DE68909007T2

DE68909007T2 - Flüssigchromatographie mit mikroporösen Hohlfasern.

Info

Publication number: DE68909007T2
Application number: DE89311825T
Authority: DE
Inventors: Edward L Cussler
Original assignee: Hoechst Celanese Corp
Current assignee: CNA Holdings LLC
Priority date: 1988-11-15
Filing date: 1989-11-15
Publication date: 1994-01-05
Anticipated expiration: 2009-11-16
Also published as: DE68909007D1; NO894414D0; JP2609335B2; KR930008108B1; EP0369769A3; ATE94079T1; EP0369769A2; JPH02187659A; CA2002370A1; DK569189D0; EP0369769B1; NO894414L; US4957620A; DK569189A; KR900007462A

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Flüssigchromatographie. In spezifischen Ausführungsformen betrifft die Erfindung neue Verfahren, die Flüssigchromatographie unter Verwendung von mikroporösen Hohlfasern bewirken.

Hintergrund der Erfindung

Hochleistungs-Flüssigchromatographie ist ein wohlbekanntes Verfahren zur Trennung gelöster Stoffspezies in Abhängigkeit von der Differential-Absorption/Desorption zwischen verschiedenen gelösten Stoffspezies. Typischerweise wird ein flüssiger Träger (in dem die zu trennenden, gelösten Stoffspezies vorhanden sind) durch eine mit Trennmedien (z.B. festen oder Gelteilchen) gepackte Säule geleitet. Diese Trennmedien steigern in der Tat die Verweilzeit einer (oder mehrerer) gelösten Stoffspezies in dem flüssigen Träger (der gegen die gelöste Stoffspezies inert ist) relativ zu einer (oder mehreren) anderen gelösten Stoffspezies in dem flüssigen Träger (d.h., aufgrund der größeren Absorptions/Desorptions-Geschwindigkeit der einen gelösten Stoffspezies relativ zu der anderen gelösten Stoffspezies). Wegen der erhöhten Verweilzeit der einen gelösten Stoffspezies in der Säule gibt es eine Zeit, bei der eine im wesentlichen reine Mischung der Trägerflüssigkeit und der anderen gelösten Stoffspezies am Auslaß der Säule vorhanden ist - das heißt, die eine und die andere gelöste Stoffspezies sind getrennt.
Mit dem kürzlichen Erscheinen der kommerziellen Herstellung biologischer Spezies (z.B. Proteine) hat sich jedoch die herkömmliche Technik der Flüssigchromatographie mit der Verwendung gepackter Teilchenbetten als unwirksames Mittel für die hochauflösende Trennung von einer Spezies von der anderen erwiesen. Diese Unfähigkeit der Chromatographiesäulen mit gepackten Teilchen kann im allgemeinen auf die hohen Druckabfälle, auf die man stößt, zurückgeführt werden und die zu geringeren Fließgeschwindigkeiten des flüssigen Trägers durch die Säule führen (wodurch geringere Produktionsraten der gewünschten biologischen Spezies erlangt werden). Außerdem tragen die sehr strenge Kontrolle der Teilchengröße, die Einheitlichkeit der Teilchen und die Art, in der solche Teilchen die Säule füllen, zu erhöhten Kosten bei, die im allgemeinen im kommerziellen Maßstab nicht geduldet werden können. Folglich sind die Techniken der Flüssigchromatographie mit herkömmlich gepackten Teilchen, obwohl sie für analytische Zwecke in kleinem Maßstab angemessen sind, zum Trennen von gelösten Stoffspezies (insbesondere biologischen Spezies) im kommerziellen Maßstab ungeeignet.
Kürzlich wurde vorgeschlagen, für die Flüssigchromatographie Hohlfasern zu verwenden. Die Geometrie solcher Hohlfasern ergibt eine interessante Alternative gegenüber Teilchen in Form eines geringeren Druckabfalls beim Durchgang durch die Säule und die geringeren Kosten der Hohlfasern (relativ zu einheitlichen Teilchen), ergeben eine interessante Wirtschaftlichkeit des Maßstabs und ermöglichen so, daß kommerziell praktikable Flüssigchromatographie-Systeme erreicht werden.
Ein früherer Vorschlag in dieser Hinsicht verwendet ein Rohr, das mit einer theoretischen Packungsdichte des Rohrs, die zwischen 60 und 100 Prozent liegt, mit im allgemeinen parallel ausgerichteten Fasern gepackt ist, um Möglichkeiten zur Durchführung der Flüssigchromatographie zur Verfügung zu stellen. Siehe US-A-4 657 742. Die Fasern in US-A-4 657 742 sind vorzugsweise Glasfasern, die fest sein können oder sie können feste Fasern sein, die porös gemacht wurden. Alternativ können die Fasern Hohlfasern mit festen Wänden sein oder Hohlfasern, deren Wände behandelt wurden, um sie porös zu machen. Es heißt, daß das Verfahren, das Rohr mit einer hohen Faserdichte zu packen, auch auf andere als Glasfasern anwendbar ist, z.B. auf Cellulose- oder organische Fasern (siehe Spalte 10, Zeile 10-13 des US-A-4 657 742).
In JP-A-55018244 ist eine Hohlfaser offenbart, die für die Verwendung in der Flüssigchromatographie geeignet ist. Die dort offenbarte Hohlfaser schließt eine äußere Flüssigkeits-undurchlässige Hautschicht und eine innere (d.h. angrenzend an den Hohlraum der Faser) poröse Schicht ein. Die Flüssigkeits-undurchlässige Schicht erlaubt offenbar, daß die Flüssigchromatographie mit erhöhtem Druck innerhalb des inneren Hohlraums der Faser, ohne "Durchbruch" von Trägerflüssigkeit auf die äußere Seite der Faser, fortschreitet.
US-A-3 570 673 offenbart ein Verfahren zur Herstellung einer Trennsäule zur Verwendung in der Flüssigchromatographie, worin ein Bündel paralleler Fasern, insbesondere anorganischer Fasern, wie z.B. Glasfasern, in ein Rohr aus chemisch resistentem Material eingelassen ist, das Rohr sicher in das Faserbündel eingefaßt ist und dann ein Lösungsmittel durch das Faserbündel laufengelassen wird, um eine lösliche Phase der Fasern zu entfernen und einen porösen, fibrösen Körper zu erhalten. Die Fasern können Oberflächen-modifiziert sein, z.B. mittels eines Trimethylchlorsilan- oder Kohlenstoffüberzugs.

Zusammenfassung der Erfindung

Obwohl die oben erwähnten Vorschläge für die Flüssigchromatographie einige Verbesserungen gegenüber den Säulen mit herkömmlich gepackten Teilchen, die bei Anwendungen der Flüssigchromatographie verwendet werden, bereitstellen können, ist noch ein Bedarf in diesem Fachgebiet an größerem Trennvermögen gelöster Stoffe in kommerziell praktikablem Maßstab vorhanden - das heißt, ein Flüssigchromatographiesystem, das geeignet ist, im Vergleich zu herkömmlichen Flüssigchromatographie-Techniken, eine größere Menge gelöster Stoffspezies pro Zeiteinheit zu trennen. Auf das Erreichen solch erforderlicher Verbesserungen ist diese Erfindung gerichtet. Gemäß der vorliegenden Erfindung werden mikroporöse Hohlfasern (vorzugsweise polyolefinische Fasern, die normalerweise hydrophob sind) als Mittel zum Immobilisieren einer stationären Phase, die eine größere Affinität zum wenigstens vorübergehenden Absorbieren von wenigstens einer gelösten Stoffspezies relativ zu wenigstens einer anderen gelösten Stoffspezies hat, innerhalb der Mikroporen der Fasern verwendet. Daher hat, wenn ein flüssiger Träger, der die zu trennenden gelösten Stoffspezies enthält, durch den zentralen Hohlraum der Hohlfaser geleitet wird, wenigstens eine der gelösten Stoffspezies eine größere Verweilzeit innerhalb der Hohlfaser (d.h. wegen ihrer Affinität wenigstens vorübergehend durch die immobilisierte Phase innerhalb der Mikroporen der Faser absorbiert zu sein), wodurch verursacht wird, daß die gelöste zu trennende Stoffspezies am Ausgangsende der Faser getrennt wird - das heißt, die gelöste Stoffspezies, zu der die immobilisierte Phase eine geringere Absorptionsaffinität hat, erscheint in im wesentlichen "reiner" Form (aber von der Trägerflüssigkeit getragen) vor der gelösten Stoffspezies, zu der die immobilisierte Phase eine größere Absorptionsaffinität hat.
In einer Hinsicht stellt die vorliegende Erfindung ein Flüssigchromatographie-Verfahren zur Trennung von wenigstens der gelösten Stoffspezies A und B zur Verfügung, umfassend die Schritte des: (a) Immobilisierens innerhalb der Poren einer Zahl offenzelliger, mikroporöser Hohlfasern mit einer mittleren Porengröße von weniger als 500 nm (5 000 Å), einem inneren Durchmesser von etwa 5 bis 1500 um (Mikrons), einem Variationskoeffizienten des Innendurchmessers von weniger als etwa 8% und einem durchschnittlichen Verhältnis der maximalen Porendichte zur minimalen Porendichte rund um den Faserumfang von weniger als etwa 3:1, durch gleichmäßiges Befeuchten jeder der mikroporösen Hohlfasern damit, einer den gelösten Stoff absorbierenden Phase, die eine größere Affinität zum Absorbieren/Desorbieren der gelösten Stoffspezies A als vergleichsweise zur gelösten Stoffspezies B hat;
(b) Passierenlassens eines Trägerflüssigkeitsstroms durch die Hohlräume der mikroporösen Hohlfasern; und dann
(c) Injizierens einer Probenmischung, die gelöste Stoffspezies A und B umfaßt, in den Trägerflüssigkeitsstrom, so daß eine flüssige Mischung, die die Trägerflüssigkeit und die gelösten Stoffspezies A und B umfaßt, durch die Hohlräume der Hohlfasern hindurchwandert;
(d) Absorbierenlassens der gelösten Stoffspezies A vorzugsweise durch die immobilisierte, den gelösten Stoff absorbierende Phase, so daß eine erste Mischung, die im wesentlichen die Trägerflüssigkeit und gelöste Stoffspezies B umfaßt, zuerst aus den Hohlräumen der Hohlfasern herausläuft; und dann
(e) Desorbierenlassens der gelösten Stoffspezies A in den Trägerstrom, so daß eine zweite Mischung gebildet wird, die im wesentlichen die Trägerflüssigkeit und die gelöste Stoffspezies A umfaßt, die aus den Hohlräumen der Hohlfaser nach dem Ablaufen der ersten Mischung, die im wesentlichen die Trägerflüssigkeit und die gelöste Stoffspezies B umfaßt, ablaufengelassen wird, wodurch die gelösten Stoffspezies A und B aus deren Probenmischung getrennt werden.
Vorzugsweise ist die immobilisierte Phase innerhalb der Mikroporen der Faser organisch, da sie die normalerweise hydrophoben Hohlfasern leichter "befeuchtet" (d.h., daß die organische Phase die Mikroporen der Hohlfaser vollständig füllt). Die immobilisierte Phase kann daher eine organische Flüssigkeit oder ein Gel sein, mit der besonderen chemischen Zusammensetzung der immobilisierten Phase, die in Abhängigkeit von einer Anzahl von Faktoren ausgewählt ist, die ihre Verträglichkeit mit dem Hohlfasermaterial und/oder ihre Verträglichkeit mit den zu trennenden gelösten Stoffen und/oder ihre Absorptions-/Desorptionsaffinität für besondere gelöste Stoffspezies, für deren Trennung Interesse besteht, umfassen.
In einer weiteren Hinsicht stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Trennung von wenigstens einer biologischen Spezies von einer anderen biologischen Spezies zur Verfügung, umfassend die Schritte des:
(a) Immobilisierens innerhalb der Mikroporen einer Zahl offenzelliger, mikroporöser Hohlfasern mit einer mittleren Porengröße von weniger als 500 nm (5 000 Å), einen inneren Durchmesser von etwa 5 bis 1500 um (Mikrons), einem Variationskoeffizienten des Innendurchmessers von weniger als etwa 8% und einem durchschnittlichen Verhältnis der maximalen Porendichte zur minimalen Porendichte rund um den Faserumfang von weniger als etwa 3:1, durch gleichmäßiges Befeuchten jeder der mikroporösen Hohlfasern damit, einer organischen Phase, die ein Netzmittel umfaßt, das befähigt ist, innerhalb der organischen Phase reverse Micellen zu bilden;
(b) Pufferns einer wäßrigen Phase, umfassend eine Mischung aus einer und einer weiteren biologischen Spezies, auf einen Anfangs-pH, wobei eine der biologischen Spezies eine negative Ladung zeigt und die andere biologische Spezies eine positive Ladung zeigt;
(c) Passierenlassens der gepufferten, wäßrigen Phase durch die Hohlräume der Hohlfasern und Absorbierenlassens im wesentlichen der gesamten einen biologischen Spezies innerhalb der reversen Micellen der immobilisierten Phase, während die andere biologische Spezies zu einem Auslaßende der Hohlfasern läuft, so daß ein Strom, der im wesentlichen die Gesamtheit der anderen biologischen Spezies umfaßt, aus dem Auslaßende der Hohlfasern herausfließt, wobei die eine und die andere biologische Spezies getrennt werden; und dann darauffolgend
(d) Eluierens der absorbierten einen biologischen Spezies, nachdem die andere biologische Spezies aus dem Auslaßende der Hohlfasern herausgelaufen ist, wobei der Elutionsschritt der absorbierten einen biologischen Spezies die Schritte umfaßt des:
(i) Pufferns einer Trägerflüssigkeit auf einen zum Anfangs- pH der wäßrigen Phase verschiedenen pH und auf einen pH, der ausreicht, um eine Ladungsumkehr der einen biologischen Spezies von einer negativen Ladung in eine positive Ladung zu bewirken; und dann
(ii)Passierenlassens der gepufferten Trägerflüssigkeit durch die Hohlräume der Hohlfasern, um die Ladungsumkehr der einen biologischen Spezies zu bewirken und hierdurch zu verursachen, daß die eine biologische Spezies von den Mikroporen in die Trägerflüssigkeit eluiert wird.
Daher wird, gemäß der vorliegenden Erfindung, eine kommerziell praktikable Alternative zu den vorherigen Flüssigchromatographie-Techniken zur Verfügung gestellt. Dieser Vorteil, wie auch andere, wird deutlicher werden, nachdem die folgende ausführliche Beschreibung der bevorzugten, als Beispiel dienenden Ausführungsformen derselben eingehend betrachtet wurde.

Kurze Beschreibung der angefügten Zeichnungen

Im Anschluß hieran werden Bezüge auf die angefügten Zeichnungen vorgenommen, in denen die gleichen Bezugszahlen in den verschiedenen Figuren gleiche Strukturelemente bezeichnen und worin:
Figur 1 eine schematische Ansicht eines Flüssigchromatographie-Systems ist, das in den unten beschriebenen Beispielen verwendet ist;
Figur 2 ein repräsentatives Diagramm der Absorption gegen die Zeit ist, das die Trennleistung zeigt, die gemäß dem unten beschriebenen Beispiel 1 erreicht wurde;
Figur 3 ein Diagramm der Absorption gegen die Zeit für dieselben, wie in Figur 2 gezeigten, gelösten Stoffe ist, jedoch ohne die Verwendung einer organischen, auf den Mikroporen der Hohlfasern immobilisierten Phase (d.h., gemäß Beipiel III, unten);
Figur 4 ein Diagramm der Absorption gegen die Trennzeit, die gemäß Beispiel IV unten erreicht wurde, ist; und
Figur 5 ein Diagramm der Absorption gegen die Trennzeit, die gemäß Beispiel V unten erreicht wurde, ist.

Detaillierte Beschreibung der bevorzugten, als Beispiele dienenden Ausführungsformen.

Die neuen Flüssigchromatographie-Säulen der vorliegenden Erfindung schließen eine Anzahl von mikroporösen Hohlfasern ein. Obwohl irgendwelche geeigneten mikroporösen Hohlfasern in der praktischen Durchführung dieser Erfindung eingesetzt werden können, ist gegenwärtig bevorzugt, mikroporöse, normalerweise hydrophobe Polyolefin-(z.B. Polypropylen oder Polyethylen) Hohlfasern zu verwenden, die im allgemeinen parallel zueinander in dicht gepackter Nachbarschaft innerhalb eines äußeren Mantels einer Struktur angeordnet sind.
Die bevorzugten, in dieser Erfindung eingesetzten Hohlfasern sind von dem Typ, der unter Verwendung der "Aufwärts-Spinnen"-Technik, die im US- A-4 405 688 und US-A-4 451 981 offenbart ist, hergestellt wurde. Kurz, es werden nicht-poröse Vorläufer-Hohlfasern gemäß den Techniken, die in diesen früheren Patenten offenbart sind, durch Schmelz-Spinnen der Vorläufer-Fasern in einer im wesentlichen vertikalen Aufwärtsrichtung (d.h., Aufwärts-Spinnen) hergestellt. Die auf diese Weise Schmelz-gesponnenen hohlen Vorläufer-Fasern werden dann Spinn-orientiert, während sie einem symmetrischen Abschreckschritt, unter Verwendung einer hohlen Ringstruktur unterzogen werden, die die Vorläufer-Faser umgibt, die eine oder mehrere Öffnungen auf ihrer inneren Oberfläche hat, die das Abschreckmittel gegen die Vorläufer-Fasern in einer im wesentlichen einheitlichen Weise verteilt. Die so gebildete, hohle Vorläufer-Faser kann dann warm getempert werden, indem z.B. die nicht poröse Vorläufer-Hohlfaser einer Temperatur zwischen 5 ºC und 100 ºC während eines Zeitraums von wenigstens wenigen Sekunden (z.B. von einigen Sekunden bis zu etwa 24 Stunden, vorzugsweise zwischen etwa 30 Minuten und etwa 2 Stunden) ausgesetzt ist.
Die fertigen mikroporösen Hohlfasern besitzen einen mittleren inneren Durchmessser im Bereich von etwa 5 bis etwa 1500 um (Mikrons) und vorzugsweise im Bereich von etwa 70 bis etwa 1500 um (Mikrons). Die Fasern sind weiterhin durch einen im wesentlichen einheitlichen inneren Durchmesser (I.D.), z.B. durch einen Variationskoeffizienten des Innendurchmessers durch einen Querschnitt, der senkrecht zu der Achse der Faser geführt wurde, von weniger als etwa 8%, vorzugsweise weniger als etwa 5% und am meisten bevorzugt weniger als 3%, gekennzeichnet.
Die Poren der bevorzugten mikroporösen Hohlfasern sind im wesentlichen über gewundene Pfade, die sich von einer äußeren Oberfläche oder einem Oberflächengebiet zu einer anderen erstrecken können, d.h. offenzellig, untereinander verbunden. Des weiteren sind die Poren der bevorzugten mikroporösen Hohlfasern der vorliegenden Erfindung mikroskopisch, d.h. die Einzelheiten der Ausrichtung oder Anordnung der Pore werden nur bezüglich mikroskopischer Abmessungen beschrieben. Daher sind die offenen Zellen oder Poren in den Fasern kleiner als jene, die unter Verwendung eines gewöhnlichen Lichtmikroskops gemessen werden können, da die Wellenlänge des sichtbaren Lichts, die etwa 500 nm (5 000 Angström) beträgt, länger als die längste Planar- oder Oberflächenabmessung der offenen Zelle oder Pore ist. Die Porengröße der mikroporösen Hohlfasern kann unter Verwendung elektronenmikroskopischer Techniken, die in der Lage sind, Einzelheiten einer Porenstruktur unterhalb von 500 nm (5 000 Angström) aufzulösen oder mit Quecksilber-Porosimeter-Techniken, definiert werden.
Die mittlere, wirksame Porengröße der mikroporösen Hohlfasern, die in der praktischen Durchführung dieser Erfindung verwendbar sind, liegt vorzugsweise zwischen 5 und 20 nm (50 und 2000 Angström) und noch typischer zwischen 10 und 100 nm (100 und 1000 Angström). Unter "mittlerer, wirksamer Porengröße" ist die kleinste Abmessung einer Pore zu verstehen, die ein im allgemeinen kugelförmiges Teilchen von der gleichen Abmessung durch sie hindurchtreten läßt. Die Poren haben im allgemeinen eine gestreckte Form mit einer Weite von 5 bis 200 nm (50 bis 2000 Angström) und einer Länge von 50 bis 1000 nm (500 bis 10 000 Angström). Daher wird die "mittlere, wirksame Porengröße" der bevorzugten mikroporösen Hohlfasern im allgemeinen durch die Abmessung der Weite der Poren bestimmt. Außerdem sind diese Poren um den Umfang der Faser herum ziemlich einheitlich. Z.B. zeigen die bevorzugten mikroporösen Hohlfasern ein durchschnittliches Verhältnis der maximalen Porendichte zur minimalen Porendichte um den Umfang der Faser herum von weniger als etwa 3:1, und für gewöhnlich weniger als etwa 2:1.
Mikroporöse Hohlfasern des oben beschriebenen Typs sind im Handel von Hoechst Celanese Corporation, Separation Products Division, Charlotte, North Carolina unter der eingetragenen Handelsmarke CELGARD zu beziehen.
Die mikroporösen Hohlfasern sind vorzugsweise ein Teil eines Moduls mit einem Einlaßende und Auslaßende. Das Modul umfaßt eine Zahl (z.B. von einigen Hundert bis vielen Tausend) Hohlfasern einer vorbestimmten Länge, die im wesentlichen innerhalb des Zentralraums eines Mantels mit im allgemeinen röhrenf örmiger Struktur (z.B. Glas- oder Metallrohre) parallel zueinander angeordnet sind. Die einzelnen Fasern werden im Innern des äußeren Mantels der Struktur auf ihrem Platz mittels Einbettungsverbindungen (z . B. Epoxyharzen) fixiert. Module dieses Typs sind im Handel in einem weiten Größen- und Kapazitätenbereich verfügbar. Z.B. ist ein besonderes Modul mikroporöser Hohlfasern, das zufriedenstellend in der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden kann, im Handel bei Hoechst Celanese Corporation, Separation Products Division, Katalognr. 50101060 erhältlich. Dieses Modul hat 27 000 CELGARD mikroporöse Hohlfasern mit 100 um Innendurchmesser. Jedoch können andere geeignete mikroporöse Hohlfasermodule für chromatographische Trennungen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Die in den Mikroporen der Hohlfasern immobilisierte Phase, ist vorzugsweise organisch und kann entweder eine Flüssigkeit oder ein Feststoff sein (z.B. ein polymeres Gel). Die Auswahl irgendeiner besonderen immobilisierten Phase hängt von einer Anzahl von Faktoren ab, umfassend den (die) besonderen, zu trennenden gelösten Stoff(e), ihre pH-Abhängigkeit und/oder ihre Verträglichkeit und Benetzungsfähigkeit bezüglich der mikroporösen Hohlfasern in dem chromatographischen Modul.
Für die vorliegende Erfindung ist von Bedeutung, daß die immobilisierte Phase so gewählt ist, daß sie gegen wenigstens eine der gelösten Stoffspezies eine größere Absorptionsaffinität zeigt, als vergleichsweise zur Absorptionsaffinität gegen wenigstens eine andere gelöste Stoffspezies. Das heißt, die immobilisierte Phase muß einen Differential-Verteilungskoeffizienten "K" zwischen der einen und der anderen gelösten Stoffspezies, deren Trennung beabsichtigt ist, aufweisen. Diesbezüglich sei auf Skoog et al., "Fundamentals of Analytical Chemistry", Seiten 639-671 (1976) verwiesen.
Die immobilisierte Phase ist am meisten bevorzugt eine organische Flüssigkeit. Tatsächlich kann jede beliebige geeignete organische Flüssigkeit in der praktischen Durchführung dieser Erfindung eingesetzt werden, wobei die Auswahl irgendeiner besonderen organischen Flüssigkeit wiederum von wenigstens einigen der oben aufgezählten Faktoren abhängt. Wenn z.B. mikroporöse Hohlfasern aus Polypropylen eingesetzt werden, ist die organische Flüssigkeit eine, die befähigt ist, die Faser zu "benetzen". Solche organischen Flüssigkeiten sind vorzugsweise mit Wasser nicht mischbar und/oder zeigen eine Oberflächenspannung von weniger als etwa 50 Dyn/cm (50 mN/m) und mehr bevorzugt weniger als etwa 35 Dyn/cm (35 mN/m).
Nur als Beispiele aufgeführt, schließen organische Flüssigkeiten, die in der praktischen Durchführung dieser Erfindung eingesetzt werden können, Aldehyde, Ketone (z.B. Methylethylketon, Methylisobutylketon, Methylcyclohexanon, Dimethylcyclohexanon), Ester (z.B. Cyclohexylacetat, Furfurylacetat, Amylacetat), Ether (z.B. 2-Chlor-2-methoxydiethylether, Diisopropylether), aliphatische und aromatische Kohlenwasserstoffe (z.B. Hexan, Dodecan beziehungsweise Benzol, Toluol), organische Alkohole (z.B. Isobutanol, Butanol - Pentanol, Octanol, Dodecanol, Methylcyclohexanol, 2-Ethylhexanol) und Carbonsäuren (z.B. Octansäure, Naphthensäuren) ein. Andere organische Flüssigkeiten können auch eingesetzt werden, wie z.B. Tributylphosphat, Trioctylphosphat, Trioctylphosphinoxid, Phosphonsäureester, Dimethylphthalat, Diethyloxalat, Arylsulfonsäuren, Hydroxyoxime, Oxinderivate, β-Diketone, Alkarylsulfonamide und primäre, sekundäre, tertiäre und quarternäre Amine, nur um einige zu nennen.
Wenn sie zur Trennung biologischer Spezies, z.B. Proteine, verwendet wird, umfaßt die immobilisierte flüssige organische Phase am meisten bevorzugt Tröpfchen einer wäßrigen Lösung im Nanometer-Maßstab, die in einer apolaren Umgebung durch die Gegenwart von Netzmitteln an der Grenzschicht stabilisiert sind - das heißt, sogenannte "reverse Micellen". Diesbezüglich siehe Goklen et al., "Protein Extraction Using Reverse Micelles", Biotechnology Progress, Band 1, Nr. 1, S. 69-74 (März, 1985) und Goklen et al., "Liquid-Liquid Extraction of Low Molecular-Weight Proteins by Selective Solubilization in Reversed Micelles", Separation Science and Technology, 22 (2&3), S. 831-841 (1987). Diese reversen Micellen zeigen eine gewisse elektrostatische Ladung, die pH abhängig ist (d.h. Ladungen mit einer Änderung im pH) und die daher verwendet werden, um ein Protein einer entgegengesetzten Ladung in Lösung zu bringen. Daher ist im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung, wenn die zu trennenden gelösten Stoffe Proteine sind und die immobilisierte organische Phase innerhalb der Mikroporen der Hohlfaser solche reverse Micellen einschließt, der pH der mobilen Phase so gewählt, daß die reverse Micelle ein spezielles Protein unterschiedlicher elektrostatischer Ladung löslich macht. Nachdem das andere Protein der im wesentlichen gleichen elektrostatischen Ladung abgetrennt wurde (d.h., da es nicht mittels der reversen Micellen löslich gemacht wurde), kann das löslich gemachte Protein durch Änderung des pH der mobilen Phase (der die elektrostatische Ladung der reversen Micelle beeinflußt) eluiert werden.
Jedes beliebige Netzmittel, das befähigt ist, reverse Micellen in einer apolaren Umgebung zu bilden, kann in der praktischen Durchführung dieser Erfindung verwendet werden. Vorzugsweise ist das Netzmittel Di-dodecylsulfosuccinat (Aerosol-OT), oder ein kationisches Amin, z.B. Hexadecyltributylammoniumchlorid.
Wenn organische Flüssigkeiten als immobilisierte Phase gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, werden die Mikroporen der Hohlfasern am geeignetsten gefüllt, indem ein kleines Volumen der organischen Flüssigkeit oben auf eine Säule gegeben wird, die eine Anzahl von Hohlfasern enthält und diese Flüssigkeit in die Fasern hineinsaugengelassen wird, wodurch dieselben benetzt werden (d.h. Füllen der Mikroporen).
Es ist wichtig, daß alle mikroporösen Fasern in dem Modul gleichmäßig mit der organischen Flüssigkeit befeuchtet sind. Wenn normalerweise hydrophobe, mikroporöse Hohlfasern aus Polyolefin (z.B. Popypropylen), wie oben beschrieben wurde, verwendet werden, ändert sich das charakteristische, normale undurchsichtige Aussehen der Fasern zu einem durchscheinenden, sobald sie mit der organischen Flüssigkeit befeuchtet sind. Das Vorhandensein ungefüllter Mikroporen in der Hohlfaser läßt sich daher leicht visuell durch Untersuchen der Fasern nach undurchsichtigen Gebieten, die von durchscheinenden Gebieten umgeben sind, nachweisen. Um in der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendbar zu sein, müssen alle Fasern in dem Modul durchscheinend sein, wodurch angezeigt wird, daß alle Mikroporen einheitlich gefüllt sind.
Eine andere Klasse organischer Phasen, die in den Mikroporen der Hohlfaser immobilisiert werden können, sind sogenannte polymere Gele, die mit Affinitätsliganden modifiziert sind. Die polymeren Gele können z.B. Polyacrylamid, vernetztes Polystyrol, Stärke (z.B. wäßriges Dextrin, das von Sephadex Corporation und Pharmacia Corporation im Handel erhältlich ist) oder vernetzte Silane sein, wobei Polyacrylamid gegenwärtig bevorzugt ist.
Wenn Polyacrylamid als die immobilisierte Gelphase innerhalb der Mikroporen der Hohlfasern eingesetzt wird, ist es bevorzugt, die Faser mit einem flüssigen Acrylamidmonomer anzufeuchten (d.h. die Mikroporen zu füllen), das zur Aufnahme von Affinitätsliganden in ähnlicher Weise modifiziert ist, wie oben unter Berücksichtigung anderer flüssiger organischer Stoffe beschrieben wurde. Flüssige Acrylamidmonomere, die so modifiziert sind, sind an sich sehr wohlbekannt und von einer Anzahl kommerzieller Quellen, z.B. von Pharmacia und Biorad Corporations erhältlich. Die Auswahl irgendeines besonderen Acrylamidmonomers (d.h., eines, das spezielle Affinitätsliganden hat), das in der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung eingesetzt ist, hängt natürlich in großem Ausmaß von den besonderen gelösten Stoffspezies ab, deren Trennung beabsichtigt ist. Hier reicht aus, zu sagen, daß die Fachleute absolut in der Lage sind, die Auswahl irgendeines besonderen Acrylamidmonomers mit einem Affinitätsliganden zu treffen, das geeignet ist, die Trennung besonders interessierender gelöster Stoffspezies zu erreichen. Wenn das Acrylamidmonomer innerhalb der Hohlfasermikroporen immobilisiert wurde, kann danach die Polymerisation des Acrylamidmonomers in situ durchgeführt werden.
Ist die organische Flüssigkeit oder das Gel einmal innerhalb der Mikroporen der Hohlfaser immobilisiert, können dann chromatographische Trennungen durchgeführt werden, z.B. unter Verwendung des Systems 10, das in der beigefügten Figur 1 dargestellt ist. Wie zu sehen ist, umfaßt das System 10 einen Lösungsmittelbehälter 12, der reines flüssiges Lösungsmittel enthält. Für-die meisten gelösten Stoffe wird als Lösungsmittel eine wäßrige Lösung eingesetzt. Das Lösungsmittel wird aus dem Behälter 12 mittels einer geeigneten Pumpe 14 durch ein Einspritzventil 16 in den Einlaß eines Hohlfasermoduls 18, wie oben beschrieben ist, gepumpt. Die gelösten Stoffspezies können so zur Zeit t&sub0; in einen Strom reinen Lösungsmittels mittels des Einspritzventils 16 eingespritzt werden und zum Einlaß des Hohlfasermoduls 18 weitergeleitet werden. Der Strom, der das Modul 18 zur Zeit t&sub1; später als zur Zeit t&sub0; verläßt, kann mit irgendeinem geeigneten Analysengerät, z.B. einem Detektor 20 für Ultraviolett- und sichtbaren Bereich analysiert werden, der Signale an einen geeigneten Mikroprozessor 22 abgibt, um graphische Darstellungen herzustellen und/oder die gesammelten Daten in eine für den Menschen lesbare Form zu überführen. Danach kann der Strom an eine Sammelstelle geleitet werden, um die getrennten, gelösten Stoffe für weitere Verarbeitung und/oder Reinigung (z.B. Entfernung des Lösungsmittels) zu sammeln.
Weiterhin wird die Erfindung mit Hilfe der folgenden Beispiele beschrieben, die nur beschreiben, aber nicht begrenzen sollen.

Beispiel I

Eine wäßrige Lösung aus den in gleichen Mengen gelösten Stoffen 2-Butanon, 2-Pentanon, 2-Hexanon und 2-Heptanon wurde in ein mikroporöses Hohlfasermodul injiziert, worin die Fasern mit einer Lösung von 50% Trioctylphosphat/50% Dodecan befeuchtet waren. Das Modul enthielt 420 mikroporöse Polypropylenhohlfasern (CELGARD ), jede 60 cm lang mit einem Innendurchmesser von 100 um und einer Wandstärke von 30 um. Die beiliegende Figur 2 zeigt die Ergebnisse der chromatographischen Trennung der gelösten Stoffe.

Beispiel IIA

Beispiel I wurde unter Verwendung eines Moduls mit 420 mikroporösen Polypropylenhohlfasern, von denen jede eine Länge von 60 cm und einen Innendurchmesser von 100 um hatte, wiederholt. Die in diesem Beispiel II eingesetzten gelösten Stoffe waren 2-Butanon, Methyl-i-butanon, 2-Pentanon, Cyclohexanon, 2-Heptanon und 4-Heptanon, wobei die immobilisierte Phase 50% Trioctylphosphat/50% Dodecan betrug. Die Ergebnisse sind nachfolgend in Tabelle A dargestellt. Tabelle A Säule (a) gelöste Stoffe Länge/Geschwindigkeit (l/v,s (b)) Verweilzeit (tR,s) Banden-Breite (T²,s²) 2-Butanon Methyl-i-butanon 2-Pentanon Cyclohexanon 2-Heptanon 4-Heptanon (a) Die erste unten angegebene Zahl ist die Säulenlänge l, die zweite ist die Anzahl der 100 Mikrometer-Fasern und die Abkürzung "TOP" bezeichnet die stationäre Phase, die aus 50% Trioctylphosphat und 50% Dodecan besteht. (b) Bezogen auf einen nominellen Durchmesser von 100 Mikrometern.
Die obigen Daten in Tabelle A verdeutlichen, daß gemischte gelöste Stoffe durch Flüssigchromatographie in mikroporösen Hohlfasern mit einer flüssigen organischen Phase, die in deren Mikroporen immobilisiert ist, erfolgreich getrennt werden können.

Beispiel IIB

Beispiel IIA wurde unter Verwendung der Säulen und gelösten Stoffe, die in der unten folgenden Tabelle B ausgewiesen sind, wiederholt. Wie aus den Daten in Tabelle B ersichtlich ist, sind wirksame Trennungen gelöster Stoffe möglich. Tabelle B Säule (a) gelöste Stoffe Länge/Geschwindigkeit (l/v,s (b)) Verweilzeit (tR,s) Banden-Breite (T²,s²) m-Nitrophenol p-Nitrophenol Uracil m-Nitrophenol 4-Heptanon 2-Pentanon Phenol o-Nitrophenol (a) Die erste unten angegebene Zahl ist die Säulenlänge l, die zweite ist die Anzahl der 100 Mikrometer-Fasern und die Abkürzung "120H" bezeichnet die stationäre flüssige Phase, die aus 75% Dodecanol und 25% Dodecan besteht. (b) Bezogen auf einen nominellen Durchmesser von 100 Mikrometern.

Beispiel III (Vergleich)

Beispiel I wurde wiederholt, außer daß eine flüssige, organische Phase nicht in den Mikroporen der Hohlfasern vorhanden war. Daher hatten die mikroporösen Hohlfasern, die in diesem Beispiel III eingesetzt waren, innerhalb der Mikroporen der Fasern keine immobilisierte Phase. Die Ergebnisse erscheinen in der Grafik der Figur 3.
Aus der Figur 3 ist sofort ersichtlich, daß keine Trennung der gelösten Stoffspezies stattgefunden hat (da z.B. nur ein einziger Peak vorhanden ist). Zu bemerken ist auch die unterschiedliche Zeitskala zwischen den Figuren 2 und 3, wobei letztere signifikant kürzer ist, als die, die in der vorhergehenden verwendet wurde. Daher würden die gelösten Stoffe auf derselben Zeitskala, wie sie für Figur 2 verwendet wurde, als scharfer Peak nahe der Y-Achse in Figur 3 erscheinen. Dieser Wert besagt, daß die "leeren" Mikroporen nicht in der Lage waren, die gelösten Stoffe voneinander zu trennen.

Beispiel IV

Die Wirksamkeit von Flüssigchromatographie bei der Verwendung einer immobilisierten organischen Phase mit reversen Micellen wurde untersucht. Dieses Beispiel IV verwendete ein Modul von 60 cm Länge mit 480 mikroporösen Polypropylenhohlfasern (CELGARD ) mit 100 um Innendurchmesser. Die mobile Phase bestand aus einer wäßrigen Lösung der Proteine Myoglobin und Cytochrom c in gleichen Mengen, die auf einen pH von 6,0 gepuffert waren. Die immobilisierte Phase bestand aus Dodecan als Lösungsmittel und Natriumdidodecylsulfosuccinat als reversem, Micellen-bildenden Netzmittel.
Die mobile, wäßrige Phase, die die Proteine enthielt und auf pH 6 gepuffert war, wurde in einen wäßrigen Strom, der durch den zentralen Hohlraum der mikroporösen Hohlfasern in dem Modul führte, injiziert. Bei einem pH von 6 zeigt Cytochrom c eine positive Ladung und wurde daher in den Micellen in der immobilisierten organischen Phase zurückgehalten. Das Myoglobin, das bei pH 6 von negativer Ladung ist, wanderte mit der mittleren Verweilzeit der mobilen Phase durch das Modul hindurch. Nachdem das Myoglobin durch das Modul hindurchgewandert war, wurde der pH der mobilen Phase auf 10 geändert. Bei diesem höheren pH hat das Cytochrom c eine negative Ladung, wodurch seine Elution aus dem Modul bewirkt wird. Daher trat eine hochauflösende Trennung zwischen dem Cytochrom c und dem Myoglobin, wie in Figur 4 dargestellt ist, auf.

Beispiel V

Beispiel IV wurde wiederholt, außer daß ein größeres Modul im kommerziellen Maßstab (Catalog Nr. 50101060, Hoechst Celanese Corporation, Separations Products Division, Charlotte, North Carolina) eingesetzt wurde. Das in diesem Beispiel V verwendete Modul war 22 cm lang mit 27 000 mikroporösen Hohlfasern (CELGARD ) mit 100 um Innendurchmesser. Die Ergebnisse der chromatographischen Trennungen, die in diesem Beispiel V erreicht wurden, sind in Figur 5 dargestellt.
Die obigen Beispiele zeigen, daß die vorliegende Erfindung Trennungen gelöster Stoffe durch Verwenden von mikroporösen Hohlfasern erreicht. Außerdem, wie Beispiel V zeigt, kann die vorliegenden Erfindung im "Maßstab erweitert" werden, um eine praktikable Technik zur Trennung kommerziell bedeutender gelöster Stoffspezies bereitzustellen.

Claims

1. Flüssigchromatographieverfahren zur Trennung wenigstens der gelösten Stoffspeziesen A und B, umfassend die Schritte des:

(a) Immobilisierens innerhalb der Poren einer Zahl offenzelliger, mikroporöser Hohlfasern mit einer mittleren Porengröße von weniger als 500 nm (5 000 Å), einem inneren Durchmesser von 5 bis 1500 um (Mikrons), einem Variationskoeffizienten des Innendurchmessers von weniger als etwa 8% und einem durchschnittlichen Verhältnis der maximalen Porendichte zur minimalen Porendichte rund um den Faserumfang von weniger als etwa 3:1, durch gleichmäßiges Befeuchten jeder der mikroporösen Hohlfasern damit, einer den gelösten Stoff absorbierenden Phase, die eine größere Affinität zum Absorbieren/Desorbieren der gelösten Stoffspezies A als vergleichsweise zur gelösten Stoffspezies B hat;

(b) Passierenlassens eines Trägerflüssigkeitsstroms durch die Hohlräume der mikroporösen Hohlfasern; und dann

(c) Injizierens einer Probenmischung, die gelöste Stoffspeziesen A und B umfaßt, in den Trägerflüssigkeitsstrom, so daß eine flüssige Mischung, die die Trägerflüssigkeit und die gelösten Stoffspeziesen A und B umfaßt, durch die Hohlräume der Hohlfasern hindurchwandert;

(d) Absorbierenlassens der gelösten Stoffspezies A vorzugsweise durch die immobilisierte, den gelösten Stoff absorbierende Phase, so daß eine erste Mischung, die im wesentlichen die Trägerflüssigkeit und gelöste Stoffspezies B umfaßt, zuerst aus den Hohlräumen der Hohlfasern herausläuft; und dann

(e) Desorbierenlassens der gelösten Stoffspezies A in den Trägerstrom, so daß eine zweite Mischung gebildet wird, die im wesentlichen die Trägerflüssigkeit und die gelöste Stoffspezies A umfaßt, die aus den Hohlräumen der Hohlfaser nach dem Ablaufen der ersten Mischung, die im wesentlichen die Trägerflüssigkeit und die gelöste Stoffspezies B umfaßt, ablaufengelassen wird, wodurch die gelösten Stoffspeziesen A und B aus deren Probenmischung getrennt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die den gelösten Stoff absorbierende Phase organisch und die Trägerflüssigkeit wäßrig ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin die immobilisierte, organische Phase flüssig ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2, worin die immobilisierte, organische Phase ein polymeres Gel ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin das polymere Gel aus der Gruppe, bestehend aus Polyacrylamid, Polystyrol, Stärke und vernetzten Silanen, ausgewählt ist.

6. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, worin die mittlere Porengröße der mikroporösen Hohlfaser zwischen 5 und 200 nm (50 und 2000 Å) ist.

7. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, worin die mikroporöse Hohlfaser einen Variationskoeffizienten des Innendurchmessers von weniger als etwa 5% hat.

8. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, umfassend den weiteren Schritt des Bereitstellens eines Flüssigchromatographie-Moduls, der einen Einlaß und einen Auslaß hat und eine Zahl mikroporöser Hohlfasern, die in dem Modul im allgemeinen untereinander parallel zwischen dem Einlaß und Auslaß des Moduls angeordnet sind, und worin die zentralen Hohlräume der Hohlfasern zwischen dem Einlaß und Auslaß des Moduls eine flüssige Verbindung herstellen.

9. Verfahren zur Trennung von wenigstens einer biologischen Spezies von einer anderen biologischen Spezies, umfassend die Schritte des:

(a) Immobilisierens innerhalb der Poren einer Zahl offenzelliger, mikroporöser Hohlfasern mit einer mittleren Porengröße von weniger als 500 nm (5 000 Å), einen inneren Durchmesser von 5 bis 1500 um (Mikrons), einem Variationskoeffizienten des Innendurchmessers von weniger als etwa 8% und einem durchschnittlichen Verhältnis der maximalen Porendichte zur minimalen Porendichte rund um den Faserumfang von weniger als etwa 3:1, durch gleichmäßiges Befeuchten jeder der mikroporösen Hohlfasern damit, einer organischen Phase, die ein Netzmittel umfaßt, das befähigt ist, innerhalb der organischen Phase reverse Micellen zu bilden;

(b) Pufferns einer wäßrigen Phase, umfassend eine Mischung aus einer und einer weiteren biologischen Spezies, auf einen Anfangs-pH, wobei eine der biologischen Spezies eine negative Ladung zeigt und die andere biologische Spezies eine positive Ladung zeigt;

(c) Passierenlassens der gepufferten, wäßrigen Phase durch die Hohlräume der Hohlfasern und Absorbierenlassens im wesentlichen der gesamten einen biologischen Spezies innerhalb der reversen Micellen der immobilisierten Phase, während die andere biologische Spezies zu einem Auslaßende der Hohlfasern läuft, so daß ein Strom, der im wesentlichen die Gesamtheit der anderen biologischen Spezies umfaßt, aus dem Auslaßende der Hohlfasern herausfließt, wobei die eine und die andere biologische Spezies getrennt werden; und dann darauffolgend

(d) Eluierens der absorbierten einen biologischen Spezies, nachdem die andere biologische Spezies aus dem Auslaßende der Hohlfasern herausgelaufen ist, wobei der Elutionsschritt der absorbierten einen biologischen Spezies die Schritte umfaßt des:

(i) Pufferns einer Trägerflüssigkeit auf einen zum Anfangs-pH der wäßrigen Phase verschiedenen pH und auf einen pH, der ausreicht, um eine Ladungsumkehr der einen biologischen Spezies von einer negativen Ladung in eine positive Ladung zu bewirken; und dann

(ii) Passierenlassens der gepufferten Trägerflüssigkeit durch die Hohlräume der Hohlfasern, um die Ladungsumkehr der einen biologischen Spezies zu bewirken und hierdurch zu verursachen, daß die eine biologische Spezies von den Mikroporen in die Trägerflüssigkeit eluiert wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin sowohl die eine, als auch die andere biologische Spezies ein Protein ist.

11. Verfahren nach Anspruch 9, umfassend den weiteren Schritt des Immobilisierens eines polymeren Gels, das modifiziert wurde, um Affinitätsliganden in den Poren einer Zahl poröser Hohlfasern aufzunehmen, durch

(i) Füllen der Hohlfaserporen mit einem flüssigen Monomer des polymeren Gels, und dann

(ii) Polymerisieren des Monomers in situ innerhalb der Poren der Hohlfasern.

12. Verfahren nach Anspruch 11, worin das Monomer ein flüssiges Acrylamid ist, das modifiziert ist, um Affinitätsliganden aufzunehmen.