaltenden Probenlösung zu separieren.
  • Ferner ist es durch geeignetes Einstellen der Bedingungen zum Betrachten der das Phospholipid enthaltenden Flüssigkeit möglich, das in der Flüssigkeit enthaltene Phospholipid mit hohem Reinheitsgrad nachzuweisen.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 ist eine Schnittansicht, die ein Beispiel für eine in der vorliegenden Erfindung zu verwendende Adsorptionsvorrichtung zeigt.
  • 2 zeigt Teilchengrößenverteilungskurven von Lecithinliposomen, die in einer Lecithinliposomen enthaltenden Lösung vorhanden sind.
  • 3 zeigt eine Absorptionskurve, die unter Verwendung einer Flüssigkeit gemessen wurde, die von einer Adsorptionsvorrichtung abgegeben wird, wenn eine ein Phospholipid enthaltende Probenlösung in die Adsorptionsvorrichtung eingebracht wird.
  • 4 zeigt eine Absorptionskurve, die unter Verwendung einer Flüssigkeit gemessen wurde, die von einer Adsorptionsvorrichtung abgegeben wird, wenn eine ein Phospholipid enthaltende Probenlösung in die Adsorptionsvorrichtung eingebracht wird.
  • 5 zeigt Absorptionskurven in einem Zustand, in dem Proteine, die in einer 4STD-Probe enthalten sind, unter Verwendung einer Adsorptionsvorrichtung voneinander separiert werden, die mit einem ein Phospholipid-Liposom adsorbierenden Füllmittel versehen ist.
  • 6 zeigt Absorptionskurven in einem Zustand, in dem Proteine, die in einer 4STD-Probe enthalten sind, unter Verwendung einer Adsorptionsvorrichtung voneinander separiert werden, die mit einem Füllmittel versehen ist, das mit verschiedenen Arten von Lösungsmitteln gewaschen wurde.
  • 7 zeigt Mengen an organischen Materialien, die an einem Füllmittel verbleiben, das mit verschiedenen Arten von Lösungsmitteln gewaschen wurde.
  • 8 zeigt Absorptionskurven in einem Zustand, in dem in einer Probenlösung vorhandenes Lecithin unter Verwendung einer Adsorptionsvorrichtung separiert wird.
  • 9 zeigt eine Absorptionskurve in einem Zustand, in dem in einer Probenlösung vorhandenes Lecithin unter Verwendung einer Adsorptionsvorrichtung separiert wird.
  • 10 zeigt Absorptionskurven in einem Zustand, in dem ein von einem Eigelb stammendes und in einer Probenlösung enthaltenes Phospholipid unter Verwendung einer Adsorptionsvorrichtung separiert wird.
  • 11 zeigt Absorptionskurven in einem Zustand, in dem ein von der Membran eines roten Blutkörperchens stammendes und in einer Probenlösung enthaltenes Phospholipid unter Verwendung einer Adsorptionsvorrichtung separiert wird.
  • 12 zeigt Absorptionskurven in einem Zustand, in dem ein von Endotoxin stammendes und in einer Probenlösung enthaltenes Phospholipid unter Verwendung einer Adsorptionsvorrichtung separiert wird.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSBEISPIELE
  • Nachfolgend wird ein Separationsverfahren nach vorliegender Erfindung basierend auf einem bevorzugten Ausführungsbeispiel, das in den begleitenden Zeichnungen dargestellt, ausführlich beschrieben.
  • Vor der Beschreibung des Separationsverfahrens nach vorliegender Erfindung wird zunächst ein Beispiel einer Adsorptionsvorrichtung (Separationsvorrichtung), wie sie in der vorliegenden Erfindung zu verwenden ist, beschrieben.
  • 1 ist eine Schnittansicht, die ein Beispiel für eine bei der vorliegenden Erfindung zu verwendende Adsorptionsvorrichtung zeigt. Es sei darauf hingewiesen, dass bei der folgenden Beschreibung die Oberseite und die Unterseite in 1 als „Zuflussseite” bzw. als ”Abflussseite” beschrieben werden.
  • Genauer gesagt, bezeichnet die Zuflussseite eine Seite, von der aus Flüssigkeiten wie eine Probenlösung (d. h. eine Flüssigkeit, die eine Probe enthält) und ein auf einem organischen Lösungsmittel basiertes Eluat in die Adsorptionsvorrichtung eingeführt werden, um ein vorgegebenes Phospholipid zu separieren (reinigen), und die Abflussseite bezeichnet eine Seite, die der Zuflussseite gegenüber liegt, d. h. eine Seite, durch die die oben beschriebenen Flüssigkeiten als Abgabeflüssigkeiten aus der Adsorptionsvorrichtung abfließen.
  • In dieser Hinsicht folgt eine Beschreibung anhand eines Falles, in dem das Phospholipid aus einer von einem Eigelb stammenden Probenlösung unter Verwendung der Adsorptionsvorrichtung 1 wahlweise separiert wird.
  • Die in 1 gezeigte Adsorptionsvorrichtung, die zum Separieren (Isolieren) des Phospholipids aus der Probenlösung verwendet wird, enthält eine Säule 2, ein granulares Füllmittel (Adsorptionsmittel) 3 und zwei Filterelemente 4 und 5.
  • Die Säule 2 besteht aus einem Säulenhauptkörper 21 und Kappen 22 und 23, die an dem zuflussseitigen Ende und dem abflussseitigen Ende des Säulenhauptkörpers 21 jeweils zu befestigen sind.
  • Der Säulenhauptkörper 21 besteht z. B. aus einem zylindrischen Element. Beispiele für das Material eines jeden Teils (Elements) der Säule 2 einschließlich des Säulenhauptkörpers 21 sind verschiedene Arten von Glas, verschiedene Arten von Kunstharz, verschiedene Arten von metallischen Materialien und verschiedene Arten von keramischen Materialien und dergleichen.
  • Eine Öffnung an der Zuflussseite des Säulenhauptkörpers 21 ist mit dem Filterelement 4 abgedeckt, und in diesem Zustand ist die Kappe 22 an dem zuflussseitigen Ende des Säulenhauptkörpers 21 verschraubt. Ähnlich ist eine Öffnung an der Abflussseite des Säulenhauptkörpers 21 mit dem Filterelement 5 abgedeckt, und in diesem Zustand ist die Kappe 23 an dem abflussseitigen Ende des Säulenhauptkörpers 21 verschraubt.
  • Die so aufgebaute Säule 2 hat einen Adsorptionsmittelfüllraum 20, der durch den Säulenhauptkörper 21 und die Filterelemente 4 und 5 definiert ist, und mindestens ein Teil des Adsorptionsmittelfüllraums 20 ist mit dem Füllmittel 3 gefüllt (in diesem Beispiel ist fast der gesamte Adsorptionsmittelfüllraum 20 mit dem Füllmittel 3 gefüllt).
  • Die volumetrische Kapazität des Adsorptionsmittelfüllraums 20 wird abhängig von dem Volumen einer zu verwendenden Probenlösung geeignet bemessen. Diese volumetrische Kapazität ist nicht besonders begrenzt, jedoch liegt sie vorzugsweise im Bereich von ungefähr 0,1 bis 100 mL, insbesondere im Bereich von ungefähr 1 bis 50 mL pro 1 mL der Probenlösung.
  • Durch Einstellen der Größe des Adsorptionsmittelfüllraums 20 auf einen Wert in dem vorstehend genannten Bereich und durch Einstellen der Größe des Füllmittels 3 (das noch beschrieben wird) auf einen Wert in einem noch zu beschreibenden Bereich, ist es möglich, das vorgegebene Phospholipid aus der Probenlösung wahlweise zu isolieren (separieren). Mit anderen Worten: Es ist möglich, das Phospholipid verlässlich von in der Probenlösung enthaltenen verunreinigenden Stoffen (Fremdstoffen) zu separieren, bei denen es sich nicht um das Phospholipid handelt.
  • Ferner wird die Flüssigkeitsabdichtung zwischen dem Säulenhauptkörper 21 und den Kappen 22 und 23 durch Befestigen der Kappen 22 und 23 an den Öffnungen des Säulenhauptkörpers 21 gewährleistet.
  • Ein Zuleitungsrohr 24 ist flüssigkeitsdicht an der Kappe 22 im Wesentlichen zentral befestigt, und ein Ableitungsrohr 25 ist ebenfalls flüssigkeitsdicht an der Kappe 23 in Wesentlichen zentral befestigt. Die oben beschriebene Probenlösung (Flüssigkeit) wird dem Adsorptionsmittelfüllraum 20 über das Zuleitungsrohr 24 und das Filterelement 4 zugeführt. Die dem Adsorptionsmittelfüllraum 20 zugeführte Probenlösung läuft durch Zwischenräume zwischen Teilchen des Füllmittels 3 und tritt dann aus der Säule 2 durch das Filterelement 5 und das Ableitungsrohr 25 aus. Zu diesem Zeitpunkt werden das Phospholipid und die in der Probenlösung (Probe) enthaltenen verunreinigenden Stoffe, bei denen es sich nicht um das Phospholipid handelt, voneinander separiert entsprechend der Differenz der Adsorptionsgrade des Phospholipids und der verunreinigenden Proteine gegenüber dem Füllmittel 3, das die Calciumionen adsorbiert, und der Differenz des Affinitätsgrades des Phospholipids und der verunreinigenden Stoffe zu einem auf organischem Lösungsmittel basierten Eluat.
  • Jedes Filterelement 4 und 5 hat die Funktion, das Austreten des Füllmittels 3 aus dem Adsorptionsmittelfüllraum 20 zu verhindern. Ferner besteht jedes Filterelement 4 und 5 aus einem nicht gewebten Material, einem Schaum (schwammartiger poröser Körper mit untereinander verbundenen Poren), einem Gewebematerial, einem Maschenmaterial oder dergleichen, das aus einem Kunstharz wie Polyurethan, Polyvinylalkohol, Polypropylen, Polyetherpolyamid, Polyethylenterephthalat oder Polybutylenterephthalat besteht.
  • Mindestens die Oberfläche des Füllmittels 3 besteht aus einer Calciumphosphat-basierten Verbindung. Wie später beschrieben wird, werden die Calciumionen an ein derartiges Füllmittel 3 adsorbiert. Das Phospholipid wird besonders an solches Füllmittel 3 adsorbiert, das die Calciumionen mit einer Adsorbierbarkeit (Haltekraft) adsorbiert, die ihnen inhärent eigen ist. Daher wird das Phospholipid basierend auf der Differenz zwischen der Adsorbierbarkeit des Phospholipids und der Adsorbierbarkeit der Fremdstoffe, bei denen es sich nicht um Phospholipide handelt, von den Fremdstoffen, bei denen es sich nicht um Phospholipide handelt, separiert und gereinigt.
  • Beispiele für die Calciumphosphat-basierte Verbindung sind, ohne eine Einschränkung vorzunehmen, Hydroxylapatit (Ca10(PO4)6(OH)2), TCP (Ca3(PO4)2), Ca2P2O7, Ca(PO3)2, DCPD (CaHPO4·2H2O), Ca4O(PO4)2, Materialien, bei denen ein Teil dieser Materialien durch andere Atome oder andere Atomgruppen substituiert sind, und dergleichen. Diese Calciumphosphat-basierten Verbindungen können einzeln oder in Kombination von zwei oder mehr Verbindungen verwendet werden.
  • Von diesen Calciumphosphat-basierten Verbindungen wird vorzugsweise eine solche verwendet, die den Hydroxylapatit als Hauptkomponente des Füllmittels 3 enthält. Insbesondere ist der Hydroxylapatit eine Substanz ähnlich Bestandteilen eines lebenden Körpers. Wenn das Phospholipid an dem Füllmittel 3 adsorbiert und von diesem separiert (desorbiert) wird, ist es daher möglich, verlässlich zu verhindern, dass ein derartiges Phospholipid verändert (denaturiert) wird.
  • Wie in 1 gezeigt, hat das oben beschriebene Füllmittel 3 vorzugsweise eine teilchenförmige (granulare) Form, kann jedoch eine andere Form aufweisen, z. B. eine Pellet-(kleiner Block)artige Form oder eine blockartige Form (z. B. ein poröser Körper, in dem benachbarte Poren miteinander kommunizieren oder eine Wabenform). Durch Ausbilden des Füllmittels 3 mit der teilchenförmigen Form, ist es mögliche seine Oberfläche zu vergrößern und dadurch die Separationseigenschaften für das Phospholipid zu verbessern.
  • Die mittlere Teilchengröße des Füllmittels 3 mit der teilchenförmigen Form ist nicht speziell eingeschränkt, liegt jedoch vorzugsweise im Bereich von ungefähr 0,5 bis 150 μm, insbesondere im Bereich von ungefähr 10 bis 80 μm. Durch Verwenden des Füllmittels 3 mit einer solchen mittleren Teilchengröße ist es möglich, das Verstopfen des Filterelements 5 verlässlich zu verhindern, während eine ausreichende Oberfläche des Füllmittels 3 sichergestellt ist.
  • Es sei darauf hingewiesen, dass das Füllmittel 3 vollständig aus der Calciumphosphat-basierten Verbindung bestehen kann. Alternativ kann das Füllmittel 3 durch Beschichten der Oberfläche eines Trägers (Basis) mit der Calciumphosphat-basierten Verbindung ausgebildet sein. Vorzugsweise kann das Füllmittel 3 vollständig aus der Calciumphosphat-basierten Verbindung bestehen. Dies ermöglicht es, die Dauerhaftigkeit des Füllmittels 3 weiter zu verbessern, wodurch man eine geeignete Säule erhält, die beim Separieren einer großen Menge des Phospholipids verwendbar ist.
  • Das Füllmittel 3, das vollständig aus der Calciumphosphat-basierten Verbindung besteht, kann folgendermaßen hergestellt werden. Teilchen einer Phosphat-Calcium-basierten Verbindung (Primärteilchen) werden unter Anwendung eines Nass-Syntheseverfahrens oder eines Trocken-Syntheseverfahrens erzeugt, eine derartige Teilchen einer Phosphat-Calcium-basierten Verbindung enthaltende Schlämme wird zubereitet und dann wird die Schlämme getrocknet und granuliert, um getrocknete Teilchen zu erzeugen. Danach werden die getrockneten Teilchen gesintert, um das Füllmittel 3 zu gewinnen, das vollständig aus der Calciumphosphat-basierten Verbindung besteht.
  • Andererseits kann das Füllmittel 3, das durch Beschichten der Oberfläche des Trägers mit der Calciumphosphat-basierten Verbindung gebildet ist, durch Anwenden eines Verfahrens hergestellt werden, bei dem die getrockneten Teilchen mit dem aus Kunstharzen oder dergleichen bestehenden Träger kollidiert (hybridisiert) werden.
  • Wenn, wie bei diesem Ausführungsbeispiel, nahezu der gesamte Adsorptionsmittelfüllraum 20 mit dem Füllmittel 3 gefüllt ist, hat das Füllmittel 3 an jeder Stelle in dem Adsorptionsmittelfüllraum vorzugsweise die gleiche Zusammensetzung. Dies verleiht der Adsorptionsvorrichtung 1 ein besonders herausragendes Vermögen, das Phospholipid zu separieren (reinigen).
  • Hierbei sei darauf hingewiesen, dass der Adsorptionsmittelfüllraum 20 teilweise mit dem Füllmittel 3 gefüllt sein kann (z. B. ein Teil des Adsorptionsmittelfüllraums 20, der auf der einen Seite gelegen ist, an der das Zuleitungsrohr 24 vorgesehen ist, kann mit dem Füllmittel 3 gefüllt sein). In diesem Fall kann der übrige Teil des Adsorptionsmittelfüllraums 20 mit einem anderen Füllmittel gefüllt sein.
  • Nachfolgend wird ein Verfahren zum Separieren des Phospholipids unter Verwendung der oben beschriebenen Adsorptionsvorrichtung 1 (d. h. ein Separationsverfahren nach vorliegender Erfindung) beschrieben.
  • (1) Schritt des Zubereitens einer Probenlösung
  • Zuerst wird beispielsweise ein Eigelb als Probe zubereitet, wobei das in diesem Eigelb enthaltene Totallipid extrahiert wird, um eine Probenlösung zuzubereiten.
  • Ein Verfahren zum Extrahieren des Totallipids aus dem Eigelb unterliegt keinen besonderen Einschränkungen, sondern es kommen vorzugsweise verschiedene Arten von Extraktionsverfahren zum Einsatz, die ein organisches Lösungsmittel verwenden. Zu den Beispielen für solche verschiedene Arten von Extraktionsverfahren gehören das Bligh-Dyer-Verfahren, das Chloroform und Methanol verwendet, das Folch-Verfahren und dergleichen.
  • Hier sind ein einfaches Lipid und ein komplexes Lipid in dem Totallipid enthalten. Ferner sind ein Phospholipid und ein Glycolipid in dem komplexen Lipid enthalten.
  • Das bei diesem Ausführungsbeispiel zubereitete Eigelb enthält Phosphatidyl-Cholin (Lecithin), Lysophosphatidylcholine, Phosphatidyl-Ethanolamin, Lysophosphatidyl-Ethanolamin, Sphingomyeline, Phosphatidyl-Inositol, Plasmalogen und dergleichen als Phospholipid. Diese Phospholipide werden aus der das Totallipid enthaltenden Probenlösung durch das Separationsverfahren des Phospholipids unter Verwendung der Adsorptionsvorrichtung 1 isoliert (separiert).
  • Die in die Adsorptionsvorrichtung 1 zu leitende Probenlösung unterliegt keinen besonderen Einschränkungen, so lange die Probenlösung die das aus dem Eigelb extrahierten Phospholipide enthält. Vorzugsweise enthält die Probenlösung jedoch ein Phospholipid-Liposom, bei dem die Phospholipide ein Liposom bilden. Wenn die Probenlösung bei dem später zu beschreibenden Schritt (3) in die Adsorptionsvorrichtung 1 gleitet wird, nimmt daher das Phospholipid-Liposom eine Struktur (einen Zustand) an, in dem Phosphatgruppen mit den Phospholipiden aus dem Liposom freigelegt sind. Mit anderen Worten: Hydrophobe Teile von Fettsäureestern, bei denen die Phospholipide vorhanden sind, sind miteinander aggregiert und dann werden sphärische Aggregationen gebildet, so dass die Struktur gebildet wird, in der hydrophile Phosphatgruppen, bei denen die Phospholipide vorhanden sind, freigelegt sind. Daher ist es möglich, die als Phospholipid-Liposom vorliegenden Phospholipide verlässlich an dem Füllmittel 3 zu adsorbieren.
  • Die ein derartiges Phospholipid-Liposom enthaltende Probelösung kann z. B. hergestellt werden, indem der extrahierten Flüssigkeit, die das aus dem Eigelb extrahierte Totallipid enthält, Wasser zugegeben wird und dies kräftig gerührt wird.
  • Die mittlere Teilchengröße des in der Probenlösung enthaltenen Phospholipid-Liposoms unterliegt keinen besonderen Einschränkungen, liegt jedoch vorzugsweise im Bereich von ungefähr 10 bis 1000 nm, insbesondere im Bereich von ungefähr 50 bis 200 nm. Das Phospholipid-Liposom mit der mittleren Teilchengröße innerhalb dieses Bereichs ermöglicht das verlässliche Adsorbieren an dem Füllmittel 3, wenn die Probenlösung in die Adsorptionsvorrichtung 1 gebracht ist.
  • (2) Schritt des Adsorbierens von Calciumionen
  • Als nächstes werden Calciumionen an dem Füllmittel 3 adsorbiert.
  • In vorliegendem Fall hat das Phospholipid Glycerin und Sphingosin als zentrales Gerüst und eine derartige chemische Struktur, dass Fettsäuren und Phosphorsäure an das zentrale Gerüst gebunden sind. Außerdem hat das Phospholipid ferner eine derartige chemische Struktur, dass ein Alkohol und die Phosphorsäure mit einer Esterbindung aneinander gebunden sind. Bei dem Phospholipid mit derartigen chemischen Strukturen sind zwei von drei Hydroxylgruppen (also PO-Gruppen) der Phosphorsäure an das zentrale Gerüst bzw. den Alkohol gebunden. Die verbleibende wird ionisiert und bildet dadurch eine Phosphatstelle, die negativ geladen ist.
  • Ferner ist die Calciumphosphat-basierte Verbindung des Füllmittels 3 durch eine chemische Formel repräsentiert: Ca10(PO4)3X2. Das Ca/P-Verhältnis der zu verwendenden Calciumphospat-basierten Verbindung liegt im Bereich von 1,0 bis 2,0. Die Calcium-Phosphat-basierte Verbindung hat eine Struktur, in der positiv geladene Calciumionen (Calcium-Stellen) und negativ geladene Phosphatgruppen (Phosphat-Stellen) regelmäßig in einem Zustand hoher Dichte angeordnet sind. Ferner weist die Calciumphosphat-basierte Verbindung auf Grund elektrostatischer Wechselwirkung als amphoterer Ionenaustauschkörper Adsorptionsfähigkeit auf. Daher weist die Calciumphosphat-basierte Verbindung auf Grund der elektrostatischen Wechselwirkung in den Calcium-Stellen gegenüber dem Phospholipid, das die Phosphat-Stellen enthält, die Adsorptionsfähigkeit auf. Andererseits wird in der Phosphat-Stelle eine Rückstoßkraft erzeugt, da sowohl die Phosphat-Stellen des Phospholipids als auch die Phosphat-Stellen der Calciumphosphat-basierten Verbindung negativ geladen sind.
  • Wie oben beschrieben ist es, wenn das negativ geladene Phospholipid an der Calciumphosphat-basierten Verbindung adsorbiert ist, unmöglich, das Phospholipid ausreichend an dem Füllmittel 3 zu adsorbieren, da die Calciumphosphat-basierte Verbindung die Adsorptionsfähigkeit auf Grund der elektrostatischen Wechselwirkung als amphoterer Ionenaustauschkörper aufweist, der sowohl positiv als auch negativ geladen ist.
  • Dagegen sind die Calciumionen bei der vorliegenden Erfindung an die Phosphat-Stellen in der Calciumphosphat-basierten Verbindung gebunden, da die Calciumionen an dem Füllmittel adsorbiert sind. Aus diesem Grund sind in dem Füllmittel 3 die Calcium-Stellen ausgedehnt und die Phosphat-Stellen eingeschränkt. Es ergibt sich eine verbesserte Adsorptionsfähigkeit des negativ geladenen Phospholipids gegenüber dem Füllmittel 3.
  • Was dies betrifft, sind die Calciumionen zwar vorzugsweise an im Wesentlichen alle Phosphat-Stellen der Calciumphosphat-basierten Verbindung gebunden, doch können die Calciumionen an zumindest diejenigen Phosphat-Stellen gebunden sein, die in einer Außenfläche des Füllmittels 3 gelegen sind. Ein Bindungsverhältnis der Calciumionen und der Phosphat-Stellen in der Außenfläche des Füllmittels 3 liegt vorzugsweise im Bereich von ungefähr 5 bis 100%, insbesondere im Bereich von ungefähr 10 bis 100% und speziell im Bereich von ungefähr 20 bis 100%. Das Bindungsverhältnis der Calciumionen und der Phosphat-Stellen kann aus der Menge (adsorbierten Menge) eines Proteins erhalten (berechnet) werden, das an den Phosphat-Stellen adsorbiert wird, wenn das an den Phosphat-Stellen zu adsorbierende Protein in den Adsorptionsmittelfüllraum 20 der Adsorptionsvorrichtung 1 eingebracht wird, in den die Calciumphosphat-basierte Verbindung gefüllt ist. In dem Fall, in dem 100% der Calciumionen an die Phosphat-Stellen gebunden sind, passiert das an den Phosphat-Stellen zu adsorbierende Protein den Adsorptionsmittelfüllraum 20.
  • Ein Verfahren zum Adsorbieren der Calciumionen an dem Füllmittel 3 unterliegt keinen besonderen Einschränkungen, doch umfassen Beispielverfahren ein Verfahren, bei dem eine Calcium enthaltende Flüssigkeit mit dem Füllmittel 3 in Kontakt gebracht wird, und dergleichen. Gemäß einem derartigen Verfahren ist es möglich, die Calciumionen mit einer einfachen Operation, die einen Schritt beinhaltet, bei dem die Calcium enthaltende Flüssigkeit mit dem Füllmittel 3 in Kontakt gebracht wird, also indem die Calcium enthaltende Flüssigkeit in die Adsorptionsvorrichtung 1 eingebracht wird, verlässlich an dem Füllmittel 3 zu adsorbieren.
  • Die Calcium enthaltende Flüssigkeit ist nicht speziell eingeschränkt, zu den Beispielen für die Calcium enthaltende Flüssigkeit gehören eine wässrige Calciumchlorid-Lösung, eine wässrige Calciumlaktat-Lösung, eine wässrige Calciumnitrat-Lösung und dergleichen. Von diesen ist die wässrige Calciumchlorid-Lösung vorzuziehen. Durch Verwenden einer solchen wässrigen Lösung ist es möglich, die Calciumionen ohne nachteilige Wirkungen auf die Calciumphosphat-basierte Verbindung verlässlich an den Phosphat-Stellen der Calciumphosphat-basierten Verbindung zu adsorbieren.
  • Der Anteil des Calciumchlorid in der wässrigen Calciumchlorid-Lösung ist nicht speziell eingeschränkt, liegt jedoch vorzugsweise im Bereich von ungefähr 0,5 bis 10 mM und insbesondere im Bereich von ungefähr 1 bis 3 mM.
  • Ferner ist der pH-Wert der wässrigen Calciumchlorid-Lösung nicht speziell eingeschränkt, liegt jedoch vorzugsweise im Bereich von ungefähr 0,5 bis 9,0 und insbesondere im Bereich von ungefähr 6,0 bis 8,0.
  • Durch Einstellen der Eigenschaften der wässrigen Calciumchlorid-Lösung wie oben beschrieben ist es möglich, die in der wässrigen Calciumchlorid-Lösung enthaltenen Calciumionen verlässlich an dem Füllmittel 3 zu adsorbieren.
  • (3) Schritt des Einbringens
  • Als nächstes wird die in obigem Schritt (1) zubereitete Probenlösung durch das Zuleitungsrohr 24 und das Filterelement 4 in den Adsorptionsmittelfüllraum 20 eingebracht. Dann durchläuft die Probenlösung die Säule 2 (Adsorptionsvorrichtung 1), wodurch sie mit dem Füllmittel 3 in Kontakt tritt, in dem die Calciumionen in obigem Schritt (2) adsorbiert worden sind.
  • Wie in obigem Schritt (2) beschrieben, werden, da bei vorliegender Erfindung die Calciumionen an dem Füllmittel 3 adsorbiert sind, das Phospholipid, das hohe Adsorbierbarkeit an dem die Calciumionen adsorbierenden Füllmittel 3 hat, und diejenigen Fremdstoffe (z. B. einfaches Lipid oder Glycolipid), bei denen es sich nicht um Phospholipid handelt und die relativ hohe Adsorbierbarkeit an dem die Calciumionen adsorbierenden Füllmittel 3 haben, an dem Füllmittel 3 in dem Adsorptionsmittelfüllraum 20 getragen. Diejenigen Fremdstoffe, die geringe Adsorbierbarkeit an dem Füllmittel 3 haben, werden durch das Filterelement 5 und das Auslassrohr 25 aus Säule 2 ausgegeben.
  • (4) Schritt des Fraktionierens
  • Als nächstes wird ein auf einem organischen Lösungsmittel basiertes Eluat zum Eluieren des Phospholipids durch das Zuleitungsrohr 24 in die Säule 2 eingebracht. Danach wird eine durch das Auslassrohr 25 aus der Säule 2 ausgegebene Flüssigkeit (Abgabeflüssigkeit) in unterschiedliche Teile bei jeder vorgegebenen Menge fraktioniert (gesammelt).
  • Wie oben beschrieben, wird bei vorliegender Erfindung das auf einem organischen Lösungsmittel basierte Eluat als Eluat zum Eluieren des Phospholipids verwendet. Durch Entwicklungen der Erfinder hat sich ergeben, dass es durch Verwenden eines derartigen auf einem organischen Lösungsmittel basierten Eluats möglich ist, das Phospholipid, das mit hoher Adsorbierbarkeit an dem die Calciumionen adsorbierenden Füllmittel 3 adsorbiert ist, verlässlich in das Eluat zu eluieren.
  • Daher ist es durch geeignetes Einstellen einer Art von auf einem organischen Lösungsmittel basierten Eluats und einer Menge des organischen Lösungsmittels in dem Eluat möglich, das Phospholipid, das aus dem Eigelb stammt und an dem Füllmittel 3 adsorbiert ist, sowie die Fremdstoffe, bei denen es sich nicht um Phospholipide handelt, basierend auf einem Unterschied zwischen den Adsorbierbarkeiten dieser Verbindungen (Phospholipide und Fremdstoffe) gegenüber dem Füllmittel 3 in die jeweilige Fraktion (Teil) zu sammeln (separieren).
  • Als auf einem organischen Lösungsmittel basiertes Eluat wird vorzugsweise eine wässrige Lösung verwendet, die ein wasserlösliches organisches Lösungsmittel enthält. Ferner ist das wasserlösliche organische Lösungsmittel nicht speziell eingeschränkt, zu den Beispielen dafür gehören Isopropanol, Butanol, Acetonitril, Pyridin, N,N-dimethylformamid und dergleichen. Diese Stoffe können einzeln oder in Kombination aus zweien oder mehreren derselben verwendet werden. Vorzugsweise wird davon Isopropanol verwendet. Dies ermöglicht es, die Phospholipide in einem Zustand, in dem die Phospholipide von den Fremdstoffen, bei denen es sich nicht um Phospholipide handelt, separiert sind, verlässlich in die jeweilige Fraktion zu eluieren, während die an dem Füllmittel 3 adsorbierten Phospholipide aus dem Füllmittel 3 eluiert werden.
  • Wird dagegen Isopropanol als wasserlösliches organisches Lösungsmittel verwendet, ist vorzugsweise eine Lösung mit linearem Gradienten als Eluat zu verwenden, bei dem der Anteil des in dem Eluat enthaltenen Isopropanols schrittweise erhöht wird. In diesem Fall ist es eher vorzuziehen, die Lösung mit linearem Gradienten zu verwenden, bei der der Anteil an Isopropanol von 0 auf 80% erhöht wird. Dies ermöglicht es, die Phospholipide in einem Zustand, in dem die Phospholipide von den Fremdstoffen, die keine Phospholipide sind, separiert sind, in die jeweilige Fraktion verlässlich zu eluieren.
  • Der pH-Wert des Eluats unterliegt keinen besonderen Einschränkungen, liegt jedoch vorzugsweise im Bereich von ungefähr 6 bis 8, insbesondere im Bereich von ungefähr 6,5 bis 7,5. Dadurch kann verhindert werden, dass die zu separierenden Phospholipide verändert werden, wodurch verhindert wird, dass ihre Beschaffenheit verändert wird. Außerdem kann verlässlich verhindert werden, dass das Füllmittel 3 verändert (gelöst) wird, wodurch verhindert wird, dass das Separationsvermögen des Füllmittels 3 in der Adsorptiorisvorrichtung 1 geändert wird.
  • Die Temperatur des Eluats ist ebenfalls nicht speziell eingeschränkt, liegt jedoch vorzugsweise im Bereich von ungefähr 30 bis 50°C und insbesondere im Bereich von ungefähr 35 bis 45°C. Dadurch kann verhindert werden, dass die zu separierenden Phospholipide verändert werden.
  • Daher ist es möglich, durch Verwenden des Eluats, dessen pH-Wert und Temperatur innerhalb der oben genannten Bereiche liegen, eine Sammelquote eines vorgegebenen Phospholipids zu verbessern.
  • Ferner liegt die Strömungsgeschwindigkeit, mit der das Eluat in dem Adsorptionsmittelfüllraum 20 strömt, vorzugsweise im Bereich von ungefähr 0,1 bis 10 mL/min und insbesondere im Bereich von ungefähr 1 bis 5 mL/min. Durch Separieren der Phospholipide aus der Probenlösung mit einer derartigen Strömungsgeschwindigkeit ist es möglich, das vorgegebene Phospholipid verlässlich aus der Probenlösung zu separieren, ohne dass eine lange Zeitspanne für den Separationsvorgang erforderlich ist. Mit anderen Worten: Es ist möglich, das Phospholipid mit hohem Reinheitsgrad zu gewinnen.
  • Ferner ist ein Test, welche Fraktionen (Teile) des Phospholipids eluiert worden sind, also ein Nachweis der Phospholipide in jeder Fraktion, nicht auf ein Verfahren dafür beschränkt. Vorzugsweise wird jedoch der Nachweis durch Betrachten der Absorption der Abgabeflüssigkeit in jeder Fraktion durchgeführt. Dadurch kann mit dem relativ einfachen Schritt, bei dem die Absorptionen der Abgabeflüssigkeit in jeder Fraktion mit der Zeit betrachtet wird, untersucht werden, welche Fraktionen der Phospholipide eluiert worden sind.
  • Wenn der Nachweis der Phospholipide in jeder Fraktion durch Betrachten der Absorption der Abgabeflüssigkeit in jeder Fraktion ausgeführt wird, liegt die Wellenlänge zum Erfassen der Phospholipide vorzugsweise im Bereich von ungefähr 190 bis 230 nm und insbesondere im Bereich von ungefähr 200 bis 210 nm. Die Wellenlängen innerhalb eines solchen Bereichs ermöglichen es, die Phospholipide in der Abgabeflüssigkeit durch Betrachten der Absorptionen der Abgabeflüssigkeit in den Wellenlängen innerhalb des Bereichs verlässlich zu erfassen. Dies liegt daran, dass die Phosphatgruppen in den Phospholipiden Licht in den Wellenlängen innerhalb eines derartigen Bereichs absorbieren.
  • Ferner werden in diesem Fall zuvor die Absorptionen eines Eluats (Blindprobe) gemessen, und dann werden die gemessenen Absorptionen des Eluats (Blindprobe) von den Absorptionen der Abgabeflüssigkeit in jeder zu betrachtenden Fraktion subtrahiert, um so Absorptionen der Abgabeflüssigkeit in jeder Fraktion zu erhalten. Dadurch können die von dem Eluat stammenden Absorptionen kompensiert werden. Mit anderen Worten: Es ist möglich, Störungen der aus dem Eluat stammenden Absorptionen zu entfernen, so dass es möglich wird, die Phospholipide in der Abgabeflüssigkeit mit höherer Empfindlichkeit nachzuweisen.
  • Gemäß vorliegender Erfindung ist es möglich, die aus einem Eigelb stammenden Phospholipide durch Anwenden relativ einfacher Verfahrensschritte mit hohem Reinheitsgrad in eine vorgegebene Fraktion zu separieren (sammeln). Bei diesen relativ einfachen Verfahrensschritten handelt es sich um den Schritt, in dem die Calciumionen an dem aus der Calciumphosphat-basierten Verbindung bestehenden Füllmittel adsorbiert werden, den Schritt, in dem die die Phospholipide enthaltende Probenlösung und das Füllmittel miteinander in Kontakt gebracht werden, und den darauf folgenden Schritt, in dem das auf einem organischen Lösungsmittel basierte Eluat in die Säule eingebracht wird.
  • Die vorstehende Beschreibung ist eine Beschreibung anhand eines Beispiels in dem Fall, dass die aus einem Eigelb stammenden Phospholipide aus dem Totallipid extrahiert werden. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf einen solchen Fall beschränkt. Gemäß vorliegender Erfindung ist selbst das Separieren von Phospholipiden, die in einer Hülse, wie z. B. einer Sojabohne, verschiedenartigen Zellen, wie Erythrozyten und gramnegativer Bakterien, Viren und dergleichen enthalten sind, mit Leichtigkeit und hohem Reinheitsgrad möglich.
  • Zwar wurde das Separationsverfahren gemäß vorliegender Erfindung vorstehend beschrieben, doch ist die vorliegende Erfindung nicht darauf beschränkt. Beispielsweise kann das Separationsverfahren nach vorliegender Erfindung zusätzlich einen oder mehrere Schritte für jeglichen Zweck enthalten.
  • Beispiele
  • Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf spezielle Beispiele beschrieben.
  • 1. Zubereitung von Phospholipid-Liposomen
  • (Lecithinliposom enthaltende Flüssigkeit)
    • -1A- Zuerst wurde aus einem Eigelb stammendes Lecithin (Los Nr. 126-00812, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) zubereitet und gerührt. Danach wurden 60 μL Lecithin zu 1,94 mL Ethanol gegeben, um ein Lecithin-Ethanol-Additiv zu erhalten. Dann wurde das Lecithin-Ethanol-Additiv unter Verwendung eines Rotators („RT-50”, hergestellt von TAITEC CORPORATION) unter den Bedingungen 30 U/min × 15 min (Raumtemperatur) gerührt.
    • -2A- Als nächstes durchlief das gerührte Lecithin-Ethanol-Additiv eine Zentrifugalseparationsvorrichtung unter den Bedingungen von 8000 U/min × 5 min (Raumtemperatur), um einen Überstand zu erhalten.
    • -3A- Danach wurden 1,5 mL des in dem obigen Schritt 2A gewonnenen Überstands (Ethanol-lösliche Fraktion) unter Verwendung einer 500 μL-Mikroinjektionsspritze für Chromatinjektion („MS-R500”, hergestellt von Ito Kabushiki Kaisha) in drei Teilen schnell zu 30 mL Wasser zugegeben, während das Wasser gerührt wurde. Danach wurde die Mischung für ungefähr 3 Minuten gerührt, um eine Lecithinliposome enthaltende Flüssigkeit herzustellen.
  • In der so hergestellten Lecithinliposome enthaltenden Flüssigkeit wurden die Größen von in der Lecithinliposome enthaltenden Flüssigkeit enthaltenen Lecithinliposomen insgesamt dreimal gemessen, wobei eine Vorrichtung zum Bestimmen der Teilchengrößenverteilung in dynamischer Streuung („N5”, hergestellt von Beckman Coulter, Inc.) verwendet wurde.
  • Die Ergebnisse sind in 2 und Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1
    Analyse Bedingungen Analyseergebnisse
    Minimale Teilchengröße [nm] Maximale Teilchengröße [nm] Viskosität [cP] RI Teilchengröße [nm] % Standardabweichung [nm] Mittlere Teilchengröße [nm] Mittlere SD % Staub
    Probe 1 3,0 3000 1,002 1,333 90,4 81,2 16,5 176,8 218,6 0,0
    5540,7 18,8 67,3
    Probe 2 95,3 74,9 18,6 262,3 354,6 0,0
    761,3 25,1 134,6
    Probe 3 92,9 78,0 17,3 212,1 275,3 0,0
    634,0 22,0 107,4
  • Wie aus 2 und Tabelle 1 deutlich zu erkennen, konnten die Lecithinliposome in dem Wasser hergestellt werden, indem die Ethanol-lösliche Fraktion dem Wasser schnell zugegeben wurde, während das Wasser gerührt wurde. Man nimmt an, dass Lecithinliposome mit einer Teilchengröße von ungefähr 100 nm und Lecithinliposome mit einer Teilchengröße von ungefähr 500 nm in diesen Lecithinliposomen enthalten sind. Die Lecithinliposome mit der Teilchengröße von ungefähr 500 nm werden durch Aggregieren der Lecithinliposome mit der Teilchengröße von ungefähr 100 nm oder durch Bilden eines großen Monoschicht-Liposoms erzeugt.
  • 2. Adsorption von Phospholipid-Liposomen an das Füllmittel
  • (Analyse unter Verwendung eines Natriumphosphatpuffers)
    • -1B- Zuerst wurden Hydroxylapatit-Perlen (GHT TypII, mittlere Teilchengröße 40 μm, hergestellt von HOYA CORPORATION) (Füllmittel) in ein rostfreies Rohr mit einer Größe von 4 × 10 mm gefüllt, um eine Säule (Adsorptionsvorrichtung) herzustellen.
    • -2B- Dann wurden ein 1 mM-Natriumphosphatpuffer (nachfolgend als „NaPB” bezeichnet; pH-Wert 6,8) und ein 400 mM-NaPB (pH-Wert 6,8) als Puffer zum Adsorbieren der Phospholipide zubereitet.
    • -3B- Als nächstes wurde die Säule mit dem 1 mM-NAPB (Anfangspuffer) gefüllt (ausgeglichen). Anschließend wurden 100 μL der in obigem Schritt 1 zubereiteten Phospholipid-Liposome als Probenlösung in die Säule eingebracht (angewendet).
    • -4B- Dann wurde der 1 mM-NaPB mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 mL/min für eine Minute in die Säule geleitet. Danach wurde eine Mischung aus dem 1 mM-NaPB und dem 400 mM-NaPB mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 mL/min für 3 Minuten in die Säule geleitet, sodass ein Mengenverhältnis zwischen dem 1 mM-NaPB und dem 400 mM-NaPB im Bereich von 0 bis 100% der Menge des 400 mM-NaPB kontinuierlich geändert wurde. Nachfolgend wurde der 400 mM-NaPB mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 mL/min für 3 Minuten in die Säule geleitet, um die aus der Säule abgegebene Flüssigkeit (Abgabeflüssigkeit) in verschiedene Teile zu je 1 mL zu fraktionieren. Die fraktionierten Flüssigkeiten wurden einem UV-Detektor ausgesetzt, um Absorptionen der in den fraktionierten Flüssigkeiten enthaltenen Phospholipide zu erhalten.
  • Die Ergebnisse sind in 3 dargestellt.
  • Wie in 3 deutlich zu erkennen, zeigte sich, dass in dem Fall, in dem die Hydroxylapatit-Perlen verwendet wurden, die nicht an den Calciumionen adsorbierten, die Phosphatliposome ohne Adsorbieren an das Füllmittel in die Abgabeflüssigkeiten eluiert wurden.
  • In dieser Hinsicht wurden die Phosphatliposome auf die gleiche Weise wie in obigen Schritten 1B bis 4B analysiert, außer dass reines Wasser als Anfangspuffer verwendet wurde und die Säule in obigem Schritt 3B mit dem reinen Wasser abgeglichen wurde. In diesem Fall ergaben sich auch die Ergebnisse, dass die Phosphatliposome ohne Adsorbieren an das Füllmittel in die Abgabeflüssigkeiten eluiert wurden.
  • (Analyse unter Verwendung einer wässrigen Calciumchlorid-Lösung)
  • Die Phopshatliposome wurden auf die gleiche Weise wie bei der Analyse unter Verwendung des Natriumphosphat-Puffers an dem Füllmittel adsorbiert, außer dass die obigen Schritte 3B und 4B wie folgt verändert wurden.
    • -3B'- Als nächstes wurde die Säule mit einem Gemisch aus einem 5 mM-MES-Puffer und einer wässrigen CaCl2-Lösung von 3 mM (pH-Wert 6,8) abgeglichen. Danach wurden 100 μL der in obigem Schritt 1 zubereiteten Phospholipidliposomen als Probenlösung in die Säule eingebracht (angewendet).
    • -4B'- Danach wurde das Gemisch aus dem 5 mM-MES-Puffer und der wässrigen CaCl2-Lösung von 3 mM mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 mL/min für 5 min in die Säule gleitet. Nachfolgend wurde reines Wasser mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 mL/min für 5 Minuten in die Säule geleitet. Danach wurde noch ein Gemisch aus dem reinen Wasser und dem 400 mM-NaPB mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 mL/min für 3 Minuten in die Säule geleitet, so dass ein Mengenverhältnis zwischen dem reinen Wasser und dem 400 mM-NaPB im Bereich von 0 bis 100% der Menge an 400 mM-NaPB kontinuierlich geändert wurde. Danach wurde der 400 mM-NaPB mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 mL/min für 5 Minuten in die Säule geleitet, um die aus der Säule abgegebene Flüssigkeit in unterschiedliche Teile zu je 1 mL zu fraktionieren. Die fraktionierten Flüssigkeiten wurden einem UV-Detektor ausgesetzt, um Absorptionen der in den fraktionierten Flüssigkeiten enthaltenen Phospholipide zu erhalten.
  • Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt.
  • Wie aus 4 deutlich hervorgeht, wurde die Elution der Phospholipid-Liposomen, die direkt nach Einleiten des Gemischs aus dem 5 mM-MES-Puffer und der wässrigen 3 mM-CaCl2-Lösung in die Säule beobachtete wurde, schwach bestätigt. Aus dieser Tatsache ergaben sich die folgenden Annahmen. Die Calciumionen wurden an dem Füllmittel adsorbiert, indem das Gemisch aus dem 5 mM-MES-Puffer und der wässrigen 3 mM-CaCl2-Lösung mit dem Füllmittel in Kontakt gebracht wurde. Folglich wurden die Phospholipid-Liposome an den Hydroxylapatit-Perlen adsorbiert, die die Calciumionen adsorbiert haben.
  • 3. Elution von an dem Füllmittel adsorbierten Phospholipid-Liposomen
  • (Auswertung der Separationsfähigkeit einer Säule, die Phospholipid-Liposome an Proteine adsorbiert)
  • [Herstellen einer Säule, die Phospholipid-Liposome adsorbiert]
    • -1C- Zuerst wurden Hydroapatit-Perlen (GHT TypII, mittlere Teilchengröße 40 μm, hergestellt von HOYA CORPORATION) in ein rostfreies Rohr mit einer Größe von 4 × 10 mm gefüllt, um eine Säule (Adsorptionsvorrichtung) herzustellen.
    • -2C- Danach wurde der 400 mM-NaPB (pH-Wert 6,8) mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 mL/min für 10 Minuten in die Säule geleitet. Daher wurde ein Füllmittel durch Einleiten von reinem Wasser in die Säule unter den gleichen Bedingungen wie oben beschrieben gewaschen.
    • -3C- Als nächstes wurde das Gemisch aus dem 5 mM-MES-Puffer und der wässrigen 3 mM-CaCl2-Lösung (nachfolgend als „MES-Ca-Puffer” bezeichnet; pH-Wert 6,8) mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 mL/min für 20 Minuten in die Säule geleitet, um die Calciumionen an dem Füllmittel zu adsorbieren.
    • -4C- Danach wurden 100 μL der in Schritt 1 zubereiteten Phospholipid-Liposome alle 2 Minuten in insgesamt 15 Schritten in die Säule eingebracht (angewendet), während der MES-Ca-Puffer mit der Strömungsgeschwindigkeit von 1 mL/min in die Säule eingeleitet wurde. Daher wurde das Füllmittel in der Säule für 5 Minuten mit reinem Wasser gewaschen.
    • -5C- Dann wurde das Füllmittel in der Säule mit dem 10 mM-NaPB (pH-Wert 6,8) abgeglichen, indem es mit dem 400 mM-NaPB (pH-Wert 6,8) mit der Strömungsgeschwindigkeit von 1 mL/min für 10 Minuten gewaschen wurde und nachfolgend noch mit dem 10 mM-NaPB (pH-Wert 6,8) mit der Strömungsgeschwindigkeit von 1 mL/min für 20 Minuten gewaschen wurde.
  • Durch Ausführen der Schritte wie oben beschrieben wurde eine Säule erzeugt, die mit dem Füllmittel versehen ist, an dem Phospholipid-Liposome adsorbiert waren.
  • (Separation von Proteinen durch die Phospholipid-Liposome adsorbierende Säule)
    • -1D- Zuerst wurden Hydroapatit-Perlen (GHT TypII, mittlere Teilchengröße 40 μm, hergestellt von HOYA CORPORATION) in ein rostfreies Rohr mit einer Größe von 4 × 10 mm gefüllt, um eine Säule (Adsorptionsvorrichtung) herzustellen.
    • -2D- Danach wurde das Füllmittel in der Säule mit dem 10 mM-NaPB (pH-Wert 6,8) abgeglichen, indem es mit dem 400 mM-NaPB (pH-Wert 6,8) mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 ML/min für 10 Minuten gewaschen wurde und dann noch mit dem 10 mM-NaPB mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 mL/min für 20 Minuten gewaschen wurde.
    • -3D- Dann wurden Myoglobin, Ovalbumin, α-Chymotrypsinogen A und Cytochrom C (Proteine) in einem 1 mM-Natriumphosphatpuffer gelöst, sodass ihre Konzentration bei 0,5 mg/mL, 1 mg/mL, 0,5 mg/mL bzw. 0,5 mg/mL lagen, um eine Probe zu erhalten (nachfolgend als „4STD-Probe” bezeichnet). Dann wurden 50 μL der 4STD-Probe in die in obigem Schritt 2D hergestellte Säule eingebracht.
    • -4D- Danach wurde der 10 mM-NaPB mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 mL/min für 1 Minute in die Säule geleitet. Dann wurde ein Gemisch aus dem 10 mM-NaPB und dem 400 mM-NaPB mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 mL/min für 3 Minuten in die Säule geleitet, sodass sich das Mengenverhältnis zwischen dem 10 mM-NaPB und dem 400 mM-NaPB in einem Bereich von 0 75% der Menge des 400 mM-NaPB kontinuierlich änderte. Danach wurde der 400 mM-NaPB mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 mL/min für 5 Minuten in die Säule geleitet, um die aus der Säule abgegeben Flüssigkeit in verschiedene Teil von 1 mL zu fraktionieren. Die fraktionierten Flüssigkeiten wurden einem UV-Detektor ausgesetzt, um Absorptionen der in den fraktionierten Flüssigkeiten enthaltenen Proteine zu erhalten.
    • -5D- Als nächstes wurden, auf die gleiche Wese wie in obigem Schritt 3D, 50 μL der 4STD-Probe in die Säule eingebracht, die in obigem Schritt 5C hergestellt wurde und die mit dem die Phospholipid-Liposomen adsorbierenden Füllmittel versehen ist.
    • -6D- Nachfolgend wurde die aus der Säule abgegebenen Flüssigkeit in die verschiedenen Teile je 1 mL fraktioniert, wie in obigem Schritt 4D. Die fraktionierten Flüssigkeiten wurden einem UV-Detektor ausgesetzt, um Absorptionen der in den fraktionierten Flüssigkeiten enthaltenen Proteine zu erhalten.
  • Die Absorptionen in einer Wellenlänge von 280 nm der in den in den obigen Schritten 4D und 6D fraktionierten Flüssigkeiten enthaltenen Proteine sind in 5 dargestellt.
  • Wie aus 5 deutlich hervorgeht, hat sich ergeben, dass die Separationsfähigkeit der 4STD-Probe durch Adsorbieren der Phospholipid-Liposome an das Füllmittel (nach Liposom-Sättigung) gegenüber einem Füllmittel (Original) vor Adsorbieren der Phospholipid-Liposome verändert wurde.
  • (Auswerten durch Waschen der Phospholipid-Liposome adsorbierenden Säule mit Lösungsmittel)
  • Es wurden drei Säulen bereitet, die in obigem Schritt 5C hergestellt wurden und mit dem die Phospholipid-Liposome adsorbierenden Füllmittel versehen waren. Das Füllmittel in jeder der drei Säulen wurde mit verschiedenen Arten von Lösungsmittel (Acetonitril, Isopropanol und 1 M-Natriumhydroxid) mit 100 CV (Säulenvolumen) gewaschen.
    • -2E- Danach wurde das Füllmittel in jeder der drei Säulen, in denen das Füllmittel durch die verschiedenen Arten von Lösungsmittel gewaschen wurde, mit dem 10 mM-NaPB (pH-Wert 6,8) abgeglichen, indem der 400 mM-NaPB (pH-Wert 6,8) für 10 Minuten mit der Strömungsgeschwindigkeit von 1 mL/min in die Säule geleitet wurde und danach der 10 mM-NaPB (pH-Wert 6,8) für 20 Minuten mit der Strömungsgeschwindigkeit von 1 mL/min in die Säule geleitet wurde.
    • -3E- Dann wurden 50 μL der 4STD-Probe in jede der drei Säulen eingebracht, in denen das Füllmittel durch die verschiedenen Arten von Lösungsmittel gewaschen wurde.
    • -4E- Nachfolgend wurde der 10 mM-NaPB für 1 Minute mit der Strömungsgeschwindigkeit von 1 mL/min in die Säule geleitet, in die die 50 μL der 4STD-Probe eingebracht war. Dann wurde ein Gemisch aus dem 10 mM-NaPB und dem 400 mM-NaPB für 3 Minuten mit der Strömungsgeschwindigkeit von 1 mL/min in die Säule geleitet, sodass sich das Mengenverhältnis zwischen dem 10 mM-NaPB und dem 400 mM-NaPB im Bereich von 0 bis 75% der Menge des 400 mM-NaPB kontinuierlich änderte. Danach wurde der 400 mM-NaPB mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 mL/min für 5 Minuten in die Säule geleitet, um die aus der Säule abgegebene Flüssigkeit in verschiedene Teile zu je 1 mL zu fraktionieren. Die fraktionierten Flüssigkeiten wurden einem UV-Detektor ausgesetzt, um Absorptionen der in den fraktionierten Flüssigkeiten enthaltenden Proteine zu erhalten.
  • Die Ergebnisse sind in 6 dargestellt. In dieser Hinsicht zeigt 6(a) Absorptionen der Proteine, die unter Verwendung der Flüssigkeiten gemessen wurden, die aus der Säule abgegeben wurden, in der das Füllmittel mit Acetonitril gewaschen wurde. 6(b) zeigt Absorptionen der Proteine, die unter Verwendung der Flüssigkeiten gemessen wurden, die aus der Säule abgegeben wurden, in der das Füllmittel mit Isopropanol gewaschen wurde. 6(c) zeigt Absorptionen der Proteine, die unter Verwendung der Flüssigkeiten gemessen wurden, die aus der Säule abgegeben wurden, in der das Füllmittel mit Natriumhydroxid gewaschen wurde.
  • Wie aus einem Vergleich der 5 mit den 6(a) bis (c) deutlich hervorgeht, zeigte sich, dass die Separationsfähigkeit der 4STD-Probe nahezu ähnlich der Separationsfähigkeit der 4STD-Probe in dem Füllmittel war, bevor die Phospholipid-Lisposome durch Waschen des Füllmittels, in dem Phospholipid-Liposome adsorbiert waren, mit den verschiedenen Arten von Lösungsmitteln adsorbiert waren. Es zeigte sich, dass die Phospholipid-Liposome aus dem Füllmittel eluiert (eliminiert) werden konnten, indem das Füllmittel mit den verschiedenen Arten von Lösungsmitteln gewaschen wurde. Eine derartige Tendenz war besonders deutlich zu erkennen, wenn ein organisches Lösungsmittel als Lösungsmittel verwendet wurde (6(a) und 6(b)). Insbesondere zeigte sich, dass die Tendenz deutlicher zu erkennen war, wenn Isopropanol als Lösungsmittel verwendet wurde (6(b)).
    • -5E- Danach wurde in jeder der Säulen, in denen das Füllmittel mit den verschiedenen Arten von Lösungsmittel gewaschen wurde, und in der Säule bevor das Füllmittel mit dem Lösungsmittel gewaschen wurde, das Füllmittel aus der Säule entfernt. Dann wurde das Füllmittel 1 Tag lang bei einer Temperatur von 37°C getrocknet.
    • -6E- Als nächstes wurden 10 mg des getrockneten Füllmittels zubereitet. Dann wurde ein Wert der thermogravimetrischen Veränderung unter Verwendung eines DTG-Analysegeräts („DTG60H”, hergestellt von Shimadzu Corporation) gemessen. Hierbei wurden die Messbedingungen auf eine Temperaturrate von 5°C/min, eine Zieltemperatur von 1200°C und einen Temperaturbereich von 26,17 bis 400°C eingestellt.
  • Die Ergebnisse sind in 7 dargestellt. Die Menge eines verbleibenden organischen Stoffes der vertikalen Achse des in 7 gezeigten Graphen wurde unter Verwendung des Werts der thermogravimetrischen Änderung und eines Werts berechnet, der durch Subtrahieren der Menge des verbleibenden organischen Stoffes in den Hydroapatit-Perlen CHT TypII von der Menge des verbleibenden organischen Stoffes in dem getrockneten Füllmittel erhalten wurde.
  • Wie aus 7 deutlich hervorgeht, zeigte sich, dass die Menge des verbleibenden organischen Stoffes, der an jedem der Füllmittel adsorbiert war, durch Waschen des Füllmittels, in dem Phospholipid-Liposome adsorbiert waren, mit den verschiedenen Arten von Lösungsmitteln gesenkt wurde. Es zeigte sich, dass die Phospholipid-Liposome durch Waschen des Füllmittels mit den verschiedenen Arten von Lösungsmittel eluiert werden konnten. Eine solche Tendenz zeigte sich besonders deutlich, wenn ein organisches Lösungsmittel als Lösungsmittel verwendet wurde (6(a) und 6(b)). Insbesondere zeigte sich diese Tendenz deutlicher, wenn Isopropanol als Lösungsmittel verwendet wurde (6(b)).
  • 4. Separation von Phosopholipid-Liposomen durch Füllmittel
  • (Nachweis von Lecithin: Beispiel 1)
    • -1F- Zuerst wurden Hydroxylapatit-Perlen (GHT TypII, mittlere Teilchengröße 40 μm, hergestellt von HOYA CORPORATION) in ein rostfreies Rohr mit einer Größe von 4 × 10 mm gefüllt, um eine Säule (Adsorptionsvorrichtung) herzustellen.
    • -2F- Dann wurde ein MES-Ca-Puffer mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 mL/min für 20 Minuten in die Säule geleitet, um die Calciumionen an dem Füllmittel zu adsorbieren.
    • -3F- Danach wurde die Säule mit dem MES-Ca-Puffer gefüllt (abgeglichen). Nachfolgend wurden 100 μL der in obigem Schritt 1 zubereiteten Phospholipid-Liposome als Probenlösung in die Säule eingebracht (angewendet).
    • -4F- Dann wurde ein MES-Ca-Puffer, der 5% Isopropanol enthielt, mit der Strömungsgeschwindigkeit von 1 mL/min für 1 Minute in die Säule geleitet. Danach wurde ein Gemisch des MES-Ca-Puffers mit 5% Isopropanol und eines MES-Ca-Puffers mit 80% Isopropanol mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 mL/min für 3 Minuten in die Säule geleitet, sodass sich das Mengenverhältnis zwischen dem MES-Ca-Puffer mit 5% Isopropanol und dem MES-Ca-Puffer mit 80% Isopropanol im Bereich von 0 bis 100% der Menge des MES-Ca-Puffers mit 80% Isopropanol kontinuierlich änderte. Danach wurde der MES-Ca-Puffer mit 80% Isopropanol mit der Strömungsgeschwindigkeit von 1 mL/min für 3 Minuten in die Säule geleitet, um die aus der Säule abgegebene Flüssigkeit in verschiedene Teile zu je 1 mL zu fraktionieren. Die in der aus der Säule abgegebenen Flüssigkeit enthaltenen Phospholipide wurden durch Messen ihrer Absorptionen in einer Wellenlänge von 202 nm erfasst.
  • Die Ergebnisse sind in 8(a) als Absorptionskurve gezeigt.
    • -5F- Danach wurde eine wässrige 5-prozentige Ethanollösung als Blindprobe in die Säule eingebracht. Danach wurde das gleiche Eluat wie das in obigem Schritt 4F in die Säule geleitet, um das Eluat aus der Säule abzugeben. So wurden von dem Eluat abgeleitete Absorptionen in der Wellenlänge von 202 nm gemessen.
  • Die Ergebnisse sind in 8(b) als Absorptionskurve gezeigt.
    • -6F- Als nächstes wurden die Absorptionen der in obigem Schritt 5F erhaltenen Absorptionskurve von den Absorptionen der in obigem Schritt 4F erhaltenen Absorptionskurve subtrahiert.
  • Die Ergebnisse sind in 9 als Absorptionskurve gezeigt.
  • Wie aus 9 deutlich zu erkennen, zeigte sich dass aus dem Lecithin abgeleitete Spitzenwerte nach ungefähr 3,5 min und 5 min in der Absorptionskurve mit hoher Empfindlichkeit betrachtet werden konnten, indem die Absorptionen des die Phospholipide enthaltenden Eluats in der Wellenlänge von 202 nm gemessen wurde, die nahe einer Wellenlänge der maximalen Absorption des Lecithin liegt, und ferner die Absorptionen des Isopropanol enthaltenden Eluats gemessen und dann diese Absorptionen subtrahiert wurden.
  • (Separation von Phospholipiden aus Eigelb: Beispiel 2)
    • -1G- Zuerst wurden 18 mL Methanol und 9 mL Chloroform in dieser Reihenfolge zu einem Eigelb (Asagiri Kogen Eggs) gegeben, während das Eigelb von 5 g gerührt wurden, um ein erstes Gemisch zu erhalten. Danach wurde das erste Gemisch für 30 Minuten stehen gelassen.
    • -2G- Dann wurden 10,8 mL reines Wasser und 9 mL Chloroform in dieser Reihenfolge zu dem ersten Gemisch gegeben, während das erste Gemisch gerührt wurde, um ein zweites Gemisch herzustellen. Danach wurde das zweite Gemisch einer Zentrifugalseparationsvorrichtung („5930”, hergestellt von KUBOTA CORPORATION) unter den Bedingungen von 3000 U/min × 10 min (4°C) ausgesetzt, um das zweite Gemisch in eine obere Phase (Wasserphase), eine mittlere Phase (Phase modifizierter Proteine und dergleichen) und eine untere Phase (Chloroformphase) zu separieren.
    • -3G- Dann wurde die untere Phase mit einer Injektionsspritze gesammelt, um die 15 mL der unteren Phase insgesamt zu gewinnen.
    • -4G- Danach wurden die 15 mL der unteren Phase in einen Glaskolben gegeben und dann bei reduziertem Druck unter Verwendung eines Evaporators („N-1000”, hergestellt von TOKYO RIKAKIKAI CO., LTD.) getrocknet. Danach wurde der Glaskolben in einen Exsikkator gestellt, um die getrocknete untere Phase für 1 Stunde bei dem reduzierten Druck weiter zu trocknen. Somit wurde ein aus dem Eigelb stammendes Totallipid von ungefähr 1,5 g extrahiert.
    • -5G- Dann wurden 50 mL reines Wasser in den Glaskolben gegeben. Danach wurde das reine Wasser bei einer Temperatur oberhalb einer Phasenübergangstemperatur des Totallipids in heißem Wasser erhitzt, während das reine Wasser unter Verwendung eines Wirbelgenerators gerührt wurde, um eine Lipiddispersionsflüssigkeit zu erhalten.
    • -6G- Man nimmt an, dass das in der Lipiddispersionsflüssigkeit enthaltene Lipid hier ein mehrschichtiges Lipid bildet. Jedoch wurde die Lipiddispersionsflüssigkeit für 1 Minute einem Ultraschallgenerator („UR-20P”, hergestellt von TOMY SEIKO CO., LTD.) ausgesetzt, um die Mehrfachschicht des mehrschichtigen Liposoms zu zerstoßen. So wurde ein aus dem Eigelb stammendes Totallipidliposom gewonnen.
    • -7G- Danach wurde das aus dem Eigelb gewonnene Totallipidliposom in dem reinen Wasser 20-fach verdünnt, um so eine in die Säule einzubringende Probenlösung zuzubereiten.
    • -8G- Dann wurden Hydroxylapatit-Perlen (GHT TypII, mittlere Teilchengröße 40 μm, hergestellt von HOYA CORPORATION) in ein rostfreies Rohr mit einer Größe von 4 × 10 mm gefüllt, um eine Säule (Adsorptionsvorrichtung) herzustellen.
    • -9G- Dann wurde der MES-Ca-Puffer mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 mL/min für 20 Minuten in die Säule geleitet, um die Calciumionen an dem Füllmittel zu adsorbieren.
    • -10G- Danach wurde die Säule mit dem MES-Ca-Puffer gefüllt (abgeglichen). Nachfolgend wurden 100 μL der in obigem Schritt 7G zubereiteten Probenlösung in die Säule eingebracht (angewendet).
    • -11G- Dann wurde der MES-Ca-Puffer, der 5% Isopropanol enthielt, mit der Strömungsgeschwindigkeit von 1 mL/min für 1 Minute in die Säule geleitet. Danach wurde ein Gemisch des MES-Ca-Puffers mit 5% Isopropanol und eines MES-Ca-Puffers mit 80% Isopropanol mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 mL/min für 3 Minuten in die Säule geleitet, sodass sich das Mengenverhältnis zwischen dem MES-Ca-Puffer mit 5% Isopropanol und dem MES-Ca-Puffer mit 80% Isopropanol im Bereich von 0 bis 100% der Menge des MES-Ca-Puffers mit 80% Isopropanol kontinuierlich änderte. Danach wurde 100% Isopropanol mit der Strömungsgeschwindigkeit von 1 mL/min für 3 Minuten in die Säule geleitet, um die aus der Säule abgegebene Flüssigkeit in verschiedene Teile zu je 1 mL zu fraktionieren. Die in der aus der Säule abgegebenen Flüssigkeit enthaltenen Phospholipide wurden durch Messen ihrer Absorptionen in einer Wellenlänge von 202 nm erfasst.
  • Die Ergebnisse sind in 10(a) als Absorptionskurve gezeigt.
    • -12G- Danach wurde reines Wasser als Blindprobe in die Säule eingebracht. Danach wurde das gleiche Eluat wie in obigem Schritt 11G in die Säule geleitet, um das Eluat aus der Säule abzugeben. So wurden von dem Eluat stammende Absorptionen in der Wellenlänge von 202 nm gemessen.
  • Die Ergebnisse sind in 10(b) als Absorptionskurve gezeigt.
    • -13G- Danach wurden die Absorptionen der in obigem Schritt 11G erhaltenen Absorptionskurve von den Absorptionen der in obigem Schritt 12G erhaltenen Absorptionskurve subtrahiert.
  • Die Ergebnisse sind in 10(c) als Absorptionskurve gezeigt.
  • Wie aus 10 deutlich hervorgeht, zeigte sich, dass von den Phospholipiden stammende Spitzenwerte nach ungefähr 3,5 min betrachtet werden konnten, indem der Adsorptionsgrad des die Phospholipide enthaltenden Eluats in der Wellenlänge von 202 nm gemessen wurde, die nahe einer Wellenlänge der maximalen Adsorption der Phospholipide liegt, und ferner die Absorptionen des Isopropanol enthaltenden Eluats gemessen und dann diese Absorptionen subtrahiert wurden. Dies zeigte, dass die aus dem Eigelb stammenden Phospholipide in die den Spitzenwerten entsprechenden Fraktionen aus der Probenlösung separiert waren.
  • (Separation von Phospholipiden aus der Membran roter Blutkörperchen: Beispiel 3)
    • -1H- Zuerst wurden 100 mL reines Wasser einem Gänse-Blutkörperchen (hergestellt von Nippon Biotest Laboratories, Inc.) beigefügt, während das 4 g schwere Gänse-Blutkörperchen gerührt wurde, um ein erstes Gemisch zu erzeugen. Dann wurde ein in dem Gänse-Blutkörperchen enthaltenes rotes Blutkörperchen hämolisiert.
    • -2H- Danach wurde das erste Gemisch einer Zentrifugalseparationsvorrichtung („5930”, hergestellt von KUBOTA CORPORATION) unter den Bedingungen von 3500 U/min × 30 min (4°C) ausgesetzt, während das erste Gemisch gerührt wurde, um das erste Gemisch in eine obere Phase und eine untere Phase zu separieren.
    • -3H- Die obigen Schritte 1H und 2H wurden dreimal wiederholt ausgeführt. Dabei wurde die untere Phase jedes Mal gesammelt.
    • -4H- Dann wurden 8 mL PBS, 20 mL Methanol und 10 mL Chloroform in dieser Reihenfolge zu der gesammelten unteren Phase gegeben, während die gesammelte untere Phase gerührt wurde, um ein zweites Gemisch zu erhalten. Danach wurde das zweite Gemisch für 30 Minuten stehen gelassen.
    • -5H- Dann wurden 10 mL Chloroform und 10 mL reines Wasser in dieser Reihenfolge zu dem zweiten Gemisch gegeben, während das zweite Gemisch gerührt wurde, um ein drittes Gemisch herzustellen. Danach wurde das dritte Gemisch einer Zentrifugalseparationsvorrichtung („5930”, hergestellt von KUBOTA CORPORATION) unter den Bedingungen von 3000 U/min × 10 min (4°C) ausgesetzt, um das dritte Gemisch in eine obere Phase (Wasserphase), eine mittlere Phase (Phase modifizierter Proteine und dergleichen) und eine untere Phase (Chloroformphase) zu separieren.
    • -6H- Dann wurde die untere Phase mit einer Injektionsspritze gesammelt, um die 15 mL der unteren Phase insgesamt zu gewinnen.
    • -7H- Danach wurden die 15 mL der unteren Phase in einen Glaskolben gegeben und dann bei reduziertem Druck unter Verwendung eines Evaporators („N-1000”, hergestellt von TOKYO RIKAKIKAI CO., LTD.) getrocknet. Danach wurde der Glaskolben in einen Exsikkator gestellt, um die getrocknete untere Phase für 1 Stunde bei dem reduzierten Druck weiter zu trocknen. Somit wurde ein aus der Membran des roten Blutkörperchens stammendes Totallipid von ungefähr 15 mg extrahiert.
    • -8H- Dann wurden 10 mL reines Wasser in den Glaskolben gegeben. Danach wurde das reine Wasser bei einer Temperatur oberhalb einer Phasenübergangstemperatur des Totallipids in heißem Wasser erhitzt, während das reine Wasser unter Verwendung eines Wirbelgenerators gerührt wurde, um eine Lipiddispersionsflüssigkeit zu erhalten.
    • -9H- Man nimmt an, dass das in der Lipiddispersionsflüssigkeit enthaltene Lipid hier ein mehrschichtiges Lipid bildet. Jedoch wurde die Lipiddispersionsflüssigkeit für 1 Minute einem Ultraschallgenerator („UR-20P”, hergestellt von TOMY SEIKO CO., LTD.) ausgesetzt, um die Mehrfachschicht des mehrschichtigen Liposoms zu brechen. So wurde ein aus der Membran des roten Blutkörperchens stammendes Totallipidliposom gewonnen.
    • -10H- Danach wurde das aus der Membran des roten Blutkörperchens gewonnene Totallipidliposom in dem reinen Wasser 20-fach verdünnt, um so eine in die Säule einzubringende Probenlösung zuzubereiten.
    • -11H- Dann wurden Hydroxylapatit-Perlen (GHT TypII, mittlere Teilchengröße 40 μm, hergestellt von HOYA CORPORATION) in ein rostfreies Rohr mit einer Größe von 4 × 10 mm gefüllt, um eine Säule (Adsorptionsvorrichtung) herzustellen.
    • -12H- Dann wurde der MES-Ca-Puffer mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 mL/min für 20 Minuten in die Säule geleitet, um die Calciumionen an dem Füllmittel zu adsorbieren.
    • -13H- Danach wurde die Säule mit dem MES-Ca-Puffer gefüllt (abgeglichen). Nachfolgend wurden 100 μL der in obigem Schritt 10H zubereiteten Probenlösung in die Säule eingebracht (angewendet).
    • -14G- Dann wurde der MES-Ca-Puffer, der 5% Isopropanol enthielt, mit der Strömungsgeschwindigkeit von 1 mL/min für 1 Minute in die Säule geleitet. Danach wurde ein Gemisch des MES-Ca-Puffers mit 5% Isopropanol und eines MES-Ca-Puffers mit 80% Isopropanol mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 mL/min für 3 Minuten in die Säule geleitet, sodass sich das Mengenverhältnis zwischen dem MES-Ca-Puffer mit 5% Isopropanol und dem MES-Ca-Puffer mit 80% Isopropanol im Bereich von 0 bis 100% der Menge des MES-Ca-Puffers mit 80% Isopropanol kontinuierlich änderte. Danach wurde der MES-Ca-Puffer mit 80% Isopropanol mit der Strömungsgeschwindigkeit von 1 mL/min für 3 Minuten in die Säule geleitet, um die aus der Säule abgegebene Flüssigkeit in verschiedene Teile zu je 1 mL zu fraktionieren. Die in der aus der Säule abgegebenen Flüssigkeit enthaltenen Phospholipide wurden durch Messen ihrer Absorptionen in einer Wellenlänge von 202 nm erfasst.
  • Die Ergebnisse sind in 11(a) als Absorptionskurve gezeigt.
    • -15H- Danach wurde reines Wasser als Blindprobe in die Säule eingebracht. Danach wurde das gleiche Eluat wie in obigem Schritt 13H in die Säule geleitet, um das Eluat aus der Säule abzugeben. So wurden von dem Eluat stammende Absorptionen in der Wellenlänge von 202 nm gemessen.
  • Die Ergebnisse sind in 11(b) als Absorptionskurve gezeigt.
    • -16H- Danach wurden die Absorptionen der in obigem Schritt 15H erhaltenen Absorptionskurve an den Absorptionen der in obigem Schritt 14H erhaltenen Absorptionskurve subtrahiert.
  • Die Ergebnisse sind in 11(c) als Absorptionskurve gezeigt.
  • Wie aus 11 deutlich hervorgeht, zeigte sich, dass von den Phospholipiden stammende Spitzenwerte nach ungefähr 3,5 min betrachtet werden konnten. Somit zeigte sich, dass gemäß der Erfindung die Phospholipide auch aus der Membran des roten Blutkörperchens separiert werden konnten.
  • (Nachweis von Endotoxin: Beispiel 4)
    • -1I- Zuerst wurde ein Kontroll-Standard-Endotoxin (nachfolgend einfach als „Endotoxin” bezeichnet, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) zubereitet. 2,6 mL reines Wasser wurden zu 500 ng Endotoxin gegeben, um eine wässrige Endotoxin-Lösung zu erzeugen. Dann wurde die wässrige Endotoxin-Lösung unter den Bedingungen 30 U/min × 15 min (Raumtemperatur) unter Verwendung eines Rotators („RT-50”, hergestellt von TAITEC CORPORATION) gerührt. Danach wurde die wässrige Endotoxin-Lösung einer Ultraschallwellenbehandlung unterzogen, um eine das Endotoxin enthaltende Probenlösung zu erzeugen.
    • -2I- Dann wurden Hydroxylapatit-Perlen (GHT TypII, mittlere Teilchengröße 40 μm, hergestellt von HOYA CORPORATION) in ein rostfreies Rohr mit einer Größe von 4 × 10 mm gefüllt, um eine Säule (Adsorptionsvorrichtung) herzustellen.
    • -3I- Dann wurde der MES-Ca-Puffer mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 mL/min für 20 Minuten in die Säule geleitet, um die Calciumionen an dem Füllmittel zu adsorbieren.
    • -4I- Danach wurde die Säule mit dem MES-Ca-Puffer gefüllt (abgeglichen). Nachfolgend wurden 100 μL der in obigem Schritt 1I zubereiteten Probenlösung in die Säule eingebracht (angewendet).
    • -5I- Dann wurde ein MES-Ca-Puffer, der 5% Isopropanol enthielt, mit der Strömungsgeschwindigkeit von 1 mL/min für 1 Minute in die Säule geleitet. Danach wurde ein Gemisch des MES-Ca-Puffers mit 5% Isopropanol und eines MES-Ca-Puffers mit 80% Isopropanol mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 mL/min für 3 Minuten in die Säule geleitet, sodass sich das Mengenverhältnis zwischen dem MES-Ca-Puffer mit 5% Isopropanol und dem MES-Ca-Puffer mit 80% Isopropanol im Bereich von 0 bis 100% der Menge des MES-Ca-Puffers mit 80% Isopropanol kontinuierlich änderte. Danach wurde der MES-Ca-Puffer mit 80% Isopropanol mit der Strömungsgeschwindigkeit von 1 mL/min für 3 Minuten in die Säule geleitet, um die aus der Säule abgegebene Flüssigkeit in verschiedene Teile zu je 1 mL zu fraktionieren. Das in der aus der Säule abgegebenen Flüssigkeit enthaltene Endotoxin (Phospholipid) wurde durch Messen ihrer Absorptionen in einer Wellenlänge von 202 nm erfasst.
  • Die Ergebnisse sind in 12(a) als Absorptionskurve gezeigt.
    • -6l- Danach wurde reines Wasser als Blindprobe in die Säule eingebracht. Danach wurde das gleiche Eluat wie in obigem Schritt 5I in die Säule geleitet, um das Eluat aus der Säule abzugeben. So wurden von dem Eluat stammende Absorptionen in der Wellenlänge von 202 nm gemessen.
  • Die Ergebnisse sind in 12(b) als Absorptionskurve gezeigt.
    • -7l- Danach wurden die Absorptionen der in obigem Schritt 6I erhaltenen Absorptionskurve von den Absorptionen der in obigem Schritt 5I erhaltenen Absorptionskurve subtrahiert.
  • Die Ergebnisse sind in 11(c) als Absorptionskurve gezeigt.
  • Hierbei wurde, da die Menge des in dem Eluat enthaltenen Endotoxin eine Spur ist, das Endotoxin nicht in der Messung der Absorptionen der Abgabeflüssigkeiten nachgewiesen. Daher wurde der Nachweis des in den Abgabeflüssigkeiten enthaltenen Endotoxin durch Messen der Aktivität des Endotoxin in den Abgabeflüssigkeiten durchgeführt.
  • Die Ergebnisse sind in 12(c) als Absorptionskurve gezeigt.
  • Wie aus 12 deutlich hervorgeht, konnten von den Fremdstoffen stammende Spitzenwerte nach 0,5 min und nach ungefähr 3 min beobachtet werden. Ferner konnten von dem Endotoxin (Phospholipid) stammende Spitzenwerte nach ungefähr 4 min beobachtet werden. So zeigte sich, dass gemäß vorliegender Erfindung auch das Endotoxin aus der Probenlösung separiert werden konnte.
  • INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
  • Gemäß dem Separationsverfahren der vorliegenden Erfindung ist es möglich, das Phospholipid aus der das Phospholipid enthaltenden Probenlösung mit hohem Reinheitsgrad zu separieren, indem das in der Probenlösung enthaltene Phospholipid an dem Füllmittel adsorbiert wird und ferner die adsorbierten Phospholipide wahlweise in das Eluat eluiert werden. Folglich hat das Separationsverfahren der vorliegenden Erfindung industrielle Anwendbarkeit.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • Hirotaka Ihara, „Function Design of Silica Coated with Polymer and Development of High Selectivity”, 14. Adsorption Symposium in Kumamoto [0007]

Claims (11)

  1. Verfahren zum wahlweisen Separieren eines Phospholipids aus einer das Phospholipid enthaltenden Probenlösung, wobei das Verfahren umfasst: Adsorbieren von Calciumionen an ein Füllmittel, wobei zumindest eine Oberfläche des Füllmittels aus einer Calciumphosphat-basierten Verbindung besteht; Einbringen der Probenlösung in eine Vorrichtung mit einem Füllraum, wobei der Füllraum mit dem Füllmittel gefüllt ist; Einleiten eines auf einem organischen Lösungsmittel basierten Eluats in den Füllraum der Vorrichtung, um eine Flüssigkeit zu gewinnen, die das Phospholipid enthält und aus der Vorrichtung ausgegeben wird; und Fraktionieren der gewonnen Flüssigkeit in eine vorgegebene Menge, um dadurch das Phospholipid aus der Probenlösung zu separieren.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Calciumionen in einer Calcium enthaltenden Flüssigkeit enthalten sind und das Adsorbieren der Calciumionen ausgeführt wird, indem die Calcium enthaltende Flüssigkeit mit dem Füllmittel in Kontakt gebracht wird.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Calcium enthaltende Flüssigkeit eine wässrige Calciumchlorid-Lösung umfasst.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Phospholipid ein Phospholipid-Liposom enthält, das ein Liposom bildet.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem beim Einleiten des auf einem organischen Lösungsmittel basierten Eluats das Eluat Isopropanol umfasst.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem beim Einbringen des auf einem organischen Lösungsmittel basierten Eluats das Eluat eine Lösung mit linearem Gradienten ist, bei der ein Anteil an Isopropanol von 0 auf 80% geändert wird.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem beim Einleiten des auf einem organischen Lösungsmittel basierten Eluats eine Strömungsgeschwindigkeit des Eluats im Bereich von 0,1 bis 10 mL/min liegt.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem beim Fraktionieren der gewonnenen Flüssigkeit das Phospholipid durch Betrachten von Absorptionen der fraktionierten Flüssigkeiten in einer Wellenlänge im Bereich von 190 bis 230 nm nachgewiesen wird.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, ferner umfassend das vorherige Erhalten eines Adsorptionsgrads des Eluats, wobei beim Fraktionieren der gewonnenen Flüssigkeit das Phospholipid durch Subtrahieren des vorher erhaltenen Adsorptionsgrads von dem Adsorptionsgrad jeder der zu betrachtenden fraktionierten Flüssigkeiten nachgewiesen wird.
  10. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Calciumphosphat-basierte Verbindung auf Hydroxylapatit als Hauptbestandteil besteht.
  11. Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend das vorherige Präparieren der Vorrichtung.
DE112010003779T 2009-09-25 2010-09-17 Separationsverfahren Pending DE112010003779T5 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2009-221301 2009-09-25
JP2009221301A JP5458239B2 (ja) 2009-09-25 2009-09-25 分離方法
PCT/JP2010/066238 WO2011037094A1 (ja) 2009-09-25 2010-09-17 分離方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE112010003779T5 true DE112010003779T5 (de) 2012-10-04

Family

ID=43795842

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE112010003779T Pending DE112010003779T5 (de) 2009-09-25 2010-09-17 Separationsverfahren

Country Status (5)

Country Link
US (1) US8481770B2 (de)
JP (1) JP5458239B2 (de)
CN (1) CN102510896B (de)
DE (1) DE112010003779T5 (de)
WO (1) WO2011037094A1 (de)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102012020128A1 (de) * 2011-10-21 2013-04-25 Mann + Hummel Gmbh Aufbereitungseinheit zur Aufbereitung eines Kühlfluids einer Kühlvorrichtung eines Funktionssystems
DE102012024428B4 (de) * 2012-12-14 2019-07-25 Mann+Hummel Gmbh Ionentauscher für einen Kühlkreislauf
WO2016090256A1 (en) * 2014-12-05 2016-06-09 Archer Daniels Midland Company Processes for fractionating phospholipids
EP3660503A1 (de) 2014-12-17 2020-06-03 Waters Technologies Corporation Vorrichtung zur durchführung einer festphasenextraktion und verfahren zur verwendung davon
CN107640783B (zh) * 2017-10-16 2018-11-16 广州质量监督检测研究院 多孔正十二面体ZnO及其作为卵磷脂吸附材料的应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61172890A (ja) * 1985-01-29 1986-08-04 Nippon Oil & Fats Co Ltd ホスフアチジルコリンの分取方法
JPH022937A (ja) * 1988-06-17 1990-01-08 Toray Ind Inc 酵素標識抗体の分離精製方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Hirotaka Ihara, "Function Design of Silica Coated with Polymer and Development of High Selectivity", 14. Adsorption Symposium in Kumamoto

Also Published As

Publication number Publication date
WO2011037094A1 (ja) 2011-03-31
JP2011068785A (ja) 2011-04-07
US8481770B2 (en) 2013-07-09
CN102510896A (zh) 2012-06-20
CN102510896B (zh) 2014-04-23
US20120178950A1 (en) 2012-07-12
JP5458239B2 (ja) 2014-04-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69906688T2 (de) Herstellung von neuen gelen für die reinigung von nicht-polaren extrakten
DE112010003779T5 (de) Separationsverfahren
DE60022280T2 (de) Verfahren zu Herstellung von gereinigte Tocotrienolen und Tocopherolen mit Hilfe von Flüssigechromatographie
AT394454B (de) Chromatographisches verfahren zur trennung einer oder mehrerer in loesung befindlicher verbindungen, sowie vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrens
DE10344820B4 (de) Adsorptionsmembranen, Verfahren zur Herstellung derselben und Verwendung der Adsorptionsmembranen in Vorrichtungen
CH637843A5 (de) Verfahren zum packen einer chromatographiesaeule.
DE112010003823T5 (de) Pulver, verfahren zur herstellung von pulver uind adsorptionsapparatur
DE3001842C2 (de)
DE10152145A1 (de) Stabilisierung von Liposomen und Emulsionen
DE60320534T2 (de) Verfahren zur qualitätskontrolle einer kräutermedizin
DE10344819B4 (de) Adsorptionsmembranen, Verfahren zur Herstellung derselben und Vorrichtungen, welche die Adsorptionsmembranen umfassen
DE3221212A1 (de) Filter und verfahren zu seiner herstellung
DE1792083A1 (de) Zweischichtenplatte und ihre Verwendung zur duennschichtchromatographischen Auftrennung von Aminosaeuren
EP1066520A1 (de) Wechselwirkungen von substanzen mit oberflächen aus amphiphilen molekülen
DE69104207T2 (de) Vorrichtung zum selektiven entfernen chemischer spezies aus fluiden.
EP2521608B1 (de) Verfahren zur qualifizierung eines nichtpartikulären adsorbens mittels sekundärreaktion
DE102008035149A1 (de) Separation method
DE2900344A1 (de) Packungsbettpatrone und verfahren zu ihrer herstellung
DE112009000923T5 (de) Beschichtete Teilchen, Verfahren zur Herstellung von beschichteten Teilchen und Adsorptionsvorrichtung
EP3167283B1 (de) Vorrichtung, verwendung dieser vorrichtung und verfahren für die stofftrennung mit verbesserter ausnutzung der kapazität chromatographischer medien
Spangenberg et al. Quantitative Dünnschichtchromatographie
CH642540A5 (de) Verfahren zum reinigen von liposomensuspensionen.
DE102010038034A1 (de) Reinigungsverfahren und Verfahren zum Herstellen von Impfstoff
DE102009010194A1 (de) Separationsverfahren
DE1792230C2 (de) Trennmedium zur Gelfiltration und Verfahren zu dessen Herstellung

Legal Events

Date Code Title Description
R163 Identified publications notified
R082 Change of representative

Representative=s name: SCHAUMBURG & PARTNER PATENTANWAELTE GBR, DE

Representative=s name: SCHAUMBURG & PARTNER PATENTANWAELTE MBB, DE

Representative=s name: SCHAUMBURG UND PARTNER PATENTANWAELTE MBB, DE

R012 Request for examination validly filed
R016 Response to examination communication