DE4440805C2

DE4440805C2 - Trennrohr und dessen Anwendung

Info

Publication number: DE4440805C2
Application number: DE4440805A
Authority: DE
Original assignee: BRETTSCHNEIDER HENNER; KAISSLING KOSCHNICK ROSWITHA
Current assignee: BRETTSCHNEIDER HENNER; KAISSLING KOSCHNICK ROSWITHA
Priority date: 1993-11-16
Filing date: 1994-11-15
Publication date: 1998-11-26
Anticipated expiration: 2014-11-16
Also published as: WO1995014220A2; WO1995014220A3; AU8139294A; DE4440805A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Trennrohr nach dem Oberbegriff des An spruches 1. Weiterhin betrifft die Erfindung Anwendungen dieses Trennrohres.

Ein Trennrohr dieser Art ist aus der Britischen Patentschrift 1 340 295 bekannt. Die bekannte Siebplatte kann aus Meersand, Quarzsand, po rösem keramischen Material oder aus einer Filterplatte bestehen. Die Siebplatte soll eine ausreichende und einheitliche Durchlässigkeit für die aufgebrachten Lösungsmittel gewährleisten. Als besonders geeignet haben sich Filterplatten erwiesen; in diesem Falle werden bevorzugt Filterplatten eingesetzt. Ausweislich der Zeichnung handelt es sich um plane Scheiben, mit parallelen, ebenen Hauptflächen. Das bekannte Trennrohr soll für chromatographische Trennungen eingesetzt werden, beispielsweise für alle analytischen, präperativen oder biochemischen Trennarbeiten.

Das Dokument SU 1 055 531 A offenbart eine für chromatographische Trennarbeiten einsetzbare Vorrichtung, die im wesentlichen wie ein herkömmlicher Schütteltrichter ausgebildet ist. Der untere Abschnitt dieses Schütteltrichters erweitert sich konisch zum Aufgabeende hin. Sofern dieser untere Abschnitt mit einer Packung aus Sorptionsmaterial gefüllt ist, resultiert eine besonders weite Auftragszone. Den Auslaß dieses unteren Abschnittes bildet ein mit einer Bohrung versehener Stopfen, der in einem Lager drehbar gehalten ist. Eine Siebplatte, insbesondere eine gewölbte Siebplatte ist offensichtlich nicht vorge sehen.

In dem Fachbuch "Gel Chromatography" von T. Kremmer, L. Boross, Verlag John Wiley & Sons, Chichester, New York, Brisbane, Toronto, 1979, wird auf den Seiten 184 bis 187 über die Fraktionierung von Proteinen an Gelen berichtet, die als Sorptionsmaterial innerhalb eines Trennrohres vorgesehen sind. Beispielsweise kommen für die Fraktionierung von organischen Extrakten, Serumproteinen oder Harnproteinen groß porige Gele in Betracht, in welche die Proteine hineindiffundieren können; als geeignete Gele werden u. a. Polyacrylamide und Agarose-Gele genannt. In Abwesenheit von Protein-Protein- oder Protein-Gel-Wechsel wirkungen bildet die chromatographische Zone der Proteine eine nahe zu symetrische Glockenkurve. Sofern sich die Proteine in ihrer Lös lichkeit unterscheiden, können im Verlauf der Fraktionierungsschritte auch zonenweise Ausfällungen bzw. Zonenprezipitation vorgesehen werden. Eine bestimmte Ausgestaltung der mit Gel gefüllten Trennsäulen wird in dieser Literaturstelle nicht angesprochen.

Des weiteren wird auf die nachstehenden Beiträge aus der wissenschaft lichen Literatur zur Trennung von Proteinen in Trennrohren dieser Art verwiesen:

- "Separation of Proteins by Gradient Solvent Extraction of a Protein Precipitate", von Zille, C. A.; Della Monica, E. S.; in Arch. Biochem. Biophys. 58, (1955) S. 31-36;
- "Separation of Proteins by Ammonium Gradient Solubilisation", von King, T. P.; in Biochem. 11, (1972)S5. 367-371;
- "Salting-out Chromatography of Serum Proteins", von Sargent, R. N.; Graham, D. L.; in Anal. Chim. Acta 30, (1964) S. 101-104;
- "Chromatographic Study of Human Serum by Gel Filtration", von Epstein, W. V.; Tan, M.; in J. Chrom. 6, (1961) S. 258-263;
- "Zone Precipitation", von Porath, J.; in Nature 196, (1962) S. 47-48;
- "Hydrodynamics of Preperative Chromatography Columns", von Nicoud, R. M.; Perrut, M.; in Chromatogr. Science Ser. 61, (1993) S. 47-77;
- "A Theoretical Study of Multicomponent Radial Flow Chromatography", von GU, T.; Tsai, G.-J.; Tsao, G. T.; in Chem. Eng. Science 46, (1991) S. 1279-1288;
- "Method of Concentrating Proteins on SEPHADEX Prior to Gel Filtration", von McGrath;in Anal. Biochem. 16, (1966) S. 402-408;
- "Salt Effects on Hydrophobic Interactions in Precipitation and Chromotography of Proteins" von Melander, W.; Horvath, C.; in Arch. Biochem. Biophys. 183, (1997), S. 200-215;
- "The Derivatization of Cross-Linked Polyacrylamid Beads", von Inman, J. K.; Dintzis, H. W.; in Biochem. 8, (1969) S. 4074-4082.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Trennrohr der gattungsgemäßen Art bereitzustellen, das verbesserte Trenneigen schaften, insbesondere eine höhere Trennschärfe gewährleistet.

Ein weiteres Ziel der Erfindung betrifft die Anwendung eines solchen Trennrohres zur Auftrennung einer Suspension von im Serum ausge fällten Proteinen. Insbesondere soll hier ein Serum entsalzt, und in einem Arbeitsschritt eine Trennung von Serum und Antikörpern er reicht werden, um sowohl das Serum wie diese Antikörper in reiner Form zu gewinnen.

Ausgehend von einem Trennrohr zur Auftrennung eines Substanzge misches in einzelne Komponenten mit einem Rohr, das ein Aufgabeende und ein Entnahmeende, sowie einen Rohrquerschnitt aufweist, der zwischen Aufgabeende und Entnahmeende konstant ist oder der sich vom Aufgabeende zum Entnahmeende hin vermindert,
mit einer Siebplatte, die im Bereich des Entnahmeendes innerhalb des Rohres angebracht ist und dort den gesamten Rohrquerschnitt aus füllt,
mit einer Packung aus Sorptionsmaterial innerhalb des Rohres, die auf der Siebplatte abgestützt ist,
wobei zur Durchführung einer Trennoperation am Aufgabeende zuerst das aufzutrennende Substanzgemisch und daraufhin eine Flüssigkeit aufgegeben werden, die beim Durchwandern der Packung eine bezüg lich des Rohrquerschnittes nicht ebene Elutionsfront gleicher Konzen tration bildet,
ist die erfindungsgemäße Lösung dieser Aufgabe dadurch gekennzeichnet, daß die Siebplatte eine von der Packung weg gerichtete Wölbung aufweist.

Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung betrifft die Anwendung eines solchen Trennrohres zur Auftrennung einer Suspension von in Serum ausgefällten Proteinen, wobei das Sorptionsmittel ein Molekular sieb ist, und wobei als Flüssigkeit ein Lösungsmittelgemisch mit in der Fällungsmittelkonzentration fallendem Lösungsmittelgradienten einge setzt wird.

Vorteilhafte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Nachstehend wird die Erfindung mehr im einzelnen mit Bezugnahme auf die Zeichnungen erläutert; die letzteren zeigen:

Fig. 1 verschiedene Ausgestaltungen eines konischen Abschnittes an einem Trennrohr;

Fig. 2 in schematischer Darstellung die jeweilige Elutionsfront, die sich innerhalb dieser verschiedenen konischen Ab schnitte nach Fig. 1 bildet;

Fig. 3 eine theoretisch abgeleitete Elutionsfront in einem sich stark verjüngenden Abschnitt eines Trennrohres;

Fig. 4 Einzelheiten zur Formgebung des konischen Abschnittes eines Trennrohres;

Fig. 5 ein Trennrohr mit einer beispielhaften Siebplatte, deren Einlauffläche eine von der Packung weg gerichtete Wölbung aufweist;

Fig. 6 für ein gegebenes Trennrohr die sich jeweils einstellende Elutionsfront in Abhängigkeit von der Siebplattenwölbung;

Fig. 7 verschiedene Arten und Ausgestaltungen einer Siebplatte.

Sowohl die Proteinfällung als auch die hydrophobe Chromatographie beruhen auf Assoziationsgleichgewichten, die sich durch Salze und Lösungsmittel steuern lassen. Davon ausgehend sollen beispielsweise aus Serum ausgefällte Antikörper effektiv und damit auch kostengünstig so abgetrennt werden, daß salz- und antikörperfreies Serum neben den ausgefällten Proteinen gewonnen wird. Um in einem Arbeitsschritt die ausgefällten Proteine durch Filtrieren abzutrennen und gleichzeitig das Filtrat, z. B. Serum, entsalzt in konzentrierter Form möglichst verlust arm zu gewinnen, ist eine leistungsstarke Chromatographievorrichtung erforderlich, die eine große ebene Auftragsfläche besitzt um das Risiko des Verstopfens zu minimieren. Hierzu bietet sich ein trichterförmig gepacktes Entsalzungsgel an (die Packungsform erinnert an den Unter teil einer Nutsche), wobei die Proteinsuspension, nur durch ein Filter getrennt, unmittelbar auf das Gelbett aufgetragen wird.

Bei einem konischen Trennrohr steht durch die Rohrerweiterung an der Probenauftragsstelle, im Vergleich zu einem zylindrischen Rohr, eine viel größere Auftragsfläche zur Verfügung. Hierdurch wird die Gefahr einer Blockierung gesenkt. Insgesamt kann bei vergleichsweise gleichen Füllmengen eine größere Stoffmenge aufgearbeitet werden. Dies gilt so wohl für den ersten Filtrationsschritt, als insbesondere auch für die anschließende Chromatographie. In dieser paßt sich das Trennboden volumen den fallenden Kapazitätsansprüchen bei fortschreitender Auf trennung an.

Die Trennmatrix wird also insgesamt effektiver genutzt. Dies äußert sich in vergleichsweise geringeren Füllmengen, kürzeren Zykluszeiten und geringerer trennbedingter Verdünnung. Allerdings muß bei koni schen Trennrohren mit starken Verzerrungen der Elutionsfront gerech net werden. Vorraussetzung für die effektive Nutzung der Trennmatrix ist deshalb eine Kompensation der verzerrten Elutionsfront durch eine entsprechende Wölbung des Fließadaptors.

Erfindungsgemäß wird die bei konischen Trennrohren auftretende Vor wölbung der Elutionsfront dadurch kompensiert, daß ein Chromato graphieboden gleicher Krümmung geschaffen wird. Da die Krümmung der Elutionsfront eng mit der Trennrohrgestalt zusammenhängt, wird das Trennrohr zu Testzwecken in Modulbauweise aufgebaut, um es so flexibler auf seine Trennaufgaben hin in seiner Gestalt optimieren zu können.

Beim Recherchieren zum Strömungsverhalten in streng zylindrischen Trennrohren wie sie in der klassischen präperativen Chromatographie eingesetzt werden, wurde deutlich, daß hier die Wandeffekte meist außer Acht gelassen werden. Bei genauerer Analyse zeigt sich, daß auch im zylindrischen Trennrohr der axialen Chromatographie die Strömungsfront nach hinten gekrümmt ist.

Damit haben die erfindungsgemäß ursprünglich für die konische Chro matographie entwickelten gewölbten Chromatographieböden auch für die klassische axiale Chromatographie Bedeutung. Ihr Einsatz im Be reich der klassischen Chromatographie führt dort ebenfalls zu einer Verbesserung der Trenneigenschaften.

In der konischen Chromatographie spielen die Wandeffekte eine bedeu tende Rolle. Bei einem theoretischen Lösungsansatz muß hier im Ver gleich zur klassischen Chromatographie mit erhöhten Schwierigkeiten gerechnet werden. Weiterhin kommt erschwerend hinzu, daß die Durch strömgeschwindigkeit in axialer Richtung nicht konstant ist, und die radiale Dispersion sowie der Massentransfer von ihr abhängen. Hierin bestehen Parallelen zur radialen Chromatographie. Zur Bestimmung der geeigneten Chromatographieböden wurde deshalb der praktische Ansatz des Ausprobierens gewählt.

Zur Ermittlung der optimalen Form für das Trennrohr wurden drei ver schiedene trichterförmige Rohre mit gleichem Volumen (73 ml) Entsal zungsgel gefüllt (Fig. 1), und die zugehörigen Elutionsprofile eines niedermolekularen Farbstoffes (Bromphenolblau) ermittelt (Fig. 2). Das Elutionsprofil des Rohres A zeigte das steilste Elutionsprofil. Dies be deutet, daß die Elutionsfront in diesem Beispiel am geringsten von einer planen Fläche abweicht. Nach dem gleichen Verfahren kann der Boden eines beliebig geformten Chromatographierohres der Gestalt der Elutions front angepaßt werden.

Grundsätzlich hat ein Flüssigkeitsstrom durch ein konisch aus geformtes Chromatographierohr an der Wand einen längeren Weg zurückzulegen als im Zentrum. Skizziert man verschiedene stromlinienförmige Trennrohre und trägt man auf den Stromlinien gleiche Abstände ab und verbindet diese, so bekommt man eine Vorstellung, wie die Strömungsfront zeit abhängig voranrückt (Fig. 3). Hieraus wird deutlich, daß bei ebener Auftragsfläche in einem beliebig geformten konischen Chromatographie rohr durch eine Außenkrümmung des Bodens die verschieden langen Trennstrecken während der Chromatographie kompensiert werden können.

Zur einfachen Handhabung, sowie zur Verwendung kommerziell erhält lichen Chromatographiermaterials, wie Adaptoren (deren Endplatten ein fach auf die jeweils ermittelte Krümmung umgearbeitet werden), ist es zweckmäßig, den Konus nach beiden Seiten durch zylindrische Rohre zu verlängern.

Der konische Abschnitt zwischen den gegebenenfalls vorhandenen zylindrischen Abschnitten wird zweckmäßigerweise stromlienienförmig ausgebildet. Als Maximalmaß sollte ein Durchmesser von 120 cm nicht überschritten werden. Dies ist die Obergrenze bis zu der Zubehör noch relativ leicht erhältlich ist.

Trennrohre bis 40 cm Innendurchmesser werden am zweckmäßigsten aus Glas oder sterilisierbarem und durchsichtigen Kunststoff hergestellt. Insbesondere Trennrohre mit großem Durchmesser werden am besten aus CrNiMoTi-Stahl gefertigt.

Zur praktischen Konstruktion eines Trennrohres werden je ein oberer und unterer zylindrischer Tubus von mindestens 10 cm Länge auf den ge wünschten Abstand gebracht. Deren Außenränder werden mit einer ge strichelten Hilfslinie verbunden. Der Mittelpunkt dieser Hilfslinie wird später zum Wendepunkt der Krümmung im stromlinienförmig ausgeformten konischen Trennrohrabschnitt. Die Tangente im Wendepunkt (Fig. 4) dient hierbei als Konstruktionshilfslinie. Mit Hilfe dieser Hilfslinien wird - wie das in Fig. 4 beispielhaft dargestellt ist - die Kontur des konischen Abschnittes des Trennrohres konstruiert. Im Falle einer geringen Höhe bei gleichzeitig großem Durchmesser (rechte Seite der Fig. 4) ist es zweckmäßig die starke Krümmung über einen größeren Bereich auszugleichen. Anderenfalls würde dies zu einer unnötig starken und uneinheitlichen Verzerrung beim Austritt der Flüssigkeitsfront im unte ren Tubus führen. Dies gilt auch für jeden abrupten Wandkrümmungs wechsel des Trennrohres, wie es zum Beispiel ein einfacher Konus dar stellen würde. Nur in der Chromatographie, nicht so sehr in der Filtra tion, ist ein gleichförmiger Stromlinienverlauf von Bedeutung. Aus die sem Grunde werden Vorrichtungen mit großer Wandkrümmung - vgl. Fig. 5 - bevorzugt zu Filtrationszwecken eingesetzt.

Die Erfindung ermöglicht eine variable Gestaltung konischer Trennrohre durch Modulbauweise. Beispielsweise gibt es für die Verrohrung im Lüftungsanlagenbau bis zu einem Innendurchmesser von 629 mm ein viel fältiges Angebot von Rohrmodulen, die den variablen Anforderungen für erfindungsgemäße Trennrohre gerecht werden. Es gibt auch geeignete Module in Kegelmantelgestalt. Diese Rohrsegmente können ohne jegliches Schweißen durch Dichtungen und Spannringe zusammengefügt werden und sind dann für die Filtration und Chromatographie im Niederdruck bereich hinreichend dicht. Solche Module lassen sich zur Konstruktion unterschiedlich geformter konischer Trennrohre einsetzen. Ausgehend von einem einfachen Bausatz von Rohrmodulen und unterschiedlich ausgeformten Fließadaptoren läßt sich so mit verhältnismäßig geringem Kostenaufwand das optimale konische Trennrohr für das jeweilige Trenn problem realisieren.

Die optimale Krümmung (Wölbung) der Siebplatte kann in einem ein fachen Versuch ermittelt werden. Beispielsweise wird ein Trennrohr wie in Fig. 1A abgebildet (oberer Innendurchmesser 10 cm, unterer Innendurchmesser 5 cm) mit ca. 700 ml Sorptionsmaterial (im vorlie genden Fall "Biogel P6 fine", ein gelförmiges Molekularsieb auf der Basis von Acrylamid) gefüllt und mit physiologischem Puffer equilibriert. Zur Ermittlung der optimalen Boden- bzw. Siebplatten krümmung wird der Einfluß drei verschiedener Krümmungen auf das Elutionsverhalten von 20 ml Bromphenolblau analysiert. Die Elutions profile sind mit den zugehörigen maßstabsgerechten Bodenkrümmungen in Fig. 6 dargestellt. Nur die stärkste Krümmung zeigt ein schärferes Elutionsprofil. Nach diesem Verfahren kann die am besten passende Sieb plattenwölbung für ein beliebig geformtes Trennrohr ermittelt werden. Eine noch genauere Analyse der Elutionsfront läßt sich dadurch er reichen, daß Farbstoffe mit unterschiedlichen optischen Adsorptionsmaxima getrennt konzentrisch aufgetragen werden, und die Ergebnisse dieser Chromatographie mit denen einer zweiten Chromatographie verglichen werden, bei der zuvor die Farbstoffe durchgemischt wurden. Durch den Vergleich der Elutionszeiten für die verschiedenen optischen Adsorptionsmaxima wird so ein direkter Hinweis darauf erhalten, wie sich die Strömung über den Rohrquerschnitt verteilt und in welcher Richtung die Krümmung des Chromatographiebodens verbessert werden muß, damit eine optimale Auftrennung erzielt werden kann.

Erfindungsgemäß wird eine gekrümmte Elutionsfront dadurch entzerrt, daß dem Boden des Chromatographierohres eine von der Packung weg gerichtete Wölbung erteilt wird. Vorzugsweise soll die Siebplatte die gleiche Krümmung aufweisen wie die verzerrte Elutionsfront. Eine beispielhafte Vorrichtung zum Entzerren der Elutionsfront kann ver gleichbar einem Teesieb (vgl. Fig. 7) ausgebildet sein, dessen flexib ler Rand (1) sich dem Inneren des Chromatographierohres (9) anpreßt. Ein feinmaschiger Filter (8) wird vom Gehäuse aufgenommen und durch Auflagerippen unterstützt und mittels einer Hakenvorrichtung (2) in Position gehalten. Im Gehäuse wird das Filtrat gesammelt (7) und ab geleitet (4). Die Halterung ist so konstruiert, daß sie z. B. über eine Steck- bzw. Luer-lock-Verbindung (5) leicht gegen andere Filter gehäuse mit unterschiedlicher Filterkrümmung ausgetauscht werden kann, so auch mit Teilen von "Fließadaptoren" (10), die bereits auf dem Markt erhältlich sind. Hierdurch sind alle bestehenden konventionellen Chromatographiesysteme einfach auf die neuen erfindungsgemäßen Chro matographieböden umrüstbar.

Erläuterungen zu den Einzelabbildungen der Fig. 7:

1. A: Siebböden verschiedener Krümmung: "laminare Strömungsfront"
2. B: Siebböden verschiedener Krümmung: "turbulente Strömungsfront"
3. C: Seitenaufriß eines Siebbodens mit Halterung incl. Installation
4. D: Sicht auf die Unterseite der Halterung
5. E: Draufsicht auf die Halterung bei entferntem Siebboden.

Mit den nachstehenden Beispielen werden verschiedene Anwendungen erfindungsgemäßer Trennrohre erläutert.

Beispiel 1: Gleichzeitige Gewinnung von entsalztem Serum und Antikörpern

Ein konisches Chromatographierohr nach Fig. 1A mit je einem Durch messer von 5 cm und einem kleinen Durchmesser von 2,5 cm wird unten mit einem Fließadaptor als Boden abgeschlossen, dessen Krümmung in beschriebener Weise verändert worden ist. Das Rohr wird mit Entsal zungsgel auf Acrylamidbasis gefüllt (73 ml: Biorad, PG6, fine, ein gelförmiges Molekularsieb auf Acrylamidbasis), weil dieses Gel wegen seiner niedrigen Ausschlußgrenze keine Proteine in die Gelpartikel eindringen läßt. Das Gel wird in physiologischem Salz puffer gequollen, und das gepackte Chromatographierohr wird mit einem Filter abgedeckt und mit gleichem Puffer equilibriert. Der überstehende Puffer, welcher sich durch Setzen des Gelbettes gebildet hat, wird bei geöffnetem Rohr vorsichtig abgelassen. Der Filter wird mit möglichst geringer Volumenmenge einer 12 Gew.-%-igen Na₂SO₄-Lösung vorsichtig überschichtet. Dabei ist wichtig, daß der Filter sehr eben auf dem Gel aufliegt. Die Salzlösung läßt man vorsichtig vom Gelbett aufsaugen - achtet aber darauf, daß zwischen Gel und Filter keine Luft eindringt. Der gleiche Überschichtungsvorgang wird wiederholt, bevor die Serum suspension (20 ml Ausgangsvolumen) mit den ausgesalzten Antikörpern, mit 1/10 des Serumgewichtes an trockenen Gelpartikeln versetzt und dann aufs Filter aufgetragen und glattgestrichen wird. Das Versetzen mit Entsalzungsgel bringt verschiedene Vorteile; u. a. wird die Protein konzentration erhöht. Dies verbessert die Effektivität der Protein fällung und führt zu konzentrierterem entsalztem Serum. Darüber hin aus wird die Proteinsuspension mit Gelpartikel durchsetzt, was die Pufferdurchdringung und Filtration in der anderenfalls sehr kompakten Auftragszone erleichtert. Das Serum wird mit der 12%-igen Natriumsulfat lösung solange eluiert, bis der Chloridnachweis (Silbersulfat) negativ ist. Dann wird das Gelbett mit physiologischem Puffer regeneriert und die Antikörper eluieren, nach der Salzabsenkung anfangs als Suspension und dann als Lösung.

Beispiel 2: Serumgewinnung frei von Antikörpern, Pyrogenen und Viren

20 Liter Serum werden zur Inaktivierung von Viren mit verdünnter Salzsäure bei 4°C unter langsamem Rühren auf pH 5 eingestellt. Nach Erreichen des pH-Wertes wird 1 kg trockenes Entsalzungsgel zugegeben, das zuvor mit quartären Aminen derivatisiert worden war. Nach beendetem Zustreuen wird mit verminderter Geschwindigkeit, die gerade dazu aus reicht, eine Absetzung von Partikeln zu verhindern, mindestens drei Stunden lang gerührt. Dann wird langsam begonnen, eine Mischung von feinpulverisiertem Trinatriumcitrat und Citronensäure zuzustreuen, so daß sich innerhalb einer Stunde ein Volumen von 24 Litern mit einem pH von 8,2 einstellt. Diese Suspension wird nach einer Fällzeit von mindestens einer halben Stunde auf die ebene Auftragszone einer Trenn vorrichtung gegeben, die 60 Liter faßt und mit konventionellem Ent salzungsgel gefüllt ist. Die Abmessungsverhältnisse und die Vorbehand lung der Trennvorrichtung sind die gleichen wie vorstehend für Bei spiel 1 beschrieben - nur daß diese Trennvorrichtung ca. das 1000-fache Volumen faßt. Das Serum wird mit Citratpuffer eluiert, dessen Konzen tration dem Fällungspuffer entspricht. Das Serum eluiert nach dieser Vorbehandlung frei von Antikörpern, Pyrogenen und Viren. Sobald am Pufferauslaß die Proteinkonzentration abfällt und die Citratkonzentration ansteigt, wird die Serumelution beendet. Die Elution wird unterbrochen und das Trennrohr wird zur Equilibrierung und Antkörperrücklösung mit PBS-Puffer rückgespült. Bei Bedarf können die Antikörper gesammelt werden, weil sie, im Gegensatz zu den inaktivierten Viren, unter Niedrig salzbedingungen nicht an die quartären Amine binden. Das mit quartärem Amin derivatisierte Entsalzungsgel wird von der Filtertrennschicht abge hoben und kann nach Regeneration und Trocknung erneut benutzt werden. Die nach oben offene Trennvorrichtung steht nun für die nächste Serum auftrennung bereit.

In einem erfindungsgemäß ausgestalteten Trennrohr kann auch eine fraktionierende Kristallisation durchgeführt werden.

Wird unter Hochsalzbedingungen eine ausgefällte Proteinsuspension auf ein Entsalzungsgel aufgetragen, so bleibt die Proteinsuspension auf dem Gel liegen und kann dort mit dem Fällungspuffer frei von löslichen "Verunreinigungen" (hier z. B. Serum) gewaschen werden. Dies funk tioniert allerdings nur dann ohne störende Rücklösung, wenn die Auf tragszone zuvor mit Fällungspuffer equilibriert worden ist. Bei einer sich anschließenden Absenkung der Salzkonzentration im Elutionspuffer werden die ausgefällten Stoffe in der Reihenfolge ihrer Löslichkeit aus dem Prezipitat in der Auftragszone extrahiert und wandern, weil sie nicht ins Gel eindringen können, im Ausschlußvolumen des Gelbettes bis zu der Position, an der sie wieder die Grenze ihrer Löslichkeit errei chen. Hier kristallisieren sie und fallen aus. Nacheinander bilden sich verschiedene Prezipitationsbanden in der Reihenfolge ihrer Löslichkeiten. Das Extrahieren in Kombination mit dem beschleunigten Wandern im Aus schlußvolumen führt hier zu einer Verschärfung der Prezipitationsban den. Da der Elutionsgradient in diesem Falle durch ein Molekularsieb stabilisiert wird, bilden sich in diesem scharfabgegrenzte Prezipitations zonen aus, die mit Fortschreiten des Gradienten schließlich als Suspension eluieren. Die Gradientenlänge (sein Volumen in Relation zum Trennma trixvolumen) ist nicht durch das Trennmatrixvolumen begrenzt. Diese Art der Trennung kann analog zu einem Ionenaustauscher gehandhabt werden.

Bei einem von außen angelegten Gradienten mit abnehmender Fällungs mittelkonzentration laufen im Trennrohr folgende Einzelprozesse ab:

Im Inneren der Gelpartikel stellt sich bereits in der Auftragszone eine geringfügige niedrigere Konzentration als im Äußeren ein. Solange die Fällungsmittelkonzentration abnimmt, befindet sich im Geläußeren immer eine höhere Konzentration des älteren Puffers, also bei der Art dieses Gradienten auch an Salz. Das bedeutet, daß die ausgefällten Stoffe dem Gradienten im äußeren Volumen folgen - ins Gelinnere können sie ja nicht - sie ordnen sich dort in der Reihenfolge ihrer Löslichkeit als Prezipitationszonen an.

Beispiel 3: Vollständige Fällung von Serumproteinen und Ihre Auftrennung und Gewinnung durch fraktionierende Kristallisation

In diesem Beispiel wird die gleiche Vorrichtung benutzt, wie in Bei spiel 1 beschrieben. Zur vollständigen Fällung der Serumproteine wird 20 ml Serum bei 23°C mit Na₂SO₄ bis zur Sättigung versetzt und 1/10 des Serumgewichtes wird als wasserfreies Entsalzungsgel (Biorad, P6, fine) hinzugegeben. Das Chromatographiegel wird in gesättigtem Na₂SO₄ ge quollen, ins Chromatographierohr gefüllt, mit dem selben Puffer equili briert und mit einem Filter abgedeckt. Das Gel zeigt unter diesen Hoch salzbedingungen einen niedrigeren Quellungsgrad, als bei physiologischer Salzkonzentration. Dementsprechend muß ein Ausgleichsvolumen im oberen zylindrischen Rohr zur Ausdehnung des Geles vorgesehen werden. Auf das Filter der Vorrichtung wird die Suspension der aus gefällten Serum proteine aufgetragen und glattgestrichen. Das mit Gel gefüllte Chroma tographierohr wird solange mit gesättigter Natriumsulfatlösung gewaschen, bis kein Natriumchlorid mehr im Eluat nahweisbar ist. Danach wird ein Gradient, bestehend aus gesättigter Natriumsulfatlösung im Mischgefäß und physiologischem Puffer im Zulauf angeschlossen. Der Gradient läßt sich an das jeweilige Trennproblem anpassen. Dies gilt für die Gradien tenform, als auch dessen Zusammensetzung und darüberhinaus auch für die Ausformung des Trennrohres.

Beispiel 4: Hydrophobierung von Entsalzungsgelen für die fraktionierende Kristallisation

Zur Verbesserung der fraktionierenden Kristallisation werden zusätzlich hydrophobe Gruppen an das Entsalzungsgel gekoppelt. Hydroxypropylierter SEPHADEX® (LH20) ist entsprechend einsetzbar und führt zu anderen Prezipitationsprofilen im Vergleich zum unmodifizierten G25 SEPHADEX®. Dies trifft auch für deren Modifikation mit aliphatischen Epoxiden zu. Gelfiltration mit SEPHADEX® LH-20 in organischen Lösungsmitteln, Uppsala: Pharmacia. In analoger Weise können die Amide des Acrylamids (z. B. BioRad, Biogel P6 und IBF Trisacryl GF05, ein gelförmiges Molekularsieb auf der Basis von stabilisiertem Acrylamid, als Entsalzungsgele) mit Alkylhydrazinen bzw. Alkylaminen durch Austausch des amidischen Stickstoffes in die entsprechenden Amide und Hydrazide überführt wer den. Diese hydrophobierten Entsalzungsgele auf Acrylamidbasis werden zur fraktionierenden Kristallisation mit verbesserter Trennung eingesetzt. Zur Herstellung der Alkylhydrazide und Alkylamide wird nach bekannter Methode vorgegangen. Die verbesserte Auftrennung äußert sich in einer Erhöhung der Bandenschärfe sowie einem größeren Elutionsvolumen zwischen zwei Prezipitationsbanden im gewünschten Bereich des Elutions profiles.

Claims

1. Trennrohr
zur Auftrennung eines Substanzgemisches in einzelne Komponenten mit einem Rohr, das ein Aufgabeende und ein Entnahmeende, sowie einen Rohrquerschnitt aufweist, der zwischen Aufgabeende und Ent nahmeende konstant ist oder der sich vom Aufgabeende zum Entnahme ende hin vermindert,
mit einer Siebplatte, die im Bereich des Entnahmeendes innerhalb des Rohres angebracht ist und dort den gesamten Rohrquerschnitt ausfüllt,
mit einer Packung aus Sorptionsmaterial innerhalb des Rohres, die auf der Siebplatte abgestützt ist,
wobei zur Durchführung einer Trennoperation am Aufgabeende zuerst das aufzutrennende Substanzgemisch und daraufhin eine Flüssigkeit aufgegeben werden, die beim Durchwandern der Packung eine bezüg lich des Rohrquerschnittes nicht ebene Elutionsfront gleicher Konzen tration bildet,
dadurch gekennzeichnet, daß die Siebplatte eine von der Packung weg gerichtete Wölbung aufweist.

2. Trennrohr nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Wölbung der Siebplatte an die Form der Elutionsfront angepaßt ist.

3. Trennrohr nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Siebplatte eine konkav gewölbte Einlauffläche und eine ebene Auslauffläche aufweist.

4. Trennrohr nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Siebplatte die Frontpartie herkömmlicher Fließadaptoren ersetzt.

5. Trennrohr nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Packung im Bereich des Aufgabeendes eben ausgebildet ist und dort auf der Packung eine plane Filterplatte dicht anliegend aufliegt.

6. Trennrohr nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens ein kegelstumpfförmiger Rohrabschnitt zwischen zwei zylindrischen Rohrabschnitten angeordnet ist.

7. Trennrohr nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß verschiedene kegelstumpfförmige Rohrabschnitte unterschiedlicher Steilheit vorhanden sind.

8. Trennrohr nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Siebplatte in ein Gehäuse eingesetzt ist, das die Siebplatten wölbung stabilisiert und das in das Entnahmeende des Rohres einsetzbar ist.

9. Trennrohr nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Rohr im Bereich des Aufgabeendes zur Umgebung hin offen aus gebildet ist.

10. Anwendung eines Trennrohres nach einem der Ansprüche 1 bis 9, zur Auftrennung einer Suspension von in Serum ausgefällten Proteinen, wobei das Sorptionsmittel ein Molekularsieb ist, und wobei als Flüssig keit ein Lösungsmittelgemisch mit in der Fällungsmittelkonzentration fallendem Lösungsmittelgradienten eingesetzt wird.

11. Anwendung nach Anspruch 10, wobei das Molekularsieb ein Gel auf der Basis von Polyacrylamiden oder Polysacchariden ist.

12. Anwendung nach Anspruch 11, wobei zur Verbesserung der fraktionierenden Kristallisation zusätz lich hydrophobe Gruppen an das Gel gekoppelt sind.

13. Anwendung nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei ein Molekularsieb mit solch kleinen Poren eingesetzt wird, die zwar die Lösungsmittelmoleküle in das Innere des Molekularsiebes eindringen lassen, nicht jedoch die im Lösungsmittelgemisch gelösten auszufällenden Substanzen.

14. Anwendung nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei noch vor dem Aufbringen der zu trennenden Suspenion wenigstens die Probenauftragszone des Molekularsiebes mit dem vorgesehenen Fällungspuffer equilibriert wird.

15. Anwendung nach Anspruch 14, wobei innerhalb der Packung Komponenten der ausgefällten Proteine nach erneuter Lösung im Elutionspuffer fraktioniert ausgefällt und als Feststoff abgeschieden werden.

16. Anwendung nach einem der Ansprüche 10 bis 15, wobei die aufzutrennende Suspension vor der Aufgabe auf das Trenn rohr mit einem trockenen Entsalzungsgel vermischt wird.