NL8302726A

NL8302726A - Werkwijze en inrichting voor het chromatografisch scheiden van twee of meer verbindingen.

Info

Publication number: NL8302726A
Application number: NL8302726A
Authority: NL
Original assignee: Cais Michael; Shimoni Moshe; Technion Res & Dev Foundation
Priority date: 1982-08-15
Filing date: 1983-08-01
Publication date: 1984-03-01
Also published as: SE8304349D0; SE8304349L; DE3329288C2; IL66551A; IL66551A0; ZA835712B; ES8507354A1; JPS6035257A; BE897508A; GB2125312A; AU1795583A; IT1194356B; AU568462B2; CH662062A5; SE457606B; IT8322354A1; DE3329288A1; GB8321305D0; CA1214398A; HU196915B

Description

N.0. 31963

Werkwijze en inrichting voor het chromatografisch scheiden van twee of meer verbindingen

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een nieuwe chromatografische methode, hierna aangeduid als vloeistofchroma-tografie met dynamische kolom (D C L C) voor de scheiding van twee of meer componenten. Meer in het bijzonder heeft de uitvinding 5 betrekking op een nieuwe methode voor de scheiding van twee of meer verbindingen, die in een oplossing aanwezig zijn, onder toepassing van een chromatografisch systeem met bewegend bed.

Zoals bekend is chromatografie een uitdrukking, die een aantal fysische methoden beschrijft, die worden toegepast in de che-10 mie en de biologie voor het scheiden en identificeren van mengsels van verschillende verbindingen. Het principe achter alle chromatografie-varianten ligt in het herhaald onderwerpen van een mengsel van chemische verbindingen aan een extractie door vloeistof of adsorptie op een vast oppervlak. Het mengsel wordt fy-15 sisch over een stationaire fase (bed of kolom) bewogen, die een vaste stof of een vloeistof kan zijn, die geïmmobiliseerd is in de poriën van een vaste stof (geplaatst in het bed of de kolom).

De scheiding van chemische verbindingen door chromatografie kan gebruik maken van een of meer van de volgende fysisch-chemische 20 krachten, afhankelijk van het speciale chromatografische systeem: (a) verschillen in adsorptie aan het poieuze milieu, het zogenaamde sorptiemiddel.

(b) Verschillen tussen de relatieve oplosbaarheden van een vloeistof, die het inerte milieu bekleedt, (stationaire fase) en 23 de vloeistof, mobiele fase genoemd, die door de poreuze kolom sijpelt.

(c) Verschillen in ionenuitwisseling met het sorptiemiddel.

(d) Verschillen in moleculaire grootte naarmate de oplossing door een gel van zeer kleine afmeting sijpelt.

30 Chromatografie wordt ook preparatieve chromatografie genoemd, wanneer het gebruikt wordt voor de isolatie van een fractie uit een mengsel voor verdere toepassingen, zoals spectroscopie, identificatie, synthese voor onderzoek- of handelsdöeleinden.

Het oorspronkelijke werk over chromatografie is gebaseerd op 35 verschillen in adsorptie over een inert materiaal, dat in een kolom is gevuld. De scheiding van componenten, bekend als verdelings-AD ORIGIN/S£r0mat0^ra^e* ds *ebaSeerd de re-*-a‘*'^eve oplosbaarheden in het 8302726 2 .

oplosmiddel, dat over de kolom gaat. Ce bij deze chromatografie verkregen splitsing hangt af van de pH en de ionogene sterkte van het oplosmiddel - de mobiele fase - en de relatieve oplosbaarheden van de bestanddelen in de twee fasen; de verschillende mate-5 rialen kunnen met een geschikt oplosmiddel geëlueerd worden en de vloeibare fracties kunnen verzameld worden in een reeks buizen en vervolgens geanalyseerd worden volgens chemische of fysische methoden. Dunne-laag-chromatografie (DLC) en papierchromatografie, zijn gebaseerd op verschillen tussen de relatieve adsorptie van 10 een component op een inert milieu. Bij de DLC bestaat de stationaire fase uit een dunne laag van een fijnverdeelde stof, die op een vel of kunststof ruglaag of op een glasplaat is aangebracht. Tot gewoonlijk gebruikte sorptiemiddelen, die als gerede platen ‘in de handel verkrijgbaar zijn, behoren aluminiumoxide, silicagel 15 en cellulose. Bij de papierchromatografie kan de mobiele fase door capillaire werking opwaarts bewegen, de zogenaamde stijgende chromatografie, of door zwaartekracht neerwaarts bewegen, zogenaamde dalende chromatografie.

Ionenuitwisselingschromatografie houdt de scheiding in van 20 moleculen op basis van hun ionogene lading. Het sorptiemiddel of de stationaire fase bestaat uit polymeren met covalent gebonden ionen. Bij kationuitwisselingsharsen zijn de stevig gebonden ionen negatief geladen en worden met positieve ionen verenigd, die los gebonden zijn door elektrostatische ladingen. De uit een mengsel 25 af te scheiden positief geladen stoffen worden eerst aan het sorptiemiddel geadsorbeerd, waarbij de in de hars aanwezige kationen verplaatst wórden. De oplossing wordt gebufferd bij een pH, die de binding zal vergemakkelijken en wordt vervolgens met dezelfde buffer geëlueerd onder verwijdering van de niet bindende fracties 30 van de oplossing. Een anior-uitwisselaar werkt precies op dezelfde wijze, behalve dat de covalent gebonden ionen ervan positief geladen zijn om de anionen uit de oplossing aan te trekken.

De scheiding, die gebaseerd is op verschillen in moleculaire grootte, wordt ontmoet bij de gelfiltratie, ook bekend als mole-35 culaire zeefchromatografie. Deze methode scheidt moleculen volgens hun grootte, hoewel de vorm van het molecuul de filtratie enigermate beïnvloedt. De gelen zijn in de vorm van parels, die een netwerk van openingen van poriën bevatten, waarin kleine moleculen gevangen kunnen worden. De uitgebreide commerciële interesse in 40 chromatografie in het algemeen en de preparatieve vloeistofchroma- “oo"”"“liJ02 72 6 3 tografie in het bijzonder, blijkt uit het grote aantal publika-ties, dat verschillende kolomvullingen met microdeeltjes en vooraf gevulde kolommen suggereert, waarin beweerd wordt, dat een betere scheiding verkregen wordt dan met de bekende adsorptiemid-5 delen, die op dit gebied worden gebruikt.

De uitvinders hebben hun onderzoek geconcentreerd op het ontwikkelen van een nieuw concept voor chromatografie, waarbij bekende adsorptiemiddelen worden gebruikt, maar de scheiding zeer snel en gemakkelijker wordt uitgevoerd. Het nieuwe concenpt van 10 de chromatografie volgens de onderhavige uitvinding is het gebruik van een dynamische kolom, waarbij het bed met het adsorp-tiemiddel beweegt in tegenstelling tot de gebruikelijke chromato-grafietechniek, waarbij het adsorberende materiaal stationair is. Derhalve bestaat de uitvinding in een werkwijze voor een 15 nieuw type chromatografietechniek, hierna aangeduid als vloeistof chromatografie met dynamische kolom (DCLC) voor de scheiding van een of meer verbindingen, die in een oplossing aanwezig zijn, gekenmerkt door de aanwezigheid van een bewegend vast adsorptie-middelbed, dat een plunjer met aan de onderzijde ervan een afdich-20 tingselement en een langwerpig kanaal, dat een adsorptiemiddel vastgehouden tussen twee afsluitingen bevat en een proefbuis, die aan de onderzijde ervan een klep met meer openingen heeft, omvat, welke plunjer nauwsluitend in de proefbuis past, waarbij door de plunjer in de proefbuis te drukken het gewenste elueermiddel, dat 25 vooraf door de klep is geperst, door het kanaal binnentreedt, waarbij de geadsorbeerde te scheiden verbindingen tussen de afsluitingen bewogen worden en de verkregen oplossing door een mondstuk, dat aan één van de eindgedeelten van de plunjer is geplaatst, naar buiten treedt. Het algemene geval, dat vaker lijkt te worden 30 ontmoet, is het gebruik van een kolom of bed met vast adsorptiemiddel, als adsorptiemiddelzone, in welk geval de methode zeer gunstig zal concurreren met de gebruikelijke chromatografietech-nieken. De methode is zeer nauwkeurig en heeft de volgende hoofdvoordelen ten opzichte van de gebruikelijke chromatografie: 35 (a) In tegenstelling tot de zwaartekrachtstroom, die bestaat bij de gebruikelijke chromatografie, wordt bij de vloeistofchro-matografie met dynamische kolom enige eigen druk in het ad-sorptiemiddelbed uitgeoefend, hetgeen een betere scheiding van de bestanddelen geeft.

ifO (b) De methode is zeer snel, mede als gevolg van de intrinsieke BAD ORIGINAL gJQ2 72 6 if druk, die in het systeem wordt uitgeoefend.

(c) De methode vereist minder elueermiddel dan bij (¾ gebruikelijke chromatografie.

(d) De aanwezigheid van intrinsieke druk bij het chromatografi- 5 sche systeem met dynamische kolom maakt het mogelijk een adsorptiemiddel te gebruiken met een kleinere deeltjesgrootte dan bij de gebruikelijke chromatografie, hetgeen een grotere gevoeligheid mogelijk maakt.

De klep met meervoudige openingen is zeer belangrijk wanneer 10 verschillende opeenvolgende elueermiddelen in de proefbuis moeten worden ingevoerd en verder door het adsorptiemiddelbed worden geleid, waarbij de gewenste fractionering verkregen wordt.

Wanneer het adsorptiemiddelbed in hoofdzaak gebruikt wordt voor de voorbèhandeling van een monster of voor het verwijderen 15 van één verbinding, is de klepeis niet verplicht en kan een eenvoudige aan de onderzijde gesloten proefbuis, passend voor de plunjer gebruikt worden. In dit geval dient het elueermiddel in de proefbuis te worden gebracht, voordat de plunjer naar beneden wordt geduwd. Vanzelfsprekend lijkt het, zelfs wanneer geen frac-20 tionering vereist is, dat de proefbuis met een klep meer doelmatig kan worden gebruikt met betrekking tot het wassen van het adsorptiemiddel en de toevoer van het elueermiddel door het aanzuigen ervan door de klep.

Het afdichtingselement glijdt langs de binnenwanden van de 25 proefbuis en blijft tegelijkertijd in goed contact met de binnenwanden, waardoor een nauwsluitende passing van de plunjer in de proefbuis mogelijk wordt. Het afdichtingselement zal in het algemeen uit een 0-ring van rubber of eén ander geschikt materiaal met een openingsboring bestaan en is _ aangepast om langs de binnen-30 wanden van de proefbuis te glijden. Wanneer de inrichting uit glas zal zijn vervaardigd zal het polijstmiddel op de buitenwand van de plunjer dienovereenkomstig zijn vervaardigd, zodat het de 0-ring kan vervangen.

De gehele methode is zeer flexibel en kan bij een groot aan-35 tal toepassingen met verschillende uitvoeringsvormen worden toegepast en zal daarom door het concq>t van de onderhavige uitvinding omvat worden. Een probleem, dat bij alle soorten chromatografie bestaat, is een gelijkmatig aanbrengen van het monster op het oppervlak van het bed. Wanneer het monster direkt door zwaarte-ifO krachtstroming wordt aangebracht, kan een gelijkmatig aanbrengen

BAD ORIGINAL

8302726 5 relatief moeilijk zijn* aangezien het bed de neiging heeft op te wervelen wanneer het monster wordt toegevoegd. Om deze reden is het bijzonder belangrijk om het oppervlak te beschermen bijvoorbeeld met een stuk .rayon filtreer papier. Een fabrikant van kolom-5 men (Pharmacia Fine Chemicals AB) voorziet enkele van de kolommen van een speciale inrichting* monsteraanbrenginrichting genoemd* die dient om het bedoppervlak te beschermen. In déze inrichting wordt een dun nylonweefsel aan het einde van een kort stuk perspex buis* die binnen de chromatografische buis past, gemonteerd. Een 10 dergelijke inrichting verhoogt vanzelfsprekend de kosten van de apparatuur naast het nadeel* dat de aanwezigheid ervan druk uitoefent op de stroom van het monster* waardoor de doorsijpeling door de kolom vertraagd wordt. Bij de meeste chromatografiesyste-men* waarbij de onderhavige uitvinding wordt toegepast, is het 15 probleem van het gelijkmatig aanbrengen veel verminderd. Bij de dynamische stroming* die in het chromatografische bed bestaat zal* wanneer Je/3opwaarts na het duwen van de plunjer in de proefbuis gedwongen wordt* geen wervelneiging tengevolge van de toevoeging van het monster bestaan. Bovendien zal de druk, die in het systeem 20 wordt uitgeoefend door de plunjer in de proefbuis te duwen, de stroming van het monster versnellen. Een andere benadering om bij te dragen bij het gelijkmatig aanbrengen van het monster is om boven het bed een ander geschikt adsorptiemiddel, dat van het reeds in het bed aanwezige adsorptiemiddel verschilt, op te nemen 25 met de rol het monster vooraf te concentreren en derhalve bij te dragen om een nauwe scheidingswand te krijgen. Een gebruikelijk voorbeeld van een dergelijk geschikt adsorptiemiddel is onzuiver siliciumdioxide, dat van het actieve siliciumdioxide met de hoge adsorptiemiddeleigenschappen verschilt.

30 De deeltjesgrootte en de deeltjesgrootteverdeling dient bij de meeste gebruikelijke chromatografiebehandelingen zorgvuldig geregeld te worden. Zoals bekend geeft een bed, dat uit kleine deeltjes bestaat, in het algemeen een goede scheiding. De reden is, dat de mechanismen, die aanleiding geven tot verbreding van 35 de zone worden versterkt naarmate de deeltjesgrootte toeneemt.

Met grotere deeltjes duurt diffusie in en uit de deeltjes langer. Het stromingsbeeld in een bed van grote deeltjes is slechter en geeft aanleiding tot meer opnieuw mengen. Anderzijds is de bestand-heid tegen stroming in een bed, dat met grote deeltjes is gevuld, 40 lager en de maximum stromingssnelheid, die bereikt kan worden, is bador,g,nal8302 72 6 6 hoger. Derhalve dient bij de gebruikelijke chromatografiebewer-kingen een compromis met betrekking tot de deeltjesgrootte bereikt te worden onder vorming van een maximum zonescheiding onder de vereiste stromingsomstandigheden. Bij de nieuwe DCLC-methode 5 volgens de onderhavige uitvinding kan een kleine deeltjesgrootte van het adsorptiemiddel worden gebruikt zonder het nadeel, dat bij de bekende methoden wordt ontmoet, te verkrijgen, waar, bjj de kleine eigen druk, die in het systeem wordt uitgeoefend, de stromingsweerstand voortgebracht door de kleine deeltjesgrootte 10 van de deeltjes wordt overwonnen. Derhalve kan deze methode zelfs gebruikt worden voor kritische fractioneringsdoeleinden, wanneer het gebruik van een materiaal van fijnere kwaliteit verplichtend zal zijn om de gewenste scheiding te verkrijgen.

In een van de oudere octrooiaanvragen van de uitvinders 15 (Duits Offenlegungsschrift 3»126.926) werd een nieuwe methode voor massa-transport en scheiding door selectieve afsluitingen beschreven onder toepassing van een inrichting met soortgelijke componenten als bij de onderhavige uitvinding. Zoals daarin vermeld bestaat de inrichting uit een menger-scheider, die een mem-20 braan en een mengreservoir bevat, waarin de menger-scheider wordt geduwd. Bij de menger-scheider zijn middelen aanwezig voor het accumuleren van een luchtzak om de op het membraan uitgeoefende druk te verlagen. Tijdens het bedrijf van de menger-scheider wordt een bepaalde hoeveelheid lucht in de luchtzak gevangen, die na 25 samendrukken fungeert als een kussen of schokabsorptie-inrichting om een deel van de druk op te nemen, die ontstaat uit de weerstand van het membraan voor de vloeistofstroom. Voor de dynamische kolom voor vloeistofchromatografie volgens de onderhavige uitvinding kan de luchtzakeis minder verplichtend beschouwd worden dan bij 30 het voorafgaande geval. Echter lijkt voor bepaalde systemen, waarbij relatief hoge drukken betrokken zijn, de luchtzak een belangrijke rol te hebben, waarbij de gevangen hoeveelheid lucht eventuele vloeistof, die opgekropen kan zijn in de ruimte tussen de binnenwanden van de proefbuis en de buitenwanden van het eind-35 gedeelte van de plunjer, in de proefbuis vordt.teaniggedraqg^ru De hoeveelheid lucht, die door dit middel . op de plunjer gevangen is, zal van vele factoren afhangen, zoals het type afsluiting, bestanddelen van de te scheiden mengsels en de bijzondere omstandigheden, die in het specifieke chromatografische systeem worden uitgeoefend. 40 Een bijzonder voordeel om een dergelijke luchtzak te gebruiken is BAD ORIGINAlg 3 Q 2 7 2 6 7 het geval» wanneer een volledig vermijden van het elueermiddel met een O-ring, aangebracht aan de onderzijde van de plunjer met de rol van afdichtingselement» vereist zal zijn·

De methode volgens de onderhavige uitvinding kan met succes 5 in de verschillende gebieden van de chromatografie worden gebruikt: silicagelchromatografie, vloeistofchromatografie met omgekeerde fase» capillaire chromatografie, affiniteitschromatografie, chroraa-tofocusseren, chromatografie onder uitsluiting van bepaalde afmetingen (ook bekend onder de naam gelfiltratie) en ionenuitwisse-10 lingschromatografie·

Silicagelchromatografie is een van de meest gebruikelijke chromatografiemethoden. Silicagel, dat een van de best bekende adsorptiemiddelen is, is relatief goedkoop in vergelijking met andere materialen. De scheidingsresultaten, die met silicagel bij 15 de methode volgens de onderhavige uitvinding wordt verkregen, zijn in hoofdzaak dezelfde *of beter met betrekking tot de nauwkeurigheid van scheiding en verkregen opbrengsten ten opzichte van die verkregen met de gebruikelijke technieken, maar is meer doelmatig door sneller te zijn en derhalve minder oplosmiddel te vereisen.

20 De methode is bovendien bijzonder voordelig, doordat de kolom opnieuw gebruikt kan worden. Voorts kunnen silicageldeeltjes met een kleinere grootte en een dichtere vulling gebruikt worden met de resulterende voordelen van een betere scheiding.

Vloeistofchromatografie met omgekeerde fase wordt gekenmerkt 25 door het feit, dat de stationaire fase ervan minder polair is dan de bewegelijke fase. Het voornaamste nadeel met silicagel is dat slechts een partiële winning vein de verbindingen, die door een dergelijk bed gaan, verkregen 'kan . worden. Met het oog op de voordelen van de DCLC volgens de onderhavige uitvinding, kan de 30 vloeistofchromatografie met omgekeerde fase ook met succes gebruikt worden bij de preperatieve chromatografie. Onlangs heeft de capillaire chromatografie meer belangstelling gekregen, in het bijzonder met het oog op de ontwikkeling in microkolommen voor vloeistofchromatografie met hoge prestaties. De reden voor deze 35 ontwikkelingen ligt in de volgende voordelen van dit type chromatografie: (a) de potentiële prestatie van betere scheidingsdoelmatigheid voor complexe mengsels en moeilijk te scheiden opgeloste stoffen.

40 (b) Een aanzienlijke afname in elueermiddelverbruik.

BAD ORIGINAL _ _ Λ _ _ Λ .

8302726 Λ 8

De DCLC-methode volgens de onderhavige uitvinding kan gemakkelijk worden toegepast voor capillaire chromatografie, door een nauw kanaal in de hiervoor beschreven plunjer te verschaffen.

Gelfiltratie, ook bekend als chromatografie onder uitsluiting 5 van een bepaalde grootte, verkrijgt meer en meer belangstelling bij de zuivering van biologische stoffen onder toepassing van een geschikt adsorptiemiddel als scheidingsmiddel. Goede resultaten werden verkregen bij de scheiding van gemerkt jood-hCG uit gemerkt jood ohder toepassing van een Sephadex G-type (bereid door 10 Pharmacia Fine Chemicals, Zweden) adsorptiemiddel, onder toepassing van de dynamische chromatografie volgens de onderhavige uitvinding (zie voorbeeld III). Gelfiltratie-chromatografie wordt ook als een eenvoudige en snelle methode beschouwd voor het ontzouten of veranderen van een buffer. Het gelbed dient voorafgaande aan 15 het experiment in evenwicht gebracht te zijn met een oplossing met de ionogene samenstelling die gewenst is, bijvoorbeeld gedestilleerd water in het geval van ontzouten. De elutie wordt met dezelfde vloeistof uitgevoerd. Met het oog op de grote snelheden, die er bij betrokken kunnen zijn, kan de gehele behandeling in een 20 korte tijdsperiode worden uitgevoerd, waarbij het ontzoute produkt in enkele minuten wordt verzameld. Andere gebieden voor gelfiltra-tie-chromatografie, die overwogen kunnen worden met de dynamische chromatografie, zullen de voorbehandeling vóór HPLC en concentratie van verdunde monsters na scheiding zijn.

25 Chromato-focusseren wordt grotendeels gebruikt voor de schei ding van proteïnen volgens de isoelektrische punten ervan. Aangezien chromato-focusseren uiterst nauwe banden gescheiden materiaal voortbrengt en in het algemeen lange nauwe kolommen vereist, lijkt het, dat de vloeistofchromatografie met dynamische kolom ideaal 30 zal zijn voor dit type chromatografie, wanneer een smalle plunjer voor de hiervoor beschreven inrichting verschaft wordt.

De DCLC is eveneens geschikt voor ionenuitwisselingschroma-tografie, die als een van de meest populaire scheidingstechnieken goed bekend is. Verschillende experimenten werden uitgevoerd voor 35 de scheiding van kopersulfaat en natriumbichromaat op Dowex 50 \VX 8 als adsorptiemiddel. (Zie voorbeeld II). Gevonden werd, dat aanzienlijke voordelen met betrekking tot tijd, oplosmiddelvolume en doelmatigheid bereikt kunnen worden door toepassing van DCLC.

Een ander voordeel van de DCLC volgens de onderhavige uitvin-40 ding is een aanzienlijke afname van het dode volume. Zoals bekend BAD ORIGINAL

8302726 9 wordt het dode volume gedefini’êerd als het volume vloeistof in de tussenruimte tussen de korrels van het adsorptiemiddel in het bed. Bij de meeste van de gebruikelijke chroraatografie-behande» lingen vormt het dode volume een probleem, dat de vaststelling van 5 een nauwkeurig resultaat beïnvloedt. Bij de DCLC wordt, omdat een dichte vulling mogelijk is, de evenwichtsverdeling Van de stof tussen het adsorptiemiddel en de vloeistof zeer snel ingesteld met zeer weinig dood volume. Dientengevolge zal het mogelijk zijn scherpe en nauwe zones te verkrijgen. Dit is zeer belangrijk bij 10 fractioneringsexperimenten, waarbij het verschil in elutievolume tussen de stoffen in het algemeen klein is. In het bijzonder voor gelfiltratie zullen grote dode volumina de verkregen scheiding nadelig beïnvloeden.

Volgens een andere uitvoeringsvorm is het adsorptiemiddel in 15 een patroon aanwezig, die in het langwerpige kanaal van de plunjer is opgenomen. Op deze wijze zal de chromatografie-inrichting voor vele doeleinden voor gebruik gereed zijn alleen door de patroon door een patroon te vervangen, dat het geschikte adsorptiemiddel bevat* Figuur 5 van de tekeningen licht deze uitvoeringsvorm toe. 20 De methode is zeer eenvoudig en de veelzijdigheid ervan kan onder de vele voordelen vermeld worden. Br zijn vele uitvoeringsvormen, die voor de inrichting overwogen kunnen worden, onder toepassing van de methode volgens de onderhavige uitvinding. Enkele van deze uitvoeringsvormen zijn hierna voorgesteld in de bijgevoegde figu-25 ren 1 tot 9, waarbij het duidelijk zal zijn, dat deze slechts gegeven zijn voor een beter begrip van de uitvinding zonder deze daartoe te beperken.

In figuur 1 is de proefbuis (R) voorzien van een slot volgens Luer (L) waaraan een driewegklep (LV) is bevestigd. Het gewenste 50 elueermiddel (E) wordt in de proefbuis (R) gebracht. De plunjer (C) heeft een langwerpig kanaal, waarin het adsorptiemiddel (P) is aangebracht en wordt vastgehouden door de twee membranen (F^ , aan de "bovenzijde en de onderzijde van de plunjer. Boven het bovenste membraan (F^) is een stop (S) aanwezig, die voorzien 35 is van een mondstuk (D), waardoor de afgescheiden fractie uit het adsorptiemiddelbed wordt verzameld. Bij het onderste deel van de plunjer is een 0-ring (0), die de rol heeft van afdichting, die is aangepast om langs de binnenwanden van de proefbuis (R) te glijden.

40 In figuur 2 bestaat geen klep bij de onderzijde van de proef- bad original 8302726 * 10 buis (R), waarbij een beperkte hoeveelheid van het gekozen elueer-middel (E) vanaf het begin in de proefbuis (R) wordt ingevoerd.

De plunjer (C) bevat het langwerpige kanaal, waarin het adsorptie-middel (P) is aangebracht en wordt vastgehouden door de twee mem-5 branen (F^, F2)· Boven het bovenste membraan (F^) is een stop (S). Het mondstuk (D), waardoor de afgescheiden fractie uit het adsorp-tiemiddelbed wordt verzameld, is verbonden met de plunjer (C). Bij het onderste deel is de 0-ring (0) als afdichtingselement. Deze inrichting kan gebruikt worden wanneer geen fractionering vereist 10 is, waarbij de handeling uit slechts één cyclus met een enkelvoudig elueermiddel bestaat.

In figuur 3 is de proefbuis (R) exact zoals in figuur 2, zonder een klep bij de onderzijde ervan. De plunjer (C) bevat het langwerpige kanaal, waarin het adsorptiemiddel (P) aanwezig is, 15 dat door de twee membranen (F1, Fg) op zijn plaats wordt gehouden. Boven het bovenste membraan (F2) is een stop (S), die van een mondstuk (D) is voorzien, waardoor de afgescheiden fractie uit het adsorptiemiddelbed wordt verzameld. Onder aan de plunjer is de 0-ring (0) als afdichtingselement.

20 In figuur k wordt de meest eenvoudige vorm van de inrichting voorgesteld, ook zonder een klep aan' de onderzijde van de proefbuis en een stop aan de bovenzijde van de plunjer. Een beperkte hoeveelheid van het gekozen elueermiddel (E) wordt vanaf het begin in de proefbuis (R) gevoerd. De plunjer (C) heeft een lang-23 werpig kanaal, waarin het adsorptiemiddel (P) aanwezig is, dat op zijn plaats wordt gehouden tussen de twee afsluitingen - membranen of filters - (F^, F2). De 0-ring (0) is aan het onderste deel van de plunjer aanwezig en heeft de rol van afdichting en is aangepast om langs de binnenwanden van deproefbuis (R) te glijden. Verbonden 30 met het kanaal met het adsorptiemiddel (P) is een mondstuk (D), waardoor de afgescheiden fractie wordt verzameld.

In figuur 5 is de methode voorgesteld, waarbij een patroon (CA), die het gewenste adsorptiemiddel (P) bevat, in het langwerpige kanaal (I) van de plunjer (C) is gebracht. De verzameling van 35 het elueermiddel kan door een mondstuk, zoals in de voorafgaande figuren beschreven, worden uitgevoerd. De 0-ring afdichting (0) is aanwezig bij het onderste deel van de plunjer (C). De wijze van uitvoering is zeer eenvoudig, zoals hierna beschreven zal worden in verband met figuur 1. De plunjer (C) wordt in de proefbuis (R), ifO die met het gekozen elueermiddel (E) is gevuld, geduwd. Dit zal BAD ORIGINAL _ 8302726 11 het elueermiddel door het onderste membraan (F^)» vervolgens door het adsorptiemiddel (P) aanwezigin het langwerpige kanaal van de plunjer (C) dwingen en tenslotte door het mondstuk (D) (in figuur k) doen druppelen. Wanneer het gevuld is met een ge-5 schikt dragermateriaal (P) zal het als een chromatografiekolom fungeren. Opnieuw vullen van de proefbuis (R) wordt uitgevoerd door eenvoudig de afvoer van de proefbuis te ontsluiten en meer elueermiddel door de klep (LV) (in figuur 1) te dwingen.

In figuur 6 is een uitvoeringsvorm van de dynamische kolom 10 voorgesteld, waarin de kolomplunjer (C) opwaarts in de proefbuis (R) beweegt en de afvoer van het elueermiddel is door een vertikaal nauw kanaal (X) in direkte voortzetting van het chromatogra-fische dragermateriaal van de kolom. Figuur 7 is een modificatie van de dynamische kolom van figuur 6, waarbij een oplosmiddel-15 reservoir van de kolom (Y) verbonden is met de dynamische kolom.

Figuur 8 licht een uitvoeringsvorm toe, die de plunjer (C) van de dynamische kolommen, bestaande uit twee of meer subeenheden, laat zien, waarvan elk dezelfde of verschillende adsorptiemiddelen (P) bevat met de mogelijkheid het elueermiddel, dat van elke sub-20 eenheid afkomt, te verzamelen.

Figuur 9 licht een andere uitvoeringsvorm toe, die de veelzijdigheid van de DCLC laat zien, waarbij het gebruik verder kan worden uitgebreid; volgens deze uitvoeringsvorm wordt het uittre-dende elueermiddel overgebracht naar een andere kolom, die het-25 zelfde of een ander adsorptiemiddel (P) bevat.

De figuren 10 tot 12 stellen in grafische vorm de resultaten voor van de scheiding van verschillende mengsels, zoals beschreven in voorbeelden IV, V en VI. Figuur 13 stelt een schematische grafiek voor voor de affiniteitschromatografie van een IgG isolering 30 zoals beschreven in voorbeeld IX.

In principe kan de dynamische chromatografie worden overwogen om ook gebruikt.· te worden in vloeistof-ionenuitwisselaars. Vloei-stof-ionenuitwisselaars worden gedefinieerd als vloeistof-vloei-stofextractiesystemen, die ten minste formeel werken door uitwis-35 seling van ionen bij het grensvlak tussen een water bevattende oplossing en een niet-mengbaar oplosmiddel met verwaarloosbare verdeling van het extractiemiddel naar de water bevattende fase. Vloeistof-anionuitwisselaars worden gebruikt bij extractiechroma-tografie met omgekeerde fase. Bij deze techniek wordt het drager-40 materiaal (silicagel, cellulosepoeder enz.), dat met vloeibare BAD ORIGINAL Q 3 fl 2 7 2 6 12 anionuitwisselaar is geïmpregneerd, als de stationaire fase gebruikt en een water bevattende oplossing van een zuur of een van de zouten ervan wordt als elueermiddel gebruikt (bewegelijke fase). Voor de onderhavige uitvinding dient het membraan zodanig gekozen 5 te worden, dat het alleen permeabel is voor het elueermiddel, maar niet voor de vloeibare ionenuitwisselaar, die in het langwerpige kanaal van de plunjer dient te blijven.

De bij de DCLC volgens de onderhavige uitvinding toe te passen inrichting kan uit elk inert materiaal, zoals glas, polyetheen 10 of elk ander geschikt kunststofmateriaal vervaardigd zijn zelfs metaal kan voor sommige speciale toepassingen overwogen worden. Voorbeeld I: Scheiding van een mengsel vanferroceen enfcrroceen- aldehyd_.

(a) Vulmethode 15 1,0 g silicagel (Merck, kiezelgel H, type 60) wordt in 3 ml van een ontgaste oplossing van dichloormethaan/hexaan 1:1 in de gesloten proefbuis gedispergeerd onder vorming van een suspensie. De plunjer, die van de stop en het bovenste membraan is voorzien, wordt in de proefbuis opgenomen tot een 20 stevig contact tussen de 0-ring en de proef is bereikt. De gehele eenheid wordt omgekeerd, vertikaal staande op de stop, en de lucht wordt door de uitlaat in de proefbuis verwijderd. De uitlaat van de proefbuis wordt vervolgens gesloten en de vulling wordt uitgevoerd door de proefbuis neerwaarts over 25 de stationaire plunjer met een stromingssnelheid van ongeveer 1 ml/min te bewegen. Wanneer het siliciumdioxidebed volledig is afgezet, wordt de uitlaat van deproefbuis ontsloten en wordt deproefbuis van de plunjer verwijderd. Het onderste membraan wordt aangebracht en de kolom is gereed voor het 30 aanbrengen van het monster.

(b) Aanbrengen van het monster

Een mengsel van fecmoeen en ferroceenaldehyd wordt in 0,2 -0,4 ml dichloormethaan opgelost en de oplossing wordt op het onderste membraan van de vertikaal staande kolom aangebracht. 35 De oplossing penetreert door het membraan en de'componenten worden op siliciumdioxide geadsorbeerd. Dit proces kan versneld worden door enig luchtdruk onder toepassing van de gesloten proefbuis aan te brengen.

(c) Elutie 40 De gevulde plunjer wordt in de proefbuis opgenomen, die 5 ml BAD ORIGINAL gjg^g 13 van het gekozen elueermiddel bevat. Lucht wordt tijdens het vullen van de kolom verwijderd en de elutie wordt uitgevoerd door het dalen van de plunjer in de gevulde proefbuis met een stromingssnelheid van ongeveer 1 ml/min.

TABEL A

I) Scheiding van een modelmengsel dat ferroceen (13 mg) en ferroceenaldehyd (19 mg) bevat

Fr. no. Elueermiddel- Elueer- Residu- Kenmerken volume middel gewicht 0 1 ml hexaan 0 blanco 1 1 ml hexaan 11»4 mg ferroceen 2 1 ml hexaan 0,79 ferroceen 3 1 ml hexaan 0,31 ferroceen k 1 ml diehloormethaan sporen blanco 5 1 ml ·· 1,79 aldehyd 6 1 ml " 13,36 aldehyd 7 1 ml n kf39 aldehyd 8 1 ml ” 1,69 aldehyd 9 1 ml ’» sporen blanco II) Scheiding van een modelmengsel dat ferroceen (25»3 mg) en ferroceenaldehyd (15t6 mg) bevat_

Fr. no. Elueermiddel- Elueer- Residu- Kenmerken volume middel_gewicht 0 1 ml hexaan 0,2 mg ferroceen 1 1 ml ” 19»0 mg ferroceen 2 1 ml " 1,7 mg ferroceen 3 1 ml M 0,3 mg ferroceen k 1 ml "0 blanco 5 1 ml dichloormethaan 0 blanco 6 1 ml ” 0,2 mg aldehyd 7 1 ml n 11,5 mg aldehyd 8 1 ml M 2,9 mg aldehyd 9 1 ml " 0,7 mg aldehyd 10 1 ml '* 0 blanco 5 Voorbeeld II: Scheiding van Na2Cr20^.2H20 van Cu S0^5H20 door ionenuitwisseling_

Het adsorptiemiddel bestond uit DOWEX 50 WX8 (afmeting 200 - IfOO mesh). Het adsorptiemiddel werd eerst gewassen en na ongeveer 30 minuten in gedestilleerd water te zijn bewaard, met 10 2 N zoutzuur aangezuurd. De zuurgraad werd vervolgens verwijderd BAD ORIGINAL 830 2 72 6 • Η door met gedestilleerd water te wassen en het neutrale adsorptie-middel werd in het kanaal van de plunjer gebracht. De twee membranen» die het adsorptiemiddelbed vasthielden, bestonden uit twee schijven poreus polyetheenfilter.

Het monster van de waterige oplossing bestond uit 359,3 mg rla2Cr2°7,^^2° en ^9,7 mg CuSO^.5^0 opgelost in 1 cra^ water. Het monster werd door het adsorptiemiddel geleid, waarbij de hoeveelheid monster, die voor de analyse werd genomen, 10Cyul was. De ionen werden uit de kolom gewassen en als volgt gescheiden: de anionen door gedestilleerd water; de kationen door een zure oplossing, bestaande uit 2 N zoutzuur.

De fracties werden in proefbuizen verzameld. Het einde van de 4 wasbehandeling werd bepaald volgens de kleur van de uittredende oplossing. De monsters werden verder kwantitatief geanalyseerd door de verschillende fracties bij 110°C te drogen en het droge residu te wegen. Een blanco proef voor het residu werd uitgevoerd, waarbij 100^,ul van het monster in een proefbuis werden gevoerd en bij 110°C werden gedroogd. Het residu van de vaste stof woog 68,5 mg.

De resultaten van de verschillende gedroogde gewogen fracties worden in de volgende tabel B gegeven. Bij experiment 2 werd de kolom na experiment 1 tot neutraal gewassen en geneutraliseerd.

TABEL B

Scheiding door ionenuitwisseling met de dynamische chromatografie_

Expt. Nr. van de Gebruikt Gewicht van Totaal Opmerking nr. fractie elueer- de gedroog- gewicht middel de fractie (mg) _:_;_{Ml_ I 1 h2o 43,0 2 » 0,2 3 " 0 43,2 4 HCK2N) · 0,5 5 " 15,2 6 " 27,5 7 " 3,2 8 " 1,3 47,7 * fractie zonder kleur 8302726

BAD ORIGINAL

15 TABEL B (vervolg)

Expt. Nr. van de Gebruikt Gewicht van Totaal Opmerking nr. fractie elueer- de gedroog- gewicht middel de fractie (mg) _ _(mg)_ 2 1 H20 44,2 2 ** 1,1 3 " 0,1 45,3 4 HCK2N) 0,4 5 " 2,3 6 " 34,0 7 " 5,7 8 » 0,8 43,2 * fractie zonder kleur.

Uit de voorafgaande resultaten blijkt, dat nadat 8 fracties door het adsorptiemiddel zijn gesijpeld, in hoofdzaak alle verbindingen waren verwijderd en gescheiden.

3 Om de doelmatigheid van de DCLC volgens de uitvinding vast te stellen, werd een vergelijkende proef uitgevoerd onder toepassing van de gebruikelijke chromatografie met zwaartekrachtstromxng met dezelfde hoeveelheid 100^ul monster en hetzelfde adsorptiemiddel· De resultaten zijn in de volgende tabel C voorgesteld.

TABEL C

Scheiding door ionenuitwisseling onder toepassing van een gebruikelijke chromatografiekolom

Fractie Gebruikt Gewicht van de ge- Totaal Opmerkingen nr. elueer- droogde fractie gewicht ______middel_(mg)_ (mg)__________ 1 H20 0,8 2 » 50,3 3 1,3 4 " 0,5 5 " 0,2 6 " 0,3 7 " 0,4 8 ·' 0,1 9 " 0,3 10 " 0,4 11 » 0,1 12 " 0,3 13 " 0,1 54,9 fractie zonder kleur

BAD ORIGINAL

8302726 16 TABEL C (vervolg)

Fractie Gebruikt Gewicht van de ge- Totaal Opmerkingen elueer- droogde fractie gewicht _middel_(mg)_(mg)_ 14 HC1(2N) 0,0 15 " 2,3 16 " 23,0 17 " 12,7 18 " 3,3 19 " 1,4 20 ·* 1,4 4^,1 fractie zon der kleur

Voorbeeld III

Bij dit experiment werd een oplossing van 100,ul β-hCG, die * / 30-35 % gemerkt jood ( J^) bevatte, door de DCLC onder toepassing van een Sephadex G-10 adsorptiemiddel gescheiden. De elutie werd 5 uitgevoerd met 10 ml buffer bij een pH van ongeveer 8. Elke fractie bestond uit ongeveer 0,4 ml*

De resultaten zijn in de volgende tabel D voorgesteld.

8302726

BAD ORIGINAL

17

TABEL D

Scheiding van β—hCG» dat J^ bevat over Sephadex G—10, geelueerd met een buffer (pH ongeveer 8)______

Fractie nr. Blanco bepaalde cpm Totaal 1 29,0 0 2 9348,0 9578,0 3 1946,0 1962,8 4 292,0 267,7 5 130,0 104,8 6 114,0 84,5 7 108,0 82,0 8 78,0 48,2 12125 cpm 9 79,0 49,6 10 98,0 67,7 11 134,0 102,9 12 182,0 152,5 13 414,0 389,3 11f 485,0 464,4 15 766,0 757,5 16 854,0 834,7 17 635,0 615.5 18 450,0 424,6 19 504,0 486,4 20 378,0 348,5 21 284,0 256,8 22 158,0 127,7 23 131,0 99,8 5169 cpm

Totaal 20534,0 20594,4 17294

Het blijkt, dat de winning ongeveer 85 % is. Deze scheiding zal bij uitvoering volgens een gebruikelijke chromatografie, veel meer elueermiddel vereisen en zal voorts meer tijd voor de scheiding gebruiken.

5 Voorbeeld IV

Bij dit experiment werd een oplossing van een kleurstofmeng-sel bestaande uit 35 % Ceres red 7B; 28 % Nitro fast blue 2B; 25 % Nitro fast violet FBL en 12 % Ceres yellow R (alle in volume-percentages) met de DCLC methode gescheiden. Dit kleurstofmengsel 10 werd verschaft door Merck (catalogusnummer 9354).

BAD ORIGINAL g 3 Q 2 ? 2 Q

18

Een hoeveelheid van 30 ml van het kleurstofmengsel in di-chloormethaan werd in een DCLC geïnjecteerd, die LICHROPREP Si-60 (handelsmerk van Merck, catalogusnummer 9336), bevatte, een ad-sorptiemiddel op siliciumdioxide-basis met een deeltjesgrootte 5 van 15-25^ura. De kolomafmetingen waren als volgt: lengte 10,6 cm en inwendige diameter 10 mm. De stromingssnelheid was 2 ml/min en het elueermiddel was dichloormethaan.

De resultaten van de scheiding worden in figuur 10 voorgesteld in de vorm van grafieken, optische dichtheid (O.D.) bij 10 254 nm tegen de fracties. Zoals uit de grafieken blijkt werd. een snelle en duidelijke scheiding verkregen.

Voorbeeld V

Bij dit experiment werd een mengsel van polycyclische aromatische verbindingen bestaande uit 50 % benzeen, 30 % naftaleen en 15 20 % antraceen (volumepercentages) in een n-heptaan-oplossing met de DCLC methode gescheiden.

Het geïnjecteerde monster bestond uit 50^ul onder toepassing van een kolom met dezelfde afmetingen als in voorbeeld XV, die hetzèjfde adsorptiemiddel bevatte. De stromingssnelheid was 20 2 ml/min en het volume van elke fractie was 1 ml. Het elueermid del was n-heptaan.

De resultaten van de scheiding zijn in fig. 11 voorgesteld in de vorm van grafieken, optische dichtheid (O.D.) bij 254 nm tegen de fracties. Zoals uit de grafieken blijkt werden de compo-25 nenten in drie scherpe pieken gescheiden.

Voorbeeld VI

Bij dit experiment werd een mengsel van alkylftalaten met de DCLC-methode gescheiden onder toepassing tean een kolom zoals in voorbeeld IV met hetzelfde adsorptiemiddel.

30 De alkylftalaten bestonden uit een mengsel van dibutylfta- laat, diethylftalaat en dimethylftalaat in n-heptaan/ethylacetaat (90/10 vol*dln). Het elueermiddel was een mengsel van n-heptaan/ ethylacetaat (90/10 vol.dln). De stromingssnelheid was 3 ml/min en het volume van elke fractie was 1 ml. De resultaten van de 35 scheiding zijn in figuur 12 voorgesteld in de vorm van grafieken, optische dichtheid (O.D.) bij 254 nm tegen de fracties. Zoals uit de grafieken blijkt werd een duidelijke scheiding verkregen.

BAD ORIGINAL 8 3 0 2 7 2 6 19

Voorbeeld VII Zuivering van anti-hCG

De zuivering van anti-hCG werd uitgevoerd met de DCLC-*methode onder toepassing van-twee verschillende bronnen van deze verbin-5 ding: a) SERONO en b) MILES, waarbij de laatste minder geconcentreerd was dan de eerstgenoemde, a) Zuivering van anti-hCG (SERONG) Eén flesje van anti-hCG werd opnieuw samengesteld met 1 ml fosfaatbuffer (pH = 6,3)· De oplossing werd op een kolom (lengte 10 10,6 cm en inwendige diameter 10 mm), die 5 g cellulose (DEAE DE-52, handelsmerk van Whatman) als absorptiemiddel bevatte, gebracht. De kolom werd met fosfaatbuffer (pH = 6,3) bij een stromingssnelheid van 2,3 ml/min geëlueerd. Onmiddellijk was een zeer hoge piek van proteïne zichtbaar in de eerste fracties (if tot 8). De kolom werd 15 net een stroomcel en registratie-inrichting voor onmiddellijke bepaling verbonden· Een verandering van de buffer tot pH = 7t1 bracht een vrijwel onmiddellijk verschijnen van proteïnen· Twee andere hoofdpieken van proteïnen werden geëlueerd.

De bepaling werd uitgevoerd door bij absorptie bij 280 op-20 tische dichtheid (O.D.) nm elke fractie af te lezen· De immunologische activiteit van elke fractie met hCG herkenning werd uitgevoerd volgens de RIA methode onder toepassing van de volgende op- 125 lossingen: 100^ul J - hCG; 100^ul serum vrij van hCG en 100^ul van elke fractie. De incubatie werd gedurende 3 uren bij kamer-25 temperatuur uitgevoerd· De scheiding werd uitgevoerd onder toepassing van een polyethyleenglycol/dubbel antiliehaam (20/1 vol. dln).

De verkregen resultaten zijn in de volgende tabel E voorgesteld.

BAD ORIGINAL Q 3 Q 2 7 2 6 , 2o

TABEL E

Scheiding van anti—hCG SERONO op DEAE DE-52

fractie O.D. RIA fractie O.D. RIA

nr»_% binding nr»_% binding 1 0,004 0,1 % 16 0,013 19 % 2 0,002 0,1 % 17 0,039 16,4 % 3 0,004 14,1 % 18 0,03 5,0 % 4 0,006 2,1 % 19 0,012 3,0 % 5 0,63 22,8 % 20 0,019 6,4 % 6 0,879 12,3 % 21 0,044 10,3 % 7 0,097 2,8 % 22 0,029 4,5 % 8 0,01 0,1 % 23 0,018 4,0 % 9 0,008 0,1 % 24 0,015 3,0 % 10 0,003 0,1 % 25 0,008 2,6 % 11 - 0,1 % 26 0,002 2,4 % 12 0,002 0,1 % 27 0,002 0,1 % 13 0,002 0,1 % 28 0,01 0,1 % 14 0,003 0,1 % 29 - 0,1 % 15 0,01 0,1 %

Zoals uit de in tabel E voorgestelde resultaten blijkt, werden drie hoofdpieken verkregen, de immunologische activiteit bleef uiterst hoog in vergelijking met de proteïne-cohcentratie» b) Zuivering van anti-hCG (HILES) 5 70yUl antilichaam (als konijneserum) werd op de DEAE DE-52 kolom, zoals in het voorafgaande gebracht en eerst met fosfaat-buffer (pH = 6,3) geelueerd. Opnieuw zoals in het voorafgaande geval werd een snelle proteïnepiek geelueerd in de fracties 3 en 4? door een afname in de optische dichtheid (O.D.) en verandering 10 van de buffer tot pH van 7,1 werden drie andere hoofdpieken verzameld.

De resultaten zijn in de volgende tabel F voorgesteld.

BAD ORIGINAL 03()2 72 6 21

TABEL F

Scheiding van anti-hCG MILES op DEAE-52

frac- O.D. RIA proteïne A frac- O.D. RIA proteïne A

tie % bin- % bin- tie % bin- % bin- nr._ding ding_nr» _ding ding 1 0,01 0,1 % - 21 0,09½ 63,6 % 7,0 % 2 0,102 0,1 % - 22 0,042 64,8 % 7,2% 3 0,656 64,2 % 2,6 % 23 0,041 63,4 % 4 0,416 45,6 % - 24 0,07 1,0 % 5 0,091 0,1 % - 25 0,518 60,3 % 5,9 % 6 0,055 0,1 % - 26 0,518 67,7 % 5,3 % 7 0,044 0,1 % - 27 0,299 55,5 % 4,5 % 8 0,022 0,1 % - 28 0,161 58,4 % 3,7 % 9 · 0,016 0,1 % - 29 0,120 66,0 % 2,5 % 10 0,007 0,1 % - 30 0,112 54 % 1,8 % 11 0,005 0,1% - 31 0,091 51,3¾ 3,9¾ 12 0,003 0,1 % - 32 0,074 59,7 % 2,4 % 13 0,003 0,1 % - 33 0,062 55,7 % onbekend .

14 0,004 0,1 % - 34 0,062 60,9 % 15 0,001 0,1% - 35 0,043 59*5 % 1,9% 16 0,004 0,1 % - 36 0,034 17 0,011 0,1 % - 37 0,035 18 0,034 65,4 % 7,2 % 38 0,029 19 0,291 55,5 % 12,1 % 39 0,021 20 0,247 61,4 % 11,6%

Zoals uit de in tabel F voorgestelde resultaten blijkt werd het afgescheiden anti-hCG in drie hoofdpieken verzameld. Alle pieken vertoonden immunologische activiteit, absorptie bij 280 nm * en herkenning door proteïne A . Alle piekenrerden scherp van el-' 5 kaar gescheiden en verzameld.

Voorbeeld VIII

Scheiding van menselijk serum

Een scheiding van menselijk serum werd uitgevoerd onder toepassing van de DCLC-methode, identiek aan de methode zoals be-10 schreven in Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir,

Md. BlackWell Scientific Publications, Oxford, Londen, 1973, 2de druk).

De chromatografie is' gebaseerd op ionenuitwisseling op een cellulose adsorptiemiddel en een gradient elutie met fosfaatbuffer 15 (0,02 molair) met een pH van 5,7»

BAD ORIGINAL

8302726 . 22

De kolom met een inwendige diameter van 10 mm was gevuld werd met 3 g DEAE DE-52 (handelsmerk van Whatman) eiymet de fosfaat-buffer (pH = 8) bij een stromingssnelheid van 2f5 ml/min gewassen. De gradient werd voortgebracht met een systeem van twee kamers 5 onder toepassing van 40 ml van een fosfaatbuffer met een pH van 8 en 60 ml van een fosfaatbuffer met een pH van 5»7· Een hoeveelheid van 3 ol menselijk serum werd gescheiden; fracties van elk 1,5 ml werden verzameld en het picfceïnegehalte daarvan werd bepaald door optische dichtheid (O.D.) bij 280 nm. De resultaten 10 zijn in de volgende tabel G voorgesteld.

TABEL G

Scheiding van menselijk serum (O.D. bij 280 nm) fractie O.D. fractie O.D. fractie O.D.

nr._' _nr._nr._ 1 0,0017 13 0,052 25 0,06 2 1,3 14 0,061 26 0,026 3 1,3 15 0,102 27 0,008 4 1,3 16 28 0,004 5 0,554 17 0,187 29 0,011 6 0,262 18 0,355 30 0,003 7 0,135 19 0,379 31 0,008 8 0,082 20 0,361 32 0,015 9 0,067 21 0,313 33 0,016 10 0,064 22 0,233 34 0,011 1.1 0,055 23 0,156 35 0,005 12 0,052 24 0,098 36 0,006

Zoals uit de in tabel G voorgestelde resultaten blijkt ver-met toont de DCLC bereikte scheiding het traditionele beeld van gescheiden menselijk serum met twee hoofdpieken (IgG, albuminen).

De scheiding is in een korte tijd voltooid.

15 Voorbeeld IX

Bij dit voorbeeld werd de DCLC-methode toegepast op affini-teitschromatografie voor de isolering van konijnen IgG onder toepassing van ligand SEFHAR0SE-4B (handelsmerk van Pharmacia) -antilichaam (antilichaam = geit-anti konijn).

BAD ORIGINAL

8302 72 6 23 SEPHAR0SE-4B - antilichaam: Het antilichaam was gekoppeld aan het SEFHAR0SE-4B (handelsmerk van Pharmacia) adsorptiemiddel onder toepassing van de instructies zoals gege-5 ven door Axel Porath c.s. (Nature 214» 1967).

1 g SEPHAR0SE-4B ) 5Q ^ 30 mg geit-anti konijn j binding DCLC kolom : Glazen kolom met een inwendige diameter 10 van 6 mm gevuld met Sepharose-4B - antilichaam.

Detectie : werd direkt uit de kolom met een stroomcel uitgevoerd. UV bij een adsorptie van 280 nm.

15 Buffer : 1. fosfaatbuffer/NaCl» pH 7*8 2. glycine/HCl (0t1 molair), pH 2,5.

De methode omvatte de volgende trappen: 1. Koppeling van SEPHAR0SE-4B aan geit-anti konijn serum.

2. Vulling van de DCLC met SEPHAR0SE-4B-anti-lichaam 3 ml gel» 20 aan beide zijden gesloten met een filtersysteem VYÓN (handels naam) ongeveer ifO^um.

3· Wassen van de gevulde kölom met 6 ml buffer 1.

4« Vulling van de kolom met 0,5 ml N.R.S (normaal konijneserum).

5· Incubatie gedurende 2 uren bij 37°C.

25 6. Elutie met buffer 1 en fractieverzameling tot de optische dicht heid bij de fotometer kleiner dan 0,1 is.

7. Elutie met buffer 2 met een pH van 2,5 en fractieverzameling tot de optische dichtheid bededen 0,1 is.

Een schematische grafiek voor de affiniteitschromatografie 30 van dit voorbeeld is voorgesteld in figuur 13· BAD ORIGINAL g 3 Q £ 7 2 6

Claims

1. Werkwijze voor de uitvoering van een chramatografische techniek, hierna aangeduid als vloeistofchromatografie met dynamische kolom, voor de scheiding van een of meer in een oplossing 5 aanwezige verbindingen, gekenmerkt door de aanwezigheid van een bewegend bed van vast adsorptiemiddel, dat een plunjer met aan de onderzijde daarvan een afdichtingselement en een langwerpig kanaal, dat een adsorptiemiddel vastgehouden tussen twee afsluitingen bevat en een proefbuis met aan de onderzijde 10 daarvan een klep met meervoudige openingen omvat, welke plunjer nauwsluitend in de proefbuis past, waarbij door de plunjer in de proefbuis te duwen het gewenste elueermiddel, dat vooraf door de klep was gedwongen, door het kanaal binnentreedt, waarbij de te scheiden geadsorbeerde verbindingen tussen de afsluitingen bewo-15 gen worden en de verkregen oplossing door een mondstuk, aangebracht aan één van de eindgedeelten van de plunjer, naar buiten treedt.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat in de gesloten positie van de klep de vloeistof onder intrinsieke druk door het kanaal binnentreedt, waarbij de te 20 scheiden geadsorbeerde verbindingen tussen de afsluitingen bewegen.

3* Werkwijze volgens conclusies 1 en 2, met het kenmerk, dat een additioneel geschikt adsorptiemiddel, dat van het adsorptiemiddel, dat bij de vloeistofchromatografie met verschilt dynamische kolom wordt gebruiky, wordt opgenomen om het toegevoer-25 de monster vooraf te concentreren.

4· Werkwijze volgens conclusies 1 tot 3, met het kenmerk, dat de proefbuis aan de onderzijde gesloten is, waarbij het elueermiddel, voorafgaande aan het neerwaarts duwen van de plunjer in de proefbuis, aan de fcroèfbuis wordt toegevoerd. 30

5· Werkwijze volgens conclusies 1 tot 4» m e t h e t kenmerk, dat de chromatografische techniek gekozen is uit silicagel-chromatografie, vloeistofchromatografie met omgekeerde fase, affiniteitschromatografie, capillaire chromatografie, chro-mato-focusseren, gelfiltratie en ionenuitwisselingschromatografie. 35

6. Werkwijze volgens conclusie 1, met het ken merk, dat het vaste adsorptiemiddel in een patroon, die in het langwerpige kanaal van de plunjer is geplaatst, aanwezig is.

7. Inrichting voor vloeistofchromatografie met dynamische kolom voor de scheiding van een of meer verbindingen, die in op-40 lossing aanwezig zijn, gekenmerkt door de aanwe- BAD ORIGINAL g 3 Q £ 7 2 6 zigheid van een proefbuis, die aan de onderzijde daarvan een af-dichtingselement en een klep met veelvoudige openingen bevat, enesn plunjer, die nauwsluitend in de proefbuis bevestigd is, welke plunjer een langwerpig kanaalt dat een adsorptiemiddel be- 5 vat, dat tussen twee afsluitingen wordt gehouden, en een mondstuk, dat aan één einde van de eindgedeelten van de plunjer aanwezig is, l36V9r1f

8· Inrichting volgens conclusie 7» met het kenmerk, dat de afvoer van het elueermiddel door een vertikaal nauw kanaal in direkte voortzetting van de kolom is·

9. Inrichting volgens conclusie 7 of 8, met het kenmerk, dat een afdichtingselsment aan de basis van de plunjer, aangepast om langs de binnenwanden van de proefbuis te glijden aanwezig is.

10. Inrichting volgens conclusie 9» met het ken-15 merk, dat het afdichtingselement uit een inert materiaal is vervaardigd.

11. Inrichting volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat het afdichtingselement bestaat uit een rubber-O-ring met een openingsboring, die met het langwerpige kanaal verbonden 20 is.

12. Inrichting volgens conclusies 7 tot 11, met het kenmerk, dat de plunjer van de dynamische kolom uit twee of meer subeenheden is geconstrueerd, die elk dezelfde of verschillende adsorptiemiddelen bevatten. 25 13· Inrichting volgens conclusies 7 tot 12, met het kenmerk, dat het mondstuk met de bovenste afsluiting van de plunjer verbonden is.

14. Inrichting volgens conclusies 7 tot 13, met het kenmerk, dat een stop boven op de plunjer geplaatst is. 30 15· Inrichting volgens conclusie 1^, met het ken merk, dat het mondstuk verbonden is door een kanaal, dat door de stop gaat*

16. Inrichting volgens conclusies 7 tot 15, met het kenmerk, dat een oplosmiddelreservoir voor de kolom met de 35 dynamische kolom verbonden is.

17· Inrichting volgens conclusies 7 tot 16, met het kenmerk, dat de proefbuis aan de onderzijde ervan gesloten is.

18. Inrichting volgens conclusies 7 tot 17, met het 40 kenmerk, dat de plunjer voorzien is van een middel voor het BAD ORIGINAL gjgg^g verzamelen van gas.

19· Inrichting volgens conclusie 18, met het ken merk, dat het middel voor het verzamelen van gas bestaat uit horizontale, vertikale of spiraalvormige groeven, die op de plun-5 jer zijn aangebracht.

20. Inrichting volgens conclusies 7 tot 19» met het kenmerk, dat de inrichting uit een inert materiaal vervaardigd is.

21. Inrichting volgens conclusie 20, met het ken- 10 merk, dat het inerte materiaal gekozen is uit de groep bestaande uit metaal, glas, polyetheen of een ander geschikt kunst-stofmateriaal* ********* BAD ORIGINAL e ^ o -7 o c

8. U 2 7 2 0