DE2605789C2 - Verwendung eines partikelförmigen siliziumdioxidhaltigen Füllmaterials - Google Patents

Verwendung eines partikelförmigen siliziumdioxidhaltigen Füllmaterials

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Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines partikelförmigen siliziumdioxidhaltigen Füllmaterials, dessen Silanolgruppen durch Trialkylsilylgruppen ersetzt sind, wobei die Aikylgruppen Methyl- und/oder Alkylgruppen sind.
In der Chromatographie ist die Nützlichkeit von Füllmaterialien auf der Basis von Silika oder Siliziumdioxid und anderen Oxiden (beispielsweise Silikagel, Tonerde) seit langem bekannt Insbesondere werden siliziumdioxidhaltige und andere Stoffe oder Zusammensetzungen Obcrflächen-Hydroxy-Gruppen weitgehend durch organische Komponenten ersetzt worden sind, sowohl bei der Gas- als auch bei der Flüssigkeits- jo Chromatographie in weitem Umfang verwendet
Die Verwertung derartiger Stoffe, nachfolgend als »oberf.ächenmodifizierte Träger« bezeichnet werden, läßt sich in zwei verschiedene Kategorien unterteilen.
Zunächst führt die Wechselwirkung der gelösten Stoffe mit den leicht sauren Obei ,lächenhydroxylgruppen bei der Gas- oder Flüssigkeitschromatographie, bei der die zu trennenden gelösten Stoffe polar sind oder polar funktioneile Gruppen aufweisen, zu Stoffpeaks, die unsymmetrisch und unscharf sind, wobei der Wirkungsgrad der Säulen nur schlecht ist Die Bildung hydrophober Alkylsilylderivate der Oberflächenhydroxylgruppen wurden bereits vor längerer Zeit als nützliches Mittel zur starken Herabsetzung der Adsorptionseigenschaften von siliziumdioxidhaltigen Materialien erkannt. Beispielsweise haben 1962 ]. H. Purnell und R. H. Perrett in J. Chromatography, 455, 7, über die Verwendung oberflächenmodifizierter siliziumdioxidhaltiger Trägermaterialien in der Gaschromatographie berichtet, die mit Hexamethyldißilazan (HMDS) 3η oder Dimethyldichlorosilan behandelt worden waren, von denen man annahm, daß sie Oberflächen-Silanolgruppen in MejSi- bzw. MejSi-Gruppen umwandeln. Die so hergestellten, oberflächenmodifizierten Trägermalerialien besaßen nachweislich eine sehr stark reduzierte bzw. vernachlässigbare Adsorptionskraft
Von K. Unger, R. Kern und M. Ninou wurde die Verwendung von mit Trimethylchlorsilan silaniertem Silika als Rückhaltematerial für die Flüssigkeitschromatographie für die Trennung von Polystyrol, Polyäthylen bo und Polypropylen beschrieben, also zum Auftrennen unpolarer Substanzen mittels Hydrophobisierung des Silika-Trägermaterials.
Auch von M. Novotny und K.D. Bartie, Chromatographie, 272, 3 (1970) wurde beschrieben, daß ein Ersetzen von hydrophilen Gruppen auf siliziumdioxidhaltigen Stoffen durch Trimethyl oder Dimethylsilylgruppen zu verminderter Absorptionsfähigkeit der Oberflächen-Silanolgruppen führt Dabei wird eine hydrophobe Oberfläche erzeugt, die als geeignete Unterlage zum Beschichten des Trägers mit nicht polaren organischen Polymeren oder anderen stationären Phasen dienen kann.
Weiterhin sind siliziumdioxidhaltige Stoffe und andere Trägermaterialien auf Oxidbasis chemisch derart behandelt worden, daß Oberflächen-Hydroxylgruppen durch größere organische Reste ersetzt wurden, um diesen Stoffen spezifische und 1 renn- und Rückhalteeigenschaften in Gas- und Flüssigkeitschromatographie zu verleihen, analog demjenigen beispielsweise einer stationären flüssigen Phase. Die Vorteile des chemischen Ankoppeins eines organischen Restes, die sich gegenüber dem einfachen Ablagern einer organischen Flüssigkeit oder eines Polymeren auf der Oberfläche eines Trägermaterials im Falle von polymeren Silikonbeschichtungen wurden durch E. W. Abel, F. H. Pollard, P. C. Uden und G. Nickless in Journal of Chromatography 23, 22, 1966 und im Falle von kohlenwasserstoffähnlichen und anderen Beschichtungen durch J. J. Kirkland und P. C. Yates in der US-PS 37 22 181 diskutiert
Das durch Abel et al. beschriebene Material wurde dadurch erhalten, daß Celit (ein modifiziertes Erdalkali-Material) mit Hexadecyl-trichlorosilan und anschließend mit HMDS behandelt wurde, um etwaige noch verbleibende Oberflächen-Silanolgruppen zu beseitigen.
Bei der Verwendung in der Gaschromatographie ergab dieses Material Stoffpeaks, die eine steilere hintere Flanke aufwiesen und zu höheren Säulen Wirkungsgraden führten als silikonbeschichtete Materialien. D. C. Locke, J. J. Schmermund und B. Banner (Analytical Chemistry 90, 44 (1972)) haben beschrieben, auf welche Weise organische Gruppen an die Oberfläche von Silika oder Kieselsäure angebunden werden können, indem zunächst die Oberflächensilanolgruppen in sSi-Cl umgewandelt und anschließend die modifizierte Kieselsäure mit einen Grignard-Reagenz chemisch behandelt wird. Kirkland und Yates erhielten, wie in der US-PS 37 22 181 beschrieben, oberflächenmodifizierte Trägermaterialien durch Anpolymerisieren von Silanen auf der Oberfläche von siliziumdioxidhaltigen Materialien. Derartige Stoffe sind in weitem Umfang in der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie verwendet worden. Eine Behandlung der Silanolgruppen mit Alkoholen oder Aminen führt ebenfalls zu oberflächenmodifizierten Trägern, jedoch sind die resultierenden sSiOR oder = SiNHR-Bindungen hydrolytisch instabil, so daß derartige Stoffe weniger vorteilhaft sind (i. Haiasz, und I. Sebestian, Angew. Chemie International Ed. 453, 8 (1969), O.-E. Brust, I. Sebestian und I. Halsz, journal of Chromatography 15, 83(1973)).
Langkettige Alkylsilylsubstituenten, wie beispielsweise C18H37S1- oder Ci6H33Si-, die an Siliziumdioxid angebunüen wurden, sind ebenfalls in weitem Umfang in der Gaschromatographie und in der sogenannten Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie verwandt worden. Derartige Stoffe sind gelegentlich mit HMDS oder anderen Reagenzien behandelt worden, welche Trimethylsilylgruppen einführen, um die restliche Adsorptionskraft des oberflächenmodifizierten Trägers weiter zu reduzieren oder zu beseitigen.
Nach dem Stand der Technik wurde die Umwandlung von Oberflächenhydroxylgruppen in — Si(MeJj oder = Si(Me)j-Gruppen stets als Deaktivierung mit dem Ziel
angewandt, die Adsorptionskraft des Trägermaterials 3!u eliminieren oder wenigstens beträchtlich zu vermindern. Niemals Findet sich in der Literatur ein Hinweis darauf, daß ein derartiges Material als Rückhaltematerial in der Chromatographie verwendet werden könnte, wobei die Reaktion der Hydroxylgruppen zur Erzeugung von — Si(Me)3 oder =Si(Me)2-Gruppen mit dem spezifischen Ziel ausgeführt wurde, ein Rückhaltematerial mit besonders wünschenswerten chromatographischen Eigenschaften zu erzeugen. Zur Herstellung oberflächenmodifizierter Trägermaterialien mit Retentionseigenschaften sind stets größere Gruppen als Si(Me)3 als Substituenten der Oberflächenhydroxylgruppen an siliziumdioxidhaJiigen Trägern oder anderen Trägermaterialien auf Gxidbasis verwandt worden.
Die Auftrennung von hochpolaren pharmazeutischen Verbindungen, beispielsweise von Tetracyclinen, mittels flüssigkeitschromatographischen Verfahren stellte bisher ein schwierig zu lösendes Problem dar, da derartige Verbindungen instabil sind und sich den bisher zu deren Auftrennung verwandten Trägermaterialien leicht zersetzen oder nur schlecht aufgetrennt werden.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe 7 igrunüe, ein Füllmaterial zur flüssigkeitschromatographischen Trennung derartiger Verbindungen zu schaffen, welches zu einem besseren Trennverhalten führt
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die Verwendung eines partikelförmigen siliziumdioxidhaltigen Füllmaterials nach dem Patentanspruch gelöst.
Der Erfindung liegt also die völlig unerwartete und überraschende Erkenntnis zugrunde, daß Trimethylsilylderivate einer Anzahl poröser silizjumdioxidhaltiger Materialien, beispielsweise von Silikagelen, sich besonders gut als chromatographische Füllmaterialien zum Rückhalten, zur Auflösung und zur Trennung von hochpolaren organischen pharmazeutischen Stoffen beträchtlichen Molekulargewichts eignen. Insbesondere haben sich derartige Stoffe zum Rückhalten, zur
ίο Auflösung und zur Auftrennung eines weiten Bereichs pharmazeutischer Stoffe als nützlich erwiesen, einschließlich Tetracyclinen, Antidepressiva, Alkaloiden und Steroiden.
Die erfindungsgemäß verwendeten Füllmaterialien eignen sich insbesondere zur Analyse komplexer pharmazeutischer Verbindungen, wie beispielsweise von Tetracyclinen.
Das Füllmaterial, welches erfindungsgemäß verwandt werden kann, läßt sich in der nachfolgend beschriebenen allgemeinen Form herstellen:
Eine bestimmte Menge eines geeigneten Adsorbens, beispielsweise Silikagel mit kleine» Partikelgröße, wird bei etwa 1200C getrocknet, um das ausorbierte Wasser zu entfernen. Dam; wird das Absorbens in einem inerten organischen Lösungsmittel, mit dem ein zur Bildung von Trialkylsilylderivaten aus Oberflächenhydroxylgruppen geeignetes Reagenz gelöst ist, erhitzt Geeignete Reagenzien für die Erzeugung derartiger Trimethylsilylderivate von Siliziumdioxid sind:
Me3SiCl, (Me3Si)2NH(HMDS), N N-SiMe3. CH3-C
NHSiMe3
Es hat sich gezeigt, daß unter diesen Verbindungen das Trimcfhylsilylimidazol erfindungsgemäß am besten verwandt werden kann, weil es einen der am stärksten reaktionsfähigen Stoffe der oben angegebenen Gruppe darstellt und insbesondere am vollständigsten mit den Oberflächenhydroxylgruppen reagiert Trialkylsilylderivate von Siliziumdioxid, bei denen einige oder alle Alkylgruppen Älhylgruppen sind, werden in ähnlicher Weise erzeugt, wobei jpdoch ein Reagenz verwandt werden, bei dem die geeignete Zahl von Methylgruppen durch Äthylgruppen ersetzt ist, oder aber durch Verwendung einer Mischung entsprechender Reagenzien.
Daß die erfindungsgemäße Verwendung auf der Bildung einer spezifischen Oberfläche beruht, nicht aber darauf, daß einfach die Oberflächensilanolgruppen entfernt wurden, ergibt sich aus folgenden Tatsachen:
a) Das Füllmaterial gibt ähnliche, in manchen Fällen noch bessere Trennergebnisse als in dem Fall, daß dasselbe Siliziumdioxid als Ausgangsstoff verwandt wird, welches jedoch zunächst zum Einführen von —SiOieH37-Gruppen behandelt und erst dann anschließend derart zur Reaktion gebracht wurde, daß die restlichen OH-Gruppen in SiMe3 umgewandelt werden.
b) Füllmaterialien, die mit weniger aktiven silanisierenden Reagenzien als Trimethylsilylimidazol hergestellt wurden, wobei also die im wesentlicher vollständige Eisnzung der Silanolgruppen. die erfindungsgemäß erforderlich ist, nicht erreicht wird, sind allgemein denjenigen unterlegen, bei denen die stärker reaktionsfähigen Reagenzien verwendet wurden.
Im folgenden wird die Herstellung der erfindungsgemaß verwendeten Füllstoffe beschrieben.
Herstellungsbeispiel ι
In diesem Herstellungsbeispiel wird ein typisches Verfahren beschrieben, welches zur Herstellung des Füllmaterials, das erfindungsgemäß beim Chromatografieverfahren verwendet werden kann, dient. 3,5 g eines Silika-Füllmateriüls wurde durch Erwärmen durch 125° C getrocknet, wobei die Zeitdauer der Erhitzung 4 Stunden betrug, im Vakuumofen. Das so getrocknete Silica wurde in 25 ml trockenen Dekalins suspendiert und in einem dreihalsigen Kolben mit einem Volumen von 100 ml eingebracht. 2 ml Trimethylsilylimidazol wurden der Suspension hinzugefügt Die Mischung wurde bei etwa 100" C 16 Stunden lang unter Stickstoffatmos^häre, mit leichtem magnetischem Rühren, erwärmt. 50 ml Aceton wurden hinzugefügt, um alles gebildete Imidazol aufzulösen, woraufhin das siianisierte Material durch einen Sinterfilter gefiltert wurde. Das Material wurde intensiv mit 200 ml Aceton gewaschen und dann in einem Vakuumofen bei 125°C für 24 Stunden ge /aschen.
Eine Analyse des Produktes ergab einen Kohlenstoffgehalt von 5,4% und einen Wasserstoffgehalt von 1,6%.
Nachfolgend wird die Herstellung eines Siüka-Ausgangsmaterials und seine Behandlung zum Herstellen eines Füllmaterials zur erfindungsgemäßen Verwendung aufgezeigt.
Herstellungsbeispiel 2
Im Labor wurde Silika dadurch hergestellt, daß ein angesäuertes kolloidales Silikagel in einem Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel emulgiert wurde, wobei das Lösungsmittel ein oberflächenaktives Agens zur Erzeugung kugelförmiger Silikapartikel aufwies. Diese wurden gewaschen und gehärtet, nach einem bekannten Verfahren, und so fraktioniert, daß sich eine 6 μηι-Fraktion ergab, die als Adsorbens und als Grundlage zum Herstellen gebundener Materialien verwendet wurde. Das Silika hatte eine Oberfläche von 205 m-'g '.
Eine bestimmte Menge der so hergestellten Silika/iibereitung mit kugelförmigen Teilchen wurde entsprechend dem Verfahren von Herstellungsbeispiel 1 behandelt, mit der Ausnahme, daß das 6 ^im-Matcrial durch wiederholte Sedimentation in Aceton gewaschen wurde. Eine Analyse des Produktes ergab einen Kohlenstoffgehalt von 2,9% und einen Wasserstoffgehalt von 0,9%.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die erfin-• !iingsgemäße Verwendung.
Beispiel I
Eine 125 mm lange Säule mit einem Durchmesser von 5 mm wurde in Anwendung eines bekannten Verfahrens trocken mit einer bestimmten Menge des bereits genannten Silikas (18 μπι mittlere Partikelgröße) gefüllt. Das Kieseldioxid war in der in Herstelliingsbeispiel 1 beschriebenen Weise behandelt worden. Die Säule wurde als Teil eines Hochdruck-Flüssigkeitschromatografen (HPLC) zur Trennung von Tetracycünen verwendet. Im übrigen war die Vorrichtung von herkömmlichem Aufbau, bestehend aus einer Hochdruck-Kolbenpumpe, einem Scheideinjektor, einem UV-Fotometer mit einer Strömungszelle von 10 μπι und einer Nachweisextinktion 280 nm.
Typische Trennkurven sind in F i g. 1 dargestellt, in der die Schreibdiagramme des Detektor-(Fotometer-)-Ausganges für die Trennungen bei zwei Proben, A und B. wiedergegeben sind, wobei O. IM wäßrige Perchloridsäure mit einem Gehalt von 25% Acetonitril als Eluent unter einem Druck von 350 N/cm2 (500 psi) verwendet wurde. Die Proben A und B hatten die folgenden Zusammensetzungen:
lenstoffalome mit hochpolaren funktioneilen Gruppen substituiert sind:
NME2
HO
Me
H .-"' OH
OH O OH
CONH2
OH
Das Vorliegen dieser Gruppen macht die Analyse mittels herkömmlicher chromalografiseher Verfahren schwierig. So haben P. P. Ascione, J. B. Zagar und G. P. Chrekian in J. Chromatography 377, 65 (1972) ein chromatografisches Verfahren für die Analyse von Tetracycünen beschrieben, jedoch ist das Verfahren langwierig. Außerdem sind die berichteten Nachweisgrenzen kritisiert worden (K. Tsuji, ). H. Robertson und W. F. Beyer, Analytical Chemistry, 599. 46 (1974)). Ein gaschromatografisches Verfahren zur Tetracyclinanalyse erforderte eine vorherige Silylierung der Hydroxylgruppen unter sorgfältig zu beachtenden Bedingungen (K. Tsuji und J. H. Robertson, Analytical Chemistry. 2136, Λ5 (1973)). In einem neuerlichen chromatografischen Verfahren (Flüssigverfahren), welches durch Tsuji. Robertson und Beyer in der obengenannten Veröffentlichung beschrieben wurde, werden die Tetracycline auf einem Zipax-HCP-Träger in etwa 30 Minuten getrennt, jedoch ist die Auflösung noch schlecht und die Quantifizierung schwierig.
Weiterhin sind Tetracyclin und seine Derivate unstabil (beispielsweise führt eine verlängerte Behandlung mit saurer Lösung zu einer Epimerisation am C4-AtOm). Deshalb ist eine sehr rasche chromatografische Analyse wünschenswert.
Erfindungsgemäß werden all diese Anforderungen erfüllt. Nach dem Verfahren nach der Erfindung ergibt :,ich, wie F i g. 1 zeigt, eine rasche quantitative Trennung von fünf Tetracycünen, die interessieren, in weniger als zehn Minuten.
Die hohe Elutionsgeschwindigkeit reduziert in weitem Ausmaß jedwede Möglichkeit einer Umordnung oder Zersetzung der Proben. Eine Veränderung der in der beweglichen Phase vorhandenen Acetonitrilmenge läßt sich dazu benutzen, das Rückhaitevolumen der Tetracycline zu variieren und die Analyse spezifischer Mischungen von Tetracyclinen zu optimieren. Werden beispielsweise nur 15% Acetonitril in der beweglichen Phase benutzt, so läßt sich nahezu eine Basislinienauflösung zwischen 4-Epitetracyclin (ETC) und Tetracyclin (TC) selbst enthalten.
ETC i-i-Epitetracyclin) 225 ng 200 ng
TC !Tetracyclin) 1000 ng 350 ng
CITC H-Chlorotetracydin) 180 ng "20 ng
EATC ^Epianhydrotetracydin) 135 ng 400 ng
ATC lAnhydrotetracyclin) 260 ng 450 ng
Die Analyse von Tetracyclin und seinen Derivaten ist häufig von großer Bedeutung. Die Tetrs>cyline bilden eine charakteristische Klasse von Antibiotika mit vier kondensierten Ringen, bei denen einige der Ring-Koh-
Beispiel 2
Eine Säule mit einer Länge von 125 mm und einem Durchmesser von 5 mm wurde mit einer Aufschlämmung gefüllt, wobei eine abgeglichene Dichtetechnik verwendet wurde, wie sie in der chromatografischen Praxis wohl bekannt ist. Dabei wurde eine Probe des im Labor hergestellten Füllmaterials verwendet hergestellt gemäß Herstellungsbeispiel 2. Die Säule wurde als Teil eines Hochdruck-FIüssigchromatografen zum Trennen einer Gruppe von B-Vitaminen verwendet.
Der Rest der Anordnung war wie in Beispiel I, mit der Ausnahme, daß bei 270 nm Extinktion nachgewiesen und aufgezeichnet wurde. Wie in F i g. 2 gezeigt, werden die Vitamine B2, B1 und Bf, voneinander sowie von Koffein getrennt, indem die trimt'thylsilylgebundene
Siliziumdioxidzubereitung verwandt wird. Dabei wird eine mobile Phase verwendet, die Wasser, Methanol/ konzentrierte schwefelige Säure im Verhältnis 85 : 15 :0,25 v/v aufweist, mit 0,1 Gew.-% Natriumlaurylsulfat.
1 lihi

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Verwendung eines partikelförmigen siliziumoxidhaltigen Fallmaterials, dessen Silanolgruppen durch Trialkylsilylgruppen, deren Alkylgruppen Methyl und/oder Äthyl sind, ersetzt sind, zur flüssigkeitschromatographischen Trennung hochpolarer pharmazeutischer Verbindungen, insbesondere Tetracylinen.
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