AT394454B - Chromatographisches verfahren zur trennung einer oder mehrerer in loesung befindlicher verbindungen, sowie vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrens - Google Patents

Description

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Trennung einer oder mehrerer in Lösung befindlicher Verbindungen mit Hilfe einer dynamischen Säulen-Hüssigkeitschromatographie, sowie ferner eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.

Mit Chromatographie werden bekanntlich eine Anzahl physikalischer Methoden bezeichnet, die in der Chemie und Biologie zur Trennung und Identifizierung von Gemischen chemischer Verbindungen dienen. Das Prinzip aller dieser Chromatographievarianten liegt darin begründet, ein Gemisch von chemischen Verbindungen wiederholten Extraktion mit einer Flüssigkeit oder der Adsorption an einer Feststoffoberfläche zu unterwerfen. Das Gemisch wird physikalisch über eine stationäre Phase (Bett oder Säule) bewegt, bei der es sich entweder um einen Feststoff oder um eine in den Poren eines Feststoffes (der sich in diesem Bett oder dieser Säule befindet) immobilisierte Flüssigkeit handelt Die Trennung chemischer Verbindungen durch Chromatographie kann von einer oder mehreren der folgenden physikalisch-chemischen Kräfte Gebrauch machen in Abhängigkeit vom speziellen chromatographischen System: (a) von Unterschieden in der Adsorption an das poröse Medium, das sogenannte Sorbens, (b) von Unterschieden zwischen den relativen Löslichkeiten einer das inerte Medium (die stationäre Phase) überziehenden Flüssigkeit und der als mobile Phase bezeichneten Flüssigkeit die die poröse Säule durchströmt (c) von Unterschieden im Ionenaustausch mit dem Sorbens, und (d) von Unterschieden in der Molekulargröße, wenn die Lösung ein Gel von sehr geringer Teilchengröße durchströmt

Chromatographie wird auch präparative Chromatographie genannt wenn sie zur Isolierung einer Fraktion aus einem Gemisch dient zu deren Weiterverwendung für zum Beispiel Spektroskopie, Identifizierung, Synthese für Forschung oder kommerzielle Zwecke.

Die Originalarbeit über Chromatographie basiert auf Unterschieden in der Adsorption an einem in eine Säule gepackten inerten Material. Die als Verteilungschromatographie bekannte Trennung von Komponenten basiert auf den relativen Löslichkeiten in dem Lösungsmittel, das durch eine Säule geschickt wird. Die bei dieser Chromatographietechnik erhaltene Auflösung hängt vom pH-Wert und der Ionenstärke des Lösungsmittels (der mobilen Phase) und den relativen Löslichkeiten der Bestandteile in den beiden Phasen ab; die verschiedenen Materialien können mit einem geeigneten Lösungsmittel eluiert und die Flüssigkeitsfraktionen können in einer Reihe von Röhrchen gesammelt und anschließend mit Hilfe von chemischen oder physikalischen Methoden analysiert werden. Die Dünnschichtchromatographie (TLC) und die Papierchromatographie basieren auf Unterschieden zwischen der relativen Adsorption einer Komponente an einem inerten Medium. Bei der TLC besteht die stationäre Phase aus einer dünnen Schicht einer fein verteilten Substanz, die auf ein Blatt oder einen Kunststoffträger oder auf eine Glasplatte aufgebracht ist. Sorbentien, die üblicherweise Verwendung finden und als gebrauchsfertige Platten gehandelt werden, sind zum Beispiel Aluminiumoxid, Kieselgel (Silicagel) und Cellulose. Bei der Papierchromatographie kann sich die mobile Phase durch Kapillarkräfte nach oben (sogenannte aufsteigende Chromatographie) oder durch Schwerkraft nach unten (sogenannte absteigende Chromatographie) bewegen.

Die Ionenaustauschchromatographie macht von der Trennung von Molekülen aufgrund ihrer Ionenladung Gebrauch. Das Sorbens oder die stationäre Phase besteht aus einem Polymer mit kovalent gebundenen Ionen. In Kationenaustauscherharzen sind die fest gebundenen Ionen negativ geladen und mit positiven Ionen, die durch elektrostatische Ladungen lose gebunden sind, assoziiert. Die zu trennenden positiv geladenen Substanzen aus einem Gemisch werden zuerst an das Sorbens adsorbiert unter Ersatz der in dem Harz vorliegenden Kationen. Die Lösung ist auf einen pH-Wert gepuffert, der die Bindung erleichtert, worauf mit dem gleichen Puffer eluiert wird zur Entfernung der nicht-gebundenen Fraktionen der Lösung. Ein Anionenaustauscher arbeitet in genau der gleichen Weise, außer daß seine kovalent gebundenen Ionen entgegengesetzt geladen sind und dadurch die Anionen aus der Lösung anziehen.

Die auf Unterschieden in der Molekülgröße basierende Trennung erfolgt in der Gelfiltration, die auch als Molekularsiebchromatographie bekannt ist. Diese Methode trennt Moleküle aufgrund ihrer Partikelgröße, wobei allerdings die Form des Moleküls die Filtration bis zu einem gewissen Grad beeinflußt Die verwendeten Gele liegen in Form von Kügelchen vor, welche ein Netzwerk von Porenöffnungen aufweisen, in denen kleine Moleküle eingeschlossen werden können. Das weitgehende kommerzielle Interesse an Chromatographie im allgemeinen und an der präparativen Flüssigkeitschromatographie im besonderen äußert sich in der großen Zahl an Publikationen, die verschiedene mikrofeinteilige Säulenpackungen und fertig gepackte Säulen vorschlagen, die zu einer besseren Trennung führen sollen als die auf diesem Gebiet bekannten Adsorbentien.

Es wurden nun die Forschungsarbeiten auf die Entwicklung eines neuen Konzepts für die Chromatographie gerichtet, bei der bekannte Adsorbentien zur Anwendung gelangen, wobei jedoch die Trennung sehr schnell erfolgt und leichter als mit den bekannten Techniken durchführbar ist. Das neue Konzept der Chromatographie gemäß vorliegender Erfindung basiert auf dem Einsatz einer sogenannten dynamischen Säule, bei dem im Gegensatz zu der konventionellen Chromatographietechnik, bei der das Adsorbentienmaterial stationär ist, das Bett mit dem Adsorbens bewegt wird.

Die Erfindung ist verfahrensmäßig im wesentlichen dadurch gekennzeichnet, daß man ein sich bewegendes -2-

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Feststoffadsorbensbett mit einem Kolben, der an seinem Bodenteil mit einem Abdichtnngselement und in seinem Inneren mit einem Längskanal, der ein zwischen zwei als Barrieren dienenden Sperreinrichtungen gehaltenes Adsorbens enthält, versehen ist, sowie ein an seinem Boden gegebenenfalls mit einem Mehrweghahn versehenes Testrohr, in das der Kolben bündig paßt, einsetzt, den Kolben in das Testrohr schiebt unter Einführung und Transport des gewünschten zuvor durch den Hahn gedrückten oder von oben in das Testrohr eingefüllten Elutionsmittels durch den Kanal zur Fortbewegung der zu trennenden adsorbierten Verbindungen zwischen den Barrieren, und die erhaltene Lösung durch eine am Kopfteil des Kolbens befindliche Ausströmeinrichtung abzieht. Die Vorrichtung zum Durchfuhren des Verfahrens ist in erster Linie gekennzeichnet durch ein Testrohr (R), das an seinem Boden gegebenenfalls mit einem Mehrweghahn (LV) versehen ist, einen Kolben (C), der in das Testrohr bündig einpaßt und an seinem Bodenteil ein Abdichtelement und in seinem Inneren einen Längskanal aufweist, der ein zwischen zwei als Barrieren dienenden Sperreinrichtungen (Fj, F2) gehaltenes Adsorbens (P) enthält, und eine Ausströmeinrichtung (D), die sich am Kopfende des Kolbens (C) befindet

Die Erfindung schafft somit ein Verfahren für einen neuen Typ von Chromatographietechnik, die als dynamische Säulen-Flüssigkeitschromatographie (DCLC) bezeichnet wird und zur Trennung von einer oder mehreren in Lösung befindlichen Verbindungen dient, wie dies in den Patentansprüchen angegeben ist

Offensichtlich findet besonders häufig der Einsatz eines Feststoffadsorbens in Form einer Säule oder eines Betts als Adsorbentienzone Anwendung und in diesem Falle erweist sich das erfindungsgemäße Verfahren besonders vorteilhaft im Vergleich zu üblichen Chromatographietechniken. Das erfmdungsgemäße Verfahren zeichnet sich durch große Genauigkeit aus und hat die folgenden Hauptvarteile gegenüber bekannten chromatographischen Verfahren: (a) Im Gegensatz zum durch Schwerkraft bewirkten Elutionsmittelfluß, wie er in der konventionellen Chromatographie vorliegt, wird in der dynamischen Säulen-Flüssigkeitschromatographie im Adsorbentienbett ein gewisser innerer Druck ausgeübt, der zu einer besseren Auflösung bei der Trennung der Komponenten führt. (b) Das Verfahren ist sehr schnell, was auch auf den inneren Druck zurückzuführen ist, der in dem System ausgeübt wird. (c) Das Verfahren erfordert weniger Elutionsmittel als in der konventionellen Chromatographie. (d) Das Vorliegen des inneren Drucks im dynamischen Chromatographiesystem ermöglicht den Einsatz eines Adsorbens mit kleinerer Partikelgröße als in der konventionellen Chromatographie, was eine höhere Empfindlichkeit zur Folge hat.

Der zum Einsatz gelangende Mehrweghahn ist sehr wichtig, wenn verschiedene aufeinanderfolgende Elutionsmittel in das Testrohr eingeführt und weiter durch das Adsorbentienbett zur Erzielung der gewünschten Fraktionierung geleitet werden müssen. Wird das Adsorbentienbett hauptsächlich zur Vorbehandlung einer Probe oder zur Entfernung von einer Verbindung verwendet, so ist der Einsatz eines derartigen Hahns nicht erforderlich und es kann ein einfaches, am Boden geschlossenes Testrohr, das zum Kolben paßt, verwendet werden. In diesem Fall muß das Elutionsmittel in das Testrohr eingebracht werden, bevor der Kolben nach unten geschoben wird. Offensichtlich ist jedoch selbst dann, wenn keine Fraktionierung erforderlich ist, ein Testrohr mit einem Hahn vorteilhafter anzuwenden im Hinblick auf das Waschen des Adsorbens und die Einführung des Elutionsmittels durch Ansaugung desselben durch den Hahn.

Das Abdichtelement gleitet längs den Innenwänden des Testrohrs, wobei es sich in einem guten Kontakt mit diesen Innenwänden befindet und ein bündiges Einpassen des Kolbens in das Testrohr sicherstellt. Das Abdichtelement besteht in der Regel aus Kautschuk oder einem anderen geeigneten Material in Form eines O-Rings mit einer Öffnungsweite, die zum Gleiten längs der Innenwände des Testrohrs geeignet ist. Besteht die erfindungsgemäße Vorrichtung aus Glas, so kann der Schliff der Außenwand des Kolbens in solcher Weise erfolgen, daß er den O-Ring ersetzen kann.

Das erfmdungsgemäße Verfahren ist sehr flexibel und kann in einer großen Anzahl von Anwendungen mit verschiedenen Ausführungsformen zum Einsatz gelangen, was im Rahmen des Konzepts der vorliegenden Erfindung liegt. Ein Problem, das in jeder Art von Chromatographie existiert, ist das gleichmäßige Aufbringen der Probe auf die Oberfläche des Adsorbensbetts. Wird die Probe direkt durch Schwerkraftfluß aufgebracht, so ist eine gleichmäßige Aufbringung relativ schwierig, da das Bett dazu tendiert, beim Einbringen der Probe aufgewirbelt zu werden. Es ist daher besonders wichtig, die Oberfläche zu schützen, zum Beispiel mit einem Stück von Rayon-Filterpapier. Ein Hersteller von Säulen (Pharmacia Fine Chemicals AB) stattet einige der Säulen mit einer speziellen, Probeapplikator genannten Einrichtung aus, die zum Schutz der Bettoberfläche dient. Bei dieser Einrichtung ist ein dünnes Nylongewebe am Ende eines kurzen Stücks von Perspex-Rohrauskleidung innerhalb des Chromatographierohrs montiert Eine derartige Einrichtung erhöht selbstverständlich die Ausstattungskosten und hat zusätzlich den Nachteil, daß ihr Vorliegen einen Druck auf den Fluß der Probe ausübt und deren Durchfließen durch die Säule verlangsamt. In den meisten Chromatographiesystemen, in denen das erfindungsgemäße Verfahren zur Anwendung gelangt, ist das Problem einer gleichförmigen Aufbringung der Probe stark erleichtert. Bei dem im chromatographischen Bett existierenden dynamischen Fluß wird die Flüssigkeit beim Einschieben des Kolbens in das Testrohr nach oben gedrückt und es besteht keine Tendenz zur Wirbelbildung aufgrund der -3-

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Einführung der Probe. Außerdem beschleunigt der in dem System beim Einschieben des Kolbens in das Testrohr ausgeübte Druck die Fließgeschwindigkeit der Probe. Ein weiterer Weg zur Unterstützung einer gleichmäßigen Aufbringung der Probe besteht darin, oberhalb des Betts ein anderes geeignetes Adsorbens, das von dem im Bett bereits vorliegenden Adsorbens verschieden ist, anzuordnen, das die Aufgabe hat, eine Vorkonzentration der Probe zu bewirken und damit eine enge Bandauflösung zu fördern. Ein typisches Beispiel für ein derartiges geeignetes Adsorbens ist rohes Siliciumdioxid, das sich vom aktiven Siliciumdioxid mit dessen hohen Adsorptionseigenschaften unterscheidet

Die Partikelgröße und die Teilchengrößenverteilung muß in den meisten üblichen Chromatographieoperationen sorgfältig gesteuert werden. Ein aus kleinen Partikeln bestehendes Bett ergibt in der Regel eine gute Auflösung. Der Grund hierfür ist darin zu sehen, daß der zu einer Zonenverbreiterung führende Mechanismus bei der Zunahme der Partikelgröße verstärkt wird. Bei großen Partikeln dauert die Diffusion in die Partikel und aus diesen heraus eine längere Zeit. Das Fließdiagramm in einem Bett aus großen Partikeln ist schlechter und äußert sich in einer stärkeren Wiedervermischung. Andererseits ist der Widerstand gegenüber dem Flüssigkeitsfluß in einem mit großen Partikeln gepackten Bett geringer und die maximal erzielbare Fließrate höher. In üblichen bekannten Chromatographieoperationen muß daher in bezug auf Partikelgröße ein Kompromiß gefunden werden, um unter den erforderlichen Fließbedingungen eine maximale Zonenauflösung zu erzielen. Demgegenüber ist in der erfindungsgemäßen DCLC-Chromatographietechnik ein Adsorbens mit kleiner Partikelgröße verwendbar ohne mit den Nachteilen, wie sie bei den bekannten Chromatographiemethoden auftreten, konfrontiert zu sein, da der geringe Druck, der im Innern des Systems ausgeübt wird, den durch die kleine Teilchengröße der Partikel verursachten Widerstand gegenüber der Fließgeschwindigkeit überwindet. Das erfindungsgemäße Verfahren kann daher selbst für kritische Fraktionierungen eingesetzt werden, wo die Verwendung eines feineren Adsorbentienma-terials unumgänglich ist, um die gewünschte Auflösung zu erzielen.

In der DE-OS 31 26 926 ist ein Verfahren zur Durchführung von Massentransfer- und -trennoperationen unter Verwendung von selektiven Barrieren beschrieben, das mit Hilfe einer Vorrichtung, die ähnliche Komponenten wie gemäß vorliegender Erfindung aufweist, realisierbar ist. Wie dort angegeben, besteht diese Vorrichtung aus einem eine Membran aufweisenden Mischerseparator und einem Mischbehälter, in den der Mischerseparator eingeschoben wird. Am Mischerseparator sind Einrichtungen zur Ausbildung einer Lufttasche vorgesehen, um den auf die Membran ausgeübten Druck zu erniedrigen. Während des Betriebs des Mischerseparators wird eine vorbestimmte Menge an Luft in der Lufttasche eingeschlossen, die bei der Kompression als Polster oder Stoßdämpfer wirkt und einen Teil des Drucks aufnimmt, der aus dem Widerstand der Membran gegen die Strömung der Flüssigkeit resultiert. Bei der erfindungsgemäßen dynamischen Säulen-Flüssigkeitschromatographie ist das Erfordernis nach einer derartigen Lufttasche weniger zwingend als im angegebenen obigen Fall. Für bestimmte Systeme, bei denen relativ hohe Drücke ausgeübt werden, spielt jedoch offensichtlich eine derartige Lufttasche eine wichtige Rolle, da die eingeschlossene Menge an Luft Flüssigkeit, welche im Zwischenraum zwischen den Innenwänden des Testrohrs und den Außenwänden des äußersten Endes des Kolbens hochgekrochen ist, in das Testrohr zurückdrückt. Die Menge an Luft, die durch eine derartige Einrichtung am Kolben eingeschlossen wird, hängt von zahlreichen Faktoren ab, zum Beispiel vom Typ der Sperrplatte oder Barriere, den Komponenten des zu trennenden Gemisches und den besonderen Bedingungen, die in dem speziellen Chromatographiesystem auftreten. Ein besonderer Vorteil der Verwendung einer derartigen Lufttasche tritt dann zutage, wenn es erforderlich ist, völlig darauf zu verzichten, das Hochkriechen von Elutionsmittel mit Hilfe eines am Boden des Kolbens angeordneten, als Abdichtelement wirkenden O-Rings zu verhindern.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist auf den verschiedensten Gebieten der Chromatographie mit Erfolg ein-setzbar, zum Beispiel bei der Silicagel-Chromatographie, der Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie, der Kapillarchromatographie, der Affinitätschromatographie, der Chromato-Fokussierung, der Ausschlußchromatographie (die auch unter dem Namen Gelfiltration bekannt ist) und der Ionenaustauschchromatographie.

Bei der Silicagelchromatographie handelt es sich um eine der üblichsten Chromatographiemethoden. Silicagel (Kieselgel) ist bei weitem das beste bekannte Adsorbens und dazu im Vergleich mit anderen Adsorptionsmaterialien auch noch relativ billig. Die mit Silicagel beim erfindungsgemäßen Verfahren erzielbaren Trennergebnisse sind praktisch die gleichen wie bei üblichen Techniken oder sogar noch besser als diese in bezug auf Trenngenauigkeit und Ausbeute an wiedergewonnener Substanz, wobei es sich aber dadurch auszeichnet, daß es einfacher und bequemer ist, weil es schneller arbeitet und weniger Lösungsmittel erfordert. Als besonderer Vorteil kommt auch hinzu, daß die Säulen wiederverwendbar sind. Zusätzlich können auch noch Silicagelpartikel mit kleinerer Teilchengröße und dichtere Packungen Anwendung finden mit den daraus resultierenden Vorteilen eines höheren Trenneffekts.

Die Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie beruht darauf, daß deren stationäre Phase weniger polar ist als die mobile Phase. Der Hauptnachteil bei Einsatz von Silicagel beruht darauf, daß nur eine teilweise Wiedergewinnung der durch ein derartiges Bett strömenden Verbindungen gelingt Im Hinblick auf die mit Hilfe der erfindungsgemäßen DCLC-Technik erzielbaren Vorteile kann die Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie auch mit Erfolg in der präparativen Chromatographie eingesetzt werden. In jüngster Zeit stieg auch das Interesse an der Kapillarchromatographie, insbesondere im Hinblick auf die Entwicklung von Mikrosäulen für Hochleistungs-Flüssigchromatographie. Der Grund für diese Entwicklungen liegt in den folgenden Vorteilen dieses Typs von Chromatographie: -4-

AT 394 454 B (a) Die potentielle Erzielbarkeit einer größeren Trenneffizienz für komplexe Gemische und schwer in Lösung zu bringende gelöste Stoffe. (b) Eine wesentliche Erniedrigung des Verbrauchs an Elutionsmittel. 5

Das erfindungsgemäße DCLC-Verfahren ist für Kapillarchromatographie leichter einsetzbar, wenn in dem zur Anwendung gelangenden Kolben ein enger Kanal vorgesehen wird.

Die Gelfiltration, die auch als Ausschlußchromatographie bekannt ist, gewinnt mehr und mehr Interesse bei der Reinigung von biologischen Substanzen unter Verwendung eines entsprechenden Adsorbens als Trennme-10 dium. Gute Ergebnisse wurden bei der Trennung von markiertem Jod-hCG von markiertem Jod unter Verwendung eines Adsorbens vom Sephadex G-Typ (Handelsprodukt der Pharmacia Fine Chemicals, Schweden) mit Hilfe der erfindungsgemäßen dynamischen Chromatographietechnik (vergleiche das unten angegebene Beispiel 3) erhalten. Die Gelfiltration hat sich auch als einfache und rasche Methode zur Entsalzung oder zur Änderung von Puffern erwiesen. Das Gelbett wird zweckmäßigerweise vor der Versuchsdurchführung mit einer Lösung mit der 15 gewünschten Ionenzusammensetzung ins Gleichgewicht gesetzt, zum Beispiel im Fall der Entsalzung mit destilliertem Wasser. Die Elution wird mit der gleichen Flüssigkeit durchgeführt. Im Hinblick auf die dabei auftretenden hohen Fließraten kann die gesamte Operation in kurzer Zeit beendet und das entsalzte Material innerhalb weniger Minuten gesammelt werden. Andere Anwendungsgebiete für mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens durchgeführte Gelfiltration sind die Vorbehandlung vor einer HPLC-Operation und die Konzentrierung 20 verdünnter Proben mit anschließender Trennung.

Die Chromato-Fokussierung findet weite Verbreitung zur Trennung von Proteinen aufgrund ihres isoelektrischen Punktes. Da die Chromato-Fokussierung zu extrem engen Banden an getrenntem Material führt und in der Regel lange enge Säulen erfordert, ist offensichtlich, daß die erfindungsgemäße dynamische Säulen-Flüssigkeits-chromatographie für diesen Typ von Chromatographie ideal ist, wenn die erfindungsgemäße Vorrichtung mit 25 einem engen Kolben ausgestattet wird.

Die erfindungsgemäße DCLC erweist sich auch als bequem und zweckmäßig für Ionenaustauschchromatographie, bei der es sich bekanntlich um eine der weitverbreitesten Trenntechniken handelt. Es wurden verschiedene Versuche zur Trennung von Kupfersulfat und Natriumbichromat an Dowec 50 WX 8 als Adsorbens durchgeführt (vergleiche das unten angegebene Beispiel 2), wobei sich zeigte, daß mit Hilfe des erfindungsgemäßen 30 Verfahrens wesentliche Vorteile in bezug auf Zeitersparnis, Lösungsmittelvolumen und Einfachheit der Durchführung erzielbar sind.

Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen DCLC-Technik liegt in der wesentlichen Verminderung des Totvolumens. Das Totvolumen wird bekanntlich als das Volumen an Flüssigkeit in den Zwischenräumen zwischen den Körnern des Adsorbens im Chromatographiebett definiert. In den meisten üblichen Chromatographieopera-35 tionen stellt das Totvolumen ein Problem dar, das die Erzielung eines genauen Ergebnisses wesentlich beeinflußt. Demgegenüber wird bei der erfindungsgemäßen DCLC aufgrund der Möglichkeit einer dichten Packung die Gleichgewichtsverteilung der Substanz zwischen dem Adsorbens und der Flüssigkeit sehr rasch mit sehr geringem Totvolumen eingestellt. Demzufolge ist es auch möglich, scharfe und enge Zonen zu erhalten. Dies ist sehr wichtig bei Fraktionierungen, bei denen der Unterschied im Elutionsvolumen zwischen den Substanzen im allge-40 meinen klein ist Insbesondere bei der Gelfiltration verschlechtern große Totvolumina die erhaltene Auflösung.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das Adsorbens in einer Hülse angewandt, die in den Längskanal des Kolbens eingesetzt wird. Auf diese Weise ist die Chromatographievorrichtung für zahlreiche Verwendungszwecke gebrauchsfertig durch einfachen Ersatz der Hülse durch eine andere, die das geeignete Adsorbens enthält (vergleiche die beigefügte Figur 5). Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich durch große 45 Einfachheit aus und seine Vielseitigkeit neben den verschiedenen anderen Vorteilen wurde bereits erwähnt. Es gibt zahlreiche Ausführungsformen, die für die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens dienende Vorrichtung in Frage kommen. Einige dieser Ausführungsformen werden im folgenden anhand der beigefügten Figuren 1 bis 9, welche die Erfindung erläutern, ohne sie zu beschränken, veranschaulicht

Gemäß Figur 1 ist das Testrohr (R) mit einem Luer-Verschluß (L) ausgestattet, an dem ein Dreiweghahn 50 (LV) angebracht ist. Das gewünschte Elutionsmittel (E) wird in das Testrohr (R) gedrückt. Der Kolben (C) hat einen Längskanal, in dem das Adsorbens (P) untergebracht und zwischen zwei am Kopf und Boden des Kolbens befindlichen Membranen (Fj, F2) gehalten wird. Oberhalb der oberen Membran (F2) ist ein Stopfen (S) vorgesehen mit einer Ausströmöffnung (D), durch welche die getrennte Fraktion vom Adsorbensbett gesammelt wird. Am unteren Teil des Kolbens befindet sich ein O-Ring (O), der als Abdichtung dient und so ausge-55 staltet ist, daß er längs der Innenwände des Testrohrs (R) gleitet.

In der Ausführungsform gemäß Figur 2 ist am Boden des Testrohrs (R) kein Mehrweghahn vorgesehen und eine begrenzte Menge an gewähltem Elutionsmittel (E) wird zu Beginn in das Testrohr (R) eingefüllt. Der Kolben (C) besitzt den Längskanal, in dem das Adsorbens (P) untergebracht und zwischen den beiden Membranen (Fj, F2) gehalten wird. Oberhalb der oberen Membran (F2) befindet sich ein Stopfen (S). Die Ausström- 60 Öffnung (D), durch welche die getrennte Fraktion aus dem Adsorbensbett gesammelt wird, ist mit dem Kolben (C) verbunden. Am unteren Teil des Kolbens befindet sich der O-Ring (O) als Abdichtelement. Diese Vorrich- -5-

AT 394 454 B tung bietet sich an, wenn keine Fraktionierung erforderlich ist und die Operation nur aus einem Zyklus mit einem einzigen Elutionsmittel besteht.

Gemäß Figur 3 ist das Testrohr (R) genau so wie in Figur 2 ohne am Boden angebrachten Hahn. Der Kolben (C) weist den Längskanal auf, in den das Adsorbens (P) eingebracht und zwischen den beiden Membranen (Fj, F2) gehalten wird. Oberhalb der oberen Membran (F2) ist ein Stopfen (S) vorgesehen mit einer Ausströmöffnung (D), durch welche die getrennte Fraktion aus dem Adsorbensbett gesammelt wird. Am Boden des Kolbens befindet sich der O-Ring (O) als Abdichtelement.

In Figur 4 wird die einfachste Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung veranschaulicht, die ebenfalls am Boden des Testrohrs (R) keinen Hahn aufweist und außerdem am Kopfende des Kolbens keinen Stopfen hat. Eine begrenzte Menge des gewählten Elutionsmittels (E) wird zu Beginn in das Testrohr (R) eingeführt. Der Kolben (C) besitzt einen Längskanal, in dem sich das Adsorbens (P) befindet, das zwischen den beiden Sperrplatten oder Barrieren (Fj, F2), bei denen es sich um Membranen oder Filter handelt, gehalten wird. Der O-Ring (O) ist am unteren Teil des Kolbens vorgesehen und dient als Abdichtung, wobei er in solcher Weise ausgestaltet ist, daß er längs der Innenwände des Testrohrs (R) gleitet. Mit dem das Adsorbens (P) aufnehmenden Kanal ist eine Ausströmeinrichtung (D) verbunden, durch welche die getrennte Fraktion gesammelt wird.

Figur 5 veranschaulicht eine Ausführungsform, bei der eine Hülse (CA), in der sich das gewünschte Adsorbens (P) befindet, in den Längskanal (I) des Kolbens (C) eingeführt wird. Das Sammeln des Elutionsmittels und der getrennten Fraktionen erfolgt durch eine Ausströmeinrichtung, wie sie im Zusammenhang mit den vorstehenden Figuren beschrieben ist. Der zur Abdichtung dienende O-Ring (O) ist am unteren Teil des Kolbens (C) vorgesehen. Die Anwendungs- und Wirkungsweise ist sehr einfach, wie im folgenden auch unter Hinweis auf Figur 1 erläutert werden soll. Der Kolben (C) wird nach unten in das Testrohr (R) geschoben, das mit dem gewählten Elutionsmittel (E) gefüllt ist. Dies führt dazu, daß das Elutionsmittel durch die untere Membran (Fj) und danach durch das Adsorbens (P) gedrückt wird, das sich im Längskanal des Kolbens (C) befindet, worauf es schließlich durch die Ausströmeinrichtung (D) (vergleiche hierzu Figur 4) heraustropft. Bei Füllung mit einem geeigneten Trägermaterial (P) wirkt die veranschaulichte Vorrichtung als Chromatographiesäule. Das Nachfüllen des Testrohrs (R) wird gemäß der in Figur 1 gezeigten Ausführungsform einfach dadurch bewirkt, daß der Ausfluß des Testrohrs geöffnet und mehr Elutionsmittel durch den Hahn (LV) gepreßt wird.

Figur 6 veranschaulicht eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen dynamischen Säulenvorrichtung, bei der der Säulenkolben (C) nach oben bewegt wird in das Testrohr (R) und der Ausfluß des Elutionsmittels durch einen vertikalen engen Kanal (X) in direkter Verlängerung des säulenchromatographischen Trägermaterials erfolgt. Figur 7 stellt eine Modifikation der in Figur 6 gezeigten Säule dar, wobei ein Lösungsmittel-Vorratsbehälter in Form einer Säule über (Y) mit der dynamischen Säule verbunden ist.

Aus Figur 8 ist eine Ausführungsform ersichtlich, bei der der Kolben (C) der dynamischen Säule aus zwei oder mehr Untereinheiten besteht, von denen jede gleiche oder unterschiedliche Adsorbentien (P) enthält, wobei es möglich ist, das aus jeder Untereinheit austretende Elutionsmittel zu sammeln.

Figur 9 veranschaulicht eine weitere Ausführungsform, aus der sich die Vielseitigkeit der erfindungsgemäßen DCLC ergibt, deren Anwendungsmöglichkeiten dadurch noch nicht erschöpft sind. Im Fall der dargestellten Ausführungsform wird das austretende Elutionsmittel in eine andere Säule geleitet, welche das gleiche oder ein unterschiedliches Adsorbens (P) enthält

Die Figuren 10 bis 12 zeigen die grafische Auswertung von Versuchsergebnissen, die bei der Trennung verschiedener Gemische, wie sie in den unten angegebenen Beispielen (4,5) und (6) beschrieben werden, erhalten wurden.

Figur 13 stellt ein Diagramm dar, das bei der grafischen Auswertung einer Affinitätschromatographie zur IgG-Isolierung erhalten wurde, wie dies im unten angegebenen Beispiel 9 beschrieben ist

Im Prinzip kann die erfindungsgemäße dynamische Chromatographie auch für einen Einsatz in der Flüssig-Ionenaustauschchromatographie ins Auge gefaßt werden. Flüssige Ionenaustauscher werden als Flüssig-Flüssig-Extraktionssysteme definiert, deren Wirkungsweise, zumindest formell, auf dem Austausch von Ionen an der Grenzfläche zwischen einer wäßrigen Lösung und einem nicht-mischbaren Lösungsmittel mit vemachlässigbarer Verteilung des Extraktanten in die wäßrige Phase besteht Flüssige Anionenaustauscher finden in der Umkehr-phasen-Extraktionschromatographie Anwendung. Bei dieser Technik dient das mit dem flüssigen Anionenaustauscher imprägnierte Trägermaterial (Silicagel, Cellulosepulver, und dergleichen) als die stationäre Phase und eine wäßrige Lösung einer Säure oder eines ihrer Salze wird als Elutionsmittel (mobile Phase) verwendet. Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sollte die Membran so gewählt werden, daß sie nur für das Elutionsmittel, nicht jedoch für den flüssigen Ionenaustauscher permeabel ist der in dem Längskanal des Kolbens verbleiben sollte.

Die zur Durchführung der DCLC verwendbare erfindungsgemäße Vorrichtung kann aus beliebigem inerten Material hergestellt sein, zum Beispiel aus Glas, Polyäthylen oder einem anderen geeigneten Kunststoffmaterial und selbst Metall kommt für einige Spezialzwecke in Frage.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie zu beschränken. -6-

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Beispiel 1

Trennung eines Gemisches aus Ferrocen und Ferrocenaldehyd (a) Packmethode 5 1,0 g Siliziumdioxid (Merck, Kieselgel H, Typ 60) wurde in 5 ml einer entgasten Lösung von Dichlor- methan/Hexan 1:1 im verschlossenen Testrohr dispergiert zur Herstellung einer Aufschlämmung. Der mit dem Stopfen und der oberen Membran ausgestatteten Kolben wurde in das Testrohr eingesetzt bis ein fester Kontakt zwischen dem O-Ring und dem Testrohr erreicht war.

Die gesamte Einheit wurde umgedreht, so daß sie senkrecht auf dem Stopfen stand und die Luft wurde durch 10 den Auslaß im Testrohr entfernt. Der Testrohrauslaß wurde sodann verschlossen und das Packen erfolgte in der Weise, daß das Testrohr entlang dem feststehenden Kolben nach unten bewegt wurde mit einer Fließrate von 1 ml/min. Sobald das Siliziumdioxidbett vollständig abgesessen war, wurde der Testrohrauslaß geöffnet und das Testrohr vom Kolben entfernt. Die untere Membran wurde installiert und damit war die Säule fertig zur Aufbringung der Probe. 15 (b) Probenaufbringung

Ein Gemisch von Ferrocen und Ferrocenaldehyd wurde in 0,2 bis 0,4 ml Dichlormethan gelöst und die Lösung wurde auf die untere Membran der senkrecht stehenden Säule aufgebracht Die Lösung drang durch die Membran und die Komponenten wurden am Siliziumdioxid adsorbiert. Diese Prozedur konnte dadurch beschleunigt 20 werden, daß mit Hilfe des geschlossenen Testrohrs etwas Luftdruck ausgeübt wurde. (c) Elution

Der gepackte Kolben wurde in das 5 ml des gewählten Elutionsmittels enthaltende Testrohr eingesetzt Luft wurde entfernt wie während des Packens der Säule und die Elution wurde durch Niederdrücken des Kolbens in das 25 gefüllte Testrohr mit einer Fließrate von etwa 1 ml/min bewirkt

Die mit zwei verschiedenen Gemischen erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I aufgeführt. 30 35 1) Trennung einer Testmischung aus Ferrocen (13 mg) und Ferrocenaldehyd (19 mg) 40 Frakt. Nr. Elutionsmittelvolumen (ml) Elutions mittel Gewicht des Rückstands (mg) Charakte risierung 0 1 Hexan 0 leer 1 1 II 11,4 Ferrocen 45 2 1 II 0,79 Ferrocen 3 1 tt 0,31 Fenocen 4 1 Dichlormethan Spuren leer 5 1 tt 1,79 Aldehyd 6 1 tt 13,36 Aldehyd 50 7 1 tt 4,59 Aldehyd 8 1 tt 1,69 Aldehyd 9 1 tt Spuren leer 55 -7- 60

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Tabelle I (Fortsetzung') 2) Trennung einer Testmischung aus Ferrocen (25,3 mg) und Ferrocenaldehyd (15,6 mg)

Frakt. Elutions- Elutions- Gewicht des Charakteri-

Nr. mittelvo- mittel Rückstands sierung lumen (ml) (mg) 0 1 Hexan 0,2 Ferrocen 1 1 tt 19,0 Ferrocen 2 1 It 1.7 Ferrocen 3 1 tt 0,3 Ferrocen 4 1 tt 0 leer 5 1 Dichlormethan 0 leer 6 1 H 0,2 Aldehyd 7 1 tt 11,5 Aldehyd 8 1 tf 2,9 Aldehyd 9 1 tt 0,7 Aldehyd 10 1 tt 0 leer

Beispiel 2

Trennung von I^C^Oy^I^O von G1SO4.5H2O durch Ionenaustausch

Das Adsorbens bestand aus Dowex 50 WX8 (200 bis 400 mesh, entsprechend 0,038 - 0,074 mm lichte Maschenweite). Das Adsorbens wurde zuerst gewaschen und danach etwa 30 Minuten lang in destilliertem Wasser, das mit Salzsäure (2N) angesäuert war, stehengelassen. Die Azidität wurde sodann durch Waschen mit destilliertem Wasser entfeint und das neutrale Adsorbens wurde in den Längskanal des Kolbens eingeführt. Die beiden Membranen, welche das Adsorbensbett hielten, bestanden aus zwei Scheiben aus porösem Polyäthylenfilter.

Die in Form einer wäßrigen Lösung vorliegende Probe bestand aus 359,3 mg NayC^Oy^E^O und 369,7 mg CUSO4.5H2O, gelöst in 1 ml Wasser. Die Probe wurde durch das Adsorbens geleitet und die für Analysezwecke entnommene Menge an Probe betrug 100 μ1. Die Ionen wurden von der Säule gewaschen und wie folgt getrennt: - die Anionen durch destilliertes Wasser; - die Kationen durch eine saure Lösung, bestehend aus 2 N-Salzsäure.

Die Fraktionsanteile wurden in Reagensgläsem gesammelt. Die Beendigung des Waschens wurde nach der Farbe der austretenden Lösung bestimmt. Die Proben wurden ferner quantitativ analysiert, indem die Fraktionsanteile bei 110 °C getrocknet und der trockene Rückstand gewogen wurde. Eine Blindprobe für den Rückstand wurde durchgeführt, indem 100 μΐ der Probe in ein Teströhrchen eingeführt und bei 110 °C getrocknet wurden. Der Feststofffückstand wog 68,5 mg.

Die Ergebnisse, die beim Wiegen der verschiedenen getrockneten Fraktionen erhalten wurden, sind in der folgenden Tabelle II wiedergegeben. Im Versuch 2 wurde die Säule nach Durchführung des Versuchs 1 bis zur Neutralität gewaschen und neutralisiert -8- 5

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Tabellen

Trennung durch Ionenaustausch mit dynamischer Chromatographie 10 Versuch Nr. Nr. da1 Fraktion Elutions mittel Gewicht der trockenen Fraktion (mg) Gesamt gewicht (mg) Bemer kungen 1 1 H2° 43,0 15 2 It 0,2 3 tt 0 43,2 *) 4 HCl (ZN) 0,5 5 tt 15,2 6 It 27,5 20 7 II 3,2 8 tt 1,3 47,7 *) 2 1 h2o 44,2 2 tt 1,1 25 3 tl 0,1 45,3 *) 4 HCl (ZN) 0,4 5 tt 23 6 tt 34,0 7 tt 5,7 30 8 tt 0,8 43,2 *) *) farblose Fraktion 35

Die Ergebnisse zeigen, daß nach Durchlaufen von acht Fraktionen durch das Adsorbens praktisch die Gesamtmenge der Verbindungen entfernt und getrennt waren.

Um die Effizienz der erfindungsgemäßen DCLC zu zeigen, wurde ein Vergleichsversuch durchgeführt unter Verwendung einer üblichen Chromatographietechnik durch Elutionsmittelfluß mittels Schwerkraft, wobei die 40 gleiche Menge einer 100 μΙ-Probe und das gleiche Adsorbens eingesetzt wurden. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle ΠΙ aufgeführL

Tabelle ΙΠ 45

Trennung durch lonenaustausch mit üblicher bekannter Chromatographiesäule 50

Gewicht der trockenen Fraktion (mg)

Nr. der Elutions-

Fraktion mittel

Gesamt- Bemerkungen gewicht (mg) 55 1 h2o 0,8 2 tt 50,3 3 tt 1,3 4 tt 0,5 5 tt 0,2 60 6 II 0,3 7 tt 0,4 -9-

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Tabelle ΙΠ (Fortsetzung)

Trennung durch Ionenaustausch mit üblicher bekannter Chiomatographiesäule

Gewicht dar trockenen Fraktion (mg)

Nr. der Elutions- Fraktion mittel

Gesamt- Bemerkungen gewicht(mg) 8 II 0,1 9 II 0,3 10 II 0,4 11 II 0,1 12 II 0,3 13 II 0,1 14 HCl (2N) 0,0 15 II 2,3 16 II 23,0 17 II 12,7 18 tt 3,3 19 fl 1,4 20 II 1,4 *) farblose Fraktion

Die Ergebnisse zeigen, daß in diesem Falle zwanzig Fraktionen zur Trennung erforderlich sind gegenüber acht beim erfindungsgemäßen Verfahren.

Beispiel 3

Es wurde eine Lösung von 100 μΐ ß-hCG mit einem Gehalt an 30 bis 35 % markiertem Jod (5¾) mit Hilfe der erfindungsgemäßen DCLC unter Verwendung eines Sephadex G-10-Adsorbens getrennt. Die Elution wurde mit 10 ml Puffer bei einem pH-Wert von etwa 8 durchgeführt. Jede Fraktion bestand aus etwa 0,4 ml. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IV aufgeführt.

Tabelle IV

Trennung von *J2 enthaltendem ß-hCG auf Sephadex G-10

Fraktion Nr. leer cpm (Einheiten pro Minute) gemessen gesamt 1 29,0 0 2 9348,0 9578,0 3 1946,0 1962,8 4 292,0 267,7 5 130,0 104,8 6 114,0 84,5 7 108,0 82,0 8 78,0 48,2 12125 cpm -10-

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Tabelle IV (Fortsetzung!

Trennung von *J2 enthaltendem ß-hCG auf Sephadex G-10

Fraktion Nr. leer cpm (Einheiten pro Minute) gemessen gesamt 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 gesamt 79.0 98.0 134.0 182.0 414.0 485.0 766.0 854.0 635.0 450.0 504.0 378.0 284.0 158.0 131.0 20534,0 49.6 67.7 102,9 152,5 389.3 464.4 757.5 834.7 615.5 424.6 486.4 348.5 256.8 127.7 99.8 20594,4 5169 cpm 17294

Die Ergebnisse zeigen, daß die Ausbeute etwa 85 % beträgt. Bei Durchführung dieser Trennung mit Hilfe einer üblichen Chromatographietechnik wird weitaus mehr Elutionsmittel gebraucht und die Trennoperation dauert sehr viel länger.

Beispiel 4

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen DCLC-Verfahrens wurde eine Lösung eines Farbstoffgemischs bestehend aus 35 % Ceres red 7B, 28 % Nitro fast blue 2B, 25 % Nitro fast violet FBL und 12 % Ceres yellow R (alle Angaben in Vol.-%) getrennt Dieses Farbstoffgemisch wurde von der Firma Merck bezogen (Katalognummer 9354).

Eine Menge von 30 μΐ des Farbstoffgemisches in Dichlormethan wurde auf eine DCLC-Säule aufgebracht die ein Adsorbens auf Siliziumdioxidbasis mit einer Partikelgröße von 15 bis 25 pm (Handelsprodukt Lichroprep Si-60 der Firma Merck, Katalognummer 9336) enthielt Die Säulendimensionen waren wie folgt: Länge 10,6 cm und innerer Durchmesser 10 mm. Die Fließrate betrug 2 ml/min und als Elutionsmittel diente Dichlormethan.

Die Ergebnisse der Trennung sind in Figur 10 in grafischer Auswertung, gemessen als optische Dichte (O. D.) bei 254 nm gegen die Fraktionen, wiedergegeben. Wie aus den Kurven ersichtlich ist, wird eine rasche und saubere Trennung erreicht

Beispiel 5

Es wurde ein Gemisch von polycyclischen Aromaten bestehend aus 50 % Benzol, 30 % Naphthalin und 20 % Anthracen (Angaben in Vol.-%) in n-Heptan-Lösung mit Hilfe des erfindungsgemäßen DCLC-Verfahrens getrennt.

Die aufgebrachte Probe bestand aus 50 μΐ und es wurde eine Säule mit den gleichen Ausmaßen wie in Beispiel 4, die das gleiche Adsorbens enthielt eingesetzt Die Fließrate betrug 2 ml/min und das Volumen jeder Fraktion war 1 ml. Als Elutionsmittel diente n-Heptan.

Die Ergebnisse da- Trennung sind in Figur 11 grafisch ausgewertet als optische Dichte (O. D.) bei 254 nm gegen die Fraktionen. Wie die Kurven zeigen, wurden die Komponenten in drei scharfe Peaks getrennt

Beispiel 6

Es wurde ein Gemisch von Alkylphthalaten mit Hilfe des erfindungsgemäßen DCLC-Verfahrens unter Verwendung einer Säule wie in Beispiel 4 mit dem gleichen Adsorbens getrennt

Die Alkylphthalate bestanden aus einem Gemisch von Dibutylphthalat, Diethylphthalat und Dimethyl- -11-

AT 394 454 B phthalat in n-Heptan/Ethylacetat (90/10 Vol.-Teile). Das Elutionsmittel war ein Gemisch aus n-Heptan/Ethyl-acetat (90/10 Vol.-Teile). Die Fließrate betrug 3 ml/min, das Volumen jeder Fraktion war 1 ml. Die Ergebnisse der Trennung sind in Figur 12 grafisch ausgewertet als optische Dichte (O. D.) bei 254 nm gegen die Fraktionen. Wie die Kurven zeigen, wurde eine klare Trennung erreicht

Beispiel 7

Reinigung von Anti-hCG

Die Reinigung wurde mit Hilfe des erfindungsgemäßen DCLC-Verfahrens unter Verwendung zweier verschiedener Bezugsquellen dieser Verbindungen durchgeführt, nämlich a) von Serono und b) von Miles, wobei bekannt ist, daß das letztgenannte Produkt weniger konzentriert ist als das erstgenannte. a) Reinigung von Anti-hCG (Serono)

Eine Phiole von Anti-hCG wurde rekonstituiert mit 1 ml Phosphatpuffer (pH = 6,3). Die Lösung wurde auf eine Säule von 10,6 cm Länge und 10 mm innerem Durchmesser aufgebracht, welche 3 g Cellulose (Handelsprodukt DEAE DE-52 der Firma Whatman) als Adsorbens enthielt. Die Säule wurde mit Phosphatpuffer (pH = 6,3) eluiert mit einer Fließrate von 2,5 ml/min. In den ersten Fraktionen (4 bis 8) war sofort ein sehr hoher Peak von Proteinen sichtbar. Die Säule wurde an eine Durchflußzelle und einen Recorder zur sofortigen Bestimmung angeschlossen. Ein Pufferwechsel auf pH = 7,1 führte zu einem fast sofortigen Auftreten von Proteinen. Zwei weitere Hauptpeaks von Proteinen wurde eluiert.

Die Bestimmung erfolgte durch Messen der Adsorption bei 280 nm optische Dichte (O. D.) jeder Fraktion. Die immunologische Aktivität in jeder Fraktion zum hCG-Nachweis erfolgte mit Hilfe der RIA-Methode unter Verwendung der folgenden Lösungen: 100 μΐ - hCG; 100 μΐ Serum frei von hCG und 100 μΐ jeder Fraktion. Die Inkubation wurde 3 h lang bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Trennung erfolgte unter Einsatz eines Polyäthylenglykol/Doppelantikörpers (20/1 Vol.-Teile).

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle V aufgeführt.

Tabelle V

Trennung von Anti-hCG Serono auf DEAE DE-52

Fraktion Nr. O. D. RIA % Bindung Fraktion Nr. O. D. RIA % Bin düng 1 0,004 0,1 16 0,013 19 2 0,002 0,1 17 0,039 16,4 3 0,004 14,1 18 0,03 5,0 4 0,006 2,1 19 0,012 3,0 5 0,63 22,8 20 0,019 6,4 6 0,879 12,3 21 0,044 10,3 7 0,097 2,8 22 0,029 4,5 8 0,01 0,1 23 0,018 4,0 9 0,008 0,1 24 0,015 3,0 10 0,003 0,1 25 0,008 2,6 11 - 0,1 26 0,002 2,4 12 0,002 0,1 27 0,002 0,1 13 0,002 0,1 28 0,01 0,1 14 0,003 0,1 29 - 0,1 15 0,01 0,1

Die Ergebnisse zeigen, daß drei Hauptpeaks erhalten wurden, wobei die immunologische Aktivität extrem hoch blieb im Vergleich zur Proteinkonzentration. b) Reinigung von Anti-hCG (Miles) 70 μΐ Antikörper (als Kaninchenserum) wurden auf die DEAE DE-52-Säule aufgebracht (wie im Versuch (a) beschrieben) und zuerst mit Phosphatpuffer (pH = 6,3) eluiert. Wie im Versuch a) wurde ein rasch auftretender -12-

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Proteinpeak eluiert in den Fraktionen 3 und 4. Durch Erniedrigung der optischen Dichte (O. D.) und Änderung des Puffers auf pH = 7,1 wurden drei weitere Hauptpeaks gesammelt.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle VI aufgeführt.

Tabelle VI

Trennung von Anti-hCG Miles auf DEAE DE-52

Frak O.D. RIA Protein tion % Bin A* Nr. dung % Bindung 1 0,01 0,1 - 2 0,102 0,1 - 3 0,656 64,2 2,6 4 0,416 45,6 - 5 0,091 0,1 - 6 0,055 0,1 - 7 0,044 0,1 - 8 0,022 0,1 - 9 0,016 0,1 - 10 0,007 0,1 - 11 0,005 0,1 - 12 0,003 0,1 - 13 0,003 0,1 - 14 0,004 0,1 - 15 0,001 0,1 - 16 0,004 0,1 - 17 0,011 0,1 - 18 0,034 65,4 7,2 19 0,291 55,5 12,1 20 0,247 61,4 11,6

Frak tion Nr. O.D. RIA % Bindung Protein A* % Bindung 21 0,094 63,6 7,0 22 0,042 64,8 7,2 23 0,041 63,4 - 24 0,07 1,0 - 25 0,518 60,3 5,9 26 0,518 67,7 5,3 27 0,299 55,5 4,5 28 0,161 58,4 3,7 29 0,120 66,0 2,5 30 0,112 54 1,8 31 0,091 51,3 3,9 32 0,074 59,7 2,4 33 0,062 55,7 unbekannt 34 0,062 60,9 - 35 0,043 59,5 1,9 36 0,034 37 0,035 38 0,029 39 0,021

Die Ergebnisse zeigen, daß das getrennte Anti-hCG in drei Hauptpeaks gesammelt wurde, die alle immunologische Aktivität zeigten, Absorption bei 280 nm aufwiesen und einen Nachweis durch Protein A* ergaben. Alle Peaks waren scharf voneinander getrennt und wurden gesammelt

Beispiel

Trennung von Humanserum

Die Trennung mit Hilfe des DCLC-Verfahrens erfolgte nach einer Prozedur, die identisch ist mit derjenigen, wie in Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir, Md. Blackwell Scientific Publications, Oxford, London, 1973,2. Auflage) beschrieben.

Die Chromatographie basiert auf Ionenaustausch auf einem Celluloseadsorbens und einer Gradientenelution mit Phosphatpuffer (0,02 M) von pH 5,7.

Die verwendete Säule hatte einen inneren Durchmesser von 10 mm und war gepackt mit 3 g DEAE DE-52 (Handelsprodukt der Firma Whatman) und sie wurde gewaschen mit dem Phosphatpuffer (pH = 8) mit einer Fließrate von 2,5 ml/min.

Der Gradient wurde mit einem Zweikammersystem erzeugt unter Verwendung von 40 ml Phosphatpuffer pH 8 und 60 ml Phosphatpuffer pH 5,7. 3 ml Humanserum wurden getrennt in Fraktionen von 1,5 ml, von denen jede gesammelt wurde, worauf der darin enthaltene Proteingehalt durch optische Dichte (O. D.) bei 280 nm gemessen wurde.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle VII aufgeführt. -13-

AT 394 454 B

Tabelle VII

Trennung von Humanserum (0. D. bei 280 nm)

Frak O. D. Frak O. D. Frak tion tion tion Nr. Nr. Nr. 0,052 25 0,06 0,061 26 0,026 0,102 27 0,008 28 0,004 0,187 29 0,011 0,355 30 0,003 0,379 31 0,008 0,361 32 0,015 0,313 33 0,016 0,233 34 0,011 0,156 35 0,005 0,098 36 0,006 1 0,0017 13 2 1,3 14 3 1,3 15 4 1,3 16 5 0,554 17 6 0,262 18 7 0,135 19 8 0,082 20 9 0,067 21 10 0,064 22 11 0,055 23 12 0,052 24

Die Ergebnisse zeigen, daß die Trennung nach dem traditionellen Kurvenbild von getrenntem Humanserum erfolgte mit zwei Hauptpeaks (IgG, Albumine). Die Trennung war in kurzer Zeit beendet.

Beispiel 9

Das erfindungsgemäße DCLC-Verfahren wurde auf Affinitätschromatographie angewandt zur Isolierung von Kaninchen-IgG unter Verwendung von Sepharose4B (Handelsprodukt der Firma Pharmacia) -Antikörper (Antikörper = Ziegen-Antikaninchen) als Ligand.

Sepharose-4B-Antikörpen Der Antikörper wurde an das aus Sepharose-4B (Handelsprodukt der Firma Pharmacia) bestehende Adsorbens gekuppelt unter Beachtung der Instruktionen, die von Axel Porath et al. in Nature 214,1967, gegeben werden. 1 g Sepharose-4B ) ) 50 % Bindung 30 mg Ziegen-Antikaninchen ) DCLC-Säule: Glassäule von 6 mm innerem Durchmesser, gepackt mit Sepharose-4B-Antikör per

Bestimmung: direkt von der Säule mit Fließzellen unter Messung der UV-Absorption bei 280 nm

Puffen 1. Phosphatpuffer/NaCl, pH 7,8. 2. Glycin/HCl (0,1 M), pH 2,5.

Die Verfahrensweise umfaßte folgende Stufen: 1. Kuppeln von Sepharose-4B an Ziegen-Antikaninchenserum 2. Packen einer DCLC-Säule mit Sepharose-4B-Antikörper 3 ml Gel, von beiden Seiten geschlossen mit einem Filtersystem VYON (Handelsprodukt), etwa 40 μτη. 3. Waschen der gepackten Säule mit 6 ml Puffer 1. 4. Laden der Säule mit 0,5 ml N. R. S. (Normalkaninchenserum). 5. Inkubation bei 37 °C 2 h lang -14-

Claims (20)

1. AT 394 454 B
2. 6. Elution mit Puffer 1 und Sammeln der Fraktion, bis die optische Dichte am Photometer unter 0,1 beträgt.
3. 7. Elution mit Puffer 2 von pH 2,5 und Sammeln der Fraktionen, bis die optische Dichte unter 0,1 beträgt. Die grafische Auswertung der erhaltenen Ergebnisse dieser Affinitäts-Chromatographie ist in Figur 13 gezeigt PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Trennung einer oder mehrerer in Lösung befindlicher Verbindungen mit Hilfe einer dynamischen Säulen-Flüssigkeitschromatographie, dadurch gekennzeichnet, daß man ein sich bewegendes Feststoff-adsoibensbett mit einem Kolben, der an seinem Bodenteil mit einem Abdichtungselement und in seinem Inneren mit einem Längskanal, der ein zwischen zwei als Barrieren dienenden Sperreinrichtungen gehaltenes Adsorbens enthält, versehen ist, sowie ein an seinem Boden gegebenenfalls mit einem Mehrweghahn versehenes Testrohr, in das der Kolben bündig paßt, einsetzt, den Kolben in das Testrohr schiebt unter Einführung und Transport des gewünschten, zuvor durch den Hahn gedrückten oder von oben in das Testrohr eingefüllten Elutionsmittels durch den Kanal zur Fortbewegung der zu trennenden adsorbierten Verbindungen zwischen den Barrieren, und die erhaltene Lösung durch eine am Kopfteil des Kolbens befindliche Ausströmeinrichtung abzieht. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man bei geschlossener Stellung des Hahns die Flüssigkeit zur Fortbewegung der zu trennenden adsorbierten Verbindungen zwischen den Sperrplatten unter innerem Druck durch den Kanal führt
4. 3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein zusätzliches geeignetes Adsorbens, das von dem in der dynamischen Säulen-Flüssigkeitschromatographie verwendeten Adsorbens verschieden ist, zur Voikonzentrierung der eingebrachten Probe einsetzt.
5. 4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man ein am Boden geschlossenes Testrohr verwendet und das Elutionsmittel in das Testrohr einbringt bevor der Kolben nach unten in das Testrohr geschoben wird.
6. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Feststoffadsorbens in eine Hülse ein-führt, die im Längskanal des Kolbens angeordnet wird.
7. 6. Verwendung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 5 zur Silicagelchromatographie, Umkehrphasen-Flüs-sigkeitschromatographie, Affinitätschromatographie, Kapillarchromatographie, Chromato-Fokussierung, Gelfiltration oder Ionenaustauschchromatographie.
8. 7. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 5, gekennzeichnet durch - ein Testrohr (R), das an seinem Boden gegebenenfalls mit einem Mehrweghahn (LV) versehen ist, - einen Kolben (C), der in das Testrohr bündig einpaßt und an seinem Bodenteil ein Abdichtelement und in seinem Inneren einen Längskanal aufweist, der ein zwischen zwei als Barrieren dienenden Sperreinrichtungen <F1’F2) gehaltenes Adsorbens (P) enthält, und - eine Ausströmeinrichtung (D), die sich am Kopfende des Kolbens (C) befindet.
9. 8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausströmöffnung für das Elutionsmittel als vertikaler enger Kanal in direkter Fortsetzung der Säule ausgebildet ist.
10. 9. Vorrichtung nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Abdichtelement aus einem inerten Material besteht.
11. 10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Abdichtelement aus einem Kautschuk-O-Ring besteht, dessen Öffnungsinnenteil am Längskanal befestigt ist -15- AT 394 454 B
12. 11. Vorrichtung nach den Ansprüchen 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Säulenkolben in Form von zwei oder mehreren Untereinheiten ausgestaltet ist, von denen jede das gleiche oder ein unterschiedliches Adsorbens enthält
13. 12. Vorrichtung nach den Ansprüchen 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß ein Stopfen am Kopfende des Kolbens vorgesehen ist.
14. 13. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausströmöffnung mit einem Kanal in Verbindung steht, der sich durch den Stopfen erstreckt
15. 14. Vorrichtung nach den Ansprüchen 7 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß ein als Säule ausgebildeter Lösungsmittel-Vorratsbehälter mit der Säule für die dynamische Chromatographietechnik verbunden ist.
16. 15. Vorrichtung nach den Ansprüchen 7 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Testrohr an seinem Boden geschlossen ist
17. 16. Vorrichtung nach den Ansprüchen 7 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Kolben mit Einrichtungen zur Ausbildung einer Gastasche ausgestattet ist
18. 17. Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtungen zur Ausbildung einer Gastasche aus am Kolben befindlichen horizontalen, vertikalen oder spiralförmigen Vertiefungen bestehen.
19. 18. Vorrichtung nach den Ansprüchen 7 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem inerten Material hergestellt ist
20. 19. Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß das inerte Material aus Metall, Glas, Polyäthylen oder anderem entsprechenden Kunststoffmaterial besteht. Hiezu 13 Blatt Zeichnungen -16-