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Verfahren zur Empfindlichkeitserhöhung des Nachweises fluores-
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zierender Substanzen in einem Lösungsmittel, insbesondere in der mobilen
Phase eines Flüssigkeitschromatographen, und Vorrichtung zur Ausführung dieses Verfahrens
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Empfindlichkeitserhöhung des nachweises
fluoreszierender Substanzen in einem Lösungsrnittel, insbesondere in der mobilen
Phase am Ausgancr eines Flüssigkeitschromatographen. Ferner betrifft die Erfindung
ein nach diesem Verfahren arbeitendes Fluorcszenzspektrometer und einen rlüssigkeitschromatographen
mit einem auf dem Verfahren },eruhenden Fluoreszenzdetektor.
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Die Chromatographie ist bekanntlich eine Trenntechnik, bei der ein
gemisch verschiedener Bestandteile durch eine sog. Trennsäule geleitet wird, d.h.
durch ein System, das eine stationre Phase und eine mobile Phase enthält. Jeder
Bestandteil der in die TrennsOule eingegebenen Prohe verteilt sich als besondere
Zone innerhalb der mobilen Phase in dynamischem Gleichgewicht zwischen der stationären
und der mobilen Phase. Die mobile Phase bewirkt beim Durchflu! durch die Trennsäule,
daß jede einem Einzelhestandteil zukommende Zone mit einer charakteristischen (eschwindiakeit
wandert, durch die einzelnen Zonen nach einer gewissen Zeit getrennt werden.
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Es gibt verschiedene Typen der Chromatographie, z.P. rlüssigkeitschromatoqrarhie,
Gaschromatographie und Dilnnschichtchromatographie. Die Hauptmerkmale, wodurch sich
die einzelnen Typen voneinander unterscheiden, sind der physikalische Zustand der
mobilen Phase (casfOrmig oder fltlssiq) und die Art, in der die stationäre Phase
festqehalten wird (z.B. als Überzug auf inertem körnigen Material, in ein Pohr qefüllt
oder auf eine inerte Platte aufgebracht). In jedem Chromatographentyp ist jedoch
der Trennvorgang im wesentlichen der gleiche, nämlich die Verteilung der Probenbestandteile
zwischen der mobilen Phase und der stationären Phase innerhalb einer Trennsäule.
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Bei der Verwendung der Chromatographie für die chemische Analyse wird
im allqemeinen am Ende der Trenns.Rule ein Detektor angebracht, um den Austritt
der den einzelnen Komponenten zugeordneten Zonen aus der Trennsäule zu beobachten.
Das Detektorsignal kann in irgendeiner Weise, z.B. mit einem Tintenschreiber aufqezeichnet
werden und die Aufzeichnunq liefert dann qualitative und quantitative Informationen
huber die Zusammensetzung der Probe.
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In der Flüssiglreit schromatoqraphie können verschiedene Detektorarten
verwendet werden, z.B. Detektoren, welche die Absorption von ultravioletten oder
sichtbarem Licht messen, Detektoren für den Brechungsindex und Detektoren, deren
Grundrrinzin auf der AdsorptionswArme, der Flammenionisation, der elektrischen Leitfähigkeit
oder den Fluoreszenzeigenschaften der aus der Trennsäule austretenden Substanzen
beruhen. Die Anwendung des Fluoreszenznachweises in der Flüssigkeitschromatographie
war Lisher nur ganz beschränkt, weil für die meisten gewöhnlich verwendeten Lösungsmittel
die fluantenausbeute der Fluoreszenz für viele interessierende Verbindungen recht
gering ist.
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Zum Fluoreszenznachweis in der Flüssiqkeitschromatooraphie ist man
bisher im allaemeinen so vorveqanaen, dan die aus der Trennsäule austretende Flüssigkeit
durch eine Durchflußzelle geleitet wird, die aus einem glatten Kanal mit strahlungsdurchlässigen
Fenstern oder Enden besteht, welche den Durchgang einer einfallenden elektromacnnetischen
C'trahlung mit einer vortestimmten Wellenlänge in die strömende Flüssigkeit gestatten.
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Die in der Flüssigkeit befindliche, nachzuweisende Probe wird durch
die einfallende Strahlung erregt und ermittiert dadurch eine Fluoreszenz, die mit
einer rhotometeranordnunq beobachtet werden kann.
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Die Nachweisempfindlichkeit für jede einzelne fluoreszierende Verbindung
hängt von der fluantenausbeute der Verbindung und von der Konzentration derselben
ab. Die Quantenausbeute wird von einer Anzahl Faktoren beeinflußt, insbesondere
von den Eigenschaften der mobilen Phase (Lösungsmittel), von der die fluoreszierende
Verbindung mitgeführt wird. Im allgemeinen bestimmen die Erfordernisse der chromatographischen
Trennung den Typ des verwendeten Lösungsmittels. Ftir viele fluoreszierende Verbindungen,
die in unpolaren Lösungsmitteln mitgeführt werden, wie in der normalen Phasenchromatographie
allgemein üblich, ist die Quantenausbeute erheblich geringer als für die gleichen
Verbindungen in reiner Forrn außerhalb solcher Lösungsmittel. So bewirkt in der
Chromatographie mit Fluoreszenznachweis im allgemeinen eine unpolare mobile flüssige
Phase die Anhebung der qerinqsten nachweisbaren Menge in der flüssigen Phase mitgeführter
Verbindungen. In manchen Fallen ist die Quantenausbeute der Fluoreszenz für interessirende
chemische Verbindungen so niedrin, daß diese Verbindungen bisher durch Fluoreszenzmethoden
überhaupt nicht nachgewiesen werden konnten.
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Andererseits ist es in der Flüssigkeitschroatoaraphie im allgemeinen
nicht vorteilhaft, ein Lösungsmittel zu verwenden,
das die Nachweisempfindlichkeit
erhöht, denn solche Lösungsmittel besitzen andere Eigenschaften, durch welche das
Auflösungsvermögen der den einzelnen Bestandteilen zuneordneten Zonen erheblich
verschlechtert wird.
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Der in Anspruch 1 gekennzeichneten Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde,
einen verbesserten Fluoreszenznachweis der in der mobilen Phase aus der TrennsSule
eines Flüssigkeitschromatographen austretenden Substanz zu ermöglichen.
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Durch die Erfindung wird die Quantenausbeute der Fluoreszenz für die
Bestandteile einer zu untersuchenden Probe erhöht und dadurch die Nachweisbarkeitsschwelle
kleiner Mengen dieser Bestandteile deutlich herabqesetzt.
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Die Erfindung läßt sich so ausgestalten, daß Verbreiterungseffekte
der Maxima auf ein Minimum t.eschränkt bleiben und so die Trennschärfe des Chromatographen
nicht wesentlich geändert wird.
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Erfindungsgemß wird das aus der Trennsäule des Chromatographen austretende
flüssige Gut durch eine Durchfluß-Detektorzeile geleitet, die mit einer die austretenden
Substanzen adsorhierenden stationAren Phase gcfüllt ist. Die Feststellung der dadurch
an der stationEren Phase adsorbierten Substanzen kann durch Messung der von diesen
adsorbierten Substanzen emittierten Fluoreszenz infolge Erregung durch eine in die
DurchfluRzelle einfallende Strahlung bewirkt werden. Auf diese Weise können fluoreszierende
Substanzen bei weit niedrigeren Konzentrationsschwellen entdeckt werden als bisher.
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Die Erfindung ist insbesondere in der normalen Phasenchromatographie
anwendbar, worin gewöhnlich unpolare Lösungsnittel verwendet werden. ;1it solchen
Lösungsmitteln zeigen viele fluoreszierende Verhindunqen Ouantenausbeuten, die deutlich
niedriger lieaen, als wenn solche Verbindungen auP.erhalb dieser Lösungsmittel bestrahlt
werden. Viele fluoreszierende Stoffe zeigen sogar, wenn sie im dynamischen Gleichgewicht
mit unpolaren Lösunqsmitteln stehen, so niedrige Quantenausbeuten, daß ihre durch
die Fluoreszenz feststellbaren Minimalkonzentrat ionen außerordentlich hoch liegen.
Für manche Verbindungen sind die Quantenausbeuten der Fluoreszenzen in Anwesenheit
unpolarer Lösungsmittel sogar so gering, daß praktisch interessierende Konzentrationen
nicht festgestellt werden können.
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Erfindungsgemäß wird eine Durchflußzelle der in der Fldssigkeitschromatoqraphie
üblichen Art mit einer stationären Phase gefüllt. Diese besteht z.B. aus Kieselsäureteilchen
mit einem mittleren Durchmesser von einigen Mikron, sehr kleinen Aluminiumoxidteilchen,
Teilchen mit gebundener Phase oder Ionenaustauscherharzen. Die stationär Phase adsorbiert
die aus der Trennsäule austretenden, durch die Zelle strXmenden Substanzen.
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Zur Erregung und Emission der Fluoreszenz ist die DurchfluB-zelle
vorzugsweise so ausoebildet, daß sie eine im wesentlichen rechtwinklige Konfiguration
besitzt, d.h. der erregende Strahl verläuft vorzuqsweise unter 90 ° relativ zur
der Richtung, unter welcher die emittierte Fluoreszenz beobachtet und gemessen wird.
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Einige Ausführungsbeispiele der Erfindung werden nachstehend anhand
der Zeichnung beschrieben. Hierin sind Fig. 1 eine schematische Schnittdarstellung
des Bereichs der Durchflußzelle eines Flüssigkeitschromatographen gemäß der Erfindung,
Fig.
2 ein ilschnitt einer abgeänderten Ausführungsform des in die Linie 2,3 - 2,3 eingeschlossenen
Teilen Fig. 1, Fig. 3 ein Teilschnitt einer weiteren abgeänderten Ausffthrungsform
des in die Linie 2,3 - 2,3 eingeschlossenen Teils in Fig. 1 und Fig. 4 ein Diagram,
worin Kurve I ein Chromatogramm darstellt, das unter Verwendung einer ungefüllten
Durchflußzelle bekannter Art erhalten wurde, während Kurve II ein Chromatogramm
darstellt, das unter sonst gleichen Bedingungen wie Kurve 1, jedoch unter Verwendung
einer erfindungsgemäß mit einem adsorbierenden Medium gefüllten Durchflußzelle erhalten
wurde.
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Fig. 1 zeigt einen schematischen Längsschnitt durch den Teil eines
Flüssigkeitschromatographen mit der Durchflußzelle.
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Die Durchflußzellenanordnung 10 enthält eine rohrförmige Durchflußzelle
12 aus Quarz, die in ein Gehäuse mit dem oberen Teil 26 und dem unteren Teil 28
eingesetzt ist. Die Quarzwände der Durchflußzelle 12 sind gegenüber einer schematisch
bei 14 anqedeuteten elektromagnetischcn Strahlung, die auf die Durchflußzelle 12
durch eine Offnung 29 in dem Gehäuse einfällt, verhältnismäßig durchlässig. Die
öffnung 29 ist vorzursweise als quer durch das Gehäuse der Durchflußzelle verlaufendes
Loch ausgebildet, wobei der obere Gehäuseteil 26 oberhalb und der untere Gehäuseteil
28 unterhalb der Loches lienen. Die verwendete Nachweismethode beruht auf der Messung
der Fluoreszenzemisionen von chemischen Substanzen, die in der mobilen Phase vorhanden
sind, welche die Durchflußzelle 12 passiert. Zu diesem Zweck kann ein Fluoreszenzdetektor
bekannter Art Verwendung finden.
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Typischerweise liegt die Wellenlänge der einfallenden Strahlung 1
oacr im ultravioletten sichtbaren Bereich und die Strahlung wird von eier Lichtquelle
üher ein passendes Filter durch eine Wand der Zelle 12 in das Tnnere derselben geleitet,
woraufhin sie durch die gegenüberliegende Wand der Zelle 12 wieder austritt. Die
hierdurch hervorgerufene Fluoreszenz einer fluoreszierenden Testsubstanz in der
Durchflußzelle 12 wird vorzugsweise durch ein nicht dargestelltes Loch beobachtet,
das gegen die einfallende erregende Strahlung um 90 ° versetzt ist.
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Durch Beobachtung der Fluoreszenzstrahlung unter einem zur Einfallsrichtunq
der erregenden Strahlung senkrechten Winkel ist eine störung des Fluorimeterdetektors
durch qestreute Errezerstrahlunq am wenigsten wahrscheinlich. Deswegen kann bei
dem dargestellten Ausführungsbeispiel die Fluoreszenzbeobachtung am vorteilhaftesten
in einer zur Parieretene der Fig. 1 senkrechten Richtung durchgefihrt werden. Die
Messung an sich läßt sich in irsenEiner bekannten Weise durchführen, z.B. mittels
eines Photomultipliers und der zugehörigen Elektronik bekannter Art.
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Die Durchflußzelle 12 aus quarz wird dadurch im Gehäuse festgehalten,
daß zwei Endkappen 16 und 18 aus PTFE um die Enden der Zelle 12 befestigt sind.
Durch die Endkappen 16 und 18 laufen mittlere verengte Kanäle 20 und 22, die mit
dem zentralen Innenvolumen 24 der Durchflußzelle 12 kommunizieren. nie Endkappen
16 und 18 sitzen in Mittelbohrungen des oberen und unteren Teils 2C und 28 der Gehäuseanordnung.
Die Yupplunqsstücke 30 und 32, die mit Gewinde in die nach außen weisenden Enden
des oberen und unteren Gehëuseteils 26 und 28 einqesetzt sind, dienen zur Kupplung
der Zellenanordnung 10 mit der Flüssigkeitsleitung des Chromatographen. Eine Einlaßleitung
38 von der Trennsäule endet in der Kupplung 30 am Einlaßende der Anordnung 10, während
eine Auslaßleitung 48 für das austretende Gut am Auslaßende der Anordnung 10 in
der Kupplung 32 endet. Die Auslaßleitung 48 kann zu einem Atfallsammler oder
zu
anderen, in Reihe mit dem Fluoreszenzdetektor angeordneten Detektoren weitergehen.
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Für bestimmte Anwendungen mag es vorteilhaft sein, das Zellengehäuse
aus zwei getrennten Teilen zusammenzusetzen, die dem oberen und unteren Gehduseteil
26 und 28 in Fia. 1 entsprechen.
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In diesem Fall werden die beiden Teile z.B. mit Schrauben zusammengehalten,
um die Durchflußzelle 12 in gleicher Weise, wie bei Fig. 1 beschrieben, in der richtigen
Beziehung zu einer Strahlungsquelle und zu einem Fluoreszendetektor zu halten.
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In der Ausführungsform nach Fig. 1 legt sich die Einlaßkupplung 30
gegen die Endkappe 16. Ein Kanal 40 verrinqerten Querschnitts in dem Kupplungsstück
30 stellt die Flüssigkeitsverbindung von der Finlaßleitung 38 über den engen Kanal
20 in der Endkappe 16 zum Inneren der Durchflußzelle 12 her.
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Die PTFE-Kappe 16 wird zwischen dem Kupplungsstück 30 und dem oberen
Ende der Quarzzelle 12 zusammengeprcßt, um eine Hochdruckabdichtung zu liefern.
Ebenso wird die PTFE-Kappe 18 zusammengepreßt, um eine llochdruckdichtung zwischen
dem Kupplungsstück 32 und dem unteren Fnde der DurchfluPzelle 12 zu erzielen.
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Das Kupplungsglied 32 an der Austrittsseite ist so ausgebildet, daß
es einen ringförmigen Pand besitzt, der in berührung mit der Endkappe 18 aus PTFE
steht. Die Ausnehmung innerhalb dieses Pandes dient zur Aufnahme eines porbsen Metallstopfens
36.
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Die Flüssigkeitsverbindung vom Inneren der Durchflußzelle 12 nach
außen geht durch den verengten Strömungskanal 22 in der Endkappe 18, dann durch
die Poren in dem Stopfen 36 zu dem verengten Strömungskanal 42 in dem Xupplungsstück
32 und schließlich zu der Auslaßleitung 48. Der Stopfen 36 besteht
z.B.
aus einer gesinterten Stahlfritte mit einem Teilchendurchmesser von 0,5 Mikron.
Der Stopfen 36 dient dazu, das Volumen der Durchflußzelle, nämlich das Volumen 24
ihres Innenraumes und dasjenige des Kanals 22 in der Endkappe 18, aDzuschließen.
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Der Stopfen 36 eröffnet eine bequeme Methode zur Füllung des Innenraumes
24 der DurchfluP zelle 12 mit einem gekörnten Material 46, das die festzustellenden
und/oder zu messenden Komnonenten der Probe in der mobilen Phase adsorbiert. Die
Poren in dem Stopfen 36 lassen die Flüssinkeit der mobilen Phase in den Strömungskanal
42 abfließen, sind aber klein genug, um zu verhindern, daß das Füllmaterial 46 aus
dem Innenraum 24 der Zelle 12 austritt. Die Zelle 12 kann mit Teilchen aus Kieselsäure
oder dgl. gefüllt werden, indem eine Aufschlämmung dieser Teilchen in den Einlaß
38 der Zelle injiziert wird. Der poröse Stopfen 36 am Auslaß der Zelle gestattet
dem Lösunasmittel den Abfluß aus der Zelle 12, hält aber die Kieselsäureteilchen
zurück. Dieses Verfahren zum Füllen der Durchflußzelle 12 ist dasselbe wie das gewöhnlich
zur Füllung von Trennsäulen verwendete Verfahren.
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Für viele Anwendungen ist es vorteilhaft, nicht nur den Innenraum
24 der Durchflußzelle 12, sondern auch den Kanal 20 in der Endkappe 16 und den Kanal
40 in dem Kupplungsstück 30 mit dem adsorbierenden Flaterial 46 zu füllen, um den
Totraum in der Str(imungsbahn der mobilen Phase möglichst klein zu halten.
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nic Abflachung der Peaks bei der Trennung der verschiedenen Komponenten
kann dadurch weitgehend vermeiden werden, daß der Totraum in der Strömungsbahn zwischen
der Trennsbule und der Durchflußzelle so klein wie möglich gemacht wird. Am günstigsten
ist es, wenn die Durchflußzelle nur eine Verlängerung der Trennsäule darstellt,
weil dann die Trennschörfe
am besten und die Peaks am schärfsten
werden. Kleinere ReakflAchen bedeuten höhere probenkonzentrationen, so daR die kleinste
festzustellende Menge der Probensubstanzen verringert werden kann.
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Fig. 2 zeigt eine andere Ausfilhrunosform der Durchflußzellenanordnung.
In diesem Falle ist ein poröser Metall stopfen 34 in eine Ausnehmung des Einlaßkupplungsgliedes
30' eingepaßt.
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Dieser Stopfen 34 kann in Große und Zusammensetzung identisch mit
dem Stopfen 36 sein. Die Füllung der Durchflußzelle nach dieser Ausführungsform
mit dem adsorbierenden Material 46 kann in gleicher Weise wie vorher erfolgen, wobei
ein Xupplungsstück verwendet wird, in das kein Filterstgfen 34 34 eingesetzt ist.
Nach dem Füllvorgang wird das Kupplungsglied 30' mit eingesetztem Filterstopfen
34 gegen das vorher zum Füllen verwendete Kupplungsstück ausgetauscht. Bei Verwendung
einessolchen Stopfens an beiden Enden der Durchflußzelle 12 können die Einlaßleitung
38 und die Auslaßleitung 48 ausgewechselt werden ohne daß die Gefahr besteht, das
Füllmaterial 46 aus der Durchflußzelle 12 auszutreiben.
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In einer weiteren Abänderung gemäß Fig. 3 sind der rornse Stopfen
36 am Auslaßende und/oder der porMse Stopfen 34 am Einlaßende der Durchflußzelle
12 durch dnne Filterscheiben ersetzt (illustriert durch die Filterscheibe 35 am
Einlaßende), die in die Endkappen aus PTFE an den Grenzflächen zwischen den Endkappen
und den entsprechenden Kupplungsstücken eingepreßt sind. Die Einlaßleitung 38 und
die Auslaßleitung 48 sind vorzugsweise aus einem glatten; chemisch widerstandfähigen
Material wie Edelstahl hergestellt.
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Die Arbeitsweise der Trennsäule kann normale Flüssis-Fliissiq-Chromatographie
(LLC), Chromatonraphie mit gebundener Phase (BPC) oder Flüssig-Fest-Chromatographie
(LSC) sein. In jedem dieser Typen werden üblicherweise eine unrolare mobile Phase
und eine Polare stationäre Phase verwendet. Demgemäß ist auch hier die aus der Trennsäule
durch die Einlaßleitung 38 herkommende flfissioe mobile Phase im wesentlichen unnolar.
Als stationäre Phase kommen Wasser, Clvlvole, Peta, nctaoxydipror-ionitril und ähnliche
polare Flüssigkeiten, sowie verschiedene Stoffe mit gebundener Phase bekannter Art
in Frage.
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Typische Komponenten der mobilen Phase sind unpolare Lösunqsmittel
wie Hexan, Heptan, Oltan, Isooktan, Penzol und Tetrahydrofuran (THF). Auch sogar
in der Flüssig-Fest-Chromatographie (LeC) kann eine unpolare mobile Phase Verwendung
finden.
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Wie erwähnt, ist die flüssige Zelle 12 mit dem feinkörnigen Material
46 gefüllt, das die festzustellenden Substanzen adsorbiert. Ein bevorzugtes Füllmaterial
Bestecht aus einem sehr feinkörninen Kieselgel bekannter Art, dessen durchschnittliche
Teilchengröße im Bereich 5 bis 10 µm liest. Fin für den gegenwärtigen Zweck besonders
geeignetes Material dieser Art wird unter dem Namen LiChrosorb SI 60 von der Firma
E. Merck vertrieben. Lin anderes zu diesem Zweck geeignetes Material besteht aus
sehr fein verteilten Aluminiumoxidteilchen, d.h.
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Aluminiumoxid, dessen mittlere Teilchengröße ebenfalls im Bereich
5 bis 10 µm liegt. Ein Material dieser Art wird von r. Merck unter der Pezeichnung
Alox T vertrieen.
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Teilchen mit chemisch gebundener Phase können ebenfalls zur Füllung
der Durchflußzelle 12 verwendet werden. Der Ausdruck gebundene Phase (bonded phase)
tezieht sich auf gekörnte Stoffe, die zur Füllung der Trennsäulen in der sog. Bondedphase
-Chromatographie
verwendet werden. Bonded-phase-Chromatographie (BPC) ist ein Verfahren, bei dem
ein stationäres Trägermaterial wie Kieselsäure eine chemische Reaktion eingeht,
so daß die stationär Phase, die aus einer Flüssigkeit oder einem Feststoff bestehen
kann, daran gefunden wird. Die gebundene stationäre Phasetritt daraufhin in dem
Chromatographievorgang mit der strömenden mobilen Phase in slechselwirkung. Eine
eingehende Erläuterung der zur Verfügung stehenden Stoffe gebundener Phase zur Verwendung
in BPC findet sich z.B. auf den Seiten 4-14 bis 4-16 des Nachschlagewrks Basic Liquid
Chromatoqraphie von Kina Hadden u.a., herausgegeben 1971 von Varian Associates.
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Die Kurven I und II in Fig. 4 sind Chromatoqramme, welche die enorme
Empfindlichkeitssteigerung zeigen, diemit dem hier beschriebenen Verfahren erzielt
werden können. Für beide Kurven geben die Ordinateneinheiten eine proportionale
Anzeige der Intensitct der von den Probenkomponenten in der Durchflußzelle emittierten
Fluoreszenzsignale bei Erregung durch einfallende elektromagnetische Strahlung.
Der Maßstabfaktor für die Ordinaten ist aber, wie Fig. 4 zeigt für die Kurven I
und II völlig verschieden. Für Kurve I ist der Skalenbereich 5 Millivolt, für Kurve
II aher 200 Millivolt.
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Wenn also die Kurven I und II im gleichen Maßstab gezeichnet wären,
werden die Maxima (Peaks) der Kurve II vierzigmal so hoch erscheinen wie die Peaks
der Kurve 1. Die Abszisse gibt die Zeit in Minuten an, wobei für beide Kurven der
gleiche Maßstab gilt.
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Die untere Kurve (Kurve I) in Fig. 4 ist ein Chromatogramm, des die
Emrfindlichkeit eines Chromatographen mit einer Durchflußzelle nach Fig. 1 ohne
das Füllmaterial 46 darstellt.
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Obwohl einige Konstruktionsein:elheiten der in Fig. 1 dargestellen
Anordnung
von denjenigen bekannter Durchflußzellen abweichen, z.B. die Verwendung des porösen
Stropfens 36, unterscheidet sich doch die arundsätzliche Arbeitsweise mit leerer
Zelle nicht von derjenigen der bekannten Fluorimeter für Flüssigkeitschromatographen.
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Die in Kurve I illustrierten Daten wurden hei einer normalen Phasentrennung
gewonnen, hei der die Trennsäule eine stationäre Phase enthielt, die aus einer an
die Oberfläche von Kieselgelteilchen gebundenen Cyan-Funktionsgruppe bestand. Sie
wurde zur chromatographischen Trennung und fluorimetrischen Bestimmung gewisser
Aflatoxine verwendet, nämlich der Aflatoxine Dl, B2, C1 und G2. Aflatoxine sind
toxische Stoffwechselprodukte eines Schimmelpilzes, der unter gewissen Redinaungen
auf Pflanzen wie Erdnüssen und Getreide wachsen kann. Es werden zwei unpolare Lösungsmittel
A und B in isokratischem Betrieb verwendet. Im einzelnen war das Lösungsmittel A
Hexan und Lösungsmittel B war ein Gemisch von 10% Isopropylalkohol mit 1% Wasser
und 89% Tetrahydrofuran (THF). Das Verhältnis von Lösungsmittel P. zu Lösungmittel
P war 70 zu 30 volumprozent. Die Durchflußgeschwindigkeit der mobilen Phase war
1 Milliliter je Minute. Die Lichtquelle zur Erregung der Fluoreszenz hatte eine
Wellenlänge von 360 nm, (lie durch Verwendung entsprechender Farbfilter ausgefiltert
wurde; solche Filter werden von der Firma Corninq Glass Werks Inc. unter der Bezeichnung
C.S. 7-60 und C.S. 7-54 vertrieben. I)ie rluoreszenzsinnale wurden bei der Wellenl;nn,e
430 nra durch ein entsprechendes Interferenzfilter gemessen. Dci der leeren Zelle
war die Hintergrundablesung etwa 8 mV und das Grundgeräusch etwa 0,02 mV. Die Hintergrundablesung
wurde durch Nullpunktverschiebung üblicher Art kompensiert, damit die Detektorsignale
in einem Meßbereich von 5 mV dargestellt werden konnten.
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Kurve II ist ein Chromatogramm zur Illustration der Leistungsfähigkeit
eines Chromatographen mit einer gemäß Fig. 1 efüllten Durchflußzelle. Die Daten
der Kurve II wurden unter Verwendung der gleichen Anordnung und der aleichen Stoffe
wie in Kurve 1 gewonnen. Wie erwähnt, ist der Ordinatenmaßstab für Kurve II vierzigmal
größer als der Maßstab der Kürve I, d.h. der volle Skalenauschlag für Kurve II cntspricht
200 mV.
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Die durch das Füllmaterial der Strömungszelle verursachte starke Streuung
ist verantwortlich fL:r ein kräftiges Hintergrundsignal von 450 mV und einen Geräuschpegel
von 0,25 mV.
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Die Hintergrundstrahlung wurde wieder durch einfache twullpunktverschiebung
kompensiert, um die Darstellung der Detektorsignale in dem Skalenbereich 200 mV
zu ermöglichen.
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Beide Kurven I und II wurden für Mennen von 2,0 Nanogramm Aflotoxin
B1, 0,6 Nanogramm Aflatoxin B2, 2,0 Nanooramm Aflatoxin G1 und 0,6 Naogramm Aflatoxin
G2 aufgenommen.
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In Tabelle I sind die Werte für die jeweiligen Versuche gemäß Kurve
I und Kurve II verzeichnet. Die Sionalmaxima und die entsprechenden nachweisbaren
Crenzmenqen für die qcffillte Zelle sind mit denjenigen für die lecre Zelle bei
den verschiedenen Aflatoxinen verglichen. Dieser Vergleich zeigt, daB die hier beschriebene
gefüllte Zelle noch Mengen er Aflatoxine B1 und B2 anzeigt, die mehr als hundertmal
geringer als bei Verwendung einer leeren Zelle bekannter Art rind.
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rus den einander entsprechenden Peaks der Kurven I und II ergibt sich,
daß die Empfindlichkeit und Trennschärfe von Aflatoxin G1 und G2 für Kurve II vierfach
verbessert ist.
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Aus diesem Vergleich ist ersichtlich, daß das Füllmaterial 46 der
stationären Phase in der Durchflußzelle 12 einen Einfluß
auf die
Quantenausbeute hat, der dem Einfluß einer polaren mobilen Phase gleichkommt. Durch
Verwendung einer gefüllten Durchflußzelle kann also der Chromatograph optimal mit
den vorteilhaftesten Lösungsmitteln, die nicht stark polar sein müssen, gefahren
werden.
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TABELLE I sfla- Cefiillte Zelle Leere Zelle toxin Signal (mV) Grenzmenge
(pg) Signal (mV) Grenzmenge (pg) B1 138 8 - lOCO B2 84 4 - 1000 G1 88 11 1,9 42
C,2 62 5 0,9 26 Die Erfindung ist nicht auf die dargestellten und beschriebenen
Ausführungsformen beschränkt, sondern kann alle im Bereich des Fachmanns liegenden
Abänderungen und Ausgestaltungen erfahren.