DE69033106T3

DE69033106T3 - Chromatographieverfahren

Info

Publication number: DE69033106T3
Application number: DE69033106T
Authority: DE
Inventors: Noubar B. Brookline AFEYAN; Fred E. West Lafayette REGNIER; Robert C. Jr. Norwich DEAN
Original assignee: PerSeptive Biosystems Inc
Current assignee: Applied Biosystems LLC
Priority date: 1989-07-06
Filing date: 1990-02-20
Publication date: 2007-09-27
Anticipated expiration: 2010-02-21
Also published as: JP2540667B2; EP0442977A1; EP0899567A1; DE69033106T2; AU630427B2; CA2018393C; ATE179901T1; AU7591594A; EP0442977B1; WO1991000762A1; AU5151190A; CA2018393A1; JPH08278299A; AU662344B2; AU2203692A; JPH04500726A; DE69033106D1; EP0442977A4; EP0442977B2; EP0442977B9

Description

Hintergrund der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Verfahren und Anwendungen von Materialien zur Ausführung sehr hocheffizienter chromatographischer Trennungen, d.h., adsorptive chromatographische Techniken, die sowohl durch hohe Auflösung als auch hohen Durchsatz pro Volumeneinheit der Chromatographiematrix gekennzeichnet sind. Insbesondere betrifft die Erfindung die Anwendung bestimmter Matrixgeometrien zur Ausführung chromatographischer Trennungen bei sehr hohen Wirkungsgraden.
Die Unterschiede in den Affinitäten einzelner gelöster Stoffe für eine Oberfläche auf den Basis von Ladung, hydrophober/hydrophiler Wechselwirkung, Wasserstoffbindung, Chelation, immunchemischer Bindung und Kombinationen dieser Effekte wurden bereits viele Jahre zur Trennung von Gemischen gelöster Stoffe in Chromatographieprozeduren verwendet. Über mehrere Dekaden hat die Flüssigchromatographie (LC – liquid chromatography) das Gebiet der analytischen Trennung beherrscht, und wurde oft für präparative Trennungen im Labormaßstab angewendet. Flüssigchromatographie umfaßt das Durchleiten eines Speisegemisches durch ein gepacktes Bett sorptiver Partikel. Das anschließende Durchleiten von Lösungen, welche die chemische Umgebung an der sorbierenden Oberfläche modifizieren, führt zu einer selektiven Eluierung der sorbierten Spezies. Die Flüssigkeit strömt bei diesen Systemen durch den Zwischenraum zwischen den Partikeln.
Die für die Flüssigchromatographie verwendeten Medien weisen typischerweise weiche Partikel mit einem hohen Oberflächenbereich/Volumen-Verhältnis auf. Wegen ihrer vielen kleinen Poren mit mittleren einem Durchmesser in der Größenordnung von wenigen zehn Nanometern (wenigen hundert Angström (Å)) oder weniger liegt 95% oder mehr von dem aktiven Oberflächenbereich innerhalb der Partikel. Solche Materialien waren ziemlich erfolgreich, insbesondere bei der Trennung relativ kleiner chemischer Verbindungen, wie z.B. organischer Verbindungen, leiden aber an den allgemein bekannten Auflö sungseinschränkungen für größere Moleküle. Flüssigchromatographiematerialien sind ferner durch betriebliche Zwänge basierend auf ihren geometrischen, chemischen und mechanischen Eigenschaften charakterisiert. Beispielsweise können weiche LC-Partikel nicht bei Druckabfällen, die etwa 3,45 bar (50 psi) überschreiten, eingesetzt werden, da die porösen Partikel leicht zerstört werden.
In letzter Zeit wurde die Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC – high performance liquid chromatography) speziell für die analytische Anwendung populär. Anstelle der Verwendung weicher, partikulärer, Gel-artiger Materialien mit mittleren Durchmessern in der Größenordnung von 100 μm, verwendet HPLC typischerweise als Medien feste poröse Kügelchen von 10 bis 20 μm aus einem anorganischen Material, wie z.B. Silika oder ein festes Polymer, wie ein Styroldivinylbenzol-Kopolymer. HPLC erlaubt etwas schnellere Trennungen mit höherer Auflösung auf Kosten hoher Säulenbetriebsdruckabfälle.
Aus der sich entwickelnden Biotechnologie auftauchende Produkte stellen neue Herausforderungen für die Chromatographie dar. Typischerweise sind diese Produkte große und labile Proteine mit Molekulargewichten in der Größenordnung von 10⁴ bis 10⁶ Dalton. Solche Produkte werden oft aus Gemischen reindargestellt, welche oft hunderte kontaminierender Spezies, einschließlich Zellentrümmer, verschiedene gelöste Stoffe, Nährkomponenten, DNA, Lipide, Saccharide und Proteinspezies mit ähnlichen physikochemischen Eigenschaften enthalten. Die Konzentration des Proteins in der Ernteflüssigkeit ist manchmal nur 1 mg/l, aber üblicherweise in der Größenordnung von 100 mg/l. Die größeren Proteine sind insbesondere sehr fragil und ihre Gestaltung ist für ihre biologische Funktion wichtig. Wegen ihrer komplexen Struktur und Fragilität müssen sie mit einer relativ niedrigen Fluidscherung und bevorzugt nur mit einem minimalen und kurz dauernden Kontakt zu Oberflächen behandelt werden. Das Vorhandensein von Proteasen in der Prozeßflüssigkeit erfordert oft, daß die Reindarstellung so schnell wie möglich durchgeführt wird.
Die Hauptleistungsmaßstäbe für Chromatographietechniken sind Produktivität und Spitzenauflösung. Die Produktivität bezieht sich auf den spezifischen Durchsatz. Sie ist ein Maß der Masse des gelösten Stoffes, welche pro Zeiteinheit pro Volumeneinheit der Chromatographiematrix verarbeitet werden kann. Im allgemeinen verbessert sich die Produktivität mit 1) Vergrößerungen des Oberflächenbereichs pro Volumeneinheit der Matrix, 2) der Rate der Massenübertragung des gelösten Stoffes auf die sorbierende Oberfläche, 3) der Rate der Adsorption und Desorption, und 4) der Fluidströmungsgeschwindigkeit durch die Matrix.
Die Auflösung ist ein Maßstab für den Grad der Reindarstellung, den ein System erzielen kann. Sie wird durch den Unterschied in der Affinität zwischen gelösten Stoffen in dem zu trennenden Gemisch durch die inhärente Tendenz des Systems zur Dispersion (Bandspreizung) spezifiziert. Die erstere Variable wird durch die Natur der gelösten Stoffen in der Prozeßflüssigkeit und die chemischen Eigenschaften der interaktiven Oberfläche des Chromatographiemediums bestimmt. Die Bandspreizung wird primär durch die Geometrie der Chromatographiematrix und die Massenübertragungsraten bestimmt, welche während der Chromatographieprozedur erzielt werden. Die Auflösung wird verbessert, wenn die theoretische Plattenhöhe abnimmt oder die Anzahl der Platten zunimmt. Die Plattenhöhe ist ein indirektes Maß einer Matrixgeometriefaktoren betreffenden Bandspreizung, welche Ungleichmäßigkeiten der Strömung, Diffusion und der Sorptionskinetik beinflussen.
Es ist offensichtlich erwünscht, in einer Matrix, die für präparative Chromatographie ausgelegt ist, die Produktivität zu maximieren und die Bandspreizung zu minimieren. Die Auslegung einer Chromatographiematrix ist jedoch bisher inhärent durch unvermeidliche Zwänge gekennzeichnet, die zu Kompromissen zwischen den Aufgaben führen. Beispielsweise ist das Erfordernis eines großen Oberflächenbereich/Volumen-Verhältnisses hinsichtlich des Durchsatzes kritisch, und erfordert praktisch, daß die Matrix mikroporös ist. Derartige mikropo rösen Materialien sind durch eine nominelle Porengröße, welche in inverser Beziehung zu dem Oberflächenbereich der Partikel steht und einen nominellen Partikeldurchmesser, welcher den Druckabfall für eine gegebene gepackte Säule vorgibt, charakterisiert. Operationen mit raschen Strömungen und kleinen mikroporösen Partikeln erfordern hohe Betriebsdrücke und fördern die Bandspreizung. Eine Vergrößerung der Partikelgröße verringert den Rückdruck. Eine Vergrößerung der Porengröße verringert den Oberflächenbereich und führt zusammen mit einer Vergrößerung der Partikelgröße zu signifikanten Verringerungen der Produktivität. Wenn starre Partikel zusammen mit hohen Drücken (z.B. HPLC) verwendet werden, können Steigerungen in der Produktivität erzielt werden, aber die Plattenhöhe, der Maßstab der Bandspreizung ist proportional zu der Strömungsrate von Flüssigkeiten durch die Matrix. Somit steigt dann, wenn poröse Partikel mit großem Oberflächenbereich verwendet werden, da die Fuidgeschwindigkeit erhöht wird, die Plattenhöhe an und die Spitzenauflösung sinkt.
Das Phänomen der Bandspreizung wird allgemein durch die nachstehende Funktion beschrieben:
wobei A, B und C Konstanten für eine spezielle Chromatographiesäule sind, u die Geschwindigkeit des Fluids durch das Bett, und H die Plattenhöhe ist. Der Term A ist ein Maßstab für eine durch Längsdiffusion verursachte Bandspreizung, d.h., ein Term der die Tatsache berücksichtigt, daß eine langsame molekulare Diffusion entlang der Achse einer Säule stattfindet. Der Term B berücksichtigt die Tatsache, daß ein durch eine Säule passierendes Fluid viele unterschiedliche Pfade nehmen kann. Dieses wird oft als eine "Wirbeldiffusion" bezeichnet. Die Terme A und B dominieren die Bandspreizungphänomene in einer gegebenen Matrix bei niedrigen Fluidströmungsgeschwindigkeiten. Bei hohen Geschwindigkeiten ist der Beitrag dieser Terme zur Bandspreizung minimal, und das Phänomen wird von dem Term C dominiert. Dieser Term berücksich tigt eine Massenübertragung bei stagnierende Mobilphase, d.h., eine niedrige Massenübertragungsrate in die Poren der Partikel der Matrix. Da eine Front eines gelösten Stoffes eine Säule mit einer gegebenen Geschwindigkeit passiert, tritt ein Teil des gelösten Stoffs durch die Poren hindurch und eluiert später als die Front.
Das auf den Term C zurückführbare Maß der Bandspreizung steht im Bezug zu dem Partikeldurchmesser, dem Diffusionskoeffizienten des gelösten Stoffes innerhalb der Poren, der Porengröße und der Geschwindigkeit des gelösten Stoffes außerhalb der Poren. Insbesondere wird der Term C von dem Ausdruck bestimmt:
wobei (das in dieser Beschreibung verwendete Symbol "≈" die Bedeutung von "ungefähr gleich" hat), c eine Konstante ist, d der Durchmesser des Partikels ist, und D_Eff der effektive Diffusionskoeffizient des gelösten Stoffes innerhalb der Pore ist. Um den Durchsatz zu maximieren, sollte die Fluidgeschwindigkeit hoch sein. Wie es aber aus dem vorstehenden Ausdruck ersichtlich ist, vergrößert eine Erhöhung der Geschwindigkeit die Massenübertragungseinschränkungen aufgrund der Porendiffusion und führt daher zu einer vergrößerten Bandspreizung und verringerten dynamischen Ladungskapazität. Man beachte ferner, daß die Bandspreizung als eine Funktion des Quadrats der Partikelgröße ansteigt. Somit erzeugen Versuche, den Durchsatz bei einem gegebenen Druckabfall durch Anwendung höherer Flüssigkeitsströmungsraten zwischen den Zwischenräumen großer Partikel zu erhöhen, geometrische Anstiege in der Bandspreizung verursacht durch eine langsame Intrapartikeldiffusion.
Es ist auch aus der Gleichung 2 ersichtlich, daß die Bandspreizung durch Erhöhung der effektiven Diffusionskonstanten reduziert werden kann. Natürlich ist die Diffusions rate eine inverse Funktion des Molekulargewichts des gelösten Stoffes und hängt von Konzentrationsgradienten ab. Somit weisen Proteine mit hohem Molekulargewicht typischerweise Diffusionskonstanten in dem Bereich von 10^–7 bis 10^–8 cm²/s auf. Aus diesem Grund kann eine chromatographische Trennung von Proteinen Pegel einer Bandspreizung erzeugen, welche man bei gelösten Stoffen mit niedrigerem Molekulargewicht nicht antrifft. Ferner ist die effektive Diffusionsfähigkeit durch die Poren der Partikel hindurch niedriger als die Diffusionsfähigkeit in freier Lösung. Dieses beruht darauf, daß die Diffusion in Poren mit einem mittleren Durchmesser vergleichbar dem Molekulardurchmesser des gelösten Stoffs, d.h., nicht mehr als etwa ein Faktor von 10 oder 20 größer als der gelöste Stoff behindert ist. Die effektive Diffusionsfähigkeit unterscheidet sich von der idealen auch deshalb, weil der gelöste Stoff in das Partikel aus dem an dem Partikel vorbeiströmenden Partikel hineindiffundieren muß. Eine Erhöhung der konvektiven Strömung in einer Richtung, welche praktisch eine senkrechte Richtung zu der Diffusionsrichtung ist, erzeugt eine effektive Diffusionsrate, die etwas niedriger als die ideale ist.
Die effektive Diffusionsfähigkeit wird auch während der Ladung der Oberfläche des Sorbenten mit dem gelösten Stoff verringert. Dieses Phänomen wird durch den Verschluß des Eingangs der Pore durch adsorbiertes Protein erklärt. Da Proteinmoleküle in die poröse Matrix zu diffundieren beginnen, glaubt man, daß sie an den ersten angetroffenen Stellen sorbieren, welche typischerweise in der Nähe des Eintrittspfads der Pore liegen. Es ist oft der Fall, daß die Abmessungen eines makromolekularen gelösten Stoffes bezüglich des Durchmessers der Pore von Bedeutung sind. Demzufolge beginnt sich der Eingang der Pore zu verschließen, wenn wenige Moleküle sorbiert wurden, und der Eintritt des gelösten Stoffes in das Innere der Pore durch Diffusion wird behindert. Als Folge dieses Verschlußphänomens wird die Massenübertragung des gelösten Stoffes in das Innere der sorbierenden Partikels weiter reduziert.
Viele von den negativen Auswirkungen auf die Plattenhöhe, die von einer stagnierenden Mobilphasenladung in porösen Partikeln bewirkt werden, können durch Verkleinerung der Partikelgröße und damit der Porenlänge vermindert werden. Jedoch erfordert diese Strategie, wie vorstehend erwähnt, einen Betrieb bei höheren Druckabfällen.
Vor kurzem wurde von F.E. Regnier vorgeschlagen, daß Chromatographiepartikel mit relativ großen Poren die Leistung verbessern können, indem diese eine schnellere Diffusion großer Moleküle zulassen. Man dachte, daß eine Vergrößerung der Porengröße das Problem des Poreneintrittsverschlusses vermindern und eine von Poreneffekten relativ unbehinderte Diffusion ermöglichen könnte.
Es gibt eine andere Klasse vom Chromatographiesystemen, welche von konvektiven Prozessen dominiert werden. Dieser Systemtyp weist sorbierende Oberflächen auf, die entlang von Strömungskanälen verteilt sind, die durch denselben Bettyp verlaufen. Das Bett kann aus nicht-porösen Partikeln zusammengesetzt sein oder kann als ein Membransystem ausgeführt sein, das aus nicht-porösen Partikelaggregaten, Fasermatten, oder aus hergestellte Löcher definierenden festen Folien bestehen. Die Kanäle des nicht-porösen Partikelsystems werden, wie bei dem diffusionsgebundenen System durch den Zwischenraum zwischen den Partikeln gebildet. Der Raum zwischen Fasern bildet Kanäle in Fasermatten aus. Kanäle, welche durch Ätzen, Laserstrahlschneiden oder Hochenergieprozesse geformt werden, verlaufen typischerweise den gesamten Weg durch die Membrane hindurch, während die erstere Kanaltypen mehr verschlungen sind.
In diesem Systemen wird der gelöste Stoff der sorbierenden Oberfläche mittels konvektiver Strömung zugeführt. Der gelöste Stoff kann über relativ lange Strecken transportiert werden ohne mit der sorbierenden Oberfläche in Kontakt zu kommen, da die Kanalabmessungen oft ziemlich groß sind (0,2 bis 200 μm). Die Strömung ist im allgemeinen laminar, und Hebekräfte lenken die gelösten Stoffe von Kanalwänden weg. Die se Nachteile der Massenübertragung des gelösten Stoffes in die feste Phase können ernst sein und ein signifikantes Hindernis für hohe Strömungsraten darstellen. Somit müssen Kanäle lang sein, um sicherzustellen, daß der gelöste Stoff nicht durch die sorbierende Matrix unter Vermeidung eines Wechselwirkungskontaktes geschwemmt wird. Das Vorsehen von Kanälen mit kleinerem Durchmesser vergrößert die erforderlichen Betriebsdruckabfälle. Wenn die Geschwindigkeit verringert wird, leidet offensichtlich der Durchsatz. Noch ein weiterer Nachteil des konvektiven Transportsystems besteht darin, daß es inhärent einen relativ kleinen Oberflächenbereich und demzufolge eine geringere Kapazität als andere Systeme des vorstehend beschriebenen Typs aufweist.
Die Elimination der Poren aus einem partikelartigen Sorbens kann ermöglichen, daß Trennungen sehr schnell erzielt werden. Beispielsweise können Säulen mit nicht-porösen Partikeln von 2 μm ein Gemisch von sieben Proteinen in weniger als 15 Sekunden trennen. Dieser Lösungsansatz kann jedoch nicht die technischen Herausforderungen lösen, welche von den Anforderungen für die Reindarstellung von Materialien mit hohem Molekulargewicht gestellt werden, wie es dramatisch in der nachstehenden Tabelle demonstriert wird.
CHARAKTERISTIKEN VON SÄULEN MIT NICHT-PORÖSEN PARTIKELN
Die mit * bezeichneten Ziffern sind die Druckabfälle in bar.
Gemäß Darstellung durch diese Daten weisen kleine Partikel, entweder in gepackten Säulen oder in Membranen ernsthafte Druckprobleme bei Partikelgrößen auf, die ausreichen, um große Oberflächenbereiche und eine große Ladungskapazitäten bereitzustellen. Im Gegensatz dazu weisen Partikel in dem Bereich von 5 bis 100 μm mit Porengrößen von 30 nm (300 Å) einen Oberflächenbereich von 70 bis 90 m²/ml auf, während ein Material mit 100 nm (1000 Å) einen Flächenbereich in der Größenordnung von 40 bis 60 m²/ml aufweist.
Ein Chromatographiezyklus weist vier festgelegte Phasen auf: Adsorption, Waschen, Elution und Gleichgewichtswiederherstellung. Der Ratenbegrenzungsschritt in jedem Stadium ist der Transport der Moleküle zwischen dem mobilen Fluid und der statischen Matrixoberfläche. Ein optimaler Wirkungsgrad wird durch eine rasche, bevorzugt sofortige Massenübertragung und hohen Fluidumschlag begünstigt. Während der sorbierenden Ladung mit einer Stufenkonzentration des Proteins werden weniger Moleküle sorbiert, da die Geschwindigkeit der Mobilphase in dem Bett ansteigt. Die Konsequenz ist, daß ein Teil des Proteins in dem Effluenten verlorengeht oder als "Durchbruch" verlorengeht. Wenn die Durchbruchskonzentration auf beispielsweise 5% der Einlaßkonzentration begrenzt ist, gibt diese Begrenzung die maximale Bettgeschwindigkeit vor, welche das Bett toleriert. Des weiteren verringern Steigerungen in der Bettgeschwindigkeit die Ladung pro Oberflächenbereichseinheit.
Wie es aus der vorstehenden Analyse offensichtlich sein dürfte, haben als fundamental zu betrachtende Zwänge Kompromisse zwischen den Aufgaben in der Auslegung existierender Chromatographiematerialien bedingt. Eine Chromatographiematrixgeometrie, welche sowohl die Produktivität als auch die Auflösung maximiert, fehlt hat dem Fachgebiet bisher.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, verbesserte Chromatographieverfahren bereitzustellen. Eine weitere Aufgabe ist die Anwendung von Chromatographiepartikeln und Matrizen, die nach Wunsch für die Praktizierung eines neuen Modus einer chromatographischen Trennung ableitbar sind, die hierin als Perfusionschromatographie bezeichnet wird und durch das Erreichen extrem hoher Produktivitäten und ausge zeichneter Spitzenauflösung bei hohen Fluidströmungsraten aber handhabbaren Druckabfällen gekennzeichnet ist. Eine weitere Aufgabe ist das Bereitstellen verbesserter Verfahren zum Trennen und Reindarstellen interessierender Produkte mit hohem Molekulargewicht aus komplexen Gemischen. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Überwindung von Mängeln sowohl konvektionsgebundener als auch diffusionsgebundener Chromatographiesysteme. Noch eine weitere Aufgabe ist die Bereitstellung einer Chromatographieprozedur und Matrixgeometrie, wobei die effektive Plattenhöhe im wesentlichen über einen signifikanten Bereich hoher Fluidströmungsgeschwindigkeiten konstant ist, und bei noch höheren Geschwindigkeiten nur moderat ansteigt.
Diese und weitere Aufgaben der Erfindung werden aus den Zeichnungen, der Beschreibung und den Ansprüche, welche folgen, ersichtlich.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es wurde nun offenbart, daß Chromatographiematrixgeometrien erdacht werden können, welche, wenn sie für chromatographische Trennungen über einer Schwellenfluidgeschwindigkeit genutzt werden, mittels eines hybriden Massentransportsystems, hierin als Perfusion bezeichnet, arbeiten, welche einen konvektiven und diffusiven Massentransport verbindet. Die Matrixmaterialien sind dahingehend außergewöhnlich, daß sie Größenordnungsanstiege in der Produktivität ohne signifikante Beeinträchtigung der Auflösung erlauben. Ferner werden überraschenderweise die dramatischsten Verbesserungen mit relativ großen Partikeln erzielt, welche einen produktiven Betrieb bei relativ niedrigen Säulendruckabfällen zulassen. Die Perfusionschromatographie entkoppelt die Bandspreizung von der Fluidgeschwindigkeit, erreicht erfolgreich eine noch nie dagewesene Kombinationen von Durchsatz und Auflösung, und entkoppelt das, was den Druckabfall bestimmt von dem, was den Massentransport bestimmt.
Die Perfusionschromatographie kann für rasche Analysen und auch in präparativen Zusammenhängen eingesetzt werden. Ihre vielleicht optimale Anwendung liegt in der Trennung und Reindarstellung großer biologisch aktiver Moleküle, wie z.B. Polypeptide, Proteine, Polysacchsaride und dergleichen. Die Technik hat geringeren Vorteil für kleine Moleküle mit deren viel größeren Diffusionskonstanten und inhärent schnellerem Massentransport. Jedoch sogar mit Materialien mit niedrigen Molekulargewicht, wie z.B. Zuckern und Alkoholen, kann die Perfusionschromatographie zur Beschleunigung insbesondere dann genutzt werden, wenn große Partikel als Chromatographiematrixmaterial dort verwendet werden, wo die Strecke, über welche die Diffusion wirken muß, relativ groß ist.
Ein Schlüssel zur Erreichung dieser Ziele ist die Verfügbarkeit von Matrixmaterialien, welche zumindest primäre und sekundäre Porensätze, d.h., "erste" und "zweite" Sätze miteinander verbundener Poren definieren, wobei die Elemente des ersten Porensatzes einen größeren mittleren Durchmesser als die Elemente des zweiten Porensatzes aufweisen. Die Matrix definiert auch Oberflächenregionen, welche reversibel mit den zu trennenden gelösten Stoffen in Wechselwirkung treten und welche in einer Fluidkommunikation mit den Elementen des zweiten Porensatzes angeordnet sind. Die Abmessungen der ersten und zweiten Porensätze werden so gesteuert, daß, wenn ein Gemisch von gelösten Stoffen durch die Matrix über einer Schwellengeschwindigkeit geleitet wird, eine konvektive Strömung durch beide Porensätze hindurch veranlaßt wird. Der Bereich der Perfusionschromatographie beginnt, wenn die Rate der Fluidströmung auf einen Pegel ansteigt, bei dem die konvektive Strömung durch die Elemente des zweiten Porensatzes die Diffusionsrate des gelösten Stoffes durch diese Poren hindurch übersteigt. Am Anfang sind die Vorteile gegenüber herkömmlichen Chromatographietechniken bescheiden, aber mit ansteigenden Bettoberflächengeschwindigkeiten, werden dramatische Anstiege in der Produktivität erreicht.
Der mittlere Durchmesser der Elemente innerhalb jedes von den ersten und zweiten Porensätzen kann signifikant variieren. In der Tat weist ein bevorzugtes Matrixmaterial einen zweiten Porensatz mit einer Pluralität miteinander verbundener Sub-Sätze auf, welche eine konvektive Strömung ermöglichen, und kleinere Subporen, welche Schleifenporen oder Blindporen aufweisen, welche mit Poren kommunizieren, in welchen Konvektion auftritt. Die Subporen tragen am deutlichsten zu dem Oberflächenbereich der Matrix bei. Die meisten Wechselwirkungen zwischen dem gelösten Stoff und der Matrix treten in diesen Subporen auf. Die Massenübertragung zwischen der Oberfläche und den Elementen der miteinander verbundenen Porensubsätze erfolgt über den Weg der Diffusion. Dieser Geometrietyp erzeugt einen zweiten Porensatz mit einer breiten Verteilung mittlerer Porendurchmesser. In einem weiteren Ausführungsbeispiel weist einer oder beide von den ersten und zweiten Porensätzen Poren mit einer schmäleren Verteilung von Porendurchmessern in der Weise auf, daß der Durchmesser von 90% der Poren in dem Satz innerhalb 10% des mittleren Durchmessers aller Poren in dem Satz fällt. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel weisen die Subporen einen mittleren Durchmesser von kleiner als etwa 70 nm (700 Å) auf. Bevorzugt wird das Fluidgemisch von zu trennenden gelösten Stoffen, durch die Matrix mit einer Rate derart geleitet, daß die Zeit für den gelösten Stoff, auf einen Oberflächenbereich im Inneren eines der Elemente des zweiten Porensatzes hin und davon weg zu diffundieren, nicht größer als etwa das zehnfache der Zeit für den gelösten Stoff ist, konvektiv hinter diesen Bereich zu strömen.
Dieser Typ einer Matrixgeometrie hat mehrere Vorteile. Erstens passiert in einer Matrix mit ausreichender Tiefe die gesamte Flüssigkeit den zweiten Porensatz mehrere Male, obwohl der Druckabfall primär von dem größeren mittleren Durchmesser des ersten Porensatzes bestimmt wird. Zweitens verhält sich in dem bevorzugten Ausführungsbeispiel einer gepackten Partikelmatrix die perfusive Matrix in Bezug auf Zwänge einer in den Partikeln stagnierenden Mobilphase, wie eine Matrix gepackter nicht-poröser Partikel, oder poröser Partikel mit sehr kleinem Durchmesser, obwohl die Druck- und Geschwindigkeitsanforderungen für viel größere Partikelbetten kennzeichnend sind. Drittens wird der Massentransport zwischen der sorbierenden Oberfläche und er Mobilphase hauptsächlich durch konvektive Strömung bewirkt. Es muß noch eine Diffusion auftreten, wobei aber die Diffusionspfade soviel kürzer sind, daß dieser Zwang minimal wird.
In dem Chromatographieprozeß der Erfindung werden die Fluidgemische, Eluenten, usw. durch die Matrix mit einer Bettgeschwindigkeit größer als 1000 cm/h und bevorzugt größer als 1500 cm/h geführt. Produktivitäten, welche 1,0 und oft 2,0 mg sorbiertes Gesamtprotein pro ml der sorbierenden Matrix pro Minute überschreiten, werden routinemäßig erzielt. In den gepackten Partikelmatrizen weisen die Partikel einen mittleren Durchmesser größer als 8,0 μm und bevorzugt größer als 20 μm auf. Da nach einer Daumenregel der mittlere Durchmesser der Poren, der durch die Zwischenräume zwischen grob kugeligen Partikeln definiert ist, etwa ein Drittel des Partikeldurchmessers ist, weisen diese Zwischenraumporen, die den ersten Porensatz ausmachen, einen mittleren Durchmesser in der Größenordnung von 3,0 μm und für die größeren Partikel von 7 bis 20 μm oder größer auf. Der zweite Porensatz in diesem Ausführungsbeispiel besteht aus den Durchtrittsporen innerhalb der Partikel. Eine effektive Perfusionschromatographie erfordert, daß das Verhältnis der mittleren Durchmesser der Partikel zu dem mittleren Durchmesser der zweiten Porensätze kleiner als 70, bevorzugt kleiner als 50 ist. Die Abmessungen der ersten und zweiten Porensätze sind bevorzugt so, daß bei praxisgerechten Strömungsgeschwindigkeiten durch das Bett das Verhältnis der konvektiven Strömungsgeschwindigkeiten durch den ersten Porensatz, d.h., durch die Zwischenräume zwischen den Partikeln, zu dem zweiten Porensatz d.h., die Durchtrittsporen in den Partikeln, innerhalb des Bereiches von 10 bis 100 liegt.
Die gemäß der Erfindung angewendeten Chromatographiematrizen können verschiedene Formen einschließlich der von Betten gepackter Partikel, membranartige Strukturen und hergestellte Mikrostrukturen annehmen, welche speziell zur Verkörperung der hierin offenbarten technischen Prinzipien ausgelegt sind,. Eine bevorzugte Form ist jedoch ein gepacktes Bett aus Partikeln mit einem mittleren Durchmesser größer als 10 μm, wovon jedes eine Pluralität von Durchtrittsporen mit einem mittleren Durchmesser größer als 200 nm (2000 Å) definiert. Die Partikel weisen starre Feststoffe auf, welche einen großen inneren mit festen Stoffen in Wechselwirkung tretenden Oberflächenbereich in einer direkten Fluidkommunikation mit dem Durchtrittsporen darstellen. Bevorzugte Partikel weisen eine Pluralität von untereinander verbundenen polymerischen Kugeln, hierin als "Poronen" bezeichnet, auf, welche zusammen Zwischenräume definieren, welche die Subporen und die Durchtrittsporen umfassen. Die Subporen besitzen bevorzugt einen mittleren Durchmesser in dem Bereich von 30 bis 70 nm (300 bis 700 Å). Dieser Lösungsweg zur Herstellung von Chromatographiepartikeln und Matrizen, die gemäß der Erfindung verwendet werden, erlaubt auch die Herstellung von Partikeln, welche Verzweigungsporen definieren, die zwischen den Durchtrittsporen und den Subporen kommunizieren, welche dazwischen liegende mittlere Durchmesser aufweisen. Bevorzugt sind die Durchtrittsporen, Subporen und alle Zwischenverbindungsporen anisotropisch.
In dieser Partikelherstellungstechnik wird es bevorzugt, die Partikel aus Poronen herzustellen, um kleine Poronenverbände zu erzeugen, und dann die Verbände zu vereinigen, und dann die Aggregate zu agglomerieren, um Partikel makroskopischer Größe (z.B. größer als 40 μm) zu erzeugen, welche optional selbst aneinander haften, um eine einteilige Matrix zu erzeugen. Dieser Lösungsweg führt zur Produktion eines zweiten Porensatzes, welcher eine Pluralität von Durchtrittsporensubsätzen und Subporen mit unterschiedlichen mittleren Durchmessern aufweist. Bevorzugt ist das Verhältnis des mittleren Durchmessers jedes nachfolgenden Sub-Satzes von Durch trittsporen kleiner als 10. Das Verhältnis des mittleren Durchmessers des kleinsten Sub-Satzes von Durchtrittsporen zu den mittleren Durchmesser der Subporen ist kleiner als 20. Das Verhältnis des mittleren Durchmessers des ersten Porensatzes, hier durch die Zwischenräume zwischen den aneinanderhängenden oder gepackten Partikeln definiert, und dem größten Sub-Satz von Durchtrittsporen ist kleiner als 70, bevorzugt kleiner als 50.
Ein Chromatographieverfahren dieser Erfindung ist in Anspruch 1 definiert, und bevorzugte Merkmale des Verfahrens sind in den Ansprüchen 2 bis 11 beschrieben.
Die Anwendung eines Partikels gemäß der Erfindung bei der Herstellung einer Chromatographiematrix ist in Anspruch 12 definiert, und bevorzugte Merkmale des verwendeten Partikels sind in den Ansprüchen 13 bis 26 beschrieben.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A, 1B, 1C, 1D und 2 sind schematische Darstellungen von Partikel/Matrix-Geometrien, die nützlich für die Erläuterung der Perfusionschromatographie sind;
3 ist ein Graph, der Produktivität in Abhängigkeit von der Fluidgeschwindigkeit (V_Bett) und von Betriebsdrücken (ΔP), welche die Bereiche diffusgebundener, konvektionsgebundener und perfusiver Chromatographie-Systeme darstellt;
4A, 4B und 4C sind Rasterelektronenmikrographien von makroporösen Chromatographiepartikeln, die für die Herstellung von Matrizen für die praktische Ausführungsform der Perfusionschromatographie nützlich sind: 4A ist 10000 ×; 4B ist 20000 × und 4C ist 50000 ×;
4D ist eine schematische Darstellung, welche die Fluiddynamiken darstellt, von welchem man glaubt, daß sie die Steuerung während der Perfusionschromatographie unter Verwendung der in 4A bis 4C dargestellten Partikelstruktur ausführen;
5A ist ein schematischer Querschnitt einer Chromatographiesäule;
5B ist ein schematisches Detail des in 5A dargestellten Kreises;
5C ist eine schematische Darstellung, welche eine idealisierte Struktur für ein Perfusionschromatographiematrixelement darstellt;
6 ist eine Durchbruchskurve für einen gelösten Stoff einer Auslaßkonzentration/Einlaßkonzentration in Abhängigkeit von dem Prozeßvolumen in Milliliter, welche die Unterschiede in dem kinetischen Verhalten zwischen einer herkömmlichen und einer Perfusionschromatographie veranschaulicht;
7 ist ein Balkendiagramm, der Kapazität in mg für ein Bett mit gegebenen Volumen in Abhängigkeit von der Oberflächenfluidströmungsgeschwindigkeit durch das Bett hindurch, welche die Adsorptionskapazität einer typischen perfusiven Säule mit einer herkömmlichen diffusiven Säule vergleicht;
8 ist ein Graph einer Bettgeschwindigkeit in cm/h in Abhängigkeit von der Durchtrittsporengröße in Å, welcher die maximalen und minimalen Porengrößen darstellt, welche das Erzielen einer Pèclet-Zahl größer als 10 bei einem gegebenen Diffusionskoeffizienten und Partikelgröße ermöglichen;
9 ist ein Graph eines minimalen mittleren Porendurchmessers in Å in Abhängigkeit von dem Partikeldurchmesser in μm, welcher den perfusiven Bereich bei verschiedenen V_Bett unter den hierin offenbarten Annahmen darstellt; und
10 bis 22 sind verschiedene Graphen, welche verschiedene Daten darstellen, welche die Eigenschaften des Perfusionschromatographiesystems demonstrieren.
Gleiche Bezugszeichen in den entsprechenden Zeichnungsfiguren bezeichnen entsprechende Teile.
BESCHREIBUNG
In dieser Spezifikation werden zuerst die Art und die theoretischen Grundlagen der erforderlichen Matrixstrukturen und Betriebsparameter der Perfusionschromatographie offenbart, gefolgt von den technischen Prinzipien, die für die Optimierung und Anpassung des Chromatographieprozesses an spezifischen Fälle erforderlich sind, der Offenbarung spezifischer Materialien, die bei der Praxisumsetzung der Perfusionschromatographie nützlich sind, und Beispielen einer Perfusionschromatographieprozedur unter Verwendung derzeit erhältlicher Materialien.
Im allgemeinen wird die Perfusionschromatographie in Übereinstimmung mit der Erfindung praktiziert, indem Fluide bei Geschwindigkeiten über einem Schwellenwert durch eine speziell ausgelegte Matrix durchgeleitet werden, die durch eine Geometrie gekennzeichnet ist, welche im Hinblick auf ihre Porosität bimodal oder multimodal ist. Die vielleicht grundsätzlichste für das neue Prozedur relevante Beobachtung besteht darin, daß es möglich ist, sowohl den für konvektionsgebundene Systeme charakteristischen Kapazitätsverlust und die große Plattenhöhen- und Bandspreizungscharakteristiken diffusionsgebundener Systeme zu vermeiden. Dieses kann durch Pressung von Chromatographiefluiden durch eine Matrix mit einem Satz größerer Poren, wie sie beispielsweise durch die Zwischenräume in einem Bett von Partikeln definiert werden, und welche Druckabfälle und Fluidströmungsgeschwindigkeiten durch das Bett definieren, und durch einen Satz von Poren mit kleinerem Durchmesser, wie z.B. anisotrope Durchtrittsporen, erreicht werden. Die kleineren Poren durchdringen die einzelnen Partikel und dienen dazu, Chromatographiefluide durch Konvektion an Oberflächenbereiche innerhalb des Partikels zu leiten, die mit den gelösten Stoffen in dem Chromatographiefluid in Wechselwirkung stehen.
Die relativen Abmessungen der ersten und zweiten Porensätze müssen so sein, daß bei vernünftig erzielbaren Geschwindigkeiten durch das Bett eine konvektive Strömung nicht nur in den größeren Poren, sondern auch in den kleineren auftritt. Da die Fluidgeschwindigkeit durch eine Pore bei einem gegebenen Druck eine Funktion des Quadrates des Porenradius ist, kann klar erkannt werden, daß bei praktischen Fluidgeschwindigkeiten, z.B. in dem Bereich von 400 bis 4000 cm/h der mittlere Durchmesser der zwei Porensätze ziemlich nahe zusammenliegen muß. Als eine Faustregel ist der mittlere Durchmesser von Poren, der von den Zwischenräumen zwischen kugeligen Partikeln gebildet wird, etwa ein Drittel des Durchmessers der Partikel. Somit definieren beispielsweise Partikel mit einem mittleren Durchmesser von 10 μm und einem durchschnittlichen Durchtrittsporendurchmesser von 100 nm (1000 Å) im eng gepackten Zustand zur Ausbildung eines Chromatographiebettes erste und zweite Porensätze mit mittleren Durchmessern von 3 bis 4 μm bzw. 0,1 μm. Somit liegt der mittlere Durchmesser der größeren Poren in der Größenordnung von dem 30- bis 40-fachen des der kleineren Poren. Unter diesen Umständen werden sehr hohe Druckabfälle erforderlich, bevor irgend ein signifikantes Anteil des Fluids mittels Konvektion durch die kleineren Poren innerhalb der Partikel passiert.
Experimente mit diesem Materialtyp konnten keine perfusive Verbesserung in der Massentransportkinetik zeigen. Somit scheint bei den getesteten Strömungsraten der Massentransport in die 10 μm Partikel hinein von der Diffusion dominiert zu sein. Anders gesagt, trägt jede konvektive Strömung innerhalb der Durchtrittsporen nicht signifikant zur Rate des Massentransports bei. Offensichtlich können konventionellere feste Chromatographiemedien, wie z.B. die meisten Silika-basierenden Materialien, Agar, Dextrans und dergleichen, welche viel kleinere Poren [im allgemeinen zwischen etwa 5 und 30 nm (50 und 300 Å)] aufweisen, in der Praxis nicht im perfusiven Modus betrieben werden. Es ist einfach keine realistische Strömungsgeschwindigkeit in einem praktischen System erzielbar, welches zu irgend einer deutlichen konvektiven Strömung innerhalb deren sekundären Mikroporen führt. Im allgemeinen sind Durchtrittsporen mit größerem mittleren Durchmesser, oder insbesondere ein kleineres mittleres Durchmesserverhält nis zwischen den ersten und zweiten Porensätzen erforderlich, um eine Perfusionschromatographie praktisch auszuführen.
Die Art der Perfusionschromatographie und deren erforderliche Matrixgeometrie kann besser durch Bezugnahme auf die 1A bis 1D verstanden werden. Diese sind schematische Darstellungen, welche grob die Fluidströmung in verschiedenen Typen von Chromatographiematrizen modellieren, welche in einem schematischen Querschnitt einen Bereich der Matrix darstellen. In das Partikel oder die Chromatographieregion erfolgt der Zugang über einen größeren Kanal 10 an der "Nord"-Seite, welcher aus der "Süd"-Seite austritt und einen Umgehungskanal aufweisen kann oder nicht, welcher es ermöglicht, daß die gelöste Stoffe enthaltende Fluidmobilphase den Partikel umgeht. Die Partikel selbst weisen eines Pluralität von mit gelösten Stoffen in Wechselwirkung tretenden Oberflächenbereichen auf, welche von Punkten dargestellt werden, welche von den Molekülen der gelösten Stoffe besetzt werden müssen. Die Art dieser Regionen hängt von der Chemie der aktiven Oberfläche ab. Der Prozeß dieser Erfindung ist unabhängig von der Art der aktiven Regionen, welche in verschiedenen Ausführungsbeispielen die Form von Oberflächen annehmen können, die für einen kationischen oder anionischen Austausch, hydrophobe/hydrophile Wechselwirkung, Chelation, Affinitätschromatographie, Wasserstoffbindung usw. geeignet sind. Eine niedrige Plattenhöhe und Minimierung der Bandspreizung erfordern eine rasche Massenübertragung zwischen den interaktiven Oberflächenregionen und der Fluidmobilphase. Eine hohe Kapazität erfordert sowohl eine rasche Massenübertragung als auch das Vorhandensein einer großen Anzahl interaktiver Regionen, d.h., eines großen Oberflächenbereichs. Der gelöste Stoff wird mittels zwei Mechanismen transportiert: Konvektion, welche durch die Porengröße, den Druckabfall, die Porenlänge und Verschlungenheit und lokale Geometrie am Eingang und Ausgang der Pore bestimmt wird; und Intraporendiffusion, welche primär eine Funktion der molekularen Abmessungen der verschiedenen gelösten Stoffe, der Abmessungen der Pore und von Konzentrationsgradienten ist.
Der Mechanismus der Wechselwirkung des gelösten Stoffes mit der Matrix mit zwei Arten von konvektionsgebundenen Chromatographiesystemen wird unter Bezugnahme auf 1A und 1B offenbart; von diffusionsgebundenen Systemen unter Bezugnahme auf 1C; und von perfusiven Systemen unter Bezugnahme auf 1D.
1A stellt die Chromatographiematrix dar, welche eng gepackte nicht poröse Partikel aufweist. Das Innere der Partikel ist gegen den Zutritt durch Moleküle des gelösten Stoffes gesperrt. Die einzigen interaktiven Oberflächenelemente, welche für die Moleküle des gelösten Stoffes zur Verfügung stehen, sind um die Außenoberfläche des Partikels herum angeordnet. 1B stellt ein membranartiges Chromatographie"Partikel" (tatsächlich einen Bereich in einer festen Matrix) dar, welcher Durchtrittsporen und interaktive Oberflächenregionen entlang der Wände aufweist. Die Geometrie von 1B ist analog zu Filterbetten- und Polymergewebemorphologien (z.B. Papier- und Membranfilter) und zu Bündeln nicht poröser Fasern oder Rohre. In den Morphologien der 1A und 1B trägt nur die Außenseite des Chromatographiedorns zu der Kapazität der Matrix bei. Das Oberflächenbereich/Volumen-Verhältnis dieser Geometrien ist relativ niedrig, weshalb diese inhärent Systeme mit niedriger Produktivität sind. Unter der Voraussetzung, daß die Strömungspfade 10 lang genug sind, können sehr rasche Trennungen und hohe Auflösung ohne Durchbruch erzielt werden, weil die Strecke die ein Molekül des gelösten Stoffes von einem konvektiven Kanal zu einem interaktiven Oberflächenelement klein ist. Natürlich läuft ein Versuch, die Anzahl der interaktiven Oberflächenelemente (Oberflächenbereich) durch Verkleinerung der Partikelgröße (1A) oder Verkleinerung des Porendurchmessers (1B) zu erhöhen, auf den Kompromiß höherer Betriebsdrücke hinaus. Eine Erhöhung der Fluidgeschwindigkeit über die optimale hinaus verschlechtert die Leistung.
In 1C sind die interaktiven Oberflächenelemente um das Innere des Partikels verteilt und pro Volumeneinheit des Partikels weitaus zahlreicher. Hier ist das Innere der Matrix über kleine Poren 12 zugänglich. Der gelöste Stoff kann durch diese Poren nur durch Diffusion oder durch eine Kombination von Diffusion gekoppelt mit einer extrem niedrigen Konvektion, welche keinen signifikanten Einfluß auf die Gesamtkinetik des Massentransportes hat, hindurchtreten. Demzufolge werden Moleküle des gelösten Stoffes aus dem Strömungskanal 10 in das Innere des Partikels durch einen langsamen Diffusionsprozeß bewegt. Diese Beschränkung kann gemildert werden, indem die Partikel kleiner gemacht werden und dadurch die durch die Diffusion zu durchquerende Strecke verkleinert wird. Dieses wird jedoch wiederum auf Kosten einer starken Erhöhung der erforderlichen Betriebsdruckabfälle erreicht. Für Makromoleküle, wie z.B. Proteine, wird die effektive Diffusionsfähigkeit innerhalb der Poren weiter durch das Porenoberflächenhindernis und Verschließungseffekte wie vorstehend diskutiert verringert.
Wenn derartige poröse Partikel vollständig beladen sind, d.h., Moleküle gelöster Stoffe entlang der Poren diffundiert sind und nun alle aktiven Oberflächenregionen besetzen, wird die Matrix gewaschen worauf die Elution beginnt. Diese plötzlichen Veränderungen in den Bedingungen veranlassen die gelösten Stoffe zum Verlassen der Partikel. Dieses wiederum wird durch eine langsame Diffusion erzielt. Nach und nach kommt der gelöste Stoff aus der Mitte des Partikels an dem Ringkanal an, um durch Konvektion wegtransportiert zu werden. Diese Verzögerung in der "Entleerung" des Partikels durch Diffusion ist ein Beitragsgrund für den Nachlaufschwanz auf einem Chromatographieimpuls, welcher die Auflösung verschlechtert. Die Rate, mit welcher der Artikel beladen und entladen werden kann, bestimmt die Kinetik des Chromatographieprozesses. Zweifellos ist die Zeit, bis der gesamte gelöste Stoff am Ausgang der Chromatographiesäule ankommt, umso kürzer und damit der Nachlaufschwanz kürzer und die Bandspreizung geringer, je schneller der gelöste Stoff entweichen kann. Eine Erhöhung der Fluidgeschwindigkeit in den Kanälen 10 über einen optimalen Pegel hinaus hat keine posi tive Auswirkung auf den Durchsatz und bewirkt eine Vergrößerung der Plattenhöhe und eine Verringerung der Auflösung.
1D modelliert ein Matrixpartikel, das für die Perfusionschromatographie geeignet ist. Gemäß Darstellung weist die Matrix zusätzlich zu Kanälen 10 mit einem relativ großen mittleren Durchmesser (definiert durch die Zwischenräume zwischen Partikeln in dem Ausführungsbeispiel einer partikelartigen Matrix) auch einen zweiten Satz von Poren 14, hier als Durchtrittsporen verkörpert, definiert durch den Körper des Partikels, auf. Der mittlere Durchmesser der Poren 14 ist wesentlich größer als der der diffusiven Transportporen 12 des in 1C dargestellten herkömmlichen Chromatographiepartikels. Das Verhältnis der mittleren Durchmesser der Poren 10 und 14 ist derart, daß ein Fluidgeschwindigkeitsschwellenwert besteht, welcher praktisch in einem Chromatographiesystem erzielt werden kann und welcher eine Konvektionsströmung innerhalb der Poren 14 erzeugt, welche schneller als die Diffusionsrate durch die Poren 14 ist. Wo genau dieser Schwellenwert der Perfusion auftritt, hängt von vielen Faktoren ab, ist aber primär von dem Verhältnis der mittleren Durchmesser der ersten und zweiten Porensätze, hier der Poren 10 bzw. 14 abhängig. Je höher dieses Verhältnis ist, desto höher ist der Geschwindigkeitsschwellenwert.
Tatsächlich ist die Bettgeschwindigkeit, welche dem Schwellenwert entspricht, diejenige, bei welcher die Intrapartikelkonvektion beginnt, die Transportkinetik zu beeinflussen. Bei viel höheren Geschwindigkeiten dominiert die Konvektion und es werden signifikante Leistungsverbesserungen beobachtet.
In Matrizen, welche eng gepackte 10 μm Partikel aufweisen, liegt der mittlere Durchmesser der Poren 10 (der die Zwischenräume zwischen den Partikeln ausmacht) in der Größenordnung von 3 μm. Solche 10 μm Partikel mit Durchtrittsporen von etwa 100 nm (1000 Å) zeigen keine Perfusion bei praktischen Strömungsraten; 10 μm Partikel mit einer Pluralität von Poren innerhalb des Bereichs von 0,2 μm bis 1,0 μm (2000 bis 10000 Å) zeigen eine gute Perfusion innerhalb eines Bereiches hoher Fluidgeschwindigkeiten durch das Bett (etwa 1000 cm/h oder höher). In Matrizen, welche eng geparkte Partikel mit Durchgangsporen mit einem mittleren Durchmesser von 0,1 μm (1000 Å) aufweisen, liegt das Verhältnis des mittleren Durchmessers von dem ersten zu dem zweiten Porensatz bei etwa 3,3/0,1 oder etwa 33. Für das entsprechende Partikel mit einem mittleren Durchtrittsporendurchmesser von 0,4 μm (4000 Å) beträgt das Verhältnis etwa 8,3. Obwohl diese Zahlen grob sind und von vielen Annahmen abhängen, glaubt man, daß das effektive Verhältnis der mittleren Durchmesser der ersten und zweiten Porensätze, um eine Nutzung des Perfusionschromatographiebereichs mit betrieblich praxisgerechten Strömungsraten zu ermöglichen, irgendwo innerhalb dieses Bereichs, d.h., 8 bis 33 liegt.
Gemäß nochmaligem Bezug auf 1D sollte angemerkt werden, daß der Massentransport zu Regionen innerhalb des Partikels und in die Nachbarschaft der interaktiven Oberflächenelemente von der Konvektion dominiert wird. Obwohl ein diffusiver Massentransport noch erforderlich ist, um die gelösten Stoffe zu den Poren 14 und den interaktiven Oberflächenbereichen und davon weg zu bewegen, ist die Strecke über welche der diffusive Transport erfolgen muß, sehr signifikant verringert. Somit verhält sich das Bett bezüglich der Bandspreizung und der Massenübertragungskinetik so, als ob es aus sehr feinen Partikeln mit einem Durchmesser ungefähr gleich dem mittleren Durchmesser zwischen benachbarten Durchtrittsporen (z.B. in der Größenordnung von 1,0 μm mit derzeit erhältlichen Materialien) bestehen würde. Es weist ein hohes Oberflächenbereich/Volumen-Verhältnis und schnelle Kinetik auf. Der Betriebsdruckabfall ist jedoch im wesentlichen von diesen Eigenschaften entkoppelt, da er von den größeren Abmessungen der Kanäle 12, die den ersten Porensatz ausmachen, bestimmt wird.
Bei niedrigen Geschwindigkeiten durch die Matrix verhalten sich perfusive Partikel, wie z.B. die in 1D schema tisch dargestellten Partikel, ähnlich zu diffusionsgebundenen herkömmlichen Chromatographiematerialien. Bei niedrigen Geschwindigkeiten ist die konvektive Strömung im wesentlichen auf die des größeren ersten Satzes der Poren 10 beschränkt. Die konvektive Strömung innerhalb der Poren 14 ist so klein, daß sie vernachlässigbar ist, so daß der Transport aus dem Inneren des Partikels zu den Strömungskanälen 10 über Diffusion stattfindet. Die größeren Poren erlauben optimalere Diffusionsraten, da Verschließungseffekte und Diffusionsbehinderungen innerhalb der Poren etwas vermindert sind.
Wenn die Fluidgeschwindigkeit in dem Bett (und der Druckabfall) erhöht wird, kommt ein Punkt an dem die konvektive Strömungsrate durch die Poren 14 die Diffusionsrate übersteigt, und der Betrieb in dem perfusiven Modus beginnt. Diese Strömungsrate beträgt etwa 300 cm/h für 10 μm Chromatographiepartikel mit Poren von 0,4 μm (4000 Å) für einen gelösten Stoff mit einer Porendiffusionsfähigkeit von 10^–7 cm²/s. Oberhalb dieses Schwellenwertes findet man, daß ein erhöhter Druckabfall und eine erhöhte Geschwindigkeit einen erhöhten Durchsatz pro Volumeneinheit der Matrix zulassen, welcher niemals zuvor in Chromatographiesystemen erreicht wurde. Bei etwa 600 cm/h werden Produktivitäten ungefähr gleich den höchsten bisher erreichten, beobachtet. Bei 1000 bis 4000 cm/h werden außergewöhnliche Produktivitäten erreicht. Ferner werden diese Produktivitäten ohne den erwarteten Anstieg in der Bandspreizung, d.h., ohne Verringerung der Auflösung erreicht.
Obwohl dieses Verhalten scheinbar lange geltende physikalische Prinzipien, welche das allgemeine Verhalten von Chromatographiesystemen bestimmen, verletzt, erinnere man sich daran, daß bei höheren Geschwindigkeiten der primäre Beitrag zur Bandspreizung die stagnierende Mobilphasen-Massenübertragung innerhalb des Partikels, oder der vorstehend diskutierte C-Term ist. Somit gilt in dem perfusiven System:
Jedoch wird D_Eff, welches bei niedrigen Fluidgeschwindigkeiten durch die Matrix ein Maß für die effektive Diffusion des gelösten Stoffes in die Poren 14 und in den Kontakt mit den Oberflächenregionen ist, in dem perfusiven Modus ein konvektionsdominierter Term. Im allgemeinen kann man D_Eff als die Summe eines diffusiven Elementes (Porendiffusionsfähigkeit) und eines Konvektiven Elementes (Porengeschwindigkeit × Partikeldurchmesser) annähern. In dieser Weise berechnet, ist D_Eff eine konservative Schätzung, welche die unterschiedlichen Antriebskräfte für die zwei Transportmodi ignoriert. Für jede gegebene Fluidgeschwindigkeit und Bettgeometrie, die in dem perfusiven Modus betrieben werden, ist das Verhältnis der Fluidgeschwindigkeit innerhalb des zweiten Porensatzes zu der Oberflächenfluidgeschwindigkeit in dem Bett gegeben durch:
wobei α eine Konstante ist. Somit wird die Fluidgeschwindigkeit innerhalb der Elemente des zweiten Porensatzes zu αV_Bett und die Plattenhöhe aufgrund des Terms C effektiv zu:
Da u die Geschwindigkeit des Fluids in dem Bett darstellt, reduziert sich die Plattenhöhe zu: H = c'd Gl.5
Somit wird der Term C im perfusiven Modus im wesentlichen von der Bettgeschwindigkeit unabhängig. Er wird nicht vollständig unabhängig, da wie vorstehend erwähnt, die Diffusion immer noch eine Rolle in der Massenübertragung zwischen konvektiven Kanälen und sorptiven Oberflächenregionen spielt. Bei einer bestimmten hohen V_Bett wird das System noch einmal durch einen Massenübertragungswiderstand aufgrund einer Diffusion in die Subporen kinetisch gebunden.
Ein Maß für die Massenübertragung eines gelösten Stoffes durch eine Pore ist durch eine charakteristische Pèclet-Zahl P_e eine dimensionslose Größe gleich VL/T gegeben ist, wobei V die konvektive Geschwindigkeit durch die Pore, L deren Länge und D die Diffusionsfähigkeit des gelösten Stoffes durch die Pore ist. In den Systemen nach dem Stand der Technik war die Pèclet-Zahl, welche das Verhältnis des konvektiven zum diffusiven Transportes innerhalb der Poren eines chromatographischen Materials beschreibt, in allen Fällen immer viel kleiner als 1. In der perfusiven Chromatographie ist die Pèclet-Zahl in dem zweiten Porensatz immer größer als 1.
Gemäß 2 weist ein Konzeptmodell einer Region der Matrix 5 im Querschnitt dargestellt drei Porentypen auf; die Elemente des ersten Porensatzes 10; Durchtrittsporen 14, welche die Elemente des zweiten Porensatzes ausmachen und Subporen 16. Diese sind jeweils durch die nachstehend gegebenen Pèclet-Zahlen P_eI, P_eII und P_eIII gekennzeichnet:
wobei ε das Leervolumen des Bettes, d_p der Durchmesser des Partikels (repräsentative Kanallänge gemittelt über einen Partikel einschließlich einer Korrektur für die Verschlungenheit), L_d die Tiefe der Subpore, D_Eff die effektive Diffusionsfähigkeit innerhalb der Durchtrittspore, D₁ die begrenzte Diffusionsfähigkeit in den Durchtrittsporen, und D₂ die begrenzte Diffusionsfähigkeit in den Subporen ist.
Die Kinetik der Chromatographie wird im allgemeinen durch einen hohen Wert von P_eI, niedrigen Wert von P_eII und hohen Wert von P_eIII nachteilig beeinflußt. Somit wird die Chromatographieleistung verbessert, wenn die effektive Diffusionsfähigkeit steigt, oder wenn die Partikelgröße sinkt oder V_Bett sinkt. Bei einem hohen P_eI schwemmen hohe Konvektionsraten den gelösten Stoff hinter die Durchtrittsporen, und beeinträchtigen somit die Massenübertragung. Andererseits wird in dem zweiten Porensatz eine hohe Pèclet-Zahl bevorzugt. Wenn P_eII hoch ist, steigt die Massenübertragung an, da die konvektive Geschwindigkeit an die Stelle der Diffusion als der dominante Mechanismus im Massentransport durch einen Partikel tritt. Innerhalb einer Subpore 16 ist eine niedrige Pèclet-Zahl erwünscht. Wenn P_eIII niedrig ist, ist die Diffusion zu der aktiven Oberfläche innerhalb der Subporen schneller als die Strömung durch das Partikel, weshalb die dynamische Kapazität hoch bleibt.
Eine Erhöhung der Mobilphasengeschwindigkeit verschlechtert die Leistung von diffusiven Systemen, hat aber weitaus weniger Auswirkung bei der Perfusion. Stattdessen ergibt eine Erhöhung der Bettgeschwindigkeit eine entsprechende Erhöhung der Porengeschwindigkeit, welche die Massenübertragungskinetik innerhalb des Trägers bestimmt. Somit wird mit der korrekten geometrischen Beziehung der Matrix, den geeigneten Strömungsraten, Druckabfällen und Fluidviskositäten ein Bereich erreicht, in welchem die Massentransportcharakteristiken des Systems gleichzeitig einen sehr hohen Durchsatz und Trennungen mit hoher Auflösung begünstigen.
3 ist ein Graph der Produktivität in Milligramm eines gelösten Stoffes pro Sekunde pro ml der Matrix in Abhängigkeit von der Bettgeschwindigkeit und Druckabfällen. Der Graph veranschaulicht den Unterschied im Verhalten zwischen diffusiv gebundenen Chromatographiesystemen, konvektiv gebundenen Systemen und perfusiven Systemen. Gemäß Darstellung steigt im herkömmlichen diffusionsbegrenzten System mit der Erhöhung der Geschwindigkeit und des Drucks, die Produktivität an bis ein Maximum erreicht wird, und weitere Erhöhungen von V_Bett führen zu Produktivitätsverlusten, welche typischerweise zu einem Durchbruch oder einem Verlust der dynamischen Ladekapazität weit vor einer Bettgeschwindigkeit von etwa 400 cm/h führen. In konvektiv gebundenen Systemen können viel höhere Fluidgeschwindigkeiten und Druckabfälle genutzt werden. Für ein Bett ausreichender Länge steigt die Produktivität stetig möglicherweise bis zu etwa 4000 cm/h Fluidströmungsrate an, wobei aber die Produktivitätsgewinne aufgrund des inhärent niedrigen Oberflächenbereichs und der niedrigen Bindekapazität bescheiden sind. Bei Perfusionssystemen erhöhen Steigerungen der Bettgeschwindigkeit am Anfang die Produktivität in einer den diffusiv gebundenen Systemen ähnlichen Weise. Jedoch erfolgt über einer Schwellenwertbettgeschwindigkeit, wenn die Pèclet-Zahl in den Durchtrittsporen größer als 1 wird, oder die konvektive Strömung die diffusive Strömungsgeschwindigkeit innerhalb der Poren übersteigt, der Eintritt in den perfusiven Bereich. Weitere Erhöhungen der Geschwindigkeit dienen zur Erhöhung der Konvektion in den Poren und erhöhen den Massentransport. Bei einer gewissen hohen Geschwindigkeit wird das perfusive System diffusiv gebunden, weil, die Zeit, welche es dauert, daß ein Molekül eines gelösten Stoffes zu und von einer Durchtrittspore zu einem interaktiven Oberflächenbereich diffundiert, wesentlich größer als die Zeit wird, welche es dauert, ein Molekül eines gelösten Stoffes mittels Konvektion hinter den Bereich zu bringen. Jedoch ist die Strecke, über welche die Diffusion als der Transportmechanismus wirken muß, viel kleiner als in herkömmlichen diffusionsgebundenen Systemen. Somit bleibt die optimale perfusive Leistung zumindest durch die Bettgeschwindigkeit erhalten, bei der die Subporendiffusionszeit zehnmal so groß wie die Durchtrittsporenzeit ist.
Zur Bewertung der Bedeutung der perfusiven Kinetik auf die Chromatographiebettsorption, werden existierenden Modelle modifiziert und zur Simulation des Sorptionsprozesses verwen det. Das Säulensorptionsverhalten wird oft in der Form "Durchbruchs"-Kurven des gelösten Stoffes dargestellt, welche eine graphische Darstellung der Effluentenkonzentration in Abhängigkeit von der Zeit aufweisen. Für eine gegebene Säule wird, wenn die Strömungsrate der Zuführung zu der sorptiven Oberfläche ausreichend niedrig ist, um zu ermöglichen, daß die Kontaktzeit zwischen dem gelösten Stoff und dem Sorbenten zur Überwindung begrenzter Massenübertragungsraten lange genug ist, eine Gleichgewichtssorption erreicht. In diesem Falle wird die Anfangsmenge des auf die Säule geladenen gelösten Stoffes sorbiert und es erscheint kein gelöster Stoff in dem Effluenten der Säule. Wenn ausreichend gelöster Stoff zur Sättigung der sorbierenden Phase geladen wird, kann kein gelöster Stoff mehr sorbiert werden und die Konzentration in dem Effluenten stimmt mit der der Einspeisung überein. In der Praxis weicht in diffusiv gebundenen Systemen die Sorption von dem Gleichgewichtsgrenzwert wegen der langsamen Massentransportraten ab.
6 ist ein Graph des Durchbruchs (Auslaßkonzentration/Einlaßkonzentration) in Abhängigkeit von dem verarbeiteten Volumen, welcher einen fundamentalen Unterschied zwischen herkömmlichen diffusiv gebundenen und perfusiven Chromatographiesystemen darstellt. Die Kurven wurden unter der Annahme einer Konzentration des zugeführten Proteins von 5mg/ml, 3,25 ml Sorbens, einer 5,4 cm langen und 1,1 breiten Säule, einem Säulenleeranteil von 0,35, einem verfügbaren Oberflächenbereich von 40 mg/ml der Matrix und einer Sorptionskonstante von 1 ml/mg berechnet. Gemäß Darstellung in 6 hat in herkömmlichen Chromatographieprozeduren die Erhöhung der Bettgeschwindigkeit den Effekt der Verschrägung der Kurve gegenüber dem Original. Bei 100 cm/h ist die Durchbruchskurve nahezu vollständig vertikal, weil ein Gleichgewicht zwischen gelöstem Stoff und Sorbens besteht. Mit ansteigender linearer Bettgeschwindigkeit beginnen die Massenübertragungsraten zu dominieren und es tritt ein vorzeitiger Durchbruch des gelösten Stoffes auf. Man vergleiche beispielsweise die Kurven für 500, 1000 und 2000 cm/h. Bei sehr hohen Bettgeschwindigkei ten, wie z.B. 5000 cm/h, ist der vorzeitige Durchbruch des gelösten Stoffes erheblich, weil ein Teil des eingespeisten gelösten Stoffes die Säule passiert ohne sorbiert zu werden, wie es durch den unmittelbaren Sprung der Konzentration des gelösten Stoffes im Effluenten dargestellt wird.
Im Gegensatz dazu ist für eine ähnliche Säule mit der derselben Simulationsbedingung, wobei aber die Matrix perfusiv ist, die prädiktive Durchbruchskurve des gelösten Stoffes wesentlich schärfer und dem Gleichgewichts-Sorptionsgrenzwert ähnlich. Dieses vorhergesagte Verhalten wurde gemäß nachstehender Diskussion experimentell verifiziert.
In der präparativen Chromatographie wird eine frontale Säulenbeladung typischerweise an dem Punkt abgebrochen, an dem die Konzentration des gelösten Stoffes im Effluenten 10% der Einspeisekonzentration erreicht. Die Menge der bis zu diesem Punkt erfolgten Einspeisung definiert die Säulenkapazität. Dieser Kapazitätsterm ist ein wichtiger Faktor für die Gesamtproduktivität in dem System, und sinkt typischerweise, wenn die Bettgeschwindigkeit in einer Säule mit diffusiven Partikeln steigt. Somit beträgt bei hohen Bettgeschwindigkeiten, beispielsweise bis zu 2500 cm/h, der anfängliche Durchbruch des gelösten Stoffes bis zu 10% der Einspeisung, womit die Säulenkapazität effektiv Null ist. Im Gegensatz dazu bleibt gemäß Darstellung in 7 die Kapazität einer Säule mit perfusiven Partikeln im wesentlichen über einen signifikanten Bereich von Strömungsraten konstant, da die Sorptionskinetik schnell ist, und demzufolge ein Durchbruch des gelösten Stoffes nur bei viel höheren Werten auftritt.
Technik der perfusiven Matrix
Aus der vorstehenden Beschreibung werden viele der grundlegenden technischen Ziele, die bei der Herstellung von Materialien zu verfolgen sind, welche für die praktische Ausführung der Perfusionschromatographie geeignet sind, dem Fachmann auf diesem Gebiet ersichtlich. Somit ist das, was zur praktischen Ausführung der Perfusionschromatographie ge braucht wird, eine Matrix, welche unter Druck nicht bricht und eine bimodale oder bevorzugt multimodale Porenstruktur und einen so großen wie nur möglichen Oberflächenbereich pro Volumeneinheit aufweist. Die ersten und zweiten Porensätze, welche dem Material dessen bimodalen Strömungseigenschaften verleihen, müssen mittlere Durchmesser in Bezug zueinander so aufweisen, daß sie eine konvektive Strömung durch beide Porensätze bei hohen Bettgeschwindigkeiten V_Bett ermöglichen, Das Vorsehen von Subporen in der Matrix ist für die Durchführung der Perfusionschromatographie nicht erforderlich, wird aber wegen der inhärenten Vergrößerung des Oberflächenbereichs pro Volumeneinheit des Matrixmaterials bevorzugt, die ein solcher Aufbau bietet.
Die Matrix kann die Form eine porösen aus einem Stück bestehenden Festkörpers mit verschiedenen Aspektverhältnissen (Höhe/Querschnittsfläche) annehmen. Die Querschnittsflächen können von einigen wenigen Millimetern bis zu mehreren Dezimetern variiert werden; die Matrixtiefe kann in gleicher Weise variieren, obwohl für hohe Fluidströmungsraten eine Tiefe von mindestens 5 mm empfohlen wird, um einen vorzeitigen Durchbruch und etwas zu verhindern, was als das Phänomen "geteilter Spitzen" bekannt ist. Die Struktur der Matrix kann ein starres, inertes Material aufweisen, welches anschließend zur Erzeugung der interaktiven Oberflächenbereiche unter Verwendung von Chemikalien, welche dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind, abgeleitet wird. Alternativ kann die Struktur aus einem organischen oder anorganischen Material hergestellt werden, welches selbst eine geeignete interaktive Oberfläche für gelöste Stoffe besitzt. Verfahren zur Herstellung geeigneter Matrizen beinhalten den Aufbau von Partikeln, welche einfach in eine Säule gepackt werden. Diese können optional nach im Fachgebiet bekannter Art behandelt werden, um eine Bindung zwischen benachbarten in Kontakt stehenden Partikeln zu erzeugen. Geeignete Matrizen können auch durch Produktion von poröse Partikel enthaltenden Fasermatten, welche die Chromatographieoberfläche bereitstellen, hergestellt werden. Diese können gestapelt oder anderweitig nach Wunsch so angeordnet werden, daß die Zwischenräume zwischen den Fasern, den ersten Porensatz bilden und die Durchtrittsporen in den Partikeln den zweiten Porensatz. Matrizen können auch mittels Laserbohrtechniken, Lösungsmittelauslaugung, Phasenumwandlung und dergleichen hergestellt werden, um beispielsweise eine Vielzahl anisotroper feiner Poren und größerer Poren beispielsweise in folienartigen Materialien oder aus Partikeln bestehenden Materialien welche gestapelt oder zusammengefügt werden, um ein Chromatographiebett zu erzeugen.
Das bevorzugte Verfahren zur Herstellung der Matrizen der Erfindung beinhaltet den Aufbau von Partikeln mit einem Durchmesser innerhalb des Bereichs von 5 bis 100 μm aus viel kleineren "Baustein"-Partikeln, hierin als "Poronen" bezeichnet, welche unter Anwendung von herkömmlichen Suspensions-, Emulsions- oder Hybridpolymerisationstechniken produziert werden. Bevorzugt werden nach der Herstellung dieser Partikel die interaktiven Oberflächenregionen erzeugt, indem die Partikel im oberen Oberflächenbereich mit Chemikalien behandelt werden, um beispielsweise auf eine hydrophile Oberfläche mit kovalent angelagerten reaktiven Gruppen, die für die Anlagerung von Immunglobulinen für die Affinitätschromatographie geeignet sind, anionische Gruppen, wie Sulfonate oder Karboxylgruppen, kationische Gruppen, wie Amine oder Imine, quarternäre Ammoniumsalze und dergleichen, verschiedene Kohlenwasserstoffe und andere bei herkömmlichen Chromatographiemedien als nützlich bekannte Anteile zu übertragen.
Es sind Verfahren zur Erzeugung von Partikeln mit vorgegebener Größe und vorgegebener Porosität aus Poronen im Durchmesserbereich von 10 nm bis 1,0 μm bekannt. Die Partikel werden aus Polymeren, wie z.B. aus mit Divinylbenzol vernetzten Styrol, oder verschiedenen verwandten Kopolymeren einschließlich solcher Materialien, wie p-Bromstyrol, p-Styryldiphenylphosphin, p-Aminostyrol, Vinylchloride und verschiedene Acrylate und Methacrylate, die bevorzugt so ausgelegt sind, daß sie stark vernetzt und ableitbar sind, d.h., kopo lymerisiert mit einem Glyzidylanteil oder Ethylendimethacrylat hergestellt.
Im allgemeinen können viele von den für die Herstellung synthetischer katalytischer Materialien entwickelten Techniken zur Anwendung bei der Herstellung von Matrixpartikeln für die Perfusionschromatographie angepaßt werden. Für Prozeduren bei dem Aufbau von Partikeln mit einem gewählten Durchmesser und einer gewählten Porosität siehe beispielsweise Pore Structure of Macroreticular Ion Exchange Resins, Kunin, Rohm and Haas Co.; Kun et al., the Pore Structure of Macroreticular Ion Exchange Resins; J. Polymer Sci. Part C, No. 16, pgs. 1457–1469 (1967); Macroreticular Resins III: Formation of Macroreticular Styrene-Divinylbenzene Copolymers, J. Polymer Sci., Part Al; Vol. 6, pgs 2689–2701 (1968); und US-A-4,186,120 für Ugelstad, erteilt am 2. Januar 1980. Diese und weiter dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannte Technologien offenbaren die Bedingungen der Emulsions- und Suspensionspolymerisation oder die in dem Patent von Ugelstad offenbarte Hybridtechnik, welche die Produktion von im wesentlichen kugelförmigen Poronen durch Polymerisation ermöglichen. Diese gleichförmigen Partikel mit einer vorbestimmten Größe in der Größenordnung von wenigen bis zu wenigen zehn nm (hundert Å) im Durchmesser sind miteinander verklebt, um ein zusammengesetztes größeres Partikel mit der gewünschten durchschnittlichen Abmessung zu erzeugen, das eine große Anzahl anisotroper Durchtrittsporen, Blindporen und verschiedener kleinerer Durchtrittsporen aufweist, die gut für die praktische Ausführung der Perfusionschromatographie geeignet sind. Der Unterschied zwischen den bisher mittels dieser herkömmlichen Techniken produzierten Chromatographiepartikeln und bei der Durchführung der Erfindung nützlichen Partikeln liegt in der Größe der für die Perfusionschromatographie erforderlichen Durchtrittsporen.
Ein Bezugsquelle von für die praktische Ausführung der Perfusionschromatographie geeigneten Partikeln ist POLYMER LABORATORIES (PL) in Shropshire England. PL verkauft eine Reihe von Chromatographiemedien, welche Poronen aus mit Divinylbenzol vernetzten Polystyrol aufweisen, welche sich zufällig während der Polymerisation zur Erzeugung der Partikel zusammenballen. PL erzeugte und vermarktete anschließend zwei "makroporöse" Chromatographiemedien, die Partikel mit einem mittleren Durchmesser von 8 bis 10 μm und einen mittleren Durchmesser der Partikeldurchtrittsporen von 0,1 bis 0,4 μm (1000 bis 4000 Å) aufweisen. Tatsächlich stellt der mittlere Porendurchmesser der Partikel einen Mittelwert zwischen Durchtrittsporen und Subporen dar, und sagt somit wenig über die Perfusionseigenschaften dieser Materialien aus. Die hierin genannten Erfinder offenbarten, daß diese Partikel mittlere Durchtrittsporendurchmesser aufweisen, die 0,2 μm (2000 Å) in dem Falle der 0,1 μm ("1000 Å")Partikel und 0,6 μm (6000 Å) im Falle der 0,4 μm ("4000 Å")Partikel übersteigen. Dieser Typ von Partikelgeometrien kann unter den hierin offenbarten geeigneten hohen Strömungsratenbedingungen zur Perfusion gebracht werden.
Ein Typ eines PL-Partikels, der für die Umkehrphasen-Chromatographie geeignet sein soll ist ein unbehandeltes Polystyroldivinylbenzol (PSDVB). Dessen interaktiven Oberflächen sind hydrophobe Polymeroberflächen, welche mit den hydrophoben Flecken auf Proteinen in Wechselwirkungen treten. Ein zweiter Partikeltyp weist mit Polyethylenimin abgeleitete interaktive Oberflächenelemente auf und wirkt als eine für einen anionischen Austausch nützliche kationische Oberfläche, Beide Partikeltypen wurden in einem von F.E. Regnier initiierten andauernden Bemühen produziert, die intrapartikuläre Diffusion großer gelöster Stoffe, wie z.B. Proteine, durch Vergrößerung der Porengröße zu erhöhen. Diese Partikel wurden von den hierin in den Anfangsoffenbarungen des Perfusionschromatographiegebietes genannten Erfindern benutzt.
Diese Materialien werden unter den Handelsbezeichnungen PL-SAX 4000 das Polyethylenimid-abgeleitete Material und PLRP-S 4000 für das nicht abgeleitete Material verkauft. Obwohl diese keinesfalls optimal für die Perfusionschroma tographie sind, weisen die von dem intrapartikulären Raum in einem gepackten Bett dieser Materialien definierten Poren und die Durchtrittsporen in den Partikeln ein geeignetes Verhältnis zum Erreichen einer Perfusionschromatographie unter praxisgerechten Strömungsbedingungen auf.
In 4A, 4B und 4C sind Rasterelektronenmikrographien des 10 μm, 0,4 μm (4000 Å) Poröspartikels von PL dargestellt. Gemäß Darstellung in 4C weist das Material eine Vielzahl miteinander verklebter Poronen von etwa 0,15 bis 0,2 μm (1500 bis 2000 Å) Durchmesser auf, welche zufällig angehäuft erscheinen, um einen unregelmäßigen Bereich mit großer Oberfläche und einer Pluralität von Durchtrittsporen und Subporen zu erzeugen.
Gemäß Darstellung in 4D bewegen sich bei einer geeigneten Geschwindigkeit V_Bett die Chromatographiefluide mittels Konvektion durch die verschlungenen Pfade innerhalb des Partikels. Die perfusiven Poren sind anisotropisch, verzweigen sich zufällig, variieren an jedem gegeben Punkt im Durchmesser und führen zu einer großen Anzahl von Blindporen, in welchen der Massentransport von der Diffusion dominiert wird. Die Blindporen und Schleifenporen (Subporen) weisen im allgemeinen einen mittleren Durchmesser auf, der merklich kleiner als der Durchmesser der Poronen (in der Größenordnung von 1/3) ist, und eine Tiefe, welche von so wenig wie einem Bruchteil des Durchmessers des Porons bis zum 5- bis 10-fachen des Durchmessers des Porons variieren kann.
5A und 5B stellen schematisch Maßstabsfaktoren der Geometrie dar. 5A ist ein Querschnitt einer Chromatographiesäule, der eine Vielzahl von Partikeln 20 darstellt, von denen jedes seine Nachbarn berührt und Zwischenräume 22 definiert, welche in dieser Form einer die Erfindung verkörpernden Erfindung, den ersten Porensatz ausmachen. Gemäß Darstellung weisen die Partikel einen Durchmesser von etwa 10 μm auf. Der mittlere Durchmesser der Zwischenräume variiert stark, liegt aber im allgemeinen in der Größenordnung von 1/3 des mittleren Durchmessers der Partikel 20. Der Kreis B in
5A ist in 5B zehnfach vergrößert. Hier ist die Mikrostruktur des Bettes in einem Maßstab von etwa 1 μm dargestellt. Die Partikel weisen Verbände von Poronen auf, die als leere Kreise 24 dargestellt sind. Die Zwischenräume zwischen den Poronenverbänden bilden Durchtrittsporen 14. Die die Verbände 24 aufbauenden individuellen Poronen sind hier als Punkte dargestellt. Auf der nächsten (nicht dargestellten) Detailebene, d.h., 0,1 μm (1000 Å) wäre zu sehen, daß ein Poronenverband 24 aus einer grob kugeligen Ansammlung von Poronen besteht. In einer solchen Struktur entsprechen die Zwischenräume zwischen den die Ansammlungen 24 bildenden Poronen analog den diffusiv gebundenen Partikel herkömmlicher Chromatographiemedien, wie e schematisch in 1C dargestellt ist. Nur in diesen wäre der Massentransport diffusionsabhängig.
Es kann klar erkannt werden, daß die Chromatographiematrizen des vorstehend beschriebenen Typs, die aus Ansammlungen kleinerer Partikel bestehen, eine Eigenähnlichkeit über mehrere geometrische Längenskalen aufweisen und somit in der Nomenklatur von Mandlebrot "Fraktale" sind.
Die ideale perfusive Chromatographiematrix für eine präparative Trennung eines gegebenen Proteins würde Subporen aufweisen, die so dimensioniert sind, daß sie einen diffusiven Transport zulassen. Somit sollten die Zwischenräume zwischen den Poronen für Proteine mit höherem Molekulargewicht größer sein. Dieses erfordert, daß größere Poronen zusammengefaßt werden. Zum Glück sind Polymerisationstechniken, welche eine Mizelle-, Emulsions-, Suspensions- und "Quellemulsions"-Polymerisation nutzen, und verschiedene die Homogenisierung nicht mischbarer Gemische beinhaltende Techniken bekannt. Diese Techniken erlauben die Präparation verschieden großer Partikel, wie es beispielsweise in den vorstehend angegebenen Literaturstellen und in Uniform Latex Particle, (Bangs, L.B., Seradyn, Inc. 1987) offenbart ist. Diese Verfahren können dazu genutzt werden, Partikel mit einem gleichmäßigen mittleren Durchmesser in dem Bereich von 20 nm (200 Å) bis etwa 20 μm herzustellen. Bei den vorstehend erwähnten Materialien PL 1000 und 4000 liegen die Verbände in der Größenordnung von 1 μm und 2 μm.
Im Gegensatz zu dem Material PL 4000, welches hinsichtlich seiner Porenstruktur multimodal ist, sollte ein idealeres perfusives Partikel eine Pluralität von Durchtrittsporenund Subporensätzen mit unterschiedlichen mittleren Durchmessern aufweisen. Eine bimodale Porengrößenverteilung kann in einem derartigen Partikel erreicht werden, indem gleiche Anteile von Partikeln mit zwei diskreten Porengrößen gemischt oder dieses Merkmal im Polymerisationsstadium technisch realisiert wird. Idealerweise wäre das mittlere Durchmesserverhältnis zwischen den Durchtrittsporen-Subsätzen kleiner als 10, das mittlere Durchmesserverhältnis zwischen den kleinsten Durchtrittsporensätzen und den Subporen wäre kleiner als 20, und das mittlere Durchmesserverhältnis zwischen dem ersten Porensatz, d.h., den Hohlräumen zwischen den die Matrix bildenden Partikeln und dem Subsatz der größten Durchtrittsporen wäre kleiner als 70 und bevorzugt kleiner als 50. Ein multimodales Material könnte durch Agglomeration von Poronen mit 50 nm (500 Å) zur Ausbildung von Verbänden von 1 μm, welche wiederum zur Ausbildung von Aggregaten von 10 μm agglomeriert werden, welche wiederum zur Ausbildung von Partikel mit 100 μm zusammengefaßt werden können, erzeugt werden. In einer derartigen Konstruktion hätten die 1 μm Verbände Zwischenräume mit einem mittleren Durchmesser in der Nähe von wenigen 10 nm (hundert Å). Diese würden die Subporen definieren und einen sehr großen Oberflächenbereich bereitstellen. Der diffusive Transport innerhalb dieser Poren müßte selten eine Strecke von 0,5 μm oder 5000 Å überwinden. Die Zwischenräume zwischen den die 10 μm Aggregate bildenden 1 μm Verbänden würden eine konvektive Strömung zur Speisung der diffusiven Poren zulassen. Diese wären in der Größenordnung von 0,3 μm im Durchmesser. Diese Durchtrittsporen würden wiederum durch größere Poren gespeist, welche durch Zwischenräume zwischen den die 100 μm Partikel ausbildenden 10 μm Partikeln ausge bildet werden. Diese hätten einen mittleren Durchmesser in der Größenordnung von 35 μm.
Aus dem Vorstehenden sollte klar erkennbar sein, daß die Diskussion hinsichtlich erster und zweiter Porensätze und deren relativer Abmessungen eine Idealisierung ist, welche, obwohl sie in der Praxis realisierbar ist, nicht notwendigerweise optimal ist. Diese Idealisierung ist jedoch für das Verständnis der Art und Eigenschaften von Perfusionschromatographiesystemen nützlich. In der Praxis können beide Porensätze weit im mittleren Durchmesser variieren, insbesondere der zweite Porensatz.
In 5C ist eine andere Form von perfusiven Chromatographiemedien als ein undurchlässiges Material 30 dargestellt, das eine vorgefertigte Durchtrittspore 14 aufweist. Gemäß Darstellung weist die Pore einen zentralen Kanal für ein konvektive Strömung und dünne radiale Rippen 32 auf, welche sich von der Innenwand 34 der Pore aus erstrecken und einen großen Oberflächenbereich definieren. Bei niedriger Fluidgeschwindigkeit wäre eine Diffusion zwischen den radial ausgerichteten Rippen 32 und der konvektiven Pore 14 erforderlich, damit der gelöste Stoff auf interaktive Flächen zutritt. Höhere Drücke würden eine konvektive Strömung innerhalb der Durchtrittspore 14 und axial innerhalb der Räume zwischen den radialen Rippen 32 bewirken, was einen konvektiven Transport gelöster Stoffe in enger Nachbarschaft mit den an den Wänden und Rippen angeordneten für gelöste Stoffe interaktiven Oberflächen ermöglicht.
Eine weitere Form einer (nicht dargestellten) perfusiven Matrix weist Strömungskanäle, wie z.B. relativ gleichförmige Poren in einer Membrane oder einer Hohlfaser auf, die an ihrer Innenwänden feine Partikel anhaften haben, welche den für gelöste Stoffe interaktiven Oberflächenbereich aufweisen. Die Subporen würden durch die Zwischenräume zwischen den Partikeln, der zweite Porensatz durch die Strömungskanäle, und der erste Porensatz durch weitere Strömungspfade gebildet, welche beispielsweise tangential zu der Oberfläche der Membrane oder zwischen Hohlfasern in einem Faserbündel angeordnet sind. Techniken zur Herstellungen solcher Strukturen sind allgemein bekannt. Der Unterschied zwischen existierenden Strukturen dieses allgemeinen Typs und einer für die perfusive Chromatographie ausgelegten liegt in der Abmessung der ersten und zweiten Porensätze, welche so ausgelegt sind wie hierin beschrieben, um eine konvektive Strömung in beiden Kanaltypen zu fördern.
Aus dem Vorstehenden dürfte es ersichtlich sein, daß gemäß der Erfindung verwendete Matrizen in vielen spezifischen Ausführungsformen ausgebildet werden können. Sie können aus anorganischen Materialien sowie aus Polymeren hergestellt werden.
Optimierung von Materialien perfusiver Matrizen
Wie vorstehend diskutiert, muß die Pèclet-Zahl P_eII der Durchtrittsporen 1 überschreiten, um in dem perfusiven Bereich einzutreten. Es werden jedoch hohe P_eII's von mindestens 5 und am bevorzugtesten größer als 10 vorgezogen. Ein perfusives Verhalten ist auch von dem inneren Oberflächenbereich abhängig. Daher ist es wichtig, daß Subporen oder andere Konfigurationen, welche die interaktive Oberfläche bereitstellen, leicht zugänglich sind. Als eine Veranschaulichung der Auslegungsparameter eines derartigen Matrixmaterials kann es instruktiv sein, die Aggregatbildung von Partikeln des vorstehend beschriebenen Typs mit einem vorgegebenen Poronendurchmesser zu überprüfen.
Für eine gegebene Partikelgröße (D_p) können umso weniger Strömungskanäle pro Partikel bei einem konstanten Partikelleeranteil vorhanden sein, je größer der Strömungskanal (d_p) ist. Ferner müssen, je größer der Strömungskanal ist, die Verbände um so größer sein, um ihn zu formen und somit ist die für den Zutritt auf den Oberflächenbereich erforderliche diffusive Durchdringung um so tiefer. Der Vorteil der Verwendung weniger aber größerer Löcher besteht darin, daß die Perfusion bei relativ niedrigeren Bettgeschwindigkeiten und ent sprechenden Druckabfällen stattfindet. Die Perfusion hängt von der Bettgeschwindigkeit ab, und der obere Grenzwert der Geschwindigkeit wird von dem Drucktoleranzgrenzwert der sorbierenden Partikel bestimmt. Bei großen Partikeldurchmessern wird dieser Zwang gemäß nachstehender Darstellung weniger signifikant.
8 ist ein Graph der Bettgeschwindigkeit in cm/h in Abhängigkeit von dem Porendurchmesser in Å für ein Partikelbett mit einem Nominaldurchmesser von 10 μm. Der Graph stellt die minimale und die maximale Durchtrittsporengröße für das Erreichen einer Pèclet-Zahl von 10 unter Annahme eines 10 μm Partikels dar, wobei der Durchmesser der Intrapartikel-Strömungskanäle 1/3 der Partikelgröße ist, und die charakteristische Porendiffusionszeit kleiner als die Konvektionszeit ist. Somit erfordern beispielsweise bei 1000 cm/h 10 μm Partikel einen mittleren Porendurchmesser größer als etwa 500 nm (5000 Å) um eine Pèclet-Zahl von 10 oder größer zu erreichen. Die mit "maximale Porengröße" bezeichnete Kurve beschreibt den maximalen mittleren Durchtrittsporendurchmesser für verschiedene Bettgeschwindigkeiten, bei welchen die konvektive Strömung durch die Pore so schnell ist, daß eine Diffusion des gelösten Stoffes in und aus den Subporen zu langsam ist, um eine effektive Massenübertragung zu den interaktiven Oberflächen zuzulassen. Man beachte, daß sich die zum Aufbau der Perfusion benötigte minimale Bettgeschwindigkeit (mit P_eII > 10) mit größer werdenden mittleren Durchtrittsporen verringert. Man beachte ferner, daß eine Perfusion in einem signifikanten Ausmaß in herkömmlichen porösen Medien [< 50 nm (< 500 Å) Porengröße] nicht stattfindet.
9 stellt den minimalen Porendurchmesser in (Tausenden von Å) dar, der für Partikel mit verschiedenen Durchmessern (in μm) für verschiedene Bettgeschwindigkeiten im Bereich von 1000 bis 5000 cm/h erforderlich ist, um eine Pèclet-Zahl (P_eII) größer als 10 unter denselben Annahmen wie unmittelbar vorstehend diskutiert, zu erreichen. Natürlich kann eine Perfusion mit Partikeln mit größerem Durchmesser verwendet werden. Beispielsweise würde ein 50 μm Partikel mit 1 μm Strömungskanälen, die zu 50 nm (500 Å) diffusiven Poren führen, in einem perfusiven Modus bei Bettgeschwindigkeiten arbeiten, die 800 cm/h überschreiten.
Eine Analyse der Strömungseigenschaften perfusiver Chromatographiematrizen legt nahe, daß sehr signifikante Vorteile durch Verwendung großer Partikel mit großen zu Subporen führenden Durchtrittsporen zu gewinnen sind. Wenn man versucht, die Auflösung zu erhalten, d.h., die Plattenhöhe konstant zu halten, indem ein Bett mit einer Partikelgröße D_p1 und Durchtrittsporengröße d_p1 vergrößert wird, ist bei konstanter Bettgeschwindigkeit die Größe der größeren Partikel (D_p2) und deren Poren (d_p2) gegeben durch den Ausdruck:
Für eine Vergrößerung bei konstanter Plattenhöhe und konstantem totalen Druckabfall gilt die Beziehung:
und im allgemeinen:
Wie es aus einer Untersuchung der vorstehenden Beziehungen ersichtlich ist, erlaubt eine lineare Partikelgröße/Porengröße-Vergrößerung dieselbe Trennung schneller und bei niedrigeren Druckabfällen auszuführen. Dieses Verhalten ist kontraintuitiv auf der Basis der derzeitigen Theorie und Praxis der Chromatographie.
Zur Veranschaulichung des Vergrößerungskonzeptes beachte man anhand von Gleichung 10, daß durch Vergrößerung der Porengröße um einen Faktor 5 die Plattenhöhe eines 50 μm perfusiven Partikels gleich dem eines 10 μm perfusiven Partikels bei 25-fach höherer Geschwindigkeit und demselben Druckabfall wird. Um bei einem niedrigeren Druckabfall, derselben Bettgeschwindigkeit, aber mit größeren Partikeln zu arbeiten, müßte die Porengröße sogar noch mehr wachsen, um eine konstante Plattenhöhe bei der Vergrößerung zu erreichen (siehe Gleichung 9). Ein Anstieg in der Porengröße um etwa das 11-fache ist erforderlich, um eine äquivalente Auflösungstrennung bei einem 25-fach niedrigerem Druckabfall zu erreichen. Aus Gleichung 11 sollte es ersichtlich sein, daß beispielsweise mit 50 μm Partikeln, einer 5-fachen Steigerung der Bettgeschwindigkeit, einer 5-fachen Verringerung des Druckabfalls und einer 5-fachen Vergrößerung des Porendurchmesser dieselbe Auflösung schneller und mit niedrigerem Druckabfall als für ein 10 μm Partikel erreicht wird.
Die nachstehend dargestellte Tabelle veranschaulicht diese Beziehungen für 6 Falluntersuchungen. Die Spalte 1 erfordert in jedem Falle eine 5-fache Vergrößerung in der Partikelgröße. Im Falle A bleibt die Porengröße in dem größeren Partikel unverändert, und es wird dieselbe Bettoberflächengeschwindigkeit verwendet (Spalte 4). In diesem Falle arbeitet bezogen auf das Bett mit den kleineren Partikeln das Bett mit den größeren Partikeln bei einem Druckabfall von 1/25-tel (Spalte 3) und weist eine Durchtrittsporengeschwindigkeit von 1/25-tel (Spalte 5) auf. Die Pèclet-Zahl in den Durchtrittsporen des größeren Partikels ist jedoch nur 1/5-tel von dem des kleineren, und die Plattenhöhe steigt um einen Faktor 125 an, was die Auflösung stark verringert.
Im Falle B bleibt die Porengröße konstant (Spalte 2) und die Bettoberflächengeschwindigkeit wird um einen Faktor 5 (Spalte 4) erhöht. In diesem Falle ist der Druckabfall nur 1/5, so wie es die Porengeschwindigkeit ist. Die Pèclet-Zahl bleibt konstant, aber die Plattenhöhe stiegt um den Faktor 25 an.
Im Falle C bleiben die Porengröße und der Betriebsdruck konstant, was zu 25-fachen Bettgeschwindigkeit gegenüber dem Bett mit kleineren Partikeln führt. Die Geschwindigkeit durch die Poren hindurch bleibt ebenfalls konstant, die Pèclet-Zahl steigt um einen Faktor 5 und die Plattenhöhe steigt um einen gleichen Faktor.
Im Falle D werden die Durchtrittsporen des Partikels um denselben Faktor wie der Partikeldurchmesser vergrößert, und der Druckabfall beibehalten, was zu einem 25-fachen Anstieg in der Bettoberflächengeschwindigkeit führt. Die Fluidgeschwindigkeit der Durchtrittsporen steigt deshalb um einen Faktor 5 an, die Pèclet-Zahl steigt um einen Faktor 25 an, und die Plattenhöhe bleibt konstant.
Im Falle E wird der Durchmesser der Durchtrittsporen um einen Faktor 125 vergrößert (5 in Bezug auf den Partikeldurchmesser). Somit ist bei denselben Bettgeschwindigkeiten der Druckabfall 25-fach höher als in dem Falle des kleineren Partikels. Die Fluidgeschwindigkeit in den Durchtrittsporen ist 5-fach höher, die Pèclet-Zahl steigt um ein Faktor 25 an, und die Plattenhöhe bleibt dieselbe.
Schließlich erhält man im Falle F, in welchem die Durchtrittspore in derselben Weise wie die Partikelgröße vergrößert wird, in einem Betrieb bei dem 5-fachen der Bettgeschwindigkeit nur 1/5 des Betriebsdrucks. Obwohl die Fluidgeschwindigkeit in den Durchtrittsporen die 5-fache des Ausgangsfalles ist, wird die Pèclet-Zahl um einen Faktor 25 erhöht, und die Plattenhöhe und damit die Auflösung bleiben dieselben. TABELLE
In der vorstehenden Analyse ist die Spalte 6, welche das Verhältnis der Pèclet-Zahlen darstellt, eine Anzeige des Vorteils in der Produktivität, der gegenüber diffusiven Partikeln erreicht wird. Das Plattenhöhenverhältnis ist eine Anzeige des Vorteils (Nachteils) in der Auflösung, der gegenüber kleineren perfusiven Partikel erzielt wird. Somit werden in den Fällen D, E und F sehr signifikante Steigerungen im Durchsatz und/oder ein verringerter Druckabfall erzielt, während gleichzeitig die Auflösungsleistung kleinerer Partikel beibehalten wird.
Demzufolge ist es offensichtlich, daß viele Kompromisse eingegangen werden können, um den perfusiven Modus für den Transport des gelösten Stoffes in die Erfindung verkörpernden Chromatographiesystemen am besten zu nutzen. Es sollte ferner offensichtlich sein, daß große Partikel, z.B. größer als 40 μm im Durchmesser, größere Durchtrittsporen aufweisen, die zu Subporen in der Größenordnung von 30 bis 70 nm (300 bis 700 Å) im Durchmesser führen, eine Klasse von Matrixmaterialien mit großen Erwartungen repräsentieren.
Beispiele
Die Vorteile der Perfusionschromatographie wurden gut unter Verwendung der im Handel verfügbaren vorstehend diskutierten Partikelmedien (PL 1000 und PL 4000) beide unbehandelt und mit Polyethylenimin abgeleitet und auch mit Prototypenmaterialien, hergestellt von Polymer Laboratories, Ltd., ähnlich dem Material PL 4000, aber mit größerem Partikeldurchmesser demonstriert. Es wurden Tests unter Verwendung synthetischer Gemische von Proteinen des Typs durchgeführt, die man im allgemeinen bei Aufgaben der Proteinreinigung und Trennung findet.
Der Beweis, daß anders als bei der herkömmlichen Chromatographie die Bandspreizung nicht durch hohe Strömungsraten in dem Bereich der perfusiven Chromatographie verschlimmert wird, ist in 10 dargestellt. Diese Chromatogramme, die durch Detektion mittels optischer Absorption der Proteinabgabe einer 50 mm × 4,6 mm Säule, gepackt mit PL 4000 Material, erzeugt wurden, zeigen deutlich, daß die Auflösung beispielsweise des Proteins OVA (Ovalbumin) und STI (Sojabohnentrypsininhibitor) bei 1 ml pro Minute (350 cm/h) 2 ml pro Minute (700 cm/h) und 4 ml pro Minute (1400 cm/h) von links nach rechts in 10 ähnlich sind. Die Chromatogramme erzielten jeweils Auflösungen von 6,0, 6,5 und 6,2.
11 stellten Daten dar, welche die Fähigkeit der perfusiven Chromatographie veranschaulichen, sehr schnelle Proteintrennungen mit hoher Auflösung bei hohen Bettgeschwindigkeiten und flachen Säulengeometrien zu erzeugen. 11 wurde mit einer 5 mm langen × 6 mm breiten Säule unter Verwendung des Materials PL 4000 mit einer Strömungsrate von 3 ml pro Minute erzielt. Man beachte die Auflösung der 4 Testproteine in weniger als 1 Minute.
12 vergleicht die Leistung der nicht-porösen gegenüber den perfusiven Medien für die Trennung des Testproteingemisches. Es ist zu sehen, daß das Material PL 4000 (rechts) in vergleichbarer Weise zu den nicht-porösen Partikeln (links) trotz der viel größeren Größe des PL Materials (10 μm gegenüber 3 μm) arbeitet. Dieses steht im Gegensatz zu difusiven Medien, bei denen sich die Auflösung typischerweise umgekehrt zu dem Quadrat des Partikeldurchmessers verhält.
13A bis 13D stellen hochauflösende Trennungen von 6 Proteinen in weniger als 90, 80, 60 und 40 Sekunden bei Bettgeschwindigkeiten von 900, 1200, 1200 und 1500 cm/h unter Verwendung nicht abgeleiteter PL 4000 Partikel (Umkehrphase) dar. Die Chromatogramme wurden auf einer 6 mm × 5 mm Säule mit einem Gradienten einer Trifluoressigsäure und Azetonitril erzeugt. Das Chromatogramm 13D wurde unter Verwendung eines steileren Gradienten erhalten.
14 liefert einen weiteren Beweis des Beitrags des konvektiven Transportes zu den perfusiven Chromatographieprozeduren. Sie offenbart Plattenhöhenkurven (H in Abhängigkeit von der Strömungsrate) für Lysozym (A) und Säurephosphatase (B) erzeugt unter Verwendung einer 250 mm × 4,5 mm Säule gepackt mit dem Material PL 4000 und mit 250 mM NaCl eluiert, hergestellt. Gemäß Darstellung sind bei niedriger Mobilphasengeschwindigkeit die Plattenhöhenkurven von herkömmlichen Matrixmaterial nicht unterscheidbar. D.h., unterhalb etwa 1 ml/min ist ein Anstieg der Plattenhöhe mit einem Anstieg der Strömungsrate zu sehen. Jedoch bei hohen Mobilphasengeschwindigkeiten in dem Bereich von 1 bis 2 ml/min für Säurephosphatase und 2 bis 3 ml/min für Lysozym ist die Plattenhöhenkurve tatsächlich flach. Bei sehr hohen Geschwindigkeiten, d.h., über etwa 700 bis 800/h für Säurephosphatase und etwa 1100 cm/h für Lysozym steigt die Plattenhöhe wieder an, aber mit einer wesentlich langsameren Rate als für die schweren Diffusionsbegrenzungen erwartet, die unter diesen Umständen in konventionellen Medien vorherrschen würden.
15A und 15B vergleichen die Plattenhöhenkurven, für verschiedene lineare Strömungsgeschwindigkeiten für jeweils ein diffusiv gebundenes Polymerkugelmaterial (Monobeads, Pharmacia) und das PL 4000 Material. Wegen der Druckbeschränkungen konnten die "Monobeads" bei einer Geschwindigkeit grö ßer als 1200 cm/h nicht benutzt werden. Bei linearen Geschwindigkeiten bis zu 2500 cm/h ist die Bandspreizung mit dem PL 4000 Partikeln weniger als das Doppelte ihres Wert am Minimum. Im Gegensatz dazu würde bei einer Extrapolation dieses durch stagnierende Massenübertragung beschränkten Verhaltens von 15A, dieser Wert nahezu viermal höher als das Minimum für das herkömmliche Monobead-Medium sein.
Ein Nebeneffekt der verbesserten Charakteristik der Transportkinetik der perfusiven Chromatographie ist eine kurze Zykluszeit. Die Verbesserung durch Perfusion kann jedoch auch zur Erhöhung der Auflösung mit derselben Zykluszeit verwendet werden. Dieses ist in den Chromatogrammen von 16A 16B und 16C veranschaulicht, welche die Trennung eines komplexes Proteingemisches unter Verwendung des PL 4000 Materials darstellen. Bei 350 cm/h (16A) ist die Prozedur diffusionsbegrenzt (die Pèclet-Zahl in den Poren ist kleiner als 1). Die Auflösung ist mit einem steilen Gradienten von 40 mM CaCl₂/min gut. Gemäß Darstellung in 16B kann die Zykluszeit merklich verkürzt werden, indem die Bettströmungsrate auf 4300 cm/h erhöht wird. Gemäß Darstellung in 16C kann durch Verwendung einer linearen Bettgeschwindigkeit von 4300 cm/h mit einem flacheren Gradienten von 12 mM CaCl₂/min eine wesentlich höhere Auflösung in einem kürzeren Zeitrahmen erzielt werden.
17A und 17B zeigen, daß die Spitzenauflösung nicht von einer Steigerung der Bettgeschwindigkeit größer als das 10-fache für die Trennung der IgG-Klasse 1 und 2 beeinträchtigt wird. Das Chromatogramm von 17A wurde auf einer 30 × 2,1 mm Säule mit PL 4000 Material erstellt. Die Immunglobuline aus einer Maus-Bauchwassersucht wurden mit einem 40 mM CaCl₂/min Gradienten bei einer Strömungsrate von 0,2 ml/min bzw. 2,5 ml/min, welche Fluidgeschwindigkeiten von 300 cm/h bzw. 4300 cm/h darstellen, getrennt.
18A bis 18F sind Chromatogramme, die durch Reinigung vom β-Galaktosidase aus E. Coli Lysat auf dem PL 4000 (A, B, C) und PL 1000 (D, E, F)-Materialien erzeugt wurden. Gemäß Darstellung kann ein voller Zyklus in weniger als 15 Minuten in dem perfusiven Modus (1200 cm/h, 18C, 18F) durchgeführt werden, was im wesentlichen dieselben Leistungen in der Auflösung ergibt, wie sie in einem typischen 60-Minuten-Zyklus (300 cm/h, 18A, 18D) erzielt werden. Die Spitz von β-Gal ist schattiert.
19A, 19B, 19C und 19D zeigen 4 Chromatogramme, die durch Trennung eines Testproteingemisches, das Beta-Laktoglobulin und Ovalbumin enthält, mit den Versionen für starken Ionenaustausch des PL 1000 und PL 4000 Materials erzeugt wurden. Dieses Testgemisch wurde mit Säulen getrennt, die mit dem angegebenen Partikel gepackt und bei 0,5 und 2,5 ml/min betrieben wurden. Mit 8 μm Partikeln ist die Trennung dieselbe bei 0,5 ml/min (19A, 19B) und bei 2,5 ml/min (19C, 19D). Gemäß Darstellung in 19E und 19F arbeitete das PL 4000 Material bei 5,0 ml/min besser als das PL 1000 Material, da es in einem höheren Maße perfusiert. Trotzdem trennen beide das Gemisch gleichwertig.
Die herkömmliche Flüssigkeitschromatographielehre, gut durch Experimente bestätigt, ist die, daß, "eine Erhöhung der Partikelgröße zu einer niedrigeren Auflösung bei einer gegebenen Strömungsrate führt, und daß mit Erhöhung der Strömungsraten der Auflösungsverlust mit einer schnelleren Rate erhöht wird". Jedoch ist, wie vorstehend erwähnt, bei perfusiven Matrizen der Grad der Perfusion von der relativen Größe der ersten und zweiten Porensätze abhängig, was für Partikelmedien zu einem Partikeldurchmesser und einer Porengröße führt. Die Trennungsleistung in einem perfusiven Bereich mit großen Partikeln ist daher erwartungsgemäß weniger von der Strömungsrate abhängig.
Die Gültigkeit dieser Hypothese wird durch einen Vergleich der 19 mit den 20 demonstriert. 20A und 20B wurden mit der Proteinprobe bei 0,5 ml/min unter Verwendung von PL 1000 bzw. PL 4000 Partikeln erzeugt, wobei beide eine mittlere Partikelgröße von 20 μm aufwiesen. 20C und 20D wurden mit PL 1000 und PL 4000 Materialien beide mit einer Partikelgröße von 20 μm bei 2,0 ml/min erstellt. 20E und 20F wurden bei 5,0 ml/min unter Verwendung der entsprechenden Materialien erstellt. Die Daten zeigen, daß bei 0,5 ml/min das PL 4000 Material leicht besser als das PL 1000 Material funktionierte, und das wie erwartet, beide bei einem Betrieb bei niedrigen Strömungsraten, die zu niedrig für die Erzeugung einer Perfusion sind, schlechter als ihre Gegenspieler mit 8 μm Partikelgröße arbeiteten. Bei 2,0 ml/min erweitert sich der Spalt in der Leistung zwischen diesen 2 Materialien, wobei das PL 1000 Material merklich an Auflösungsleistung verliert, während das PL 4000 Material die Spitzen noch trennen kann. Bei 5,0 ml/min (1500 cm/h) kann das 20 μm PL 4000 Material immer noch diese Spitzen auflösen, während das PL 1000 Material diese Leistung nahezu vollständig verliert. Der Unterschied zwischen der Leistung der Materialien ist bei 8 μm kleiner als bei 20 μm, weil, während beide im Falle der kleineren Partikel (in unterschiedlichem Ausmaß) perfundieren, die größeren Partikel des PL 1000 Materials erwartungsgemäß nur sehr wenig im Vergleich zu dem PL 4000 Material perfundieren.
Schließlich stellen die 21 und 22 eine experimentelle Verifikation der vorstehend diskutierten Berechnungen für den Unterschied im Durchbruchsverhalten zwischen perfusiven Partikeln und herkömmlichen porösen, diffusiv gebundenen Partikeln dar. 21, ausgeführt in einer 5 × 50 mm Säule unter Verwendung von Monobeads (Pharmacia) zur Trennung von BSA, zeigt, daß bei 150 cm/h die Durchbruchskurve wie erwartet für eine diffusive Säule geformt ist, die unter Gleichgewichtsbedingungen betrieben wird. Wenn die Fluidgeschwindigkeit auf 300 cm/h gesteigert wird, beginnt die Abweichung von der Gleichgewichtskurve, und bei 900 cm/h ist ein vorzeitiger Durchbruch klar ersichtlich. Im Gegensatz dazu sind gemäß Darstellung in 22, unter Verwendung von PL 4000 in derselben Säule zur Trennung desselben Proteins die Durchbruchskurven im wesentlichen bei 300, 1500 und 2700 cm/äquivalent.

Claims

Chromatographieverfahren, umfassend das Durchleiten eines Flüssigkeitsgemisches aus biologische Moleküle aufweisenden gelösten Stoffen, und anschließend eines flüssigen Eluierungsmittels, durch eine Chromatographiematrix, um die gelösten Stoffe auf die Matrix zu laden und anschließend daraus herauszulösen, wobei die Matrix miteinander verbundene erste und zweite Durchtrittsporensätze aufweist, das Verhältnis des mittleren Durchmessers des ersten Durchtrittsporensatzes zu dem mittleren Durchmesser des zweiten Durchtrittsporensatzes klein genug ist, so dass die intrapartikuläre Strömung den Massentransport in dem zweiten Durchtrittsporensatz auf Flüssigkeitsgeschwindigkeiten über 1000 cm/h durch das Matrixbett hindurch verbessert, die Elemente des ersten Durchtrittsporensatzes einen größeren mittleren Durchmesser als die Elemente des zweiten Durchtrittsporensatzes aufweisen, der zweite Durchtrittsporensatz in Fluidverbindung mit für gelöste Stoffe interaktiven Bereichen steht, welche reversibel mit den gelösten Stoffen in Wechselwirkung treten, um deren chromatographische Trennung zu bewirken, das Flüssigkeitsgemisch oder das Eluierungsmittel durch die Matrix mit einer Fluidgeschwindigkeit hindurchgeleitet wird, die ausreicht, um (i) eine konvektive Fluidströmung durch die Durchtrittsporen hindurch zu erzeugen, (ii) zu bewirken, dass die Fluidströmungsgeschwindigkeit durch den ersten Durchtrittsporensatz hindurch größer als die Fluidströmungsgeschwindigkeit durch den zweiten Durchtrittsporensatz ist, und (iii) eine konvektive Fluidströmung durch den zweiten Durchtrittsporensatz hindurch mit einer Rate zu erzeugen, die größer als die Diffusionsrate des gelösten Stoffes durch den zweiten Durchtrittsporensatz ist, wodurch ein Bereich von Flüssigkeitsgeschwindigkeiten über 1000 cm/h durch das Matrixbett hindurch existiert, in welcher eine Bandspreizung im wesentlichen konstant ist, wobei das Eluierungsmittel oder Flüssigkeitsgemisch durch die Matrix bei einer Bettgeschwindigkeit größer als 1500 cm/h durchgeführt wird, und wobei die Matrix gepackte Partikel mit einem mittleren Durchmesser größer als 8 μm aufweist, der zweite Durchtrittsporensatz Durchtrittsporen innerhalb der Partikel mit einem mittleren Durchmesser größer als 200 nm (2000 Å) aufweist, und das Verhältnis des mittleren Durchmessers der Durchtrittsporen kleiner als 70 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, in welchem die Matrix ferner eine Menge von Subporen in Fluidverbindung mit dem zweiten Durchtrittsporensatz bildet, welche einen Abschnitt der interaktiven Oberflächenbereiche bilden,
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, in welchem die Chromatographiematrix dadurch erzeugt wird, dass eine Menge von Partikeln zusammengepackt werden, wobei die Zwischenräume zwischen den Partikeln den ersten Durchtrittsporensatz ausmachen, und Durchtrittsporen innerhalb der Partikel den zweiten Durchtrittsporensatz ausmachen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Eluierungsmittel oder Flüssigkeitsgemisch durch die Matrix mit einer solchen Bettgeschwindigkeit hindurchgeleitet wird, dass die Péclet-Zahl in einer Durchtrittspore des zweiten Durchtrittsporensatzes größer als 1 ist, wobei die Péclet-Zahl als das Verhältnis des Konvektions- zum Diffusionstransport für einen gegebenen gelösten Stoff innerhalb der Durchtrittspore definiert ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Eluierungsmittel durch die Matrix mit Bettgeschwindigkeiten hindurchgeleitet wird, die ausreichen, um eine spezifische Produktivität von mindestens 1 mg gesamten gelösten Feststoff sorbiert pro ml der Matrix pro Minute zu erzeugen.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Fluidströmungsgeschwindigkeiten durch die Matrix eine spezifische Produktivität von mindestens 2 mg gesamten gelösten Feststoff sorbiert pro ml der Matrix pro Minute erzeugen.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Matrix gepackte Partikel aufweist, und das Verhältnis des mittleren Durchmessers der Partikel zu dem mittleren Durchmesser der Durchtrittsporen kleiner als 50 ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei einer der Durchtrittsporensätze Poren mit einer schmalen Verteilung von Porendurchmessern in der Weise aufweist, dass 90% der Poren innerhalb 10% des mittleren Porendurchmessers fallen.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei mindestens einer der Durchtrittsporensätze eine Pluralität von Sub-Sätzen mit unterschiedlichen mittleren Durchmessern aufweist, welche zusammen eine breite Verteilung von Porendurchmessern erzeugen.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die interaktiven Bereiche Subporen mit einem mittleren Durchmesser kleiner als 70 nm (700 Å) aufweisen.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Matrix eine aus einem Stück bestehende Chromatographiematrix ist.
Anwendung von Partikeln, die eine Porenstruktur bilden, die in ihrer Verteilung mindestens bimodal ist, welche eine Chromatographiematrix in dem Chromatographieverfahren nach Anspruch 1 bilden, wobei die Matrix in der Anwendung eine im wesentlichen konstante Bandspreizung über einen Bereich von Strömungsgeschwindigkeiten größer als 1000 cm/h durch das Matrixbett hindurch zeigt, beinhaltend ein hybrides Massenübertragungssystem von Konvektions- und Diffusionstransport, wobei die Geschwindigkeit des Konvektionstransportes die Geschwindigkeit des Diffusionstransportes in den die Partikel durchdringenden Durchtrittsporen übersteigt, wobei die Partikel einen mittleren Durchmesser größer als 10 μm besitzen und einen starren Feststoff aufweisen, welcher (1) für gelöste Stoffe interaktive Bereiche abgeleitet mit chemischen Gruppen, welche reversibel mit biologischen gelösten Stoffen in Wechselwirkung treten, um deren chromatographische Trennung zu bewirken, (2) eine Pluralität von Durchtrittsporen für einen Konvektionsmassentransport, und (3) eine Pluralität von kleineren Poren in Verbindung mit den Durchtrittsporen für einen Diffusisonsmassentransport zu den interaktiven Oberflächenbereichen bildet, wobei das Verhältnis des mittleren Durchmessers der Partikel zu dem mittleren Durchmesser der Durchtrittsporen kleiner als 70 ist, und mit Durchtrittsporen mit einem mittleren Durchmesser größer als 200 nm (2000 Å), und wobei die Strömungsgeschwindigkeiten durch das Matrixbett hindurch größer als 1500 cm/h sind.
Anwendung nach Anspruch 12, wobei das Verhältnis des mittleren Durchmessers der Partikel zu dem mittleren Durchmesser der Durchtrittsporen kleiner als 50 ist.
Anwendung nach Anspruch 12 oder 13, wobei die Partikel miteinander verbundene polymerische Kugeln aufweisen, welche eine Pluralität von Sub-Sätzen von Durchtrittsporen und kleineren Poren mit unterschiedlichen mittleren Durchmessern bilden.
Anwendung nach einem der Ansprüche 12, 13 oder 14, wobei die kleineren Poren einen mittleren Durchmesser in dem Bereich von 30–70 nm (300 bis 700 Å) aufweisen.
Anwendung nach einem der Ansprüche 12 bis 15, wobei die Partikel einen Durchmesser größer als 20 μm besitzen.
Anwendung nach Anspruch 12, wobei die Partikel einen mittleren Durchmesser größer als 40 μm besitzen.
Anwendung nach Anspruch 12, wobei die Partikel ferner Verzweigungsporen bilden, die zwischen Durchtrittsporen und kleineren Poren kommunizieren, wobei die Verzweigungsporen einen mittleren Durchmesser zwischen den mittleren Durchmessern der Durchtrittsporen und kleinen Poren besitzen.
Anwendung nach einem der Ansprüche 12 bis 16, wobei die für die gelösten Stoffe interaktiven Bereiche eine Oberfläche aufweisen, abgeleitet um einen anionischen Austausch, kationischen Austausch, hydrophobe Wechselwirkung, Chelation oder Affinitäts-Chromatographiemedium zu erzeugen.
Anwendung nach einem der Ansprüche 12 bis 19, wobei der starre Feststoff polymerisches organisches Material aufweist.
Anwendung nach einem der Ansprüche 12 bis 19, wobei die Partikel vernetztes Polystyrol aufweisen.
Anwendung nach einem der Ansprüche 12 bis 21, wobei die Durchtrittsporen einen mittleren Durchmesser größer als 600 nm (6000 Å) besitzen.
Anwendung einer Matrix zur Ausführung einer Adsorptions-Füssigkeitschromatographie unter Anwendung von Partikeln nach einem der Ansprüche 12 bis 22.
Anwendung eines Chromatographiesystems einschließlich der Anwendung einer Chromatographiematrix nach Anspruch 23, die in einer Säule angeordnet ist mit einer Pumpe zum Durchleiten von Flüssigkeiten durch die Matrix.
Anwendung eines Systems nach Anspruch 24, in welchem die Matrix eine aus einem Stück bestehende Chromatographiematrix ist.
Anwendung eines Systems nach einem der Ansprüche 24 oder 25, das ferner einen Detektor enthält.