WO1995014220B1 - Verfahren und vorrichtung zur trennung gelöster und ungelöster stoffgemische - Google Patents
Verfahren und vorrichtung zur trennung gelöster und ungelöster stoffgemischeInfo
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Abstract
Das Verfahren ermöglicht eine Filtration, Extraktion und Chromatographie von gelösten und ungelösten Stoffgemischen, insbesondere die Gewinnung von entsalztem Serum sowie die fraktionierende Kristallisation - auch Fällungschromatographie oder Zonenprezipitation genannt. Zur effektiven kombinierten Durchführung dieser Verfahren wurde eine Trennvorrichtung entwickelt. Sie besteht aus einem Chromatographierohr, das durch poröse wenigstens teilweise nach außen gekrümmte Endflächen in Position gehalten wird und mit einem Molekularsieb gefüllt ist. In seiner speziellen Ausbildungsform erweitert sich das Rohr nach oben trichterförmig. Die beschriebenen Trennvorrichtungen können nicht nur mit Entsalzungsgelen sondern auch mit beliebigen Chromatographiematerial betrieben werden, wodurch sich herkömmliche Filtrations-, Extraktions- und Chromatographieverfahren erheblich vorteilhafter gestalten lassen. Durch seine universelle Einsatzmöglickeit ist dies Verfahren im hohen Maße dazu geeignet, biochemische Reinigungen - insbesondere deren Eingangsschritte - effektiver zu gestalten.
Claims
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GEÄNDERTE ANSPRÜCHE
[beim Internationalen Büro am 29. August 1995 (29.08.95) eingegangen; ursprüngliche Ansprüche 4-7, 9, 10, 15, 17, 22, 25, 27-29, 33 und 34 geändert; weitere Ansprüche unverändert (5 Seiten)]
1. Die Vorrichtung zur Durchführung von Filtrationen, Extraktionen bzw. der Chromatographie ist dadurch gekennzeichnet, daß in einem Trennrohr zwischen zwei wenigstens teilweise nach außengewölbten porösen Abschlußstücken eine Trennmatrix so eingebettet ist, daß die Elutionsfront nach Durchwandern der Matrix die Austrittsfläche zum selben Zeitpunkt mit seiner maximalen Konzentration an allen Stellen durchströmt.
2. Das Trennrohr nach Anspruch 1 ist dadurch gekennzeichnet, daß es trichterförmig ausgebildet ist.
3. Das trichterförmige Trennrohr nach Anspruch 2 ist dadurch gekennzeichnet, daß es in Modulbauweise aus Kegelmantelsegmenten zusammengesetzt wird und sich deshalb dem jeweiligen Trennproblem variabel anpassen läßt.
4. Die trichterförmigen Trennrohre nach Anspruch 2 oder 3 sind dadurch gekennzeichnet, daß sie nach oben und unten durch ein zylindrisches Chromatographierohr verlängert sind. Die Tubusansatz¬ stellen sind dabei vorzugsweise stromlinienförmig ausgebildet.
5. Die Trennvorrichtungen nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4 sind dadurch gekennzeichnet, daß die Probenauftragsfläche eben ist und der Chromatographiematrix aufliegen. Das Abschlußstück für den Austritt der Elutionsfront bildet den Boden und ist nach außen gekrümmt.
6. Die Trennvorrichtung nach Anspruch 5 ist dadurch gekenn- zeichnet, daß sie einen Filter enthält der in ein Gehäuse eingepaßt ist, welches der Filter stabilisiert und das Eluat sammelt und ableitet.
7. Die Trennvorrichtungen nach Anspruch 6 ist sind so ausgebildet, daß die Gehäuse mit ihren gewölbten Filtern leicht wechselseitig als auch gegen die Frontpartie der im Handel erhältlichen Fließ- adaptoren ausgetauscht werden können.
GEÄNDERTES BLAπ (ARTIKEL 19)
8. Die Trennvorrichtung nach Anspruch 7 ist dadurch gekennzeichnet, daß in ihr ein beliebiges Chromatographiematerial verwendet werden kann.
9. Die Trennvorrichtungen nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4 sind dadurch gekennzeichnet, daß ihre Probenauftragsfläche nach außen gekrümmt ist wohingegen die Austrittsfläche der Elutionsfront eben ist.
10. Die Vorrichtung nach Anspruch 9 ist dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Filter enthält, das in ein Gehäuse eingepaßt ist, welches den Filter stabilisiert und den Auftrag zuleitet und verteilt.
11. Die Chromatographievorrichtung nach Anspruch 10 ist so ausgebildet, daß die Gehäuse mit Filtern unterschiedlicher Krümmung leicht wechselseitig sowie auch gegen die Frontteile der im Handel erhältlichen Fließadaptoren ausgetauscht werden können.
12. Die Chromatographievorrichtung nach Anspruch 11 ist dadurch gekennzeichnet, daß in ihr ein beliebiges Chromatographiematerial verwendet werden kann.
13. Die Chromatographievorrichtung nach Anspruch 12 ist dadurch gekennzeichnet, daß sie sich besonders für solche Chromatographie¬ verfahren eignet, in denen eine Verdünnung vermieden werden muß.
14. Die Trennvorrichtung nach Anspruch 5 eignet sich wegen ihrer Anordnung und Ausformung der Filter besonders für das Arbeiten im nach oben geöffnetem Zustand. Dies hat den Vorteil, daß mit dieser Vorrichtung gleichzeitig sowohl extrahiert, filtriert als auch chromatographiert werden kann.
15. Das Verfahren der fraktionierenden Kristallisation ist dadurch gekennzeichnet, daß als Trennmatrix ein Molekularsieb verwendet wird, dessen Porengröße das Fällungsmittel aber nicht die zu trennenden Substanzen ins Innere der porösen Matrix eindringen läßt und ferner dadurch, daß sie mit der Extraktion eines
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ausgefällten Stoffgemisches gekoppelt ist.
16. Das Verfahren nach Anspruch 15 ist dadurch gekennzeichnet, daß zumindest die Probenauftragzone mit dem Fällungspuffer equilibriert wird, sonst aber ohne vorgeformten Fällungsmittel- gradienten auskommt.
17. Die fraktionierende Kristallisation nach Anspruch 16 ist dadurch gekennzeichnet, daß unter Zuhilfenahme der Trennvor¬ richtung nach Anspruch 14 eine ausgefällte Stoffgemischsuspension durch Absenkung der Fällungsmittelkonzentration erheblich effektiver in einem Arbeitsschritt extrahiert, filtriert und chromatographiert werden kann.
18. Das Trennverhalten der fraktionierenden Kristallisation nach Anspruch 16 und 17 ist dadurch gekennzeichnet, daß bei zeitab¬ hängiger Senkung der Fällungsmittelkonzentration im Elutionspuffer, sich im Trennrohr ein Gradient aufbaut der systeminherent zu einer Verschärfung der Prezipitationsbanden führt.
19. Die Effektivität der fraktionierenden Kristallisation nach den Anspruch 18 läßt sich dadurch steigern, daß die aufgetragene Suspension des ausgefällten Stoffgemisches vor dem Auftragen mit trockenem Molekularsieb versetzt wird.
20. Die fraktionierende Kristallisation nach Anspruch 19 ist dadurch gekennzeichnet, daß sowohl entsalztes Serum als auch Antikörper in einem Arbeitsschritt unter Verwendung eines Entsalzungsgeles gewonnen werden.
21. Die fraktionierende Kristallisation nach Anspruch 20 ist dadurch gekennzeichnet, daß mit einer Vorinkubation des Serums bei pH 5 für mindestens 3 Stunden eventuell im Serum enthaltene Viren inaktiviert werden.
22. Das Verfahren nach Anspruch 21 ist dadurch gekennzeichnet, daß durch Verwendung gemäß Anspruch 19 eines mit guartären Aminen
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gemäß Anspruch 33 modifizierten Entsalzungsgeles die Pyrogene sowie inaktivierte Viren in der Auftragszone festgehalten werden, so daß sie durch Entfernung und Regeneration dieses Entsalzungsgeles leicht entfernt werden können.
23. Das Verfahren nach Anspruch 19 ist dadurch gekennzeichnet, daß vollständig ausgefällte Serumproteine auf ein Entsalzungsgel aufgetragen werden. Die Proteine werden dann durch Absenkung der Fällungsmittelkonzentration als Suspension im Elutionspuffer gewonnen
24. Das Verfahren nach Anspruch 19 ist dadurch gekennzeichnet, daß ausgefällte Stoffe beliebigen Ursprungs aufgetrennt werden.
25. Das Verfahren nach Anspruch 19 ist dadurch gekennzeichnet, daß ein Gemisch ausgefällter und unlöslicher Stoffe, insbesondere Fällungen von Zellhomogenaten sich ohne weitere Vorreinigung ι auftrennen lassen.
26. Die Reinigungsverfahren nach Anspruch 23, 24 oder 25 sind dadurch gekennzeichnet, daß ein Molekularsieb verwendet wird, dessen Oberfläche eine ähnlich starke Hydrophobizitat zeigt wie die zu reinigende Substanz.
27. Das Reinigungsverfahren nach dem Anspruch 26 ist dadurch gekennzeichnet, daß als Molekularsieb ein Entsalzungsgel verwendet wird, dessen Hydrophobizitat gemäß einer der Ansprüche 30, 31, 32 oder 33 auf die gewünschte Hydrophobizitat eingestellt wurde.
28. Die Reinigungsverfahren nach Anspruch 23, 24 oder 25 sind dadurch gekennzeichnet, daß ein Molekularsieb verwendet wird, dessen Oberfläche eine ähnlich starke Hydrophobizitat zeigt wie die schwer abzutrennende Begleitsubstanz.
29. Das Reinigungsverfahren nach dem Anspruch 28 ist dadurch gekennzeichnet, daß als Molekularsieb ein Entsalzungsgel verwendet wird, dessen Hydrophobizitat gemäß einer der Ansprüche 30, 31, 32 oder 33 auf die gewünschte Hydrophobizitat eingestellt wurde.
27
Folgende Epoxide steigender Hydrophobizitat finden Verwendung:
C-HgO- Epoxypropanol
C-Hj-0 Propenoxid
C.HgO- 2,3-Epoxy 2-Methyl-l-propanol C.HgO- 2 ,3-Epoxypropyl-methylether
C.HQO Butenoxid
C-Ho0 Cyclopentenoxid ö
C-H. -O» 2,3-Epoxypropyl-isopropylether C-H„0 Styroloxid
33. Eine ausreichende Gelhydrophilierung nach den Ansprüchen 22, 27 und 29 macht insbesondere bei engporigen Gelen wie Sephadex G10 und G15 sowie BioGel P2 und P4 Schwierigkeiten. Die hydrophile Modifikation solcher Gele ist deshalb dadurch gekennzeichnet, daß Ionenaustauschfunktionen eingeführt werden, deren störender Einfluß sich unter Hochsalzbedingungen nicht bemerkbar macht.
Für die Acrylamide sind dies die Austauschreaktion mit Aminosäuren: Glycin, beta-Alanin, gamma-Aminopropionsäure sowie Aminomethan- sulfonsäure und Aminoethansulfonsäure (Taurin). Außerdem sind dies die Austauschreaktionen mit den Diaminen: Ethylendiamin. 1,3-Propandiamin, 1,4-Butandiamin sowie entsrechende tertiäre Amine wie N,N-Dimethyl-N*-ethylendiamin und quartäre Amine wie (2-Aminoethyl)-trimrthylammoniumchlorid. Für die Modifikation der Entsalzungsgele auf Polysaccharidbasis eignen sich folgende Epoxide: Epoxybernsteinsäure, Epoxy tricarballylsaure und Epoxysulfonsäuren sowie 2 ,3-Epoxy-propyl- trimethylammoniumchlorid.
34. Die gemäß Anspruch 33 mit Ionenaustauschgruppen modifizierten Gele sind dadurch gekennzeichnet, daß sie unter Hochsalzbe¬ dingungen zunächst der Stabilisierung des Salzgradienten in der fraktionierenden Kristallisation dienen, bei Absenken der Ionenkonzentration dann zu einer Auftennung nach dem Ionenaus¬ tausch- und Ausschlußprinzip übergehen.
PCIYDE94/01350
2 8
IN ARTIKEL 19 GENANNTE ERKLÄRUNG
Die Singularform "Vorrichtung" in der Überschrift ist ein
Übertragungsfehler aus der Orginalvorlage. Es muß
"Vorrichtungen" sowie "Devices" heißen.
Die korrekte Übersetzung für "Entsalzen" im Abstract ist
"desalinating" .
Diese Korrekturen sind am Deckblatt des Patentes vorzunehmen.
Darüber hinaus möchten wir die Ansprüche 4, 5, 6, 7, 9, 10, 15, 17, 22, 25, 27, 28, 29, 33 und 34 ändern. Die anderen Ansprüche bleiben unverändert.
Die Einfügungen in Anspruch 22 sind Beispiel 7 entnommen und erleichtern das Verständnis dieses Anspruches.
Die sachliche Einfügung in Anspruch 34 ist ein dem Fachmann bekanntes Phänomen, wie auch aus der Literatur hervorgeht. Wir schlagen deshalb vor ein Zitat mit Erläuterung beim Stand der
Technik auf Seite 3 zwischen Zeile 9 und 10 zur Verdeutlichung einzufügen.
Alle übrigen Änderungen präzisieren die bestehenden Ansprüche und beugen damit Mißverständnissen vor.
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