HU196915B

HU196915B - Method and apparatus for separating one or more component being in solution by chromatography

Info

Publication number: HU196915B
Application number: HU832861A
Authority: HU
Inventors: Michael Cais; Moshe Shimoni
Original assignee: Michael Cais; Moshe Shimoni; Technion Res & Dev Foundation
Priority date: 1982-08-15
Filing date: 1983-08-15
Publication date: 1989-02-28
Also published as: SE8304349D0; SE8304349L; DE3329288C2; IL66551A; IL66551A0; ZA835712B; ES8507354A1; JPS6035257A; BE897508A; NL8302726A; GB2125312A; AU1795583A; IT1194356B; AU568462B2; CH662062A5; SE457606B; IT8322354A1; DE3329288A1; GB8321305D0; CA1214398A

Description

A találmány új kromatográfiás eljárás és berendezés a „mozgó-oszlopos folyadékkromatográfiás” eljárás keretén belül egy vagy több komponens elkülönítésére. A találmány tárgyát új eljárás képezi oldatban lévő egy vagy több vegyület elkülönítésére, mozgóágyas kromatográfiás rendszert használva. A találmány tárgyához tartozik továbbá az eljárás végrehajtására alkalmas berendezés is. Mint ismeretes, a kromatográfia kifejezés nagyszámú fizikai eljárást foglal magába, amelyeket kémiai vegyületek keverékeinek a szétválasztására és azonosítására a kémiában és biológiában használnak. Valamennyi kromatográfiás eljárás elve az, hogy kémiai vegyületek elegyét folyadékkal ismételten extrahálják vagy szilárd felületen adszorbeálják. Az elegyet fizikai úton mozgatják álló fázison (ágy vagy oszlop) át, ez lehet szilárd anyag vagy folyadék; utóbbit az ágyban vagy oszlopban elhelyezett szilárd anyag pórusaiban rögzítik.

A kémiai vegyületek kromatográfiás szétválasztására — az adott kromatográfiás rendszertől függően —egy vagy több alábbi fizikai-kémiai hatás alkalmazható:

a) különbségek a porózus anyagon, az úgynevezett adszorbensen való adszorpcióban;

b) különbség az incrs közegét (álló fázist) bevonó folyadék és a porózus oszlopon átszivárgó folyadék, az úgynevezett mozgó fázis relatív oldhatósága között a porózus oszlopon való perkolálásnál;

c) különbségek a szorbensen lezajló ioncserében;

d) különbségek a molekulaméretben, amikor az oldat egy igen kis pórusméretú gélen átszívárog.

A kromatográfia lehet preparatív kromatográfia is, ha egy frakciót elegyéből további felhasználáshoz, így például spektroszkópiához, azonosításhoz, vagy kutatási vagy kereskedelmi célokra szolgáló szintézishez való elkülönítésre alkalmazzák.

Eredetileg a kromatográfia az oszlopba töltött incrs anyagon való adszorpciós különbségeken alapszik. A komponensek szétválasztása — ami megoszlásos kromatográfia néven is ismert — a komponenseknek az oszlopon áthaladó folyadékban való relatív oldhatóságán alapszik. Ennél a módszernél a kapott eredmény függ a mozgó fázis, azaz a folyadék pH-értékétől és polaritásától; a komponenseknek a két fázisban való oldhatósági viszonyaitól; a különböző anyagok megfelelő oldószerrel eluálhatók, és a folyékony frakciók egy sor kémcsőben felfoghatók, majd kémiai és fizikai módszerekkel analizálhatók.

A vékonyréteg-kromatográfia és a papírkromatográfia a komponenseknek a közömbös közegen való relatív adszorpciójában mutatkozó különbségeken alapszik. A vékonyréteg-kromatográfiában az álló fázis fmomeloszlású anyag, amelyet lemezre vagy műanyaggal bevont lapra vagy üveglemezre visznek fel. Általánosan használt és a keresekedelemben kész lemezek formájában kapható szorbensek: az alumfnium-oxid, a kovasavgél és a cellulóz. A papírkromatográfiás eljárásban a mozgó fázis a kapilláris hatás következtében felfelé is mozoghat — ez az úgynevezett felszálló kromatográfia — vagy a nehézségi erő hatására lefelé mozog — ez az úgynevezett leszálló kromatográfia.

Az ioncserés kromatográfiában a molekulák szétválasztása az iontöltésük különbségén alapszik. A szorbens vagy álló fázis polimerekből áll, amelyek kovalens kötésű ionokat tartalmaznak A kationcserélő gyantákban a vázba szorosan megkötött ionok negatív töltésűek és ezekhez elektrosztatikus erőkkel csak lazán kapcsolódnak a pozitív ionok. Az elegyből elkülönítendő pozitív töltésű ionokat szorbens adszorbeálja, miközben a gyantában eredetileg jelenlévő kationokat leadja, azaz ioncsere következik be az álló és a mozgó fázis között. Az oldatot olyan pH-értékre pufferolják, amely az adott ion kötődését megkönnyíti. Ezután ugyanezzel a pufferral eluálják a gyantát, és így a nem kötődő részeit az oldatnak eltávolítják. Az an ioncserélők ugyanilyen módon működnek, azzal az eltéréssel, hogy kovalens kötésű ionjaik ellenkező — azaz pozitív — töltésűek, s így az oldatból az anionokat kötik meg.

A molekulák méretének különbségén alapuló elválasztást gélszűréssel vagy más szóval molekulaszítás kromatográfiával végzik. Ezzel az eljárással a molekulákat nagyságuk szerint választják szét, de a gélszűrést bizonyos mértékig a molekulák alakja is befolyásolja. A gélek ágyakban vannak elhelyezve, maga a gél pórusos anyag hálózata, a pórusokban a kisebb molekulák megrekednek.

Az óriási iapri érdeklődést — ami általában a kromatográfia és főképpen a preparatív folyadékkromatográfia iránt megmutatkozik — bizonyítja a közlemények nagy száma, amelyekben különböző mikroszemcsés oszloptölteteket és előre töltött oszlopokat javasolnak, jobb elválasztást ígérve, mint ami az ezen a téren használatos ismert adszorbensekkel elérhető.

A 31 26 926 számú német szövetségi köztársasági nyilvánosságrahozatali iratban olyan kromatográfiás berendezést ismertetnek, amelynek tartálya, oszlopa, tömítő körgyűrűje és egyetlen tartóeleme van.

Arra törekedtünk, hogy olyan kromatográfiás eljárást és berendezést dolgozzunk ki, amelyben ismert adszorbenseket használunk, de az elválasztás igen gyors ás igen könnyen keresztülvihető. A találmány szerinti új kromatográfiás eljárás azon alapszik, hogy mozgó oszlopokat használunk, amelyekben az adszorbens ágy mozog, ellentétben a hagyományos kromatográfiás technikákkal, amelyeknél az adszorbens anyag nyugalomban van.

A találmány tárgya tehát — a célkitűzésnek megfelelően — új típusú kromatográfiás eljárás, az úgynevezett mozgó-oszlopos folyadékkromatográfiás eljárás oldatban jelenlévő egy vagy több vegyület elkülönítésére, amelynek lényege, hogy — az oldat szétválasztandó komponenseit legalább egy szilárd adszorbensággyal töltött, ellentétes végein be-, illetve kivezető nyílással ellátott, mozgatható kromatografáló oszlopon adszorbeáltatjuk;

— az oszlopot bevezető nyílásának irányában adott mennyiségű eluenssel töltött, csőszerűén kialakított, az oszloppal alakosan illeszkedő és azt befogadó tartályba helyezzük;

— az oszlopot a csőben lévő eluensen keresztül elmozgatjuk, oly módon, hogy a csőben létrejövő belső nyomással az eluenst az adszorbenságyon keresztül kényszerítjük és az oszlopról eluált, legalább egy elválasztott komponenst az oszlop kivezető nyílásán elvezetjük.

A célkitűzésnek megfelelően a találmány tárgyához tartozik az eluenst befogadó tartályból és a tartályban elmozgatható, alsó végén határolóelemmel

196 915 ellátott, adszorbenst tartalmazó üreges oszlopból álló mozgó-oszlopos folyadékkromatográfiás berendezés is oldatban lévő egy vagy több komponens elkülönítésére, amely áll az eluenst befogadó, csőszerűén kialakított, egyik végén zárt vagy záróeszközzel ellátott tartályból, továbbá a tartály belső falához alakosán illeszkedő, ellentétes végein be-, illetve kivezető nyílással és célszerűen felső végén záróelemmel ellátott, a tartályban dugattyűszerűen elmozgatható, két határolóelem között adszorbenst tartalmazó üreges oszlopból.

A találmány szerinti berendezés különböző kiviteli alakjait az 1—9. ábrákon mutatjuk be.

Az 1. ábra a berendezés olyan hosszmetszeti rajza, ahol a tartály záróeszköze egy többágú szelep.

A 2. ábra azonos az 1. ábrával, de a tartály egyik végén zárt és az oszlop hajlított kivezetőcsővel van ellátva.

A 3. ábrán szintén zárt a tartály és az oszlop felső végén az 1. ábrával azonosan üreges dugó van.

A 4. ábra a berendezés legegyszerűbb hosszmetszetét mutatja be.

Az 5. ábrán olyan berendezés látható, amelyben az üreges oszlopban lévő adszorbens cserélhető hetében foglal helyet.

A 6. ábrán bemutatott berendezésnél a tartály felül van, és az oszlop felfelé mozgatható. A 7. ábra a 6. ábra szerinti berendezés módosítása, itt az eluensnek külön tartálya van.

A 8. ábra két, azonos alegységből álló berendezést mutat be.

A 9. ábrán bemutatott berendezésnél a távozó eluenst egy másik kromatográfiás oszlopra vezetjük.

A 10—12. ábrák a 4., 5. és 6. példákban ismertetett különböző keverékek szétválasztásának grafikus eredményei.

A 13. ábra az IgG affinitás-kromatográfiával végzett izolálásának vázlatos grafikonja (1. 9. példa).

A berendezés különböző kiviteli alakjait és működését a későbbiekben részletesen ismertetjük.

Minden kromatográfiás eljárásnál fellépő probléma a minta egyenletes felvitele az ágy felületére. Ha a mintát közvetlenül ráöntjük az oszlopra, és hagyjuk rajta átfolyni, akkor az egyenletes felvitel viszonylag nehézkes lehet, mivel a minta bevezetésekor az ágy örvénylésre hajlamos. Ezért igen fontos az örvénylés elkerülésére, hogy a felületet például egy darab műselyem szűrőlappal lefedjük. Az oszlopok egyik gyártója a Pharmacia Fine Chemicals AB az oszlopok némelyikét felszereli egy speciális eszközzel, a minta-applikátorral, amely az ágy felületét megvédi. Ennél az eszköznél vékony nejlon-anyagot tesznek egy rövid plexicső végére, amely a kromatográfiás csőbe beleillik. Ez az eszköz természetesen növeli a berendezés költségét, ezenkívül még az a hátránya, hogy ellennyomást gyakorol a minta áramlására, s így annak haladását az oszlopon keresztül lelassítja. A találmány szerinti eljrást alkalmazó legtöbb kromatográfiás rendszerben nagymértékben csökken a minta egyenletes felvitelének problémája.

A kromatográfiás ágy mozgása közben, amikor az oszlopot a tartályba toljuk, a folyadékot felfelé kényszerítjük, így a minta bevezetésekor örvénylésre nem hajlamos. A nyomás, amit az oszlopnak a tartályba tolásával gyakorolunk a rendszerre, még gyorsítja is a minta áramlását. Egy másik mód, ami segíti a minta egyenletes bevitelét az, hogy az ágy felett elhelyezünk egy másik megfelelő adszorbenst, amely az ágyban már jelenlévő adszorbenstől különbözik. Ennek a szerepe, hogy a mintát előre koncentrálja és így elősegíti, hogy az oldódás egy keskeny sávon történik. Ilyen megfelelő adszorbens például a durvaszemcsés kovasavgél, amely a kiváló adszorbens tulajdonságokkal rendelkező aktív kovasavgéltől különbözik.

A legtöbb hagyományos kromatográfiás eljárásban gondosan ellenőrizni kell a szemcsenagyságot és a szemcsenagyság eloszlását. Mint ismeretes, kis szemcsékből álló ágy használata általában eredményesebb. Ennek oka, hogy a mechanikai mozgások, amelyek a zóna szélesedését előidézik, fokozódnak a szemcsenagyság növekedésével. Nagy szemcséknél a szemcsékbe való be- és kidiffundálás hoszszabb ideig tart. Az áramlási rendszer a nagy szemcséjű ágyakon kedvezőtlenebb, visszakeveredés inkább létrejön. Másrészt, az áramlás irányába az ellenállás egy nagy szemcsékkel töltött ágyon kisebb, és az elérhető maximális áramlási sebesség nagyobb. így a hagyományos kromatográfiás eljárásokban a szemcsenagyságot illetően meg kell alkudni, hogy a kívánt áramlási körülmények között a zóna a lehető legjobb eredményt szolgáltassa. A találmány szerinti mozgó-oszlopos folyadékkromatográfiás eljárásban kis szemcsenagyságú adszorbens használható, anélkül, hogy az ismert eljárások hátrányai jelentkeznének. Az a kis nyomás ugyanis, amit a rendszerben jellemzően alkalmazunk, legyőzi az áramlás irányába. azt az ellenállást, amit a szemcsék kis szemcsenagysága idéz elő. így a találmány szerinti eljárás még kritikus frakcionálási célokra is használható, amikor a kívánt eredmény elérése céljából feltétlenül finomszemcsés anyagot kell alkalmazni.

A 31 26 926 számú német szövetségi köztársasági nyilvánosságrahozatali iratból megismerhető berendezésben van egy eszköz légzsák kialakítására, hogy a membránra kifejtett nyomást csökkentsük. A keverő szeparátor működése alatt a légzsákba meghatározott mennyiségű levegő szorul, amely kompressziós hatásra úgy működik, mint egy párna vagy lökéscsillapító; a légzsák felveszi annak a nyomásnak egy részét, ami a membránnak a folyadékáramlásra gyakorolt ellenállásából származik. A találmány szerinti mozgó-oszlopos folyadékkromatográfiánál a légzsák alkalmazása kevésbé szükséges mint az előző esetben. Bizonyos rendszereknél azonban — ahol viszonylag nagy nyomások lépnek fel — úgy látszik, hogy a légzsáknak fontos szerepe van, mivel a benne lévő levegőmennyiség a tartályba szorítja vissza azt a folyadékot, amely a tartály belső fala és az oszlop végének külső fala közötti résbe esetleg felszivárgott. Az oszlopon az említett eszközzel a légzsákba bezárt levegő mennyisége számos tényezőtől függ, így a válaszfal típusától, a szétválasztandó keverékek komponenseitől és a specifikus kromatográfiai rendszerben fennálló speciális körülményektől. Ilyen légzsákot elsősor3

196 915 bán akkor előnyös használni, amikor az eluens és az oszlop alján elhelyezett, a tömftőelem szerepét betöltő körgyűrű érintkezését mellőzni kell.

A találmány szerinti eljárás sikeresen alkalmazható a kromatográfia különféle területein, így a kovasvgél-kromatográfiában, a fordított fázisú folyadékkromotagráfiában, a kapilláris-kromatográfiában, az affinitás-kromatográfiában, a kromato-fokuszálásban, a méret szerinti kizárásos kromatográfiában — más néven gélszűrésben — és az ioncserélő kromatográfiában.

A kovasavgél-kromatográfía az egyik legáltalánosabb kromatográfiás eljárás. A kovasavgél meszsze az egyik legjobb ismert adszorbens, amely viszonylag olcsó más anyagokhoz hasonlítva. A találmány szerinti eljárásban a kovasavgéllcl kapott elválasztási eredmények — ami az elválasztás pontosságát és a kitermelést illeti — lényegileg azonosak vagy jobbak, mint a hagyományos eljárásokkal kapott eredmények, de a találmány szerinti eljárás kényelmesebb, mivel gyorsabb és kevesebb oldószerre van szükség. A találmány szerinti eljárásnak még az a különleges előnye van, hogy az oszlop újra felhasználható, továbbá kisebb méretű kovasavgél szemcséket és tömörebb töltést lehet alkalmazni, ennek eredménye a jobb elválasztás.

A fordított fázisú folyadékkromatográfiát az jellemzi, hogy az álló fázis kevésbé poláris, mint a mozgó fázis. Ennek fő hátránya a kovasavgél-kromatográfiával összehasonlítva az, hogy az ilyen ágyán átvezetett vegyületeknek csak egy része különíthető el. A találmány szerinti mozgó-oszlopos folyadékkromatográfia előnyeit kihasználva, a fordított fázisú folyadékkromatográfia is sikeresen alkalmazható a preparatív kormatográfiában.

Újabban a kapilláris-kromatográfia nagyobb jelentőségre tett szert, elsősorban a nagyteljesítményű folyadékkromatográf iához kifejlesztett mikrooszlopok tekintetében. Ezek kifejlesztésének oka a kapilláris-kromatográfia következő előnyeiben rejlik:

a) megvalósítható komplex keverékek jobb hatásfokú szétválasztása és az oldott anyagok éles elválasztása,

b) a felhasznált eluens mennyiség lényegesen csökken.

A találmány szerinti mozgó-oszlopos folyadékkromatográfiás eljárás könnyen alkalmazható a kapilláris-kromatográfiához úgy, hogy az ismertetett oszlopot vékony csatornával látjuk el.

A gélszűrés — ami méret-kizáró kromatográfia néven is ismert — egyre nagyobb érdeklődésre tesz szert biológiai anyagok tisztításánál, elválasztó közegként megfelelő adszorbenst használva. Jó eredményeket értünk el jelzett jódot tartalmazó hCG-oldatból a jelzett jód elválasztásánál, Sephadex G-típusú adszorbenst használva (Pharmacia Fine Chemicals, Sweeden), a találmány szerinti mozgó-oszlopos kromatográfiát alkalmazva (3. példa). A gélszűréses kromatográfia egyszerű és gyors módszer pufferok sómentesftésére vagy átalakítására. A gélágyat a kísérlet előtt egyensúlyba kell hozni egy megfelelő ionösszetételű oldattal, sómentesftés esetében például desztillált vízzel. Az eluálást ugyanezzel a folyadékkal végezzük. Az alkalmaz4 ható nagy sebességek következtében az egész eljárás rövid idő alatt elvégezhető, a sómentesített anyagot néhány perc alatt kapjuk. Más területei a gélszűréses kromatográfiának a dinamikus kiomatográfia alkalmazását tekintve, a nagyteljesítményű folyadékkromatográfiánál végzett előkezelés, majd az elválasztás után a híg minták koncentrálása.

A kromato-fokuszálást széles körben használják proteinek szétválasztására, izoelektromos pontjaik szerint. Mivel a kromato-fokuszálásnál az elválasztandó anyagnak igen keskeny sávjait kapjuk és az eljárás általában hosszú, szűk keskeny oszlopokat igényel, a mozgó-oszlopos folyadékkromatográfia vékony oszlopot alkalmazva ideálisnak látszik erre a célra.

Λ mozgó-oszlopos folyadékkromatográfia alkalmazható a jól ismert, széleskörben alkalmazott ioncserélő kromatográfiához is. Számos kísérletet végeztünk réz-szulfát és nátrium-bikromát szétválasztására Dowex 50 WX 8 adszorbensen (2. példa). Azt találtuk, hogy a mozgó-oszlopos folyadékkromatográfia alkalmazása igen előnyös az időtartam, az oldószer-térfogat és a kényelmes kivitelezés szempontjából.

A találmány szerinti mozgó-oszlopos folyadékkromatográfia alkalmazásával a holttérfogat lényegesen csökken. Mint ismeretes, a holttérfogat (hézagtérfogat) a folyadéknak az a térfogata, amely az ágy adszorbens szemcséi közötti teret foglalja el. A legtöbb hagyományos kromatográfiás eljárásban a pontos eredménymeghatározás szempontjából a holttérfogat problémát jelent. A mozgó-oszlopos folyadékkromatográfiánál, mivel az oszlop tömör lehet az anyag egyensúlyi megoszlása az adszorbens és a folyadék között igen gyorsan beáll, igen kis holttérfogattal. Ennek megfelelően éles és keskeny zónákat kapunk. Ez igen fontos a frakcionáló kísérletekben, ahol az anyagok között eluált térfogatok különbsége általában kicsi. Kiváltképpen a gélszűrésnél rontja le a nagy holttérfogat a kapott eredményt.

Az 1. ábra szerint az 1 tartály fel van szerelve egy Luer féle 9 zárószerkezettel, amelyhez egy háromágú 3 szelep csatlakozik. A szükséges 4 eluenst az 1 tartályba kényszerítjük. Az 5 oszlop üreges, amelyben a 6 adszorbens van elhelyezve, ezt az oszlop tetején és alján két 7 és 8 határolóelem, előnyösen tartja. A felső 8 határolóelem felett egy 2 záróelem van egy 10 kivezetőnyílással, amelyen keresztül az elválasztott frakciót az adszorbens-ágyról eltávolítjuk. Az oszlop alsó részén van egy 11 tömftőelem, amely úgy van az 5 oszlophoz illesztve, hogy az 1 tartály belső fala mentén csússzon.

A 4 eluenst tartalmazó 1 tartály alján egy- vagy többágú 3 szelep helyezhető el. A többágú 3 szelep használata igen fontos, ha egymást követően több eluenst kell bevezetni az 1 tartályba, amelyeket a 6 adszorbens ágyon vezetünk tovább, és így jön létre a szükséges frakcionálódás. Ha a 6 adszorbenst főleg egy minta előkezelésére vagy egy vegyület elkülönítésére használjuk, akkor a 3 szelep alkalmazása nem feltétlenül szükséges, hanem használható egy egyszerű 1 tartály is, amelynek alsó része zárt és amelybe az 5 oszlop beleillik. Ebben az esetben a 4 eluenst még az 5 oszlop betolása előtt kell az 1

196 915 tartályba tölteni. Természetesen még abban az esetben is, amikor nem kívánunk frakcionálni, sokkal előnyösebb záróelemes tartályt használni, az adszorbens mosása és az eluensnek a 3 szelepen át felszívással való bevezetése érdekében.

Az 5 oszlop a csőszerűén kialakított 1 tartály belső fala mentén csúsztatható 11 tömítőelemet tartalmazhat, amely jó érintkezést létesít a tartály belső falával, biztosítva az 5 oszlop illeszkedését. A 11 tömftőelem általában gumiból vagy más megfelelő anyagból álló 0-gyűrű, amely alkalmas arra, hogy a tartály belső fala mentén csússzon. Ha a berendezést üvegből készítjük el, akkor az 5 oszlop külső falát olyan simára kell készíteni, hogy a tömftőelemet helyettesíteni tudja.

A 2. ábrán látható berendezésnél nincs szelep az tartály alsó részén, mivel itt a választott 4 eluens bizonyos mennyiségét töltjük induláskor az 1 tartályba. Az 5 oszlop üreges, amelyben a 6 adszorbens helyezkedik el, ezt két 7 és 8 határolóelem tartja. A felső 8 határolóelem felett egy 2 záróelem van. A 10 kivezetőcső, amelyen keresztül az elválasztott frakciót az adszorbens-ágyról eltávolítjuk, összeköttetésben áll az 5 oszloppal. Az 5 oszlop alsó részén van egy körgyűrű, mint 11 tömftőelem. Ezt a készüléket akkor használjuk, ha nincs szükség frakcionálásra, az eljárás egyetlen eluenssel végzett egyetlen ciklusból áll.

A 3. ábrán látható berendezésen az 1 oszlop pontosan olyan, mint a 2. ábrán, az alján záróeszköz nélkül. Az 5 oszlop üreges, amelyben a 6 adszorbens helyezkedik el. Az adszorbenst két 7 és 8 határolóelem tartja. A felső 8 határolóelem felett egy 2 záróelem van, egy 10 kivczctőnyilással, amelyen keresztül az elválasztott frakciót az adszorbens-ágyról eltávolítjuk. Az oszlop alsó részén van az O-gyűrű, mint 11 tömftőelem.

A 4. ábrán látható a berendezés legegyszerűbb formája, az 1 tartály alján itt sincs 3 záróoszlop és záróelem sincs az oszlop felső részén. Induláskor a választott 4 eluens adott mennyiségét töltjük az 1 tartályba. Az 5 oszlop üreges, ebben van a 6 adszorbens, amit két 7 és 8 határolóelem, előnyösen membrán vagy szűrő tart. All tömftőelem az oszlop alsó részén van elhelyezve és feldata a tömítés, mivel úgy van az 5 oszlophoz illesztve, hogy az 1 tartály belső fala mentén csússzon. A 6 adszorbenst tartalmazó csatornával van összekötve egy 10 kivezetőnyílás, amelyen keresztül az elválasztott frakciót eltávolítjuk.

Az 5. ábra azt a kiviteli módot szemlélteti, amikor a szükséges 6 adszorbenst egy 12 betét tartalmazza, és ez az 5 oszlop hosszanti irányú 13 üregébe van behelyezve. A 12 betét cserélhető. Az elválasztott frakció — mint azt az előző ábráknál ismertettük — egy kivezetőcsövön keresztül távolítható el. Az 5 oszlop alsó részén körgyűrű 11 tömítőelem van.

A 6. ábra a mozgó oszlopnak egy olyan kiviteli módját szemlélteti, amikor az 5 oszlop felfelé mozog az 1 tartályban és az eluens egy vékony, függőleges 14 csövön át távozik, amely közvetlen folytatása az oszlop kromatográfiás adszorbensének. Itt egy további határolóelem és a 7 határolóelem között durvaszemcsés adszorbens van.

A 7. ábra a 6. ábra szerinti mozgó oszlop egy módosított változata, amelynél az oszlophoz szükséges oldószer tartálya van a mozgó oszloppal aló vezetéken összeköttetésben.

A 8. ábra a berendezésnek egy olyan kiviteli alakját szemlélteti, amelynél a dinamikus 5 oszlop két vagy több alegységből áll, amelyek azonos vagy különböző 6 adszorbenseket tartalmaznak. Ennél a berendezésnél meg van a lehetőség arra, hogy az cluenst mindegyik alegységen átvezessük.

A 9. ábra egy másik változat, amely a mozgóoszlopos folyadékkromatográfia sokoldalúságát szemlélteti, annak alkalmazási köre tovább tágítható. Ennél a kiviteli alaknál a távozó eluenst egy másik 5 oszlophoz vezetjük, amely azonos vagy nás 6 adszorbenst tartalmaz.

A berendezés működése igen egyszerű, amint azt az 1. ábrára hivatkozva ismertetjük. Az 5 oszlopot betoljuk az 1 tartályba, amely meg van töltve a választott 4 eluenssel így kényszerítjük az eluenst, hogy áthaladjon az alsó 7 határolóelemen, majd az 5 oszlopban lévő 6 adszorbensen, és végül kicsepegjen a 10 kivezető nyíláson. Ha a berendezést megfelelő 6 adszorbenssel megtöltjük, akkor úgy működik mint egy kromatográfiás oszlop. Az í tartály újratöltését egyszerűen úgy végezzük, hogy 9 zárószerkezetet kinyitjuk, és a 3 szelepen keresztül még vezetünk eluenst a berendezésbe.

A mozgó-oszlopos kromatográfia elvileg alkalmazható folyékony ioncserélőkhöz is. A folyékony ioncserélők folyadék-folyadék extrakciós rendszerek, amelyek — legalábbis formailag — úgy működnek, hogy az ionok kicserélődnek egy vizes oldat és egy vízzel nem elegyedő oldószer érintkezési felületén, ahol az extrabáló oldószer keveredése a vizes fázishoz elhanyagolható.

Folyékony anioncserélőket használnak a fordított fázisú extrakciós kromatográfiában. Ennél a technikánál a folyékony anioncserélővei impregnált hordozó anyag (kovasavgél, cellulózpor stb.) az álló fázis és egy savat vagy ennek egy sóját tartalmazó vizes oldat az eluens (mozgó fázis). A találmány szerinti eljárásban ilyenkor a membránt úgy kell megválasztani, hogy csak az eluenst engedje át, de a folyékony ioncserélőt nem, utóbbinak az oszlop hosszanti irányú csatornájában kell maradni.

A találmány szerinti mozgó-oszlopos folyadékkromatográfiához alkalmazott berendezés elkészíthető bármely közömbös anyagból, így üvegből, polietilénből vagy bármely más műanyagból, sőt — speciális esetben — fémből is.

A találmány szerinti eljárás megvalósítását közelebbről a példákkal szemléltetjük, anélkül, hogy a találmány oltalmi körét ezekre, vagy a leírásban ismertért kiviteli módokra korlátoznánk.

196 915

1. táblázat folytatás

1. példa

Ferrocén és ferrocén-aldehid keverékének szétválasztása

a) Az oszlop töltése

1,0 g kovasavgélt (Merck, Kieselgel H, Type 60) diszpergálunk diklór-metán és hexán 1:1 arányú, gázmentesített oldatának 5 ml-ében, szuszpenziót képezve a zárt 1 tartályban. Λζ 5 oszlopot a 2 dugóval és a felső 8 határolóelemmel a tartályba toljuk, amíg all körgyűrű és az 1 tartály között szoros kontaktus jön létre. Az egész egységet megfordítjuk, hogy függőlegesen, a 2 dugón álljon, és a levegőt az 1 tartály 9 kivezető csövén eltávolítjuk. Ezután az 1 tartály 9 kivezetőcsövét lezárjuk és a töltést ügy végezzük, hogy az 1 tartályt mozgatjuk lefelé az álló 5 oszlopon, kb. 1 ml/perc áramlási sebességet létesítve. Amikor a kovasavgél-ágyat teljesen betöltöttük, az 1 tartály kivezető csövét megnyitjuk és a tartályt az 5 oszlopról eltávolítjuk. Az alsó 7 határolóelemet helyretesszük, és az oszlop kész a minta bevitelére.

b) A minta bevitele

Ferrocén és ferrocén-aldehid keverékét feloldjuk 0,2-0,4 ml diklór-metánban és az oldatot a függőlegesen álló oszlop alsó 7 határolóelemére felviszszük. Az oldat áthatol a határolóelemen, és a komponensek a kovasavgélen adszorbeálódnak. Ezt a folyamtot meggyorsíthatjuk úgy, hogy zárt oszlopot használva levegőnyomást alkalmazunk.

c) Eluálás

A megtöltött 5 oszlopot az 1 tartályba helyezzük, mely utóbbi 5 ml választott eluenst tartalmaz. A levegőt eltávolítjuk az oszlop töltése közben, és az eluálást úgy végezzük, hogy az oszlopot a megtöltött tartályba eresztjük, körülbelül 1 ml/perc áramlási sebességgel.

Az eredményeket az 1. táblázatban fogaljuk össze.

1. táblázat

I. 13 mg ferrocént és 19 mg ferrocén-aldehidet tartalmazó modell-keverék szétválasztása

Frakció száma	Eluens térfogata	Eluens	A maradék tömege	Megne- vezés
0	1 ml	hexán	0	üres
1	1 ml	hexán	11,4 ing	ferrocén
2	1 ml	hexán	0,79	ferrocén
3	1 ml	hexán	0,31	ferrocén
4	1 ml	diklór- metán	nyomok	üres
5	1 ml	diklór- metán	1,79	aldehid

Frakció száma	Eluens térfogata	Eluens A mata- Megne-
dék tömege	vezés
6	1 ml	diklór- 13,36 metán	aldehid
7	1 ml	diklór- 4,59 metán	aldehid
8	1 ml	diklór- 1,69 metán	aldehid
9	1 ml	diklór- nyomok	üres

metán

II. 25,3 mg ferrocént és 15,6 mg ferrocén-aldehidet tartalmazó modell-keverék szétválasztása

Frakció száma	Eluens térfogata	Eluens	A maradék tömege	Megne- vezés
0	1 ml	hexán	0,2	ferrocén
1	1 ml	hexán	19,4 mg	ferrocén
2	1 ml	hexán	1,7	ferrocén
3	1 ml	hexán	0,3	ferrocén
4	1 ml	hexán	0	üres
5	1 ml	diklór- metán	0	üres
6	1 ml	diklór- metán	0,2	aldehid
7	1 ml	diklór- metán	11,5	aldehid
8	1 ml	diklór- metán	2,9	aldehid
9	1 ml	diklór- metán	0	aldehid
10	1 ml	diklór- metán	0	üres
		2. példa
Na₂Cr₂O₂.	2H₂O és	CuSO₄.	5ll₂O szétválasztása

ioncserével

Az adszorbens Dowex 50 WXS (200—400 mesh méretű). Az adszorbenst először átmossuk, körülbelül 30 percig desztillált vízben állni hagyjuk és ezután 2 n sósavval megsavanyítjuk. Ezt követően desztillált vízzel végzett mosással a savat eltávolítjuk, és a semleges adszorbenst az oszlop üregébe töltjük. A 6 adszorbens-ágyat tartó két 7 és 8 határolóelem két porózus polietilén-szűrő.

A vizes mintaoldat 359,3 mg Na₂Cr₂.2H₃O-ot és

369,7 mg CuSO₄.51 I₂O-t tartalmaz 1 ml vízben oldva.

A mintát átvezetjük az adszorbensen, a kísérlethez vett minta mennyisége 100 pl. Az ionokat lemossuk az oszlopról, a következőképpen választva szét:

az anionokat desztillált vízzel, a kationokat 2 n sósavból álló savas oldattal.

A frakciókat kémcsövekben fogjuk fel. A mosás végt a távozó oldat színe alapján határozzuk meg.

-611

196 915

3. táblázat

Ioncserés szétválasztás hagyományos kromoatográfiás oszlopot alkalmaz va

A mintákat a továbbiakban kvantitatív analízisnek vetjük alá, úgy, hogy a különböző frakciókat 110 °C-on megszárítjuk ős a száraz maradékot megmérjük. A maradékokhoz vakpróbát végeztünk úgy, hogy 100 μΐ mintát vettünk kémcsőbe és 110 °C-on megszárítottuk. A szilárd maradék súlya

68,5 mg.

A különböző szárított frakciók súlyát a 2. táblázat szemlélteti. Az 1. kísérlet után a 2. kísérlethez az oszlopot semlegesre mostuk és semlegesítettük.

A szárított

Frak- frak- Összes ció Eluens ció tömeg Megjegyzés száma törne- (mg) gc (mg)

2. tdbldzat

Ioncserés szétválasztás dinamikus kromatográfiával

Kísérlet Frakció száma száma	Eluens	A szárított frakció tömege (mg)	Összes tömeg (mg)	Meg- jegyzés
1. 1	HjO	43,0
2	H₂O	0,2
3	h₂o	0	43,2	*
4	2 n Ha	0,5
5	2 n l ia	15,2
6	2 n Ha	27,5
7	2nHQ	3,2
8	2 π Ha	1.3	47,7	♦

* színtelen frakció

9

H₂O 0,8

H₂O 50,3

HjO 1,3 ll₂O 0,5 H₂O 0,2 H₂O 0,3 H₂O 0,4 H₂O 0,1 H₂O 0,3 H₂O 0,4 I1₂O 0,1 H₂O 0,3

H₂O 0,1 54,9 színtelen frakció 2 n HCl 0,0 2 n HCl 2,3 2nHCl 23,0 2nHCl 12,7 2 n HQ 3,3 2 n HQ 1,4 n HQ 1,4 44,1 színtelen frakció

Kísérlet Frakció száma száma ^Eluens	A szárított frakció tömege (mg)	Összes tömeg (mg)	Meg- jegyzés
2. 1 H₂O	44,2
2 H₂O	1,1
3 I1₂O	0,1	45,3	*
4 2nHa	0,4
5 2nHO	2,3
6 2ηΗΩ	34,0
7 2 n HÓ	5,7
8 2nHa	0,8	43,2	*
* színtelen frakció
Λ fenti eredményekből látható, hogy	miután

3. példa

Ebben a kísérletben 100 μΐ 30—35 % jelzett jódot (*J₂) tartalmazó béta-hCG-oldatot (humán koriongonadotrop hormon) választottunk szét dina40 mikus-oszlopos folyadékkromatográfiával, Sephadex G-10 adszorbenst használva. Az eluálást 10 ml, körülbelül 8 pl 1-éitékű puffénál végeztük. Minden egyes frakció körülbelül 0,4 ml térfogatú. Az eredményeket a 4. táblázat szemlélteti.

4. táblázat *J₂-tartalmú béta-hCG elválasztása Sephadex G-10 adszorbensen, kb. 8 pH-értékűpufferral eluálva nyolc frakció átszivárgóit az adszorbensen, lényegileg az összes vegyületet eltávolítottuk és szétválasztottuk.

Abból a célból, hogy rámutassunk a találmány szerinti dinamikus-oszlopos folyadékkromatográfta hatásosságára, összehasonlító kísérletet végeztünk hagyományos, gravitációs áramlásit kromatográfiát alkalmazva, azonos mennyiségű, 100 μΐ mintával és azonos adszorbenssel. Az eredményeket a 3. táblázat szemlélteti.

55	Frakció száma	Vakpróba	Percenkénti számlálás (cpm)	Összesen
	1	29,0	0
	2	9348,0	9578,0
60	3	1946,0	1062,8
	4	292,0	267,7
	5	130,0	104,8
	6	114,0	84,5
	7	108,0	82,0
65	8	78,0	48,2	12125 cpm

-713

196 915

4. táblázat folytatás

Frakció száma	Vakpróba	Percenkénti számlálás (cpm)	Összesen
9	79,0	49,6
10	98,0	67,7
11	134,0	102,9
12	182,0	152,5
13	414,0	389,3
14	485,0	464,4
15	766,0	757,5
16	854,0	834,7
17	635,0	615,5
18	450,0	424,6
19	504,0	486,4
20	378,0	348,5
21	284,0	256,8
22	158,0	127,7
23	131,0	99,8	5 169 cpm
Összesen	20534,0	20549,4	17294

A fentiekből kitűnik, hogy a kitermelés körülbelül 85%-os. Ha ezt az elválasztást hagyományos kromatográfiával végezzük, akkor sokkal több eluensre van szükség és az elválasztás több időt vesz igénybe.

4. példa

Ebben a kísérletben egy színezék-keveréket választottunk szét dinamikus-oszlopos folyadékkromatográfiával. A keverék összetétele: 35% Ceres red 7B, 28% Nitro fást blue 2B, 25% Nitro fást violet FBL és 12% Ceres ycllow R (valamennyi térfogatszázalékban). Ez a színezék-keverék Merck gyártmány (katalógus száma 9354).

A színezék-keverék 30 pl diklór-metános oldatát dinamikus-oszlopos folyadékkromatográfiás berendezésbe injektáljuk, amelynek adszorbense Lichroprep Si-60 (Merck gyártmány, katalógus száma 9336), egy szilikagél alapú adszorbens, a szilikagél szemcsenagysága 15—20 pm. Az oszlop méretei: hossza 10,6 cm és belső átmérője 10 mm. Az áramlás sebessége 2 ml/perc, az eluens diklór-metán.

A szétválasztás eredményeit a 10. ábra szemlélteti grafikusan. Λ grafikon a frakciók 254 nm-en mért optikai sűrűségét (O. D. = optical density) adja meg.

5. példa

Ebben a kísérletben policiklusos aromás vegyületek keverékét választottuk szét dinamikus-oszlopos folyadékkromatográfiával. A keverék: 50% benzol, 30% naftalin és 20% antracén (térfogatszázalékok) n-heptánban oldva.

pl mintát injektáltunk, a 4. példa szerinti méretű oszlopot és ugyanazt az adszorbenst használva.

Az áramlás sebessége 2 ml/perc, minden egyes frakció térfogata 1 ml. Az eluens n-heptán.

A szétválasztás eredményeit all. ábra szemlélteti grafikusan. A grafikon a frakciók 254 nm-en mért optikai sűrűségét adja meg. Amint az a grafikonból látható, a komponensek szétválasztása három éles csúcsot ad.

6. példa

Ebben a kísérletben alkil-flalátok keverékét választottuk szét dinamikus-oszlopos folyadékkromatográfiával, a 4. példa szerinti oszlopot és adszorbenst használva. Az alkil-ftalát-keverék dibutil-ftalátot, dietil-ftalátot és dimetil-ftalátot tartalmazott n-heptán és etil-acetát 90:10 térfogatarányú keverékében. Az eluens n-heptán és etil-acetát 90:10 térfogatarányú keveréke. Az áramlási sebesség 3 ml/perc, a frakciók térfogata 1—1 ml.

A szétválasztás eredményét a 12. ábra szemlélteti grafikusan, a grafikon a frakciók 254 nm-en mért optikai sűrűségét adja meg. Amint az a grafikonból látható, éles elválasztást kaptunk.

7. példa

Anti-hCG tisztítása

Az anti-hCG tisztítását dinamikus-oszlopos folyadékkromatográfiával végeztük, két különböző forrásból származó vegyületet használva: a) a SERONO cég gyártmányát és b) a MiLES cég gyártmányát, melyek közül az utóbbi, mint ismeretes, kevésbé koncentrált, mint az előbbi.

a) SERONO-féle anti-hCG tisztítása

Egy fiola anti-hCG-t feloldunk 1 ml foszfát-pufferban (pH = 6,3). Az oldatot 10,6 cm hosszú és 10 mm belső átmérőjű oszlopra visszük, amely adszorbensként 3 g Whatman-féle DEAE DE-52 cellulózt (védjegyzett termék) tartalmaz. Az oszlopot

6,3 pH-értékű foszfát-puffcrral eluáljuk 2,5 ml/ perc áramlási sebesség mellett. Már az első frakciókban (4—8.) igen nagy protein-csúcsot kapunk. Az oszlopot a közvetlen kimutatás céljából mérőcellával és regisztráló berendezéssel kötjük össze. A puffer pll-értékét 7,1-re változtatva, ez csaknem azonnal proteinek megjelenését idézte elő. Az cluálás még két nagy protein-csúcsot eredményezett.

A meghatározást úgy végeztük, hogy minden egyes frakció optikai sűrűségét (O.D.) mértük, az abszorpciót 280 nm-en leolvasva. Az immunológiai aktivitást a hCG-tartalmú frakciók meghatározásával RIA (radio-immuno-assay) módszerrel végeztük, a következő oldatokat használva: 100 pl ^,25JhCG, 100 pl hCG-mentes szénun és az egyes frakciók 100 μΐ-e. Az inkubálást 3 órán át szobahőmérsékleten végeztük. A szétválasztást polietilénglikol/kétszeres antitest (20/1 térfogatrész) összetétellel végeztük.

-815

196 915

A kapott eredményeket az 5. táblázat szemlélteti

5. táblázat

SERONO-féieanti-hCG elkülönítése DEAE DE-52 adszorbensen

Frakció száma	O.D.	RIA kötés %	Frakció száma	O.D.	RIA kötés %
1	0,004	0,1 %	16	0,013	19 %
2	0,002	0,1%	17	0,039	16,4%
3	0,004	14,1%	18	0,03	5,0%
4	0,006	2,1%	19	0,012	3,0%
5	0,63	22,8%	20	0,019	6,4%
6	0,879	12,3%	21	0,044	10,3%
7	0,097	2,8%	22	0,029	4,5%
8	0,01	0,1%	23	0,018	4,0%
9	0,008	0,1%	24	0,015	3,0%
10	0,003	0,1%	25	0,008	2,6%
11	—	0,1%	26	0,002	2,4%
12	0,002	0,1%	27	0,002	0,1%
13	0,002	0,1%	28	0,01	0,1%
14	0,003	0,1%	29	—	0,1%
15	0,01	0,1%

Amint az az 5. táblázat eredményeiből látható, három fő csúcsot kaptunk, az immunológiai aktivitás a proteinkoncentrációhoz viszonyítva igen nagy maradt.

b) MILES-féle anti-hCG tisztítása pl antitestet (nyúl szérumot) az előzőleg azonos DEAE DE-52 oszlopra vittünk, és először 6,3 pH-értékű foszfát-pufferral eluáltuk. Mint az előző esetben, most is gyors proteincsúcsot eluáltunk a 3. és 4. frakciókban; az optikai sűrűség (O.D.) csökkenésével és a puffer pH-értékének 7,1-re változtatásával három másik főcsúcsot kaptunk.

Az eredményeket a 6. táblázat szemlélteti.

6. táblázat

MILES-féle anti-hCG elkülönítése DEAE DE-52 adszorbensen

Frakció száma	O.D.	RIA kötés %	Protein A* kötés %
1	0,01	0,1%
2	0,102	0,1%	—
3	0,656	64,2%	2,6%
4	0,416	45,6%	—
5	0,091	0,1%	—
6	0,055	0,1%	—
7	0,044	0,1%	—
8	0,022	0,1%	—
9	0,016	0,1%	—
10	0,007	0,1%	—
11	0,005	0,1%	—
12	0,003	0,1%	—

6. táblázat folytatás

Frakció száma	O.D.	RIA kötés %	Protein A* kötés %
13	0,003	0,1%	_
14	0,004	0,1%	—
15	0,001	0,1%	—
16	0,004	0,1%	—
17	0,011	0,1%	—
18	0,034	65,4%	7,2%
19	0,291	55,5%	12,1%
20	0,247	61,4%	11,6%
21	0,094	63,6%	7,0%
22	0,042	64,8%	7,2%
23	0,041	63,4%	—
24	0,07	1,0%	—
25	0,518	60,3%	5,9%
26	0,518	67,7%	5,3%
27	0,299	55,5%	4,5%
28	0,161	58,4%	3,7%
29	0,120	66,0%	2,5%
30	0,112	54 %	1,8%
31	0,091	51,3%	3,9%
32	0,074	59,7%	2,4%
33	0,062	55,7%	nem ismert
34	0,062	60,9%	—
35	0,043	59,5%	1,9%
36	0,034
37	0,035
38	0,029
39	0,021

Amint az a 6. táblázat eredményeiből kitűnik, az elkülönített anti-hCG-t három főcsúcsba kaptuk. Valamennyi immunológiai aktivitást mutatott, adszorpciót 280 nm-en és Protein A*-val kimutatható volt. Valamennyi csúcs élesen elvált egymástól ás ezeket izoláltuk.

8. példa

Humán szérum szétválasztása

Humán szérum szétválasztását dinamikus-oszlopos folyadékkromatográfia alkalmazásával végeztük a Handbook of Experimental Immunology (D.

M. Weir, Md. Blackwell Scientific Publications, Oxford, London, 1973. 2. kiadás) eljárás szerint. A kromatográfia ioncserén alapszik, cellulóz adszorbensen és 5,7 pH-értékű, 0,02 M foszfát-pufferral végzett grádiens-eluálással.

A 10 mm belső átmérőjű oszlopot megtöltjük 3 g DEAE DE-52 (védjegyzett Whatman gyártmány) adszorbenssel és 2,5 ml/perc áramlási sebesség mellett 8 pH-értékű foszfát-pufferral mossuk. Λ grádicnst két tartállyal hozzuk létre, 40 ntl S pll-értékű foszfát-puffért és 60 ml 5,7 pH-értékű foszfát-puffért használva. 3 ml humán szérumot választottunk szét, 1,5 ml-es frakciókat szedve, amelyek proteintartalmát a 280 nm-en mért optikai sűrűség (O.D.) alapján állapítottunk meg. Az eredményeket a 7. táblázat szemlélteti.

-917

196 915

7. táblázat /hintán szérum szétválasztása (optikai sűrűség 280 nm-en)

Frakció száma	O.D.	Frakció száma	O.D.	Frakció száma	O.D.
1	0,0017	13	0,052	25	0,06
2	1,3	14	0,061	26	0,026
3	1,3	15	0,102	27	0,008
4	1,3	16		28	0,004
5	0,554	17	0,187	29	0,011
6	0,262	18	0,355	30	0,003
7	0,135	19	0,379	31	0,008
8	0,082	20	0,361	32	0,015
9	0,067	21	0,313	33	0,016
10	0,064	22	0,233	34	0,011
11	0,055	23	0,156	35	0,005
12	0,052	24	0,098	36	0,006

Amint az a 7. táblázat eredményeiből látható, a dinamikus-oszlopos folyadékkromatográfiával kapott szétválasztás a szétválasztott humán szérum hagyományos képét mutatja két főcsúccsal (IgG, albuminok). A szétválasztás rövid idő alatt végbement.

9. példa

Ebben a példában a dinamikus-oszlopos folyadékkromatográfiát affínitás-kromatográfiához alkalmaztuk nyúl IgG izolálására, ligandumként SEPIIAROSE-4B (védjegyzctt Pharmacia gyártmány) — antitestet használva. Az antitest kecskében termelt anti nyúl szérum.

SEPHAROSE-4B-antitest: az antitestet a SEPHAROSE-4B adszorbenshez (védjcgyzctt Pharmacia gyártmány) kapcsoljuk, Axel Porath és munkatársai: Natúré, 214 (1967) instrukciói szerint g SEPHAR0SE-4B 50% 30 mg kecske-anti nyúl szérum kötés

Dinamikus oszlop: 6 mm belső átmérőjű üvegoszlop, töltve SEPHAROSE-4B antitesttel.

Kimutatás: Közvetlenül az oszlopról, mérőcellával, 280 nm-en mért UV adszorpcióval.

Puffer: 1. Foszfát-puffer/NaCL, pH—7,8

2. Glikokoll/HCl (0,1 M), _PH-2,5

Az eljárás során a következő műveleteket végeztük:

1. A SEPHAROSE-4B-t kapcsoltuk a kccskcanti nyúl szérumhoz.

2. A dinamikus oszlopba töltöttünk 3 ml SEPHAROSE-4B antitest gélt, mindkét oldalon 10

VYON (védjegyzett) szűrőrendszer (körülbelül 40 μιη-cs) közé zárva.

3. Λ töltött oszlopot 6 ml 1. púderral mostuk.

4. Az oszlopra vittünk 0,5 ml normál nyúl szérumot.

5. 37 °C-on 2 órán át inkubáltuk az oszlopot.

6. Az oszlopot az 1. pufferral eluálluk, és frakciókat szedtünk, amíg a fotométer 0,1 alatti optikai sűrűséget mutatott.

7. Az oszlopot a 2. pufferral (pH=2,5) elváltuk, és frakciókat szedtünk, amíg az optikai sűrűség 0,1-nél kisebb lett.

A példa szerinti affinitás-kromatográfia eredményét grafikusan a 13. ábra szemlélteti.

A találmány szerinti eljárás igen pontos és a hagyományos kromatográliával összehasonlítva, az alábbi előnyei vannak:

a) a hagyományos kromatográfia gravitációs áramlásával ellentétben a mozgó-oszlopos folyadékkromatográfiában kifejezetten nyomást fejtünk ki az adszorbens ágyra, ami a komponensek jobb elválasztását teszi lehetővé;

b) az eljárás igen gyors, ami a rendszerben alkalmazott belső nyomásnak is következménye,

c) az eljáráshoz kevesebb eluens szükséges, mint a hagyományos kromatográfiához,

d) a mozgóágyas kromatográfiás rendszerben a belső nyomás alkalmazása lehetővé teszi, hogy kisebb szemcsenagyságú adszorbens! használjunk, mint a hagyományos kromatográfiában; ez nagyobb érzékenységet eredményez.

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Eljárás oldatban lévő egy vagy több komponens elkülönítésére mozgó-oszlopos folyadékkromatográfiás úton — az oldat szétválasztandó komponenseinek legalább egy szilárd adszorbenssel töltött, ellentétes végein be-, illetve kivezetéssel ellátott, mozgatható kromatografáló oszlop adszorbenságyán való adszorbeáltatásával;

— a kromatografáló oszlop bevezetésének adott mennyiségű eluenssel töltött, csőszerűén kialakított, az oszloppal alakosan illeszkedő és azt befogadó tartályba való helyezésével és — a kromatografáló oszlopnak a tartályban lévő eluensen át való elmozgatásával, azzal jellemezve, hogy az eluenst a csőszerű tartályban létrejövő belső nyomás révén az adszorbenságyon keresztül kényszerítjük, és az oszlopról így eluált, legalább egy elválasztott komponenst a kromatografáló oszlop kivezetésén elvezetjük.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy két adszorbenságyat használunk, és a másik adszorbensággyal a bevezetett oldatot koncentráljuk.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eluenst a tartályba vezetjük, mielőtt a tartály alját lezárva, az oszlopot lefelé kényszerítve a tartályba toljuk.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzaljellemezve, hogy a szétválasztandó komponenseket az osz-1059

196 915 lopban lévő betétben elhelyezett adszorbenságyon adszorbcáltatjuk.
5. Mozgó-oszlopos folyadékkromatográfiás berendezés oldatban lévő egy vagy több komponens elkülönítésére, amelynek eluenst befogadó tartálya és a tartályban elmozgatható, alsó végén határolóelemmel ellátott, adszorbcnst tartalmazó üreges oszlopa van, azzal jellemezve, hogy az eluenst (4) befogadó, csőszerűén kialakított, egyik végén zárt vagy záróeszközzel ellátott tartálya (1), továbbá a tartály (1) belső falához alakosan illeszkedő, ellentétes végein be-, illetve kivezető nyílással (10) és célszerűen felső végén záróelemmel (2) ellátott, a tartályban (1) dugattyúszerűen elmozgatható, két határolóelem (7, 8) között adszorbenst (6) tartalmazó üreges oszlopa (5) van.
6. Az 5. igénypont szerinti berendezés azzal jellemezve, hogy a záróeszköz szelep (3).
7. A 6. igénypont szerinti berendezés azzal jellemezve, hogy a szelep (3) többágü.
8. Áz 5—7. igénypontok bármelyike szerinti berendezés azzal jellemezve, hogy az oszlop (5) alsó részén a tartály (1) belső fala mentén csúszó tömítőelem (11) van.
9. A 8. igénypont szerinti berendezés azzaljellemezve, hogy a tömftőclcm (11) gumi O gyűrű
10. Az 5—9. igénypontok bármelyike szerinti berendezés azzal jellemezve, hogy az oszlop (5) ₅ azonos vagy különböző adszorbenseket (6) tartalmazó két vagy több alegységből áll.
11. Az 5—10. igénypontok bármelyike szerinti berendezés, azzal jellemezve, hogy a felső kivezetőnyílás (10) az oszlop (5) felső határolóeleméhez θ (8) van csatlakoztatva.
12. Az 5—11. igénypontok bármelyike szerinti berendezés, azzal jellemezve, hogy a kifolyónyílás (10) az oszlop (5) felső végén elhelyezett záróelemen (2), előnyösen dugón áthaladó cső.
13. Az 5—12. igénypontok bármelyike szerinti berendezés, azzal jellemezve, hogy az eluenset (4) tartalmazó tartály (1) van a mozgó-oszlophoz kapcsolva.
14. Az 5—13. igénypontok bármelyike szerinti 20 berendezés, azzal jellemezve, hogy a tartály (1) alja zárt.