JPS6035257A - 新タイプのクロマトグラフィーの方法およびその装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １、発明の背景 技術分野 本発明は、２以上の成分を分離するための、以下、動的
カラム液体クロマトグラフ（Ｄ　ＣＬ　Ｃ）と称する新
規なりロマトグラフ方法に関する。本発明は、更に特に
、移動床クロマトグラフシス−Σムを用いる、溶液中に
存在する２以上の化合物を分離するための新規な方法に
関Ｊる。

先行技術 周知のようにクロマトグラフは、化学Ｊｊよび生物学に
おいて用いられ、また化合物の混合物を分離し、かつ同
定するための多くの物理的方法を示す用語である。全て
のクロマトグラフ種類の背後にある原理は、化合物混合
物を、固体表面上の液体抽出あるいは吸着に繰り返し変
ることにある。

混合物は、固体または固体の細胞中に（床またはカラム
中に配置された）不動化された液ｒあり冑る静置相（床
またはカラム）上に物理的に移動けしめられる。クロマ
１〜グラフによる化合物の分離は、特別のクロマトグラ
フシステムに依存する次の物理化学的力の１以上を用い
得る。

（ａ＞吸着剤と呼ばれる多孔質媒体に対する吸着性の差
異。

（ｂ）不活性媒体（静置用）を被覆する液体の比較溶解
度の間の差異、液体は移動相と呼ばれ、多孔質カラムを
通して浸透する。

（Ｃ）吸着剤でのイオン交換の差異。

（ｄ）溶液が非常に小さい径のゲル中を浸透するときの
分子径の差異。

まＬ　ｚクロマトグラフは、混合物からクラクションを
単離するために用いられる場合、調整用クロマトグラフ
と称され、研究のためあるいは商業的目的の分光、同定
および合成のごとき用途のためである。

り１コマトゲラフに関する元来の研究は、カラム中に充
填された不活性材料上の吸着性の差異に基づく。分配ク
ロマトグラフィとして知られる成分の分離は、カラムを
通過される溶媒中の比較溶解度に基づいている。このク
ロマトグラフィ中で得られる分解能は、溶媒−移動相の
ｐＨおよびイオン強度および二つの相の中の成分の比較
溶解度に依存している。種々の材料は、適当な溶媒で溶
離でき、また、液体フラクションは一連の管中に回収さ
れ、次いで、和学的または物理的方法によって分析され
得る。薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）およびペーパー
クロマトグラフィは、成分の不活性媒体上への比較吸着
性の間の差異に基づいている。ＴＬＣにｄ５いて、静置
用は、シー］−またはプラスチック支持板に、あるいは
ガラス板に適用された細かく分かれた物質の薄層よりな
る。通常用いられ、仕上げ板として商業的に入手できる
吸収剤には、アルミナ、シリカゲルＪ３よびセルローズ
がある。ペーパークロマ１へグラフィにおいて、移動相
は、毛細管作用によって上に動くことができ、このため
上昇クロマトグラフィと称され、あるいは重力によって
下に移動し得、下降クロマトグラフィと呼ばれる。

イオン交換クロマトグラフィは、そのイオン電荷に基づ
く分子の分離である。吸収剤づなゎち静置用は、共有的
に結びつけられたイオンを有する重合体よりなる。カチ
オン交換樹脂においてかたく結合したイオンは、負に荷
電され、また静電によりゆるく付着された正イオンを伴
なう。混合物より分離すべき正に荷電された物質は、第
一に吸収剤に吸着され、樹脂中に存在するカチオンと置
き代わる。溶液を、結合が容易になるＩＩＨに緩衛し、
次に、同じ緩衝液で溶離せしめ、溶液の非結合クラクシ
ョンを除去する。アニオン交換樹脂は、全く同じ方法で
操作するが、その共有的に結合したイオンが逆に荷電さ
れており、溶液からアニオンを引きつける。

分子の大ぎさの差異に基づく分離は、分子篩クロア１−
グラフィとして知られるゲル濾過に考えられる。この方
法は、その大きさにしたがって分子を分離Ｊ”るもので
あり、一方、分子の形がある程度濾過に悪影響を与える
。ゲルは小さな分子がとらえられ得る孔の開口の網を含
むビーズの形をとる。一般的にクロマトグラフィに大き
な商業的関心があり、そして、特に、調整用液体クロマ
トグラフィに関心があり、それは、この分野で用いられ
る既知の吸着剤よりもより良好な分離を１！′Ｊる種々
の微粒子カラム充填物および予め充填されたカラムを示
唆している多数の刊行物にＪ：って証明される。

■０発明の目的 発明者らは、既知の吸着剤が利用されるが、分離が非常
に早く、かつより容易に行なわれるクロマトグラフィに
対する新しい考えを開発することに研究を集中した。本
発明にＪζるクロマトグラフィの新しい概念は、吸着剤
をもつ床が、従来の吸着材料が静置しているクロマトグ
ラフィ技術とは逆に、移動する動的７Ｊラムを利用する
ものである。

したがって、本発明は、溶液中に存在づる１以上の化合
物を分離するための、以下動的７Ｊラム液体クロマトグ
ラフィ（ＤＣＬＣと略称する）と称する新しいタイプの
クロマトグラフィ技術の方法であり、それは、移動固体
吸着剤床の存在を特徴とし、底部にシーリング要素を、
また二つのバリヤの間に保持された吸着剤を含む縦チト
ンネルをもつピストンと、底部に他方向バルブをもつ試
験管とを有し、該ピストンは試験管の中へきらんと適応
しており、ピストンを試験管中に押すことにより該バル
ブを通して予め圧入された所望の溶離剤がチャンネルを
通して入り、該バリＡ７の間に分離すべき吸着された化
合物を移動ヒ“しめ、ピストンの端部の一つに配置され
たノズルを通して外に出て、溶液が得られるものである
。よく遭遇するにうに見える一般的場合は、吸着帯とし
て固体吸着床を用い、その場合は本方法は従来のクロマ
トグラフィ技術と最も有利に競合するものである。

本方法は非常に正確であり、従来クロマトグラフィに対
して下記の主要な長所を有する。

（ａ　）従来のクロマトグラフィに存在する重力流どは
逆に、動的カラム液体クロマトグラフィにおい−Ｃは、
いくらの圧力が本来的に吸着床にががり、成分に分離に
、より良好な分解能を与える。

＜１＋）本方法は、システムにががる固有の圧力の結果
として非常に迅速である。

＜Ｃ＞本方法は、従来のクロマトグラフィよりも少ない
溶離剤でよい。

（ｄ　）動的り【コマトグラフィシステム中の固有の圧
力の存在により、従来のクロア１−グラフィよりも小さ
い粒子サイズの吸着剤を利用することが可能となり、よ
り高い感度が可能である。

多方向バルブでは、数個の逐次の溶離剤を試験管中に導
入しなければならない時に非常に重要であり、そこでは
さらに吸着剤床を通して通過せしめ、所望の分別を得る
。吸着剤床が主にサンプルの予１紬処理に、あるいは一
つの化合物の除去のために利用される場合、バルブ要件
は必須のものでなく、底部が閉じられた単純な試験管で
ピストンに合うものが利用できる。この場合、溶離剤は
ピストンの押し下げの前に試験管中に導入すべきである
。もらろん分別が必要でない場合でさえ、バルブをもつ
試験管は利用するにより有利であり、バルブを通しての
７スピレータによる吸着剤の洗滌および溶離剤の導入に
関して有利である。

シーリング要素は、試験管の内壁に沿って滑り、同時に
該内壁と良好な接触を保持し、試験管の中にピストンが
きらんと合致するようになる。シーリング要素は、一般
的にオリフィス孔を有するゴムあるいは他の適当な材料
よりなり、試験管の内壁に沿って滑るに適している。装
置がガラスで作られる場合、ピストンの外壁が研磨され
ると、それ（１０−リングの代りとなるように製造され
得る。

全体の方法は非常に柔軟性があり、種々の具体例に多数
の適用種で応用され得、また、このために本発明の概念
に含まれるものである。全ての種類のクロマトグラフィ
に存在する問題は、その床の表面へのサンプルの均一な
適用である。サンプルが直接に重力流によって適用され
る場合、均一な適用が比較的に困難であり、床は、サン
プルが導入されたときに渦巻く傾向がある。この理由の
ために、表面がレイヨンフィルターペーパー片のように
保護されることが特に重要である。カラムの一つのＨ’
ＩＭ業者（ｐ　ｈａｒｍａｃｉａ　Ｆ　ｉｎｅ　Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌｓ　ＡＳ＞は、サンプル適用装置と称される
特殊な装置をもついくつかのカラムを備えており、床表
面を保護する役目をする。この装置においては、薄いナ
イロン織物がクロマトグラフ管の内側に合うパースペッ
クスの短片の端に取付られる。

このような装置は、もちろん設備のコストを上げ、そし
てその存在はサンプルの流れに圧力を生じ、カラムを通
しての浸透を遅くする。本発明を利用するタロマドグラ
フィシステムのほどんどにおいて、均一した適用の問題
は多く軽減される。クロマトグラフ床中に存在する動的
流れにおいて、液体は、ピストンが試験管中に押し込ま
れることにより、上に圧入されており、渦巻く傾向はサ
ンプル導入により存在しなくなる。しかしながら、ピス
トンの試験管への押し込まれかう、システムにかかる圧
力はサンプルの流れを促進する。サンプルの均一した適
用を補助づ−る他の方法は、床の一トに、床に既に存在
づる吸着剤とは異なる他の適当な吸着剤を組込むことで
あり、それはサンプルを予め濃縮化する役目をし、分解
能の狭い領域を得るのに助【〕となる。このような適当
な吸着剤の典型的例には粗シリカがあり、それは、その
高い吸着剤特性をもつ活性シリカとは異なるものである
。

粒子径および粒子径分布は、通常のクロマトグラフィ操
作のほとんどにおいて注意深（制御しなければならない
。周知のように、小さな粒子よりなり床は、一般的に良
好な分解能を与えるものである。その理由は、粒子径が
大きくなると領域を広くする機構が適用されるからであ
る。大きな粒子では、粒子の内外の拡散が大きくなるの
である。

大きな粒子の床の中の流れのパターンは弱いものであり
、より再混合することとなる。他方、大きな粒子で充填
された床の中の流れに対する抵抗は低く、そして達成さ
れ１ｑる最大の流量は大きい。

したがって、通常のクロマトグラフィ操作において、粒
子径に関する妥協は、必要な流条件下で最大の領域分解
能を得るように行うべきである。新規なりＣ１０法にお
いては、本発明により吸着剤の小ざな粒子径が、既知の
方法で遭遇する欠点を起づことなく利用することができ
、システムに元来かかる小さな圧力は、粒子の小さな粒
子径により生じる流れ抵抗を克服してしまうものである
。

したがって、本方法は、細かい級の材料の使用が分別目
的のためでさえ利用することができる。

本発明者らの前の特許出願の一つ（西独特許公開箱３１
２６９２６．５号）にｉＪ５いて、選択的バリヤを通し
ての質量移送および分１！Ｉｌｌの新規な方法が、本発
明と同様な部品をもつ装置を用いて開示される。そこに
記されるように、装置は、膜および混合器−分離器が押
し込まれる混合器めを有Ｊる混合器−分離器を構成する
。混合器−分離器の上に、膜にかかる圧力を減らすエア
ポケットを蓄積する手段がある。混合器−分離器の操作
の間に、空気の測定ｍはエアポケット中にとらえられ、
圧縮により液体流に対する膜抵抗からの圧力の一部を取
ってしまうクッションまたはショックアブソーバ−の役
目をする。本発明により動的カラム液体クロマトグラフ
ィのため、エアポケットの要件は、前の場合よりも必須
でないものと考えられ１りる。しかしながら、比較的に
高い圧力が生じる特定のシステムのために、エアポケッ
トは重要な役目をもつようであり、とらえられた空気の
ｆｆｉは、試験管中へ液体を押し返し、液体は、試験管
内壁とピストンの端部の外壁の間の空間の中にクリープ
してしまう。ピストン上の該手段によってとらえられた
空気量は、バリヤのタイプ、分離すべき混合物の成分お
よび特定クロマトグラフィ操作ムにかかる特別の条件の
ような多くの因子に依存している。このようなエアポケ
ットを利用する特別の長所は、溶融剤の完全な回避は、
シーリング要素の役目をするピストン底部に配置された
０−リングによって満足される場合である。

本発明による方法は、以下種々のクロマトグラフィ域に
おいて成功裏に利用できる。シリカゲルクロア１へグラ
フィ、反転相液体クロマトグラフィ、毛細管クロマ１〜
グラフィ、親和力クロマトグラフィ、クロマト集束、大
きさ・排除クロマトグラフィ（ゲル濾過の名前で知られ
る）およびイオン交換クロア１〜グラフイ。

シリカゲルクロマトグラフィは、最も普通のクロマトグ
ラフィ法の一つである。シリカゲルは、最もよく知られ
る吸着剤の一つであり、他の材料と比べて比較的に安価
である。本発明による方法において、シリカゲルにより
得られた分離結果は、従来の技術において得られたもの
と、分離の正確さおよび回収収量に関して基本的に同じ
がより良好であるが、より迅速であることおよび少ない
溶媒ですむことにおいてより便利である。また、カラム
が再利用できるという特別の長所をもつ。さらに、小さ
な径のシリカゲル粒子および、より密な充填が、より高
い分解能の長所を得ながら利用できる。

反転相液体クロマトグラフィは、その静置用が移動相よ
りもより極性がない事実により特徴づけられる。シリカ
ゲルによる主な欠陥は、そのような床も通過する化合物
の一部しか回収できないことである。本発明によるＤＣ
ＬＣの長所を鑑みると、反転相液体クロマトグラフィは
、調整用クロマトグラフィにおいて、成功裏に利用でき
る。最近、毛細管クロマトグラフィが、高い性能の液体
クロマ１−グラフィのためのマイクロカラムの１用発を
鑑みて、特により多くの関心を呼んでいる。これらの開
発のための理由は、クロマトグラフィのこのタイプの以
下のような長所にある。

（ａ）大きな分離の潜在的達成による複雑な混合物おＪ
：び溶質の分割の困難なものについての効率。

（ｂ）溶離剤の消費を基本的に低減すること。

本発明によるＤＣＬＣ法は、前記のごときピストン中に
狭いチャンネルを備えることにより、毛細管クロマトグ
ラフィに容易に適用できる。

大きさ・ＪＪＩ除クロマトグラフィとして知られるゲル
濾過は、分離媒体として適合づ−る吸着剤を用いて、生
物学的物質の精製に、より大きな関心を奇Ｕられる。良
好な結果が、セファデックス（Ｓｃｐｈａｄｅｘ　）　
Ｇ−タイプ（スウェーデンのＰ　ｈａｒｍａｃｉｎ　ｌ
：！ｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ社製）吸着剤を用いて、本
発明による動的クロマトグラフィを用いて、標識化され
た沃素から標識された沃素−ｈＣＧの分離において得ら
れた（例３参照）。ゲル濾過クロマトグラフィもまた、
バッファの脱塩または変化のための単純かつ迅速な方法
として考えられる。

ゲル床は、実験の前に、所望のイオン組成物をもつ溶液
によって平衡化されるべきであり、例えば蒸留水は脱塩
の場合に用いる。溶離は、同じ液体によってなされる。

それに伴なう高い速度を鑑みると、全操作は、数分間内
に脱塩材料を回収し、短時間の内の完了され１ｑる。動
的り］」７１〜グラフイで具体化されるゲル濾過クロマ
トグラフィの他の分野は、ＨＰ　Ｌ　Ｃ前の予備処理で
あり、また希釈されたサンプルの濃縮とそれに続く分離
である。

クロマト集束は、その等電位点によりたん白質を分１１
１１するために広く用いられる。クロマ１〜集束は、分
離された材料の非常に狭い域を作り、また通常、長くて
狭いカラムを必要とするために、動的カラム液体クロマ
トグラフィは、このタイプのクロマトグラフィに理想的
であり、前記の装置に対して狭いピストンを備えるもの
である。

ます、ＤＣＬＣは、最も人気のある分離技術の一つとし
て、よく知られるイオン交換クロマ１〜グラフィのため
に都合がよい。数個の実験が、硫酸銅と重クロム酸す１
〜リウムの、ダウエックス（Ｄｏｗｅｘ）　５０ＷＸ　
８上での分離についてなされた（例２参照）。時間、溶
媒容積および便宜さに関してＤＣＬＣを用いては基本的
に有利であることが見出された。

本発明によるＤＣＬＣの他の利点は、死容積の基本的低
減である。周知のように、死容積は、床中の吸着剤の粒
の間にある間隔空間にある液体の容積として規定される
。はとんどの従来のクロマトグラフィ操作において、死
容積は、正確な結果の決定に悪影響を与える問題となる
。ＤＳＬＣにおいて、密な充填が可能であるので、吸着
剤と液体との間の物質の平衡分布は、非常に小さく死容
積で、非常に早く確立される。したがって、鋭くて、狭
い領域を得ることが可能となる。これは、物質量の溶離
容積の差が一般的に小さい場合の分別実験において非常
に重要である。特にゲル濾過に対しては大きな死容積は
１ｑられる分解能を与えるものである。

他の具体的例により、吸着剤は、ピストン縦チヤンネル
中に挿入されるカー１−リッジ中に存在する。この方法
によりクロマトグラフィ装置は、単に、カートリッジを
適当な吸着剤を含むものに置き変えることにより、多く
の目的用途に準備されるものである。添付の第５図は、
この具体例を例示する。本方法は非常に簡単であり、そ
の万能性はその種々の利点の中で説明され１りる。本発
明による方法を利用する装置について具体化できる多く
の具体例がある。それらの具体例のいくつかは、以下、
第１〜９図と共に示され、それらは、本発明より良い理
解のためのみに与えられ、でれに限られるものでないこ
とは理解される。

■９発明の具体的栴成 第１図において、試験管Ｒは、ルエ（ｌｕｃｒ）ロック
Ｌを備え、それに３方向バルブＬ　Ｖが付けられている
。所望の溶離剤Ｅは、試験管［＜中に圧入される。ピス
トンＣは縦チャンネルを有し、その中に吸着剤Ｐが配置
されており、外ピストンの頂点と底部にある二つの膜Ｆ
＋　、Ｆ２によって保持されている。上部膜「１の上に
栓Ｓがあり、ノズルＤを備え、それを通して吸着剤床か
ら分離フラクションを回収する。外ビス１ヘンの下部分
にＯ−リングＯがあり、それは試験管Ｒの内壁に沿って
渭動するに適するシーリングの役目を持つ。

第２図において、試験管Ｒの底部にバルブはなく、選択
された溶離剤の制限された量が、試験管Ｒにはじめから
導入されている。ピストンＣは、縦チャンネルを有し、
その中に吸着剤Ｐが配置され、二つの膜Ｆ＋　、Ｆ２に
よって保持されている。

上部膜Ｆ１の上に栓Ｓがある。吸着剤床からの分離フラ
クションが回収されるノズルＤは、ピストンＣに連通さ
れている。下部分にＯ−リングがシーリング要素としで
ある。この装置は、分別が必要でない時に利用でき、そ
の操作は単一溶離剤により一つのみのサイクルよりなる
。

第３図において、試験管Ｒは、第２図のものと同じで、
その底部にバルブがない。ピストンＣは縦チャンネルを
有し、その中に吸着剤Ｐが配置され、二つのＰＡＦ＋、
Ｆ２によって保持されている。

その上部膜Ｆ２の上に、栓Ｓがあり、吸着剤床からの分
離フラクションを回収するノズルＤを備えている。該ピ
ストンの底部に、シーリング要素として０−リングＯが
ある。

第４図において、試験管の底部にバルブがなく、ピスト
ンの頂点に栓がない、最も簡単な形の装置が示される。

選択された溶離剤Ｅの限られた量が、試験管Ｒの初めか
ら導入される。ピストンＣは縦チャンネルを有し、その
中に吸着剤Ｐが存在し、二つのバリヤー膜またはフィル
ターＦ＋　、Ｆ２の間に保持されている。Ｏ−リングＯ
はピストンの下部分に配置され、シーリングと試験管Ｒ
の内壁に沿って摺動するに適応さぜる役目を有する。吸
着剤Ｐを充填したチャンネルに連結してノズルＤがあり
、それを通して分離フラクションが回収される。

第５図において、所望の吸着剤Ｐを含むカー１−リッジ
ＣＡがピストンＣの縦チャンネルＩ中に導入される場合
の方法が示される。溶離剤の回収は、前記の図で説明し
た如く、ノズルを通して、成し得る。Ｏ−リングＯは、
ピストンＣの下部分に存在覆る。操作モードは、以下の
第１図で説明するように、非常に簡単である。ピストン
Ｃは、選ぽれｋｉｆｆ　ｍｌ剤で充された試験管Ｒ内で
下方に押圧される。これにより溶離剤は、下部膜Ｆ１を
通して押込まれ、かつピストンＣの縦チャンネルに存在
する吸着剤を通して圧入され、そして最後にノズルＤを
通してしたたり出る（第４図において）。

適切な支持材料Ｐで満たされると、クロマトグラフィカ
ラムの役目をするものである。試験管Ｒを再び充たすに
は、単に、試験管の排出口を開き、ざらに溶離剤をバル
ブ（ＬＶ）を通して圧入することによって行える（第１
図）。

第６図において、動的カラムの具体例が示され、カラム
ピストンＣは、試験管Ｒの中を上へ移動し、溶離剤の出
口は、垂直な狭いチＶンネルＸを通して、カラムクロマ
トグラフ支持材料は直接的連続しである。第７図は第６
図の動的カラムの変更例であり、それにより、カラム溶
媒溜めは動的カラムと結合している。

第８図は、２以上のサブユニットよりなる動的カラムの
ピストンＣを示す具体例を例示し、そこでは各サブユニ
ットは、同一あるいは異なる吸着剤Ｐを含み、各サブユ
ニットから得られる溶ＰａＭを回収することが可能であ
る。

第９図は、ＤＣＬＣの万能性を示す他の具体例を例示し
、それにより利用性がさらに拡げＩうれ得る。この具体
例によると、出た溶ｍ液は、同一あるいは異なる吸着剤
Ｐを含む他のカラムに運ばれる。

なお、第１〜９図において同−符丹は、同一部材を表ね
り。

第１０〜１２図は、グラフの形で例４，５および６に説
明する種々の混合物の分離の結果を表わず。第１３図は
、例９に説明するＩａＧ単離の親和ツノクロマトグラフ
ィに対する概略グラフを示１゜原理的に、動的クロマト
グラフィは、８１休イオン交換体中でも、利用されるよ
うに具体化でさる。

液体イオン交換体は、少なくとも形式的には水溶液と水
性相への抽出弁の無視できる分布をｂつ不混和性の？？
７媒どの間の界面でのイオン交換によって操作する液−
液抽出システムとして規定される。

液体アニオン交換体は、逆層抽出クロマｉ〜グラフィに
用いられる。この技術において、担持材料（シリカゲル
、セルローズ粉末等）は、液体アニオン−交換体にしみ
込まれており、静置相として用いられ、そして酸の水溶
液あるいは、その塩の水溶液は、溶離剤（移動相）とし
て用いられる。

本発明のために、膜は、溶離剤のみを透過でき、ピスト
ンの縦チヤンネル中に残るべき液体イオン交換体に対し
ては透過性でないものであるように選択されるべきであ
る。

本発明によりＤＣＬＣで利用されるべき装置は、ガラス
、ポリエチレンまたは他の適当なプラスチック材料のご
とき不活性材料で作ることができ、金属−ｂ何か特別の
用途には考えられ得る。

本発明をさらに次の実施例によって説明するが本発明は
、該実施例または明細書中に記された具体例に限られる
ものではない。逆に、特許請求の範囲によって規定した
ごとき本発明の範囲内に含まれて１ｑる変更、修正およ
び均等物の全てをカバーすることを意図している。

例　１：７エロセンおよびフェロセンアルデヒドΔ塁塗
ｔｊリリＥ （ａ）皮層１日［ １，０ｇのシリカしメルク社キーゼルゲンＭ（Ｋ　ｉｅ
ｓｅｌｇｅｌ　Ｍ　）　、タイプ６０］を、閉じられた
試験管中の５ｎ＋ｌのジクロロメタン／ヘキサン１：１
の脱ガス化溶液中に分散せしめ、スラリーを作る。栓お
よび上部膜を備えたピストンを、試験管内に０−リング
と試験管の間の接触がきつくなるまで挿入する。全ユニ
ットを、反転させ、栓の上に垂直に立て、そして空気を
試験管内のｉｌｌ出口を通して除去する。次に試験管排
出口を閉じ、充填物が試験管内を約１ｍｌ／分の速流で
静置ピストンに下方に移動することによって行なう。シ
リカゲルが完全に降りた時、試験管排出１」を開（）試
験管をピストンから取り除く。下部膜を取（＝Ｊｌ）、
そして、カラムはサンプル適用に準備する。

（ｂ）（Ｊ−）ＬＬ１厘 フェロセンＪ３よびフェロセンアルデヒドの混合物を、
０．２〜Ｑ、４ｍ　ｌのジクロロメタン中に溶解眩しめ
、かつ溶液を垂直に立っているカラムの下部股上に適用
する。溶液は膜に浸透し、また成分はシリカ上に吸着さ
れる。この処理は、閉じた試験管を用い、空気圧をいく
らかかけることによって促進できる。

（Ｃ）ｌｌ 充填されたピストンを、５ｍｌの選択された溶離剤を含
む試験管中に挿入する。空気はカラムの充填の間に除去
され、また溶離は、ピストンを充たされた試験管中に約
１ｍ　ｌ　／分の流速で降下せしめること己よってなさ
れる。その結果を第１表に示づ。

（以下余白） 、＼　２ 特開昭６０−３５２５７（９） 例２：Ｎａ２Ｃｒ２Ｏ７・２Ｈ２０のＣｕ　ＳＯｓ・５
Ｈ２０からのイオン交換による分離吸着剤は、ＤＯＷＥ
Ｘ５０ＷＸ８　（２，００〜４００メツシユ系）よりな
るものだった。吸着剤を先ず洗浄し、また約３０分間蒸
留水中に放置後、塩酸（２Ｎ）により酸性化した。酸性
は、次に蒸溜水による洗浄によって除去し、かつ天然吸
着剤をピストンのチャンネル中に導入した。吸着剤床を
保持する二つの膜は、多孔質ポリエチレンフィルターの
二つの円板よりなった。水溶液サンプルは、１　ａｃａ
）水に溶解した３５９．３１１１！ＩのＮａ２Ｃｒ　２
０ｙ　”　２１−ｈ　Ｏｊ’３よび３６９．７ｎｚのＣ
ｕ５（Ｌ＋　・５Ｈ２０よりなった。サンプルを吸着剤
を通して導入して分析用に取った４）−ンプル用は１０
０μ℃であった。イオンをカラムから洗浄し、かつ次の
如く分離した。

蒸溜水によるアニオン。

２Ｎ塩化水素酸よりなる酸性溶液によるカヂＡン。

各部分は、試験管中に回収された。洗浄の終りは出口溶
液の色によって決定された。さらにサンプルは、種々の
部分を１１０″Ｃで乾燥し、かつ乾燥残香の重さをＨす
ることにより定量的に分析された。残香についてのブラ
ンク実験は１００μ℃のサンプルを試験管中に導入し、
かつ１１０℃で乾燥した場合なされた。固体残渣は６８
．５１１１の重さであった。

重量を削った種々の乾燥したフラクションの結果は、次
の第２表に与えられる。実験２において実験１の後にカ
ラムを、中性に洗浄し、ついで中和化した。

（以下余白） 、■ １ 翅 上記の結果から、吸着剤を通して浸漬された８つのフラ
クションの後に、基本的に全ての化合物が除去され、か
つ分離された。

本発明によりＤＣＬＣの効率を指摘するために、比較テ
ストが通常のクロマトグラフィを用いて、小ツノ流によ
ってサンプルの１００μあの同じｍで、同じ吸着剤によ
って行った。結果を次の第３表に挙げる。

（以下余白） 例　３ この実験において、３０〜３５％の（票識ヨード（’Ｉ
２）を含むβ−ｈＣＧの１００μＣの溶液を、七フ１デ
ツクス（Ｓ　ｅｐ＋＋ａｄｃｘ　）　Ｇ　−１０吸着剤
を用いて、ＤＣＬＣによって分離した。溶離は、約８の
ｐ　ｌ−１の緩衝液１０ｍ　ｌによってなされた。

各フラクションには、約０．４ｍ、ｅよりなっていた。

その結果を、次の第４に承り。

（以下余白） 第４表 セファデックスＧ−１０上で緩衝液（ｐＨ約８）により
溶離される″　Ｉ２を含むβ−ｈＣＧの分離フラクショ
ン　決定された 番号　ブランク　ｃｐｍ　合　削 １　２９．０　０ ２　９３４８．０　９５７８，０ ３　１９４６．０　１９Ｇ２．８ ４　２９２．０　２６７．７ ５　１３０．０　１０４，８ ６　１１４．０　Ｂ４．５ ７　１’０８，０　８２，０ ８　７８．０　４８，２　１２１２５ｃｐｍ０　７９．
０　４９．６ ［１９８，ＯＧ７．７ １１　１３４．０　１０２，９ １２　１ｇ２，０　１５２，５ １３　４１４．０　３８９，３ １４　４８５．０　４６４．４ １５　７６（ｉ、Ｏ７５７，５ １６８５４，０１１３４，７ １７６３５，０６１５，５ １８４５０，０４２４，２ １９５０４，０４８６，４ ２０３７８，０３４８，５ ２１２８４，０２５６，８ ２２１５８，０１２７，７ ３ 一一一一一一一一二ど−）　９９．８−一一±且肛辺り
合　計　２０５３４．０　２０５９４．４　１７２！１
４ｃｐｍ回収率は約８５％である。通常クロマトグラフ
ィで行なわれた時のこの分離は、非常によく多くの溶離
液を必要とし、そして分離のためのより多くの時間を取
るものである。

例　４ この実験において、染料混合物の溶液は、３５％セレス
レッド（Ｃｅｒｅｓ　ｒｅｄ　）　７Ｂ、２８９（＋　
（１）ニトロファストブルー２８，２５％の二１〜（コ
ファストバイオレットＦ　Ｂ　Ｌ　Ｊ５よび１２％のセ
レス（Ｑ　ｅｒａｓ）イエローＲ（全て容量％）よりな
り、ＤＣＬＣ法によって分離された。この染料は、メル
ク礼（カタログ番号９３５４）によって供されｌこ　。

ジクロロメタンの中の染料混合物３０μ℃の量を、！Ｊ
クロアし７’　（Ｌ　ｒｃＨＲＯＰＲＥＰ）Ｓｉ−６０
（メルク社によって製造、商標、カタログ番号９５３６
）を含むＤＣＬＣ中に注入した。シリカベースの吸着剤
は１５〜２５μｍのシリカの粒径を有する。カラムの大
きさは、長さ１０．６ｃｍｒ、内径１０ｍｍテあった。

流ｍは、２ｍ１１分であり、また溶離剤はジクロロメタ
ンであった。

分離の結果は、第１０図にグラフの形で示され、２５４
　ｎｍにおける光学密度（０，Ｄ）に対するフラクショ
ンであった（１・・・セレスレッド７Ｂ、２・・・二１
〜１〜ロフアストブルＢ１３・・・二１−ロファストバ
イオレットＦＢＬ、４・・・セレスイエローＲ）、。

グラフから速くて、きれいな分離が受けられたことが分
る。

例　５ この実験において、多環芳香族類の混合物はｎＺヘプタ
ン溶液中の５０％ベンゼン：３０％ナフタレンおよび２
０％アントラセン（容積％）よりなり、ＤＣＬＣ法によ
り分離された。

注入されたサンプルは、５０μ℃よりなり例４と同じ大
きさで、同じ吸着剤を含むカラムを用いる。流量は：２
＋　ｌ　／分であった。そして、各フラクションの容積
は１ｌｌであり溶離剤はｎ−ヘプタンであった。

分離の結果は、第１１図に、グラフの形で示され、２５
４　ｎ１ｌｌにおける光学密度（０，Ｄ、）に対するフ
ラクションで表わされる（１−ベン１ン、２・・・ナフ
タレン、３・・・アントラセン）。該グラフらから分る
ように、成分は、三つの鈍いピーク中に分離された。

例　に の実験にＪ）いて、フタル酸アルキルの混合物をＤＣＬ
Ｃ法によって、例４と同じカラムを用いて同じ吸着剤で
分離した。

フタル酸アルキルは、ジブチルフタレー１−、ジエチル
フタレートａ３よびジメヂルフタレ−１〜のｊ）−へブ
タン／エチルアセテート（９０，’１０容積部）中の混
合物よりなった。溶離剤は、ｎ−ヘプタン／エチルアセ
テート（９０／１０容積）の混合物であった。流量は３
ｍ１／分であり、各フラクションの容積は１ｍｌであっ
た。分離の結果は、第１２図に、グラフの形で示され、
２５４ｎｍにお【プる光学密度（０，Ｄ、）に対するフ
ラクションであられさる（１・・・ジブチフタレート、
２・・・ジエチルフタレート、３・・・ジメチルフタレ
ート）。グラフから、きれいな分離が得られたことが分
る。

例　７ 抗−ｈＣＧの精製 抗−ｈＣＧの精製を、ＤＣＬＣ法により、（ａ　）ＳＥ
ＲＯＮＤおよび（ｂ）ＭＩＬ、ＥＳの化合物の二つの異
なる源を用いて行った。後者は、前者より濃縮されない
と知られている。

（ａ　）抗−ＩＩ　ＣＧ　（ＳＥＲＯＮＯ）（７）ＩＩ
抗−１＋ｃＧの一つの小瓶を、１ｍｌのリン酸塩ａｍ液
によって再構成した。溶液を吸着剤として、３ｇのセル
ローズ（ＤＥＡＥ　ＤＥ−５２、Ｗｈａｔ　ｒｅ　ａ　
ｎ礼によって製造、商標）を含む、カラム（長さ１０．
５ｃｍ、内径１０ｍｍ）上に適用した。カラムを２．５
ｍ　ｌ　／分の流量でリン酸塩緩衝液（ｐｌ−１＝６．
３）によって溶離した。直ちに、１＝んばくしつの非常
に高いピークは、第１のフラクション（４〜８）で可視
的であった。カラムは、フローセルおよび直接的検出の
ための記録計に結合されていた。バッファはｐｌ−１＝
７．１に変え、はとんど直接的にたん白質が分った。二
つの他の主要たん白質ピークを溶離した。

測定は、２８０の光学密度（０，Ｄ、）ｎｍで各フラク
ションの吸光度を読取ることによって行った。１１ＣＧ
　ｍ識の各フラクションの免疫活性は、ＲＩＡ法によっ
て、次の溶液を用いて測定した。

１００μｆｉ　Ｉ　−ｈ　ＣＧ、１００μ℃の血清にな
いｈＣＱ及び１００μ℃の各フラクション。＋ｔＳ　ｍ
は、３時間室温で行った。分離は、ボリエチレングリコ
ール／二重抗体（２０／１容偵部）を用いて行った。

得られた結果は、次の第５表に示される。

第５表に示された結果から、三つの主要ピークが１ｑら
れたこと、免疫活性はたんばく質濃度と比べて非常に高
く残っていたことが分る。

（ｂｊ抗−ｈ　ＣＯ（Ｍ　Ｉ　ＬＥＳ）のｆｆｌ製７０
μ℃の抗体（うさぎ血清として）を、Ｄ　ＥＡＥ　ＤＥ
、５２カラムに（上記の場合と同様に）適用し、そして
、第一に、フォスフェートバッファ（ｏｆ−１＝６．３
＞によって溶離した。前の場合と同じく、早いたんばく
質ピークは、フラクション３および４で溶離された；光
学密度（０，Ｄ、）の減少およびバッフ１のｌ１ｌ−１
＝７．１の変化によって、他の三つの主要ピークが回収
された。

結果は次の第６表に示される。

く以下余白） 第６表に示された結果から、分離された抗−ｈＣＧは、
三つの主なピークで回収されたことが分る。それらの全
ては、免疫活性、２８０　ｎ１ｌｌでの吸光度およびた
ん白質Ａによる認識を示した。全てのピークは、互いに
、鋭く分離されてい、そして、回収された。

例　８ 旦」」〔立設ｊＵ【 と１〜血清の分離がＤＣＬＣ法を用いて、Ｈａｎｄｂｏ
ｏｋ　ｏｆ　Ｅ　ｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｌ　ｍ＋ｎ
ｏｌｏｇｙ　（実験免疫学ハンドブック＞　（Ｄ、　Ｍ
、　Ｗｅｉｒ　、　Ｍｄ　、　。

ＢｌａｃｋＷｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ｐｕｂｌ
ｉｃａｔｉｏｎ、　０ｘｆｏｒｄ　、　Ｌ−ａｎｄｏｎ
　、　１９７３　２ｎｄ　ｅｄ、　）に説明される手順
と同じもので行われた。

クロマ１〜グラフイは、セルローズ吸着剤上でのイオン
交換および１ｌＨ５，７のフォスフェートバッファ　（
０，０２Ｍ＞による傾斜溶離に基づいている。

内径１０ＩｌｌＩｌｌのカラムに、３ｇのＤＥＡＥ　Ｄ
Ｅ−５２（Ｗｈａｔｍａｎにより製造、商標）を充填し
、流量２．５ｍ　ｌ　７分で、フォスフェートバッファ
（ｐＨ＝８）により洗浄した。傾斜は、二つのチャンバ
ーシステムにより４．０ｍｌのｐｉ−１８フエスフエー
トバツフアで６０川１のＤＩ−１５，７７オスフエート
バツフアを用いて作られた。各１．５ｍｌのフラクショ
ンが回収され、そして、そこのたん白質含有率は、２８
Ｏｒ＋ｍでの光学密度（０，Ｄ。

）によって決定された。

結果は、次の第７表に示される。

（以下余白） 特開昭６０−３５２５７（１４） 第７表に示される結果から、ＤＣＬＣによって達成され
た分離は、二つの主要ピーク（ＩｇＧ。

アルピミン類）をもつ分離されたヒト血清の伝統的な様
子を示している。分離は、短時間に達成される。

例　９ この実験において、ＤＣＬＣ法を、親和力クロマトグラ
フィに、うさぎＩｇＧの単離のために、リガンドとして
５ＥＰＨＡＲＯ３ＳＥ〜４Ｂ（商標、Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ社によって製造）−抗体（抗体−山羊一抗うさき）を
用いて、適用した。

Ｓ　Ｅ　Ｐ　ｌ−Ｉ　Ａ　ＲＯＳ　Ｅ　−４Ｂ　：抗体
抗体を、Ｓ　Ｅ　Ｐ　ＨＡ　ＲＯＳ　Ｅ〜４Ｂ（商標、
Ｐ１＋ａｒｍａｃｉａ社により製造）吸着剤と、Ａ　ｘ
ｅｌ　Ｐ　ｏｒａ【［１ら（Ｎａｔｕｒｅ　２１４．１
９６７）の指示を用いて、結合せしめた。

ＤＣＬＣカラム：内径６ｍｍのガラスカラム、５ｅｐｈ
ａｒｏｓθ−４８＝抗体で充填せしめる。

検出二カラムから直接的に７ｏ−セル により行った。紫外線（ＵＶ）で２８０ｎｍでの吸光度 バッファ： １．７Ａスフニー１〜バツフｒ／Ｎａ　Ｃ１ｐ　Ｈ７゜
８２、　グＪシン／ＨＣＩ’（０，１Ｍ）ｌ）８２．５
手順は、次の工程を有した； （１）　Ｓ　ｅｐｔ＋ａｒｏｓｅ　−４Ｂと山羊−抗う
さぎ血清の結合。

（２＞ＤＣＬＣを５ｅｐｈａｒｏｓｅ　−４Ｂ−抗体３
ｍｌゲルで充填し、両側からフィルターシステムＶＹＯ
Ｎ（商標）約４０μｍで閉じる。

（３）充填カラムを５ｍｌのバッファ１により洗浄。

（４）カラムを０．５ｍ　ｌ　Ｎ、Ｒ，Ｓ　（正常うさ
ぎ血清ンで負荷する。

く５）２時間、３７℃で培養。

（６）バッファ１で溶離し、そしてフォトメータの光学
密度が０．１以下になるまでフラクションを回収。

（７）ｐ　ｌ−１２，５のバッファで溶離し、そして光
学密度が０．１以下になるまでフラクションを回収。

この例の親和力クロマトグラフィの概略グラフは第１３
図に示される（１・・・血清たん白質、２・・・Ｉａ　
Ｇ）。

【図面の簡単な説明】

第１〜９図は本発明を利用する装置の具体例を示す断面
図、第１０〜１２図は本発明を利用した種々の混合物の
分離のｉ’ｉ！ｉ果をグラフの形で示づものであり、ま
た第１３図は、本発明を利用した親和力クロマトグラフ
ィによるＩａＧのＩｌｌ　ＰＪｔの結果をグラフの形で
示すものである。 ＩＲ・・・試験管、　Ｃ・・・ピストン、　Ｐ・・・吸
着剤、Ｆｌ　、Ｆ２・・・膜、　Ｓ・・・栓、　Ｄ・・
・ノズル、Ｅ・・・溶離剤。 特許出願人　テクニオン、リサーチ、アンド、デベロッ
プメン１へ、ファウンデ ーション、リミデッド 第１図　第２図 第３図　第４図 第５図　第６図 第７図 第８図 第９図 第１０図 ワラクシ１ン フラクシ、ソ 第１２図 ■ 第１３図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）溶液中に存在する１以上の化合物を分離するため
   の動的カラム液体クロマトグラフィ技術のための方法に
   おいて、移動固体吸着剤床の存在があり、その底部にシ
   ーリング要部を、また二つのバリ４フ間に保持された吸
   着剤を含む縦チャンネルをもつピストンを有し、多方向
   バルブをその底部にもつ試験管を有し、かつ前記ピスト
   ンは試験管中に均密に合うものであり、ピストンを試験
   管の中に押すことにより前記バルブを通して予め圧力さ
   れた所望の溶離剤（よ、該チャンネルを通して入り、前
   記バリヤ間に分離ずべぎ吸着された化合物を移動けじめ
   、該ピストンの端部の一つに配置されたノズルを通して
   出す溶液を得ることを特徴とするクロマトグラフィ方法
   。 （２）前記バルブの閉じた位置において、溶体が固有の
   圧力下で、チャンネルを通して入り、前記バリヤ間に分
   離されるべき吸収された化合物を移動せしめることを特
   徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。 （３）動的カラム液体クロマトグラフィで利用された吸
   着剤とは異なる付加的適切な吸着剤が、導入サンプルを
   １１１１するために組み込まれることを特徴とする特許
   請求の範囲第１項または第２項に記載の方法。 （４）試験管がその底部で閉じられており、溶離剤はピ
   ストンを試験管中に下に押づ前に試験管中に導入せしめ
   られることを特徴とする特ｎ請求の範囲第１項ないし第
   ３項のいずれか一つに記載の方法。 （５）該クロマトグラフィ技術は、シリカグルりロマト
   グラフィ、逆相液体クロマｔ・グラフィ、親和力クロマ
   トグラフィ、毛細管クロマトグラフィ、クロマト−集束
   、ゲル濾過およびイオン交換クロマトグラフィから選択
   されるものである特許請求の範囲第１項ないし第４項の
   いずれが一つに記載の方法。 （６）固体吸着剤がピストンの縦ヂ１７ンネル中に配置
   されたカートリッジ中にあることを特徴とする特許請求
   の範囲第１項に記載の方法。 （７）溶液中に存在する１以上の化合物を分離する動的
   カラム液体クロマトグラフィのための装置において、底
   部にシーリング要素を、そして多方向バルブをもつ試験
   管、該試Ｐ！Ａ管中に均密に合うピストンを有し、前記
   ピストンは、二つのバリヤ間に保持された吸着剤を含む
   縦チャンネルおよび該ピストンの端部の一つに配置され
   たノズルを有することを特徴とする動的カラム液体クロ
   マトグラフィ装置。 （８）溶離剤の出口はカラムの直接連続にある垂直な狭
   いチャンネルを通してのものであることを特徴とする特
   許請求の範囲第７項に記載の装置。 （９シーリング要素は、試験管の内壁に沿って滑るに適
   合されたピストンの基礎に備えられていることを特徴と
   する特許請求の範囲第７項または第８項に記載の装置。 （１０）前記シーリング要素は不活性材料で作られであ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第９項に記載の装置
   。 （１１）該シーリング質素は、縦ヂｐンネルに結合した
   オリフィス孔を有するゴムＯ−リングによりなることを
   特徴とする特許請求の範囲第１０項に記載の方法。 （１２）該動的カラムのピストンは、２以上のりブユニ
   ツ１〜より溝成され、各ザブユニツ１〜は同一または異
   なる吸着剤を含むことを特徴とする特ｊ［請求の範囲第
   ７項ないし第１１項のいずれが−っに記載の装置。 〈１３）ノズルはピストンの上部バリヤに結合している
   ことを特徴とする特許請求の範囲第７項ないし第１２項
   のいずれが一つに記載の装置。 （１４）　１ｆｆｉがピストンの頂点に配置されている
   ことを特徴とする特許請求の範囲第７項ないし第１３項
   のいずれか一つに記載の装置。 〈１５）ノズルがチャンネルによって結合され、栓を通
   して通過していることを特徴とする特許請求の範囲第１
   ４項に記載の装置。 （１６）カラム溶媒溜めは動的カラムと結合しているこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第７項ないし第１５項の
   いずれか一つに記載の装置。 （１７）試験管は、その底部で閉じていることを特徴す
   る特許請求の範囲第７項ないし第１６項のいずれか一つ
   に記載の装置。 く１８）ピストンはガスポケットを蓄積する手段を備え
   ることを特徴とする特許請求の範囲第７項ないし第１７
   項のいずれか一つに記載の装置。 （１９）前記のガスポケットの蓄積手段は、ピストン上
   に配置された水平、垂直またはスパイラルの溝よりなる
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１８項に記載の装置
   。 （２０）Ｆ［置は不活性材料より作られることを特徴と
   する特許請求の範囲第７項ないし第１９項のいずれか一
   つに記載の装置。 （２１）該不活性材料は、金属、ガラス、ポリエチレン
   または他の適切なプラスチック材料よりなる群からｉ！
   択されることを特徴とする特許請求の範囲第２０項に記
   載の装置。