DE19821812C2 - Miniaturisierte Trennsäule - Google Patents

Abstract

Miniaturisierte Trennsäulen, deren Trennmittel von einer einzelnen mit Separationseffektoren derivatisierten porösen Hohlfasermembran gebildet wird, und die mit Anschlüssen für Elutionsmittelzu- und -ablauf versehen sind, werden offenbart.

Description

Die Erfindung betrifft eine miniaturisierte Trennsäule, insbesondere für die Flüssigkeitschromatographie, sowie deren Verwendung zur Substanz­ trennung und in Trenneinrichtungen.

Für analytische Anwendungen wird zunehmend eine Miniaturisierung von Trennvorrichtungen, z. B. HPLC-Anlagen, vorgenommen. So werden an­ stelle der in der analytischen HPLC üblichen Trennsäulen mit 4 mm inne­ rem Durchmesser zunehmend engere Trennsäulen eingesetzt, z. B. solche mit 2 mm innerem Durchmesser oder micro bore Säulen mit einem inneren Durchmesser von 1 mm oder weniger. Sorbentien für derartig miniaturi­ sierte Säulen weisen Partikeldurchmesser von 3 µm oder weniger auf. Da­ durch ist eine gute Trennleistung, d. h. eine hohe Anzahl theoretischer Trennböden (≧ 100 000/m) möglich. Es ist jedoch schwierig, Trennsäulen mit derartigen Sorbenspackungen reproduzierbar zu packen. Auch ist der Druckabfall bei Verwendung derartig kleiner Sorbenspartikel sehr hoch, wenn übliche lineare Flußraten angewandt werden.

Die japanische Offenlegungsschrift JP 63-246 657 offenbart flüssigkeits­ dicht ummantelte flexible oder starre Kapillaren aus porösen Membran­ materialien, die als miniaturisierte Trennsäulen für die Gelpermeations­ chromatographie geeignet sind. Hinweise auf die Einführung von Separa­ tionseffektoren werden nicht gegeben. Diese Druckschrift offenbart Trenn­ säulen, in denen Probe und Elutionsmittel das Lumen der hohlen Membran, nicht die Membran selbst durchströmen.

Es besteht also die Aufgabe, miniaturisierte Trennsäulen bereitzustellen, deren Trennmittel Separationseffektoren enthalten, und die somit bei­ spielsweise für die Ionenaustausch- oder die reversed-phase-Chromato­ graphie geeignet sind; diese miniaturisierten Trennsäulen sollen für minia­ turisierte Trenneinrichtungen geeignet sein, reproduzierbar hergestellt wer­ den können und sich durch einen geringen Druckabfall auszeichnen.

Gegenstand der Erfindung sind miniaturisierte chromatographische Trenn­ säulen, die mit Anschlüssen für Elutionsmittelzu- und -ablauf versehen sind und deren Trennmittel aus einer porösen, mit Separationseffektoren derivatisierten Membran besteht, die von einer einzelnen Hohlfaser gebildet wird. Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung der erfindungsgemäßen Trennsäulen für die chromatographische Trennung mindestens zweier Substanzen, sowie die Verwendung der erfindungsgemäßen Trennsäulen in Trenneinrichtungen.

In den Abb. 1, 2 und 3 (jeweils Teilabbildungen a und b) werden Varianten von erfindungsgemäßen Trennsäulen dargestellt. Die Pfeile kennzeichnen die Flußrichtung von Elutionsmittel und Probe. In den

Abb. 4a und 4b werden zwei weitere Varianten von erfindungsgemäßen Trennsäulen dargestellt, die in eine optische Meßzelle integriert sind.

Abb. 5 zeigt ein Elutionsdiagramm; experimentelle Einzelheiten finden sich in dem Anwendungsbeispiel A.

Aus WO 96/22 316 und WO 97/49 754 sind Trennmmittel bekannt, die auch als Hohlfasermembranen ausgeprägt sein können. Es wurde gefun­ den, daß einzelne poröse Hohlfasern als Trennmittel verwendet werden können. Sie können anstelle eines Sorbens in eine angepaßte chromato­ graphische Säule eingebracht werden. Derartige Hohlfasern sind repro­ duzierbar herstellbar. Mit diesem Trennmittel versehene chromatographi­ sche Säulen erlauben Trennungen in einem weiten Bereich von linearen Fließgeschwindigkeiten, ohne daß ein übermäßiger Druckabfall auftritt.

Der Begriff "Trennmittel" umfaßt bekannte partikuläre und nicht-partikuläre Sorbentien, sowie die erfindungsgemäßen Trennmembranen; Trennmittel bestehen aus einem Grundträger und an diesen Grundträger gebundenen Separationseffektoren. Separationseffektoren bewirken die chromatogra­ phische Trennung der Substanzen im Eluentenstrom. Beispiele für Separationseffektoren sind ionische Gruppen wie die Carboxyl- oder die Sulfonsäuregruppe für die Kationenaustauschchromatographie, alkylierte Amino- oder Ammoniumgruppen für die Anionenaustauscherchromato­ graphie, lang- und mittelkettige Alkylgruppen oder Arylgruppen für die reversed-phase Chromatographie. Weitere Beispiele für Separations­ effektoren sind in den Druckschriften WO 96/22 316 und WO 97/49 754 offenbart. Die erfindungsgemäßen Trennmembranen sind einzelne Hohlfasermembranen, die Separationseffektoren enthalten. Trennsäulen umfassen zusätzlich zu dem Trennmittel einen Säulenmantel und Anschlüsse für Elutionsmittelzu- und -ablauf. Trenneinrichtungen umfas­ sen neben einer Trennsäule optional eine weitere Trennsäule als Vor­ säule, sowie periphere Einrichtungen, zu denen beispielsweise Elutions­ mittelbehälter und -pumpen, Gradientenmischer, Probenauftragevorrich­ tungen und Detektoren gehören.

Hohlfasermembranen werden im allgemeinen mit einem äußeren Durch­ messer von 0,2 bis 3 mm und einem inneren Durchmesser von 0,1 bis 1 mm hergestellt. Als Grundlage für die erfindungsgemäß verwendeten Trennmembranen sind handelsübliche poröse Hohlfasermembranen geeignet, in die durch geeignete Derivatisierungsverfahren Separations­ effektoren eingebracht worden sind. In den oben genannten Druckschrif­ ten sind auch Verfahren zur Derivatisierung von Polyamidmembranen offenbart, nach denen die genannten Separationseffektoren in die Basis­ membran eingeführt werden können.

Im folgenden werden beispielhaft Aufbau und Herstellung einer erfindungs­ gemäßen Trennsäule beschrieben: Eine Trennmembran (Hohlfasermem­ bran) wird einseitig verschlossen, beispielsweise mit einem Epoxypfropfen; in das andere Ende der Trennmembran wird eine Kapillare beispielsweise aus Polypropylen (PP), Polyethylen (PE), Polytetrafluorethylen (PTFE), Glas oder auch Edelstahl eingeschoben. Der weitere Aufbau der Trenn­ säule ist aus den Abb. 1 bis 3 ersichtlich. In Abb. 1 ist eine Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Trennsäule dargestellt: (1) bezeichnet das Säulenmaterial, d. h. die poröse Hohlfaser, die mit Separa­ tionseffektoren derivatisiert ist. (2) bezeichnet das Mantelrohr, (3a) die Kapillare, auf die das Säulenmaterial (1) aufgeschoben ist. Kapillare (3a) und Säulenmaterial (1) werden mittels einer Muffe aus Kleber (4) im Man­ telrohr (2) flüssigkeitsdicht fixiert. Ein Stopfen aus Kleber (6) verschließt das Lumen des Säulenmaterials, d. h. der porösen Hohlfaser (1). Als Ab­ lauf ist eine Kapillare (3b) vorgesehen, die in einer Muffe aus Kleber (4) im Mantelrohr (2) gehalten ist.

In der in den Abb. 2 dargestellten Version, wird das Säulenmaterial (1) ebenfalls auf die Kapillare (3a) aufgeschoben und mit Kleber (4) fixiert. Im Gegensatz zu der Ausführungsform nach Abb. 1 werden jedoch die Kapillare (3a) mit dem Säulenmaterial (1), sowie die Kapillare (3b) nicht mit Muffen (4) aus Kleber, sondern durch Pressringe aus Stahl (5) fixiert.

Eine weitere Variante ist in Abb. 3 dargestellt: Die Muffen (4) aus Kleber beziehungsweise die Preßringe (5) aus Stahl sind durch Ver­ schraubungen ((7a) und 7b)) ersetzt, die einen Doppelkonus (8) aus verformbarem Material um die Kapillare (3a) und das Säulenmaterial (1), sowie um die Kapillare (3b) pressen.

Die erfindungsgemäße Trennsäule umfaßt somit die Trennmembran (1), d. h. eine einseitig verschlossene Hohlfasermembran, die erwähnte Kapilla­ re (3a) und das Mantelrohr (2), sowie Dichtungs- und Anschlußelemente ((4), (5), (6), (7a), (7b), (8) und (3b)).

Es ist ebenfalls möglich, die Zulaufkapillare (3a) mit der einseitig ver­ schlossenen Trennmembran (1) und der Auslaufkapillare einzuschrumpfen; in diesem Fall ersetzt der Schrumpfschlauch das Mantelrohr (2).

Die erfindungsgemäße Trennsäule kann auch in einen für die HPLC übli­ chen UV-Detektor integriert werden (siehe Abb. 4). In Abb. 4 bedeuten (9) einen Schraube mit zentraler Bohrung, die die Trennsäule (12) in dem Zellkörper (13) fixiert. Die Meßzelle des UV-Detektors ist mit (14) gekennzeichnet. Die Ausführungsform nach Abb. 4a weist zu­ sätzliche Dichtelemente auf einen PTFE-Konus (10) und eine PTFE- Scheibe (11).

Die Dimensionen des Mantelrohres werden so ausgewählt, daß der innere Durchmesser des Mantelrohres geringfügig größer ist als der Außendurch­ messer der Trennmembran, so daß zwischen beiden nur ein geringes Tot­ volumen verbleibt. Die Länge des Mantelrohres wird entsprechend der Länge der Trennmembran gewählt.

Prinzipiell ist es auch möglich, die Trennsäule zunächst aus einer unmodi­ fizierten Basismembran aufzubauen und anschließend zu modifizieren.

Soweit die Trennsäule aus elektrisch-isolierenden Materialien besteht, kann sie nicht nur für chromatographische Trennungen, sondern auch für Trennungen auf der Grundlage von Kapillarelektrophorese oder Elektro­ chromatographie benutzt werden. Wegen des geringen Druckabfalles beim Betrieb der erfindungsgemäßen Trennsäule ist es auch möglich, Vorrichtungen für andere Trennmethoden vorzusehen, die es erlauben, Fraktionen weiter aufzutrennen; Beispiele sind Kapillarzonenelektrophore­ se oder Isotachophorese. Vorrichtungen für die Anschluß und Betrieb derartiger zusätzlicher Trennverfahren sind im Prinzip bekannt; beispiels­ weise aus der Kopplung von chromatographischen Verfahren mit der Massenspektrometrie. Derartige Vorrichtungen können also als weitere periphere Vorrichtungen zu einer erfindungsgemäßen Trenneinrichtung ge­ hören. Außerdem ist es wegen des geringen Druckabfalles beim Betrieb der erfindungsgemäßen Trennsäule auch möglich, einfache Pumpen wie Spritzenpumpen für die Förderung des Elutionsmittels einzusetzen. Für Trennungen von komplexen Proben, die zur Verstopfung der Poren der Trennmembran führen könnten, kann auch, wie in der HPLC üblich, eine zusätzliche Trennsäule als Vorsäule vorgeschaltet werden.

Auch ohne weitere Ausführungen wird davon ausgegangen, daß ein Fach­ mann die obige Beschreibung im weitesten Umfang nutzen kann. Die bevorzugten Ausführungsformen und Beispiele sind deswegen lediglich als beschreibende, keineswegs als in irgendeiner Weise limitierende Offen­ barung aufzufassen.

Die vollständige Offenbarung aller vor- und nachstehend aufgeführten Anmeldungen, Patente und Veröffentlichungen sind durch Bezugnahme in diese Anmeldung eingeführt.

Beispiele Beispiel 1: Herstellung einer Trennsäule für die Kationen­ austauschchromatographie (Membran vom SO₃ ^--Typ)

Ein Ende einer nach WO 96/22 316 mit SO₃H-Gruppen modifizierten Hohlfasermembran aus Polyamid wird mit Araldit® AW136H (Fa. Ciba- Geigy) verklebt. In das andere Ende der Hohlfasermembran, die einen Innendurchmesser von 0,55 mm aufweisen, wird eine Edelstahlkapillare (innerer Durchmesser 0,2 mm; Außendurchmesser 0,5 mm) eingeführt. Die Trennmembran wird zusammen mit der Stahlkapillare in ein Glasrohr eingeführt (Innendurchmesser 0,6 mm), so daß die Stahlkapillare über das Ende des Glasrohres hervorsteht. An diesem Ende wird ein Pfropfen aus Araldit® AW136H (Fa. Ciba-Geigy) erzeugt, der sowohl die Stahlkapillare im Glasrohr als auch die auf die Stahlkapillare aufgezogene Trennmem­ bran umgibt. Am anderen Ende wird eine Edelstahlkapillare mit einem Pfropfen aus Araldit® AW136H (Fa. Ciba-Geigy) fixiert.

Die Trennsäule ist in Abb. 1 dargestellt.

Anwendungsbeispiel A: Trennung verschiedener Proteine durch Kationenaustauschchromatographie

Die Trennsäule hergestellt nach Beispiel 1 wird in eine Trenneinrichtung eingebaut; die Trenneinrichtung umfaßt einen Gradientenmischer für die beiden Elutionsmittel, eine Probenauftragevorrichtung und einen UV- Detektor. Die Trennbedingungen waren:
Probe: Chymotrypsinogen, Cytochrom C, Lysozym (je 15 µg/µl) in 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6.0)
Probenvolumen: 5 µl
Gradient:
Starteluent: 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6.0)
Schlußeluent: 1 M NaCl in 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6.0)
Dauer: 40 min.
Flußrate: 1 ml/min.

Das Elutionsdiagramm ist in Abb. 5 dargestellt.

Claims (3)

1. Miniaturisierte chromatographische Trennsäule mit Anschlüssen für Elutionsmittelzu- und -ablauf, die in einem Säulenmantel ein Trennmittel enthält, welches aus einer porösen, mit Separationseffektoren derivatisierten Membran besteht, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran aus einer einzigen Hohlfaser besteht, die von dem Elutionsmittel durchströmt wird.

2. Verwendung einer miniaturisierten chromatographischen Trennsäule mit den Merkmalen des Anspruches 1 in einer Trenneinrichtung.

3. Verwendung einer miniaturisierten chromatographischen Trennsäule mit den Merkmalen des Anspruches 1 für die chromatographische Tren­ nung mindestens zweier Substanzen.