DD278482A3

DD278482A3 - Vorrichtung und verfahren zur chromatographischen trennung

Info

Publication number: DD278482A3
Application number: DD31704288A
Authority: DD
Inventors: Rudolf Ehwald; Holger Woehlecke; Ulrich Klein; Ulrike Zimare
Original assignee: Univ Berlin Humboldt
Priority date: 1988-06-22
Filing date: 1988-06-22
Publication date: 1990-05-09
Also published as: DE3916219A1; GB8914243D0; GB2220867A; SE8902254D0; SE8902254L; FR2633397A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein chromatographisches Festbett als trockene Packung in einer geschlossenen Saeule oder als trockene Schicht auf einer Folie oder Platte. Das Festbett ist durch einen hohen Volumenanteil an gasgefuellten intra- und extrapartikulaeren Kapillarraeumen ausgezeichnet und besteht gaenzlich oder ueberwiegend aus vesikulaeren bzw. zellstrukturierten Traegern. Das selbstsaugende Festbett ist - ungeachtet der hohen Absorptionsfaehigkeit fuer Fluessigkeiten - volumenstabil an der Befeuchtungsfront. Es ermoeglicht ein chromatographisches Verfahren, mit dessen Hilfe niedermolekulare Stoffe von Makromolekuelen ausschlusschromatographisch getrennt werden koennen und die Elution der Makromolekuele in konzentrierter Form moeglich ist.

Description

Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Chromatographie im analytischen und präparativen Einsatz.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Vorrichtungen für die Flüssigchromatographie mit Festbetten aus dicht gepackten trockenen Partikeln (Füllkörpern) sind in zahlreichen Varianten allgemein bekannt. Als Beispiele seien die Dünnschichtchromatographie und die Verwendung von Pulvern in Trockensäulen (z. B. G.-J. Krauß und G. Krauß, Experimente zur Chromatographie, VEB Deutscher Verlag der Wissenschaften, Berlin 1979) genannt. Der Vorteil von Vorrichtungen mit trockenen Festbetten, z. B. DE 3043608, besteht darin, daß sich das flüssige Laufmittel ohne äußere Kräfte auf Grund von Kohäsion und Adhäsion kapillar durch die selbstsaugende poröse Trennstrecke bewegt. Allerdings bereitet die chromatoyraphische Nutzung von trockenen Festbetten Schwierigkeiten bei Trennmaterialen mit hohem Absorptionsvermögen für das flüssige Laufmittel, z. B. bei zahlreichen Xerogelen, da die Ausdehnung des chromatographischen Bettes bei zu starker Quellung der Füllkörper zur Destabilisierung und Ablösung der Packung von einem Flächenträger führt. Die Schwierigkeit, daß chromatographische Dünnschichten aus quellfähigem Material beim Trocknen reißen, ist allgemein bekannt. Trockensäulen aus quellfähigem Material sind wegen des hohen Quellungsdruckes und der einseitigen Ausdehnung der Säulenfüllung beim Quellvorgang nicht nutzbar. Aus diesen Gründen war es bisher nicht möglich, die oben genannten Vorteile der trockenen Trennstrecken mit den Vorteilen quellfähiger Füllkörper (großer innerer Verteilungsraum, ausschlußchromatographische Wirksamkeit, große innere Oberfläche) in einer chromatographischen Vorrichtung oder einem chromatographischen Verfahren zu verbinden. Insbesondere ist es mit Hilfe der bisher bekannten Vorrichtungen und Verfahren nicht möglich, einen hochmolekularen Stoff oder eine Gruppe hochmolekularer Stoffe nach dem Ausschlußprinzip von niedermolekularen Begleitstoffen ohne beträchtliche Verdünnung verlustfrei und vollständig zu trennen.

Es sind verschiedene „Batch-Verfahren" bekannt, bei denen die ausgeschlossenen hochmolekularen Bestandteile eines flüssigen Gsmisches durch Einquellen eines Xerogels (zus. Darstellung bei Determann, H., Gelchromatographie, Springer-Verlag Berlin, Heidelberg, New York, 1967) oder unvollständig gequollener vesikulärer Füllkörper (DD WP 247570) selektiv im Zwischenkornvolumen konzentriert werden. Hierbei werden aber die niedermolekularen Bestandteile des Stoffgemisches nicht vollständig abgetrennt, und es kommt entweder zu Verlusten auf Grund der Unvollständigkeit, mit der die Zwischenkornflüssigkeit separiert wird, oder zu Verdünnungseffekten beim Nachwaschen der Packung.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung ist die Weiterentwicklung der chromatographischen Technik zur Reinigung und Trennung von Stoffen hinsichtlich der Ökonomie und Qualität des Trennvorganges.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Aufgabe besteht in der Bereitstellung eines trockenen chromatographischen Fostbottes und eines Verfahrens für die Chromatographie, welche die Vorteile stark quellfähiger Füllkörper und die Vorteile einer trockenen Trennstrecke besitzen bzw. ausnutzen und insbesondere eine verdünnungsfreie oder verdünnungsarme ausschlußchromatographische Reinigung von Makromolekülen ermöglichen.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die Vorrichtung durch eine trockene chromatographische Packung mit gasgefüllten intra- und extrapartikulären Kapillarräumen gekennzeichnet ist, wobei das Volumen der gasgefüllten Kapillarräume über 80% des Gesamtpackungsvolumens beträgt, die chromatographische Packung zu über 50 Vol.-% aus bekannten vesikulären bzw. zellstrukturierten Füllkörporn besteht und die Weite der intrapartikulären Kapillarräume überwiegend zwischen 0,5 und lOOpm liegt.

Eine vorteilhafte Variante der genannten Vorrichtung besteht in einer geschlossenen Chromatofjraphiesäule, die mit trockenem lufthaltigen Pulver aus lyophilisierten vesikulären Füllkörpern nach DD WP 247 570 gefüllt ist. Eine zweite vorteilhafte Variante der genannten Vorrichtung besteht in einer Platte oder Folie, der eine Packung aus lyophilisierten vesikulären Füllkörpern für die Chromatographie als offene Trennstrecke aufliegt. Eine weitere vorteilhafte Variante der genannten Vorrichtung ist dadurch gekennzeichnet, daß die trockene chromatographische Packung neben dem vesikulären Trägermaterial ein weiteres pulverförmiges Medium mit bestimmten Adsorptionseigenschaften enthält.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe der verdünnungsfreien bzw. verdünnungsarmen Reinigung von Makromolekülen mit Hilfe des genannten Festbettes dadurch gelöst, daß zunächst ein Tei! des trockenen Festbettes mit der als Laufmittel genutzten Flüssigkeit gesättigt wird, so daß das Festbett einseitig befeuchtet ist, danach das flüssige Gemisch mit den zu reinigenden Makromolekülen von der feuchten Seite her in das Festbett eingeführt wird, anschließend von der gleichen Seite her das chromatographische Laufmittel erneut in das Festbett eingeführt wird, bis die Befeuchtungsfront das gesamte Festbett durchlaufen hat, und daß vom zuletzt befeuchteten Teil des Festbettes mindestens eine flüssige Probe eluiert wird. Überraschend hat sich gezeigt, daß die aus trockenem vesikulären Trägermaterial mit hohem Gas- bzw. Luftgehalt bestehenden chromatographischen Festbetten ungeachtet ihrer hohen Absorptionsfähigkeit für Flüssigkeiten beim Befeuchtungsvorgang volumtnstabil und selbstsaugend mit hohen Flußraten sind. Dabei vollzieht sich - entgegen den bisherigen Erfahrungen mit zu starker Flüssigkeitsaufnahme fähigem Material - die quellungsbedingte mikroskopische Strukturänderung an der Befeuchtungsfront ohne strömungshemmende Verdichtung oder einen die Geschlossenheit des Festbettes zerstörenden makroskopischen Quellvorgang.

Mit dem hier geschilderten chromatographischen Verfahren ist es erstmals möglich, hochmolekulare Stoffe von niedermolekularen Stoffen verlustfrei abzutrennen, ohne sie dabei zu verdünnen. Für die Vollständigkeit der Abtrennung der niedermolekularen Stoffe muß die Länge der vor dem Auftragen der Mischprohe bereits feuchten Trennstrecke ausreichend sein. Für die Konzentration der eluierten makromolekularen Bestandteile ist dagegen die Länge des beim Auftragen der Probe noch trockenen Teils der Trennstrecke entscheidend. Beträgt das Volumenverhältnis zwische ίdem trockenen und dem feuchten Teil des Festbettes nach dem Auftragen der Probe mehr als 0,8, ist es mit dem beschriebenen Verfahren auch möglich, einen hochmolekularen Stoff oder eine Gruppe von Makromolekülen im Zusammenhang mit der Reinigung von niedermolekularen Stoffen zu konzentrieren. Dabei ist es möglich, die konzentrierten Makromoleküle verlustfrei zu eluieren. Eine hinsichtlich der Konzentration der eluierten Makromoleküle günstige Variante des Verfahrens besteht darin, daß vor der Einführung des Probegemisches das Festbett zu wenigstens 20% seines Volumens mit dem Laufmittel gesättigt wird und daß der trockene Volumenanteil des Festbettes nach der Einführung des flüssigen Gemisches mit den zu reinigenden Makromolekülen wenigstens noch 30% beträgt.

Ausführungsbeispiele

Die Erfindung wird an Hand von nachstehenden Beispielen näher erläutert.

Beispiel 1

Eine Probe eines aus pflanzlichen Zellaggregaten hergestellten vesikulären Trägermaterials nach DD 247 570 wurde lyophilisiert. 330mg des erhaltenen trockenen Pulverswurden dicht in eine Chromatographie-Säule (V = 7ml,I = 7 cm) gepackt. Der Vorgang wird durch die Abbildung verdeutlicht. Auf die Trockenpackung wurden 20ml eines 0,1 M Phosphatpuffers nach Sörensen mit pH 7 aufgetragen. Nach dem Einsaugen der Pufferlösung wurden 0,4ml eines flüssigen Gemisches aus Blue Dextran 2000 (Pharmacia) und Phenolrot, beide Stoffe in einer Konzentration von 0,025% in wäßriger Lösung, auf den bereits feuchton Teil des selbstsaugenden Festbettes aufgetragen (1 in der Abbildung). Nach Eindringen der Probe wurde das Festbett mit dem Elutionspuffer überschichtet. Beim Einsaugen der Flüssigkeiten wurde keine Entstehung von Gasblasen im befeuchteten Teil des Festbettes festgestellt. Beim Einsaugen des Probegemisches und dem anschließenden Eindringen des Elutionspuffers kam es zu einer sichtbaren Trennung zwischen der Phenolrotbande (2 in der Abbildung, kleine Punkte), die sich gerade so schnell wie die Befeuchtungsfront bewegte, und der Bande des makromolekularen Blue Dextrans (größere Punkte), die den feuchten Teil des Festbettes schneller durchlief und die Befeuchtungsfront erreichte, bevor letztere am unteren Ende der Packung angelegt war (3 in der Abbildung). Der makromolekulare Farbstoff wurde an der Befeuchtungsfront konzentriert und konnte quantitativ in nur 0,2 ml der ersten Eluatf raktion aufgefangen werden. Die Konzentration der 0,2 ml-Fraktion an Dextran betrug 0,05% (photometrisch bestimmt). Die Abtrennung vom Phenolrot war vollst-.idig. In gleicher Weise wurde eine vollständige Trennung zwischen Proteinen (a-Amylase aus dem menschlichen Speichels jkret, Ferritin) und Ammoniumsulfdt mit einer deutlichen Konzentrierung der Proteine erreicht. Die gesamte in 0,4ml aufgetragene Proteinrr.cnge wurde in den ersten 0,2 ml des Eluats sulfatfrei gewonnen.

Beispiel 2

An eine Glasplatte (2cm χ 7cm) wurde eine 2rrm starke Schicht des >n Beispiel 1 genannten Trockonpulvers aufgebracht. Die Trennstrecke wurde an den Enden durch einen schmalen Streifen ChromatOfciaphiekarton begrenzt, über den das Elutionsmittel und die Probelösung zugeführt wurden. Nach dem Einsaugen von 1 ml eines Phosphatpuffers nach Sörensen mit pH 7 (0,1 M) wurde auf den bereits feuchten Teil des selbstsaugenden Festbettes die in Beispiel 1 genannte Mischung aus Blue Dextran und Phenolrot aufgetragen. Anschließend wurde der genannte Puffer in das Festbett gesaugt. Das Flächeniiett blie an der Befeuchtungsfront formstabil und wurde ohne makroskopische Quellung oder Rißbildung mit gerader Sefeuchtungsfront in 30 min mit der wäßrigen Lösung gesättigt. Dabei wurde die Trennung zwischen Blue Dextran und Phenolrot sichtbar. Blue Dextran <onzentrierte sich an der Befeuchtungsfront wie bei der in Beispiel 1 dargestellten Säulenpackung.

Beispiel 3

Trockenes zellstrukturiertes bzw. vesikuläres Trägermaterial wurde im Verhältnis 1:1 mit Diethylaminocellulose vermischt. Das erhaltene Pulver wurde, wie in Beispiel 1 dargestellt, in eine Chromatographie-Säule gepackt. Die Auftragung des Elutionsmittels und der Probelösung erfolgton wie in Beispiel 1 beschrieben, als Elutionsmittel wurde dostillietes Wasser eingesetzt. Die Probemischung bestand aus 0,2 mg Blue Dextran 2000 und 0,2 mg Dextran T 250 in 0,4ml destillierten Wassers. Das neutrale Dextran T 250 konzentrierte sich, wie in Beispiel 1 beschrieben, an der Befeuchtungsfront, während das durch Cibachrom Blue F 3G-Aderivatisierte und daher anionische Blue Dextran bereits beim Eintritt in die Packung durch Adsorption immobilisiert wurde. Das neutrale Dextran T 250 wurde von den anionischen Blue Dextranmolekülen quantitativ abgetrennt und gleichzeitig konzentriert.

Claims

1. Trockenes chromatographisches Festbett mit vesikulären Füllkörpern nach DD-247570, dadurch gekennzeichnet, daß es gasgefüllte intra- und extrapartikuläre Kapillarräume enthält, wobei das Volumen der gasgefüllten Kapillarräume über 80% des gesamten Festbettvolumens beträgt und bei Vorhandensein weiterer zugemischter pulverförmiger Medien der Volumenanteil das nichtvesikulären Materials an der Trockenmischung kleiner 50% ist und die Weite dor intrapartikulären gasgefüllten Hohlräume überwiegend zwischen 0,5 und 100μηη liegt.

2. Trockenes chromatographisches Festbett nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es in einer geschlossenen Chromatographie-Säule lokalisiert ist.

3. Trockenes chromatographisches Festbett nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es als offene Schicht oder Packung auf einer Folie oder Platte aufliegt.

4. Trockenes chromatographisches Festbett nach Ansprucn 1, dadurch gekennzeichnet, daß das nichtvesikuläre pulverförmige Medium selektive Adsorptionseigenschaften besitzt.

5. Verfahren zur chromatographischen Trennung, dadurch gekennzeichnet, daß zunächst ein Teil des Festbettes nach Anspruch 1 mit der als Laufmittel eingesetzten Flüssigkeit befeuchte» wird, so daß ein einseitig befeuchtetes Festbett entsteht, danach das flüssige Gemisch mit zu reinigenden Makromolekülen von der gleichen Seite her in das Festbett eingeführt oder eingesaugt wird, anschließend von der gleichen Seite her das chromatographische Laufmittel erneut in die Packung eingeführt oder eingesaugt wird, bis die Befeuchtungsfront das gesamte Festbett durchlaufen hat, und daß vom zuletzt befeuchteten Teil des Festbettes mindestens eine flüssige Probe eluiert wird.

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