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Die vorliegende Erfindung betrifft
die Verwendung eines adsorbierenden Gels, welches die Eigenschaften
der sterischen Ausschlußchromatographie
und der Affinitätschromatographie
vereint (AdSEC ("Adsorptive
Size Exclusion Chromatography")-Gel).
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Das Prinzip eines AdSEC-Gels ergibt
sich aus der Verschmelzung zweier chromatographischer Vorgehensweisen:
Ausschluß nach
Größenkriterien und
Affinität
für den
Erhalt von Trägermaterialien, welche
deren interessantesten Eigenschaften in sich vereinen.
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Die SEC-Chromatographie (Gelfiltration)
ermöglicht
die Abtrennung von Molekülen
in Abhängigkeit
einzig von der sterischen Behinderung bei ihrer passiven Diffusion
in einem Molekularsieb (Gel). Die größten Moleküle können nicht durch die vernetzte Matrix
hindurchtreten und werden infolgedessen schneller von der Säule ausgeschlossen.
Diese Vorgehensweise weist die Besonderheit auf, daß sie keine
Wechselwirkungen zwischen dem Träger
und den Molekülen
aufweist und somit vergleichsweise wenig empfindlich gegen die biochemischen
Bedingungen (pH, Ionenstärke)
der Lösung
ist. Hinwiederum sind aufgrund ihres Diffusionsprinzips die beschränkenden
Faktoren bei ihrer Verwendung im wesentlichen eine lange Handhabungszeit
(aufgrund der Verwendung kleiner Durchsätze), sowie ein relativ beschränkter Einsatz
von Proben (1 bis 5% des Volumens der Säule).
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Die Affinitätschromatographie beruht auf
molekularen Wechselwirkungen zwischen dem Träger (Matrix mit aufgepfropften
Affinitätsliganden)
und den abzutrennenden Molekülen.
Unter diesen Affinitätsliganden
stellen die im Jahre 1975 von Porath et al. (Nature, 1975, 21, 598–599), eingeführten immobilisierten
Metallionen ein Trennungsverfahren dar, das auf den Wechselwirkungen
(Koordinationsverbindungen) zwischen den in Lösung befindlichen Biomolekülen und
auf einem Träger
immobilisierten Metallionen beruht; Zn(II)-, Cu(II)-, Ni(II)- und
Co(II)-Ionen sind die am häufigsten
verwendeten. Man spricht hierbei von Affinitätschromatographie an immobilisierten
Metallionen (IMAC).
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Die gemeinsame Anwendung der Prinzipien von
sterischer Ausschluß-
und Affinitätschromatographie
(AdSEC) wurde von Porath et al. (Int. J. of Bio-Chromatogr., 1997,
3, 9–17)
erörtert.
Diese Autoren haben gezeigt, daß Iminodiessigsäurederivate von
Dextran, welche als Affinitätsligand
Metallionen tragen, einen sterischen Ausschluß ermöglichen und in der Lage sind,
Lösungen
aufgrund ihrer Adsorptions- und Affinitätseigenschaften auf wirksame
Weise zu konzentrieren. Diese Autoren haben gezeigt, daß eine AdSEC-Gel-Säule mit
einem Volumen von 5 ml in der Lage war, in einem einzigen Arbeitsschritt
einen hohen Prozentanteil von Verbindungen mit einem Molekulargewicht
von zwischen 5 kDa und 50 kDa zu fixieren und sie ungefähr 1000fach
zu konzentrieren.
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Solche Träger ermöglichen es, auch sehr kleine
Moleküle
(mit einer Affinität
für den
aufgepfropften Liganden) mit großen Durchsätzen und Volumina (die bei
der Gelfiltration nicht möglich
sind) zu adsorbieren. Andererseits kann bei der Synthese des adsorbierenden
Gels die Schwelle der Zugänglichkeit
zum Affinitätsliganden
während
der Synthese des Gels in Abhängigkeit
von der Größe des zu
entfernenden bzw. zu reinigenden Biomoleküls moduliert werden.
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Von terminaler Niereninsuffizienz
sind gegenwärtig
in Frankreich 22000 Personen betroffen, von denen 20000 mit iterativer
Hämodialyse
behandelt werden. Nur 1800 jährlich
dürfen
auf eine Transplantation hoffen, wobei nicht vergessen werden sollte,
daß ein
Viertel von diesen im Verlauf von fünf Jahren infolge einer Abstoßung zur
Hämodialyse
zurückkehrt,
um auf eine erneute Transplantation zu warten.
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Die Überlebensdauer des Urämiepatienten kann
bei Zusammenwirken aller Verfahren mehr als 25 Jahre betragen, falls
er nicht von einem schweren Herz-Kreislaufleiden betroffen ist.
In diesem Fall ändert
sich die Qualität
seiner Lebenserwartung im Lauf der Jahre tiefgreifend aufgrund von
osteoartikulären Komplikationen
der terminalen Urämie,
bei der im ersten Stadium erosive Arthropathien als Folge von Ablagerungen
von β2-Mikroglobulin
(β2-M) beschrieben
sind.
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Der Mechanismus des Auftretens dieser
Arthropathien beginnt ab dem Zeitpunkt des Auftretens einer Niereninsuffizienz,
die für
eine Akkumulation von β2-Mikroglobulin
verantwortlich ist. Dieses Protein mit einem Molekulargewicht von
11800 Da sammelt sich im Lauf der Jahre im Organismus an und lagert
sich selektiv an den Bandscheiben der Zervikalwirbelsäule, den
Schultern, Hüften
und Handgelenken an. Ablagerungen im Herzen und Verdauungstrakt
sind berichtet worden. Diese Ablagerungen verspröden das Gelenk und den angrenzenden
Knochen bis hin zur vollständigen
Zerstörung
des Gelenks. Man beobachtet hierbei ein Zerdrücken der Wirbelkörper, das
zu einer medullären
Kompression mit Verlust der Kontrolle über die vier Extremitäten, irreversiblen
Gelenkluxationen, einem Griffverlust an den Händen, Pseudofrakturen der Hüfte führen kann. Des
weiteren wurde das Zusammen drücken
von Nerven in Kanälen,
wie das Karpaltunnelsyndrom beobachtet.
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Diese Komplikationen führen den
Urämiepatienten
unwiderruflich zur Invalidität
und Bettlägerigkeit,
welche von den klassischen Dialyseverfahren nicht verhindert werden
können.
Eine Transplantation gestattet eine Stabilisierung dieser Läsionen.
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Um diese Komplikationen effektiv
zu verhindern, ist es wichtig, die verunreinigenden Bestandteile
im Blut, insbesondere β2-Mikroglobulin,
auf wirksame Weise reinigen zu können,
die tagtäglich
vom Organismus synthetisiert werden und bei Dialysepatienten durch
die schadhaften Nieren entweder gar nicht oder nicht in ausreichendem
Maße ausgeschieden
werden.
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Die Reinigung dieser verschiedenen
Biomoleküle
kann nur an den künstlichen
Membranen bei der Dialyse stattfinden, die gegenwärtig trotz
einer Reinigung durch Filtration und nichtspezifische Membranadsorption
einen ungenügenden
Wirkungsgrad besitzen.
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Bei den bestehenden Vorgehensweisen
zum Entfernen von Biomolekülen,
darunter dem β2-Mikroglobulin,
handelt es sich gegenwärtig
um drei Typen:
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1. Entfernung von Biomolekülen durch
Hämodialyse
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Die Hämodialyse ist eine Verfahrensweise, welche
für Personen
bestimmt ist, die an einer partiellen oder totalen Niereninsuffizienz
leiden (1). Sie besteht
in einer extrakorporalen Behandlung des Blutes, welche mit Hilfe
eines Vorgangs unter Verwendung einer Membran die gleichen Funktionen wie
die Niere bewirkt. Der wesentliche Bestandteil des Hämodialysators
(1) ist eine Austauschermembran, auf deren beiden Seiten
das Blut des Patienten und das aus dem Hämodialysegenerator (2)
stammende Dialysat gegenläufig
zirkulieren. Diese Vorgehensweise ermöglicht das Reinigen von Verbindungen
mit geringem Molekulargewicht, welche das Blut verunreinigen, wie
Harnstoff, Aminosäuren,
Mineralsalze, die normalerweise durch die Niere ausgeschieden werden.
Im Fall von serischem β2-Mikroglobulin
besitzen die verschiedenen, derzeit verwendeten Dialysemembranen
zwei antagonistische Eigenschaften:
- – Einfangen
von β2-Mikroglobulin
durch nichtspezifische Adsorption an der Membran,
- – Erzeugung
von β2-Mikroglobulin
mittels Ablösen dieses
Moleküls,
das im Histokompatibilitäts-Hauptkomplex
vom Typ 1 nicht-kovalent an die Oberflächen der kerntragenden Blutzellen
gebunden ist.
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Der Umfang der Erzeugung von β2-Mikroglobulin
ist eines der Kriterien, welche die Biokompatibilität von Membranen
begrenzen. Aufgrund dieser beiden antagonistischen Eigenschaften
führen
daher bestimmte Membranen bei einer Hämodialysesitzung global zu
einer Erhöhung
der β2-Mikroglobulin-Konzentration,
während
wieder andere sie senken.
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Ungeachtet der Art der verwendeten
Membranen sind diese Ergebnisse jedoch über Zeiträume von mehr als einem Jahr
ausgeglichen. So wurde etwa festgestellt, daß der Anteil von β2-Mikroglobulin im
Plasma von Urämiepatienten
nach fünfzehn
Monaten Dialyse unveränderlich
erhöht
war, so daß er zwischen
40 und 50 mg/l (gegenüber
1 bis 2 mg/l bei gesunden Patienten) lag. Solche Biokompatibilitätsprobleme
finden sich auch mit anderen Biomolekülen.
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2. Entfernung
der Biomoleküle
mittels Hämofiltration
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Einmal pro Monat durchläuft der
Dialysepatient eine Ultrafiltrationssitzung. Das verwendete Modul
(1) besitzt einen höheren
Cutoff-Schwellwert als bei der Hämodialyse
(mittlere Schwelle von 40 kDa) und ermöglicht die Entfernung durch
Ausfiltrieren kleiner Moleküle
aus dem Plasma, darunter der kleinsten Proteine wie etwa β2-Mikroglobulin
(2). Während einer
Ultrafiltrationssitzung wird der Verlust an Plasmawasser durch eine äquivalente
Zuführung von
physiologischer Flüssigkeit
(3) ausgeglichen.
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Die qualitativen Resultate im Hinblick
auf die Entfernung von β2-Mikroglobulin
(Reinigung und Erzeugung dieses Moleküls durch die Ultrafiltrationsmembranen)
sind den bei einer Hämodialyse
erzielten ähnlich.
Es findet sich etwa ein starker Einfluß der Art der Membran und der
Dauer der Hämofiltration. Obgleich
bestimmte Membranen über
5 Stunden (eine Sitzung) mehr β2-Mikroglobulin
entfernen zu können
scheinen, wird auch ein Ausgleich der Resultate im Verlauf der Zeit
angetroffen. In quantitativer Hinsicht scheint es, daß ca. 50%
des serischen β2-Mikroglobulins pro
Hämofiltrationssitzung
entfernt werden. Dennoch, auch wenn diese Vorgehensweise wirksamer
für die
Reinigung von β2-Mikroglobulin
als die Hämodialyse
ist, so bleibt sie dennoch ungenügend,
um das Auftreten der Krankheit zu verhindern und zu verlangsamen.
Des weiteren weist diese Vorgehensweise den Nachteil auf, daß zahlreiche
weitere Proteine als β2-Mikroglobulin
entfernt werden, da das Ultrafiltrat endgültig entfernt wird.
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3. Kopplung
von Säule
und Hämodialysator
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Dieses Verfahren wurde als Alternative
zu den üblichen
Hämodialyse-
und Ultrafiltrationsverfahren vorgestellt (Nakazawa et al., Int.
J. Artif. Organs, 1994, 17, 203–208).
Es besteht in einer seriellen Adsorption der Biomoleküle an einem
porösen
Cellulosegel (350 ml Adsorptionsmittel), gefolgt von einer klassischen
Hämodialyse.
Es wird beschrieben, daß das
Gel im Fall von β2-Mikro globulin
eine theoretische Kapazität
für β2-Mikroglobulin
von 1 mg pro ml Adsorptionsmittel besitzt. Die erzielten Resultate
sind die besten in der Literatur beschriebenen, da es dieses System
bei einem Patienten, dessen anfänglicher
Anteil an β2-Mikroglobulin
30 mg/l betrug, ermöglichte,
die β2-Mikroglobulin-Konzentration
nach 6monatiger Behandlung auf abschließend 10 mg/l zu reduzieren.
Die Autoren haben bei ihren Patienten eine Verbesserung der Retardierung
des Auftretens von Amyloidablagerungen in 2 von 3 Fällen nach
der Therapie gezeigt.
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Dennoch beobachtet man auch hier
nach der Behandlung einen Konzentrationsabfall bestimmter Moleküle im Serum
("retinol binding
protein", Lysozyme).
Dieses Phänomen
läßt sich
dem direkten Durchtritt des Blutes durch das Adsorptionsmittel zuschreiben,
das Biokompatibilitätsprobleme
erzeugen kann.
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Somit weisen die bereits vorhandenen
Vorgehensweisen zum Entfernen von β2-Mikroglobulin und anderen
Biomolekülen
hauptsächlich
zwei Einschränkungen
auf:
- – die
Biokompatibilität
der Träger,
insbesondere für
die Erzeugung von β2-Mikroglobulin,
d. h. das Gleichgewicht zwischen der nicht-spezifischen Adsorption
an der Membran und der Erzeugung von β2-Mikroglobulin beim Durchtritt
der Zellen bei ihrem Kontakt; dieses Gleichgewicht bestimmt die β2-Mikroglobulinmenge,
die bei einer Hämodialyse-
oder Hämofiltrationssitzung
tatsächlich
entfernt wird,
- – die
Spezifität
des Substrats: die Verfahrensweisen der Hämofiltration und der nicht-spezifischen Bindung
mit an Gele gekoppelten Liganden führen zu einr unerwünschten
Entfernung weiterer serischer Moleküle.
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Eine Vorrichtung zum Entfernen von β2-Mikroglobulin
oder jeglichem anderen Biomolekül
sollte daher eine zufriedenstellende (quantitative) Entfernung mit
einer spezifischen (qualitativen) Entfernung des betreffenden Moleküls verbinden.
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Bei der vorliegenden Erfindung haben
sich die Erfinder daher die folgende Aufgabe gestellt:
- – die
Verwendung in einer Vorrichtung zum Entfernen von Biomolekülen eines
adsorbierenden Gels, welches die Eigenschaften der sterischen Ausschlußchromatographie
und der Affinitätschromatographie
vereint, wobei das Gel im wesentlichen aus einer Polysaccharidmatrix
besteht, auf die ein Polymer aufgepfropft ist, das an einen Affinitätsliganden
(AdSEC-Gel, für "Adsorptive Size Exclusion
Chromatography")
gekoppelt ist und einen zwischen 2 kDa und 60 kDa liegenden, einstellbaren
Cutoff-Schwellwert aufweist,
- – die
Verwendung eines AdSEC-Gels zum Abtrennen und Reinigen von Biomolekülen mit
einem Molekulargewicht von zwischen 2 kDa und 60 kDa,
- – eine
Vorrichtung zum Reinigen von Biomolekülen mit einem Molekulargewicht
von zwischen 2 kDa und 60 kDa, mit einem gegebenenfalls stromaufwärts von
und in Reihe mit einem Dialysemodul angeordneten Ultrafiltrationsmodul,
welches eine Säule
mit AdSEC-Gel mit einem zwischen 2 kDa und 60 kDa liegenden, einstellbaren
Cutoff-Schwellwert aufweist, wobei die Säule vom Ultrafiltrationsmodul
abzweigend angebracht ist; diese Vorrichtung gestattet eine Eliminierung
der Biokompatibilitätsprobleme
und ein spezifisches Entfernen der gewünschten Biomoleküle,
- – eine
Vorrichtung zum Reinigen von Biomolekülen mit einem zwischen 2 kDa
und 60 kDa liegenden Gewicht unter Verwendung einer Säule mit AdSEC-Gel
mit einem zwischen 2 kDa und 60 kDa liegenden, einstellbaren Cutoff-Schwellwert, wobei
die Säule
gegebenenfalls von einem Filtrationssystem abzweigend angebracht
ist; diese Vorichtung gestattet eine Abtrennung von normalen Biomolekülen und von
beispielsweise durch Glycolisierung modifizierten Biomolekülen.
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In einer vorteilhaften Ausführungsform
handelt es sich bei der Polysaccharidmatrix um Agarose oder eine
auf Basis eines Agarosederivats, das Polymer kann Polyethylenglycol
(PEG) oder Polypropylenglycol (PPG) sein, und der Affinitätsligand
kann beispielsweise ein an Metallionen gekoppelter Metallchelatbildner,
ein Protein, ein Peptid, ein Enzymsubstrat oder ein Enzyminhibitor
sein.
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Bei einer bevorzugten Ausführungsform
besteht das adsorbierende Gel einer Matrix auf Basis eines Agarosederivats,
auf die Polyethylenglycol aufgepropft ist, welches an Iminodiessigsäure gekoppelt ist,
welche wiederum an Metallionen, beispielsweise Kupferionen gekoppelt
ist; dieser Komplex wird als IMAdSEC-Gel ("Immobbilized Metal Ion Adsorptive Size
Exclusion Chromatography")
bezeichnet. Bei einer ebenfalls bevorzugten Ausführungsform beträgt der Cutoff-Schwellwert
des adsorbierenden Gels 20 kDa, was somit die Entfernung bzw. Reinigung
von Biomolekülen
mit einem Molekulargewicht von weniger als 20 kDa, insbesondere
serischem β2-Mikroglobulin,
ermöglicht.
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Das Reinigungssystem gemäß der vorliegenden
Erfindung weist die Besonderheit auf, daß es das adsorbierende Gel
für das
zu entfernende Biomolekül
von dem zu reinigenden Kreislaufsystem abzweigend anordnet. Bei
der Blutreinigung besteht somit zu keinem Zeitpunkt Kontakt zwischen
dem Gel und den Blutbestandteilen, so daß Probleme der Biokompatibilität (z. B.
Erzeugung von (β2-Mikroglobulin durch
Kontakt der kerntragenden Blutzellen) oder der Hämolyse der Zellen in Kontakt
mit dem Gel vermieden sind.
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Des weiteren wird im Gegensatz zu
anderen, gegenwärtig
verwendeten Vorgehensweisen die Reinigung des zu entfernenden bzw.
zu reinigenden Biomoleküls
mittels eines Liganden durchgeführt,
der nur dieses Molekül
zurückhält. Diese
Spezifität
wird mit Hilfe der Doppelsiebung durch die Ultrafiltrationsmembran
(welche beispielsweise die Blutbestandteile und die großen Moleküle im Serum
zurückhält) und des
AdSEC-Gels erhalten, wodurch weiteren Molekülen mit einer Affinität für den Affinitätsliganden,
deren Größe aber über dem
Cutoff-Schwellwert des Gels liegt, der Zugang zum Liganden verwehrt
ist.
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Das weitere Interesse der Verwendung
dieses AdSEC-Gels
liegt in seiner Regenerationsfähigkeit.
Wenn beispielsweise ein Metall als Affinitätsligand verwendet wird, kann
dieses durch eine EDTA-Lösung
cheliert werden, die es ermöglicht,
jegliches an dem Gel adsorbierte Molekül abzulösen, wodurch eine Säuberung
des Gels, seine Regenerierung durch eine neue Metallbestückung und
seine Sterilisierung ermöglicht
werden.
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Das erfindungsgemäße Entfernungssystem kann beispielsweise
im Rahm einer Nierendialyse eingesetzt werden; in diesem Fall besteht
ein zusätzlicher
Vorteil im Zusammenhang damit, daß die durch Passage über das
AdSEC-Gel gereinigte
Fraktion zu dem Kranken zurückkehrt,
wodurch Verluste an weiteren, im Blut vorhandenen Bestandteilen
beschränkt werden.
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Abgesehen von den obenstehenden Maßnahmen
weist die Erfindung noch weitere Maßnahmen auf, die sich aus der
nachfolgenden Beschreibung ergeben, die sich auf Beispiele sowie
auf die beigefügten
Zeichnungen bezieht. Es zeigt:
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1 das
allgemeine Schema der Nierendialyse; (1) Hämodialysator,
(2) Hämodialysegenerator,
(3) Pumpe,
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2 zeigt
das Schema einer Hämofiltration mittels
Ultrafiltration; (1) Hämofilter,
(2) Hämodialysegenerator,
(3) physiologische Flüssigkeit,
(4) Pumpe,
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Fig. 3 zeigt
Chromatographien an Metallionen (Kupfer), die auf 3 Geltypen immobilisiert
sind: A Sepharose® 4B-IDA-Kupfer, Peak 1:
nicht-adsorbierte Proteine; Peak 2: Elution bei pH-Wert
6,0; Peak 3: Elution bei pH-Wert 5,0; Peak 4:
Elution bei pH-Wert 4,0; Peak 5: Elution bei pH-Wert 3,0;
Peak 6: EDTA 25 mM. B Novarose® -IDA-Kupfer,
Peak 1: nicht-adsorbierte Proteine; Peak 2: Elution
bei pH-Wert 6,0; Peak 3: Elution bei pH-Wert 5,0; Peak 4:
Elution bei pH-Wert 4,0; Peak 5: Elution bei pH-Wert 3,0; Peak 6:
EDTA 25 mM. C Novarose®-PEG/IDA-Kupfer (IMAdSEC),
Peak 1: nicht-adsorbierte Proteine; Peak 2: Elution
bei pH-Wert 6,0; Peak 3: Elution bei pH-Wert 5,0; Peak 4:
Elution bei pH-Wert 4,0; Peak 5: Elution bei pH-Wert 3,0 (1. Peak);
Peak 5: Elution bei pH-Wert 3,0 (2. Peak); Peak 6:
EDTA 25 mM,
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Fig. 4 zeigt
die elektrophoretische Analyse der Fraktionen, die durch die in 3 dargestellte Chromatographie
abgerennt wurden; die Ziffern entsprechen den durch die Chromatographie
von 3 abgetrennten Fraktionen; A Sepharose® 4B-IDA-Kupfer. B Novarose®-IDA-Kupfer. C Novarose®-PEG/IDA-Kupfer
(IMAdSEC). Diese Figur zeigt die Spezifität des IMAdSEC-Gels für β2-Mikroglobulin
im Verhältnis
zu zwei weiteren Geltypen,
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5 zeigt
die massespektrometrische Analyse der Proteinzusammensetzungen des
Ausgangs-Ultrafiltrats und der auf IMAdSEC-Gel zurückgehaltenen
Fraktion. A (I) Spektrum des Ultrafiltrats, (II)
Deconvolution des Spektrums (a) Berechnung der Masse von β2-Mikroglobulin
(b) Berechnung der Masse von Albumin. B (I)
Spektrum der gereinigten Fraktion, (II) Deconvolution des
Spektrums, und Berechnung der Masse von β2-Mikroglobulin,
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6 zeigt
die Leistungsfähigkeit
des IMAdSEC-Gels für β2-Mikroglobulin,
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7 zeigt
die abzweigende Anordnung eines Filtrationsmoduls der erfindungsgemäßen Reinigungsvorrichtung;
(1) Ultrafiltrationsmodul, (2) IMAdSEC-Gel enthaltende
Säule,
(3) Pumpen, (4) Ultrafiltrat,
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8 zeigt
die Leistungsfähigkeit
der in 7 dargestellten
Vorrichtung zum Entfernen von β2-Mikroglobulin
aus einem Ultrafiltrat eines Urämiepatienten,
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9 zeigt
die elektrophoretische Analyse der Fraktionen, die durch die in 8 dargestellte Chromatographie
abgetrennt wurden; 1: Ultrafiltrat; 2: 15 min
Verlauf über
das IMAdSEC-Gel; 3: 30 min Verlauf über das IMAdSEC-Gel; 4:
120 min Verlauf über
das IMAdSEC-Gel; 5: bei pH-Wert 5,0 eluierte Fraktion; 6:
bei pH-Wert 4,0 eluierte Fraktion; 7 bei pH-Wert 3,0 eluierte
Fraktion; 8: mit EDTA eluierte Fraktion, 9: Proteinstandard,
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10 zeigt
ein Hämodialysesystem
mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung;
(1) Hämofilter,
(2) Hämodialysator,
(3) IMAdSEC-Säule,
(4) Hämodialysegenerator,
(5) Blutpumpe und (6) Ultrafiltrationspumpe.
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BEISPIEL 1
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Bestimmung der Spezifität und der
Leistungsfähigkeit
eines IMAdSEC-Gels: (Novarose®-PEG/IDA-Kupfer) für β2-Mikroglobulin
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1. Synthese des Gels Novarose®-PEG/IDA-Kupfer:
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Schritt 1: Kopplung von
PEG und Erzeugung des Cutoff-Schwellwerts
des Gels:
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10 g Novarose® Act
High 100/40 (INOVATA, Bromma, Schweden), vorausgehend getrocknet durch
Saugen, werden in 5 ml Na2CO3 1
M, pH > 12 und 5 ml
vollentsalztem Wasser aufgenommen. Man gibt 5 ml Na2CO3 1 M, pH > 12,
5 ml vollentsalztes Wasser und 30 ml NH2-PEG-NH2 10% in Na2CO3 1 M, pH > 12
zu. Die Mischung wird bei Raumtemperatur (22°C) je nach dem gewünschten
Cutoff-Schwellwert 1 bis 24 h lang unter schwachem Rühren gehalten
(diese Zeitspanne beträgt
4 h für
einen Cutoff-Schwellwert von 20 kDa, den für β2-Mikroglobulin gewünschten
Schwellwert).
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Schritt 2: Kopplung des
Liganden: Iminodiessigsäure (IDA).
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Das in Schritt 1 erhaltene Gel wird
auf einem Sinterteil (durch Saugen) mit einer Lösung von vollentsalztem Wasser
gespült.
Es wird erneut in einer Lösung
suspendiert, welche 15 ml Na2CO3 1
M , pH > 12, 15 ml
vollentsalztes Wasser und 10 ml einer Lösung von 10%igem IDA in Na2CO3 1 M, pH > 12 enthält. Die
Mischung wird bei Raumtemperatur (22°C) 48 h lang unter schwachem
Rühren
gehalten. Das IMAdSEC-Gel wird auf einem Sinterteil aufeinanderfolgend
mit vollentsalztem Wasser, einer Natronlösung 1 M, vollentsalztem Wasser,
einer Salzsäurelösung 0,1
M, daraufhin mit vollentsalztem Wasser gespült. Das auf diese Weise erhaltene
Gel wird bei 4°C
in einer 20%igen Ethanollösung
bis zu seiner Verwendung aufbewahrt.
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Schritt 3: Kopplung der
Metallionen (Kupfer Cu II-Ionen):
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Die Metallbestückung wird unter Verwendung
einer wäßrigen Kupfersulfatlösung 50
mM unter klassischen Bedingungen durchgeführt.
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2. Herstellung
von biologischen Lösungen
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Die Produkte stammen aus der Hämofiltration
von Blut bei einer Ultrafiltrationssitzung im Rahmen der Behandlung
von Urämiepatienten
(2). Es werden Ultrafiltrate
(pH 7,2, 13 mS/cm) verwendet, deren (32-Mikro globulin-Konzentration
je nach Patient von 7 bis 20 mg/l variiert.
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3. Spezifität des Gels
Novarose®-PEG/IDA-Kupfer
für β2-Mikroglobulin
bezogen auf gels sans tamisage Sepharose ®4B-IDA-Kupfer
und Novarose®-1 DA-Kupfer
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BETRIEBSWEISE:
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Es wurden 3 Gels getestet: Sepharose®4B-IDA-Kupfer,
Novarose®-IDA-Kupfer (IMAC-Gels)
und Novarose®-PEG/IDA-Kupfer (IMAdSEC-Gel),
auf ihre Leistungsfähigkeit
zum Adsorbieren der Moleküle
des Ultrafiltrats eines Urämiepatienten.
Das Gel Sepharose® 4B-IDA wurde gemäß dem von
Sundberg und Porath (J. Chromatogr., 1974, 90, 87–98) beschriebenen
Protokoll hergestellt. Das Gel Novarose®-IDA resultiert aus
dem gleichen Protokoll wie dem oben unter Punkt 1 für die Synthese
des IMAdSEC-Gels beschriebenen, wobei nur der zweite und dritte
Schritt durchgeführt
wurden (keine vorherige Aktivierung des Gels mit PEG). 2 ml Gel
werden in eine Säule
(Durchmesser 1 cm) appliziert, und eine Niederdruckchromatographie
(1 ml/min) durchgeführt.
Es werden 10 ml Ultrafiltrat eines Patienten, dessen (β2-Mikroglobulin-Konzentration
20 μg/ml
beträgt,
auf jedem der 3 verschiedenen Gels im geschlossenen Kreislauf über 20 min
eingeleitet. Äquilibrierung
und Spülen
einer jeden Säule
werden nach Adsorption des Ultrafiltrats mit einem Puffer MMA pH 7,0
(MMA = MOPS, MES, Actat, jeweils 25 mM) durchgeführt. Es wird mit einem diskontinuierlichen, abnehmenden
pH-Gradienten (Puffer, MMA 25 mM, pH 6,0, dann pH 5,0, dann pH 4,0
und Glycin 25 mM bei pH 3,0) eluiert, daraufhin mit einer EDTA-Lösung (50
mM) zum Ablösen
von Kupfer. Der Gehalt an Proteinen bei der Chromatographie wird
durch durch Ablesen der optischen Dichte (λ = 280 nm) mit einem am Austritt
aus der Säule
angeordneten Detektor gemessen. Ein Assay des (β2-Mikroglobulins wird mit einem
Immunassay (polyklonaler Kaninchen-anti-human-(β2-Mikroglobulin-Anti körper, Dako,
Dänemark) unter
Verwendung einer Nephelometrie-Apparatur (Beckman, USA) durchgeführt. Die
verschiedenen Fraktionen werden mittels SDS-PAGE-Elektrophorese
gemäß dem von
Laemmli (Nature, 1970, 227, 680–685)
beschriebenen Protokoll und Einfärben
der Proteine mit Silbernitrat analysiert. Nach Entsalzen und Konzentrieren
werden die Fraktionen mittels Massenspektrometrie analysiert (ESI-MS-Verfahren für "ElectroSpray Ionisation
Mass Spectrometry"), dessen
Empfindlichkeit für
eine Bestimmung der Massung fast auf ein Dalton genau eine Identifizierung
der Moleküle
gestattet.
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RESULTATE:
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- – Die
Chromatographie über
das Gel Sepharose® 4B-IDA-Kupfer (3A)
zeigt, daß wenn
das ß2-Mikroglobulin
eine hohe Affinität
für das
chelierte Kupfer besitzt, sein Eluieren in den gleichen Anteilen
wie denen von Albumin stattfindet (4A).
Alle Proteine des Ultrafiltrats werden an dem Gel adsorbiert, das somit
keine Spezifität
für ß2-Mikroglobulin
besitzt.
- – Die
Chromatographie über
das Gel Novarose®-IDA-Kupfer (3B) zeigt ebenfalls, daß dieser Geltyp
die Adsorption aller Proteine des Ultrafiltrats ermöglicht (4B). Seine Kupferkapazität, die geringer
als diejenige des Sepharose®-4B-IDA ist, resultiert
wiederum in Elutionen von Proteinen bei dem diskontinuierlichen
pH-Gradienten, anders
als das Gel Sepharose®4B-IDA (4B versus
4A). Wie dieses letztere stellt es keine Spezifität für ß2-Mikroglobulin
zur Verfügung
(4B).
- – Die
Chromatographie über
das Gel Novarose®-PEG/IDA-Kupfer wiederum
gestattet die Adsorption einzig von ß2-Mikroglobulin aus dem Ultrafiltrat
des Patienten. Sein Eluieren findet bei einem pH-Wert von 3,0 mit
zwei deutlichen Peaks statt (4C).
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Bei den drei Chromatographietypen
bestätigen
die Nephelometrieanalysen das vollständige Verschwinden von β 2-Mikroglobulin
aus der Ultrafiltratfraktion, die über die 3 Geltypen geleitet
wurde, und seine Elution aus der Säule.
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Die ESI-MS-Analyse zeigt, daß die Chromatographie über IMAdSEC-Gel
es gestattet, von einer Fraktion bestehend aus einer Ausgangsmischung: Albumin
+ β2-Mikroglobulin,
zu einer bei pH-Wert 3,0 eluierten Fraktion zu gelangen, die einzig β2-Mikroglobulin
enthält
(5A gegenüber 5B).
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Diese Resultate zeigen die Affinität von (β2-Mikroglobulin
für den
Liganden (cheliertes Metall, hier: Kupfer) und die durch das molekulare
Sieben (PEG-Kopplung) des IMAdSEC-Gels zur Verfügung gestellte Spezifität im Vergleich
mit den klassischen IMAC-Gels.
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4. Leistungsfähigkeit
des Gels IMAdSEC-Kupfer für β2-Mikroglobulin
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BETRIEBSWEISE:
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50 ml Ultrafiltrat von einem Urämiepatienten, enthaltend
350 μg (32-Mikroglobulin
(bzw. eine (32-Mikroglobulin-Konzentration
von 7 μg/ml)
zirkuliert im geschlossenen Kreislauf 150 min lang über 0,65
ml IMAdSEC-Gel unter den gleichen chromatographischen Bedingungen
wie zuvor (Durchsatz = 1 ml/min). Es wird direkt bei pH 4,0 eluiert
(6).
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RESULTATE
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Nach 150 min beträgt die Konzentration an (β2-Mikroglobulin,
gemessen durch Nephelometrie, 2,3 μg/ml, d. h. eine Restmenge an
(β2-Mikroglobulin von
115 μg.
Folglich wurden 235 μg
(β2-Mikroglobulin an
den 0,65 ml Gel fixiert, was einer Fixierungsleistung des Gels IMAdSEC- Kupfer von 360 μg/ml entspricht.
Die SDS-PAGE- und ESI-MS-Analyse
der Fraktionen wurde gemäß der vorausgegangenen
Beschreibung durchgeführt.
Die bei pH-Wert 4,0 eluierte Menge an β2-Mikroglobulin beträgt ca. 180 μg anstelle
der erwarteten 235 μg.
Die Differenz ist erklärbar durch
das Nichtvorliegen der Messung der Spülungs- und EDTA-Fraktionen, die wiederum β2-Mikroglobulin
enthalten können.
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Diese Resultate deuten darauf hin,
daß angesichts
dieser Leistungsmerkmale und dieser Spezifität für β2-Mikroglobulin eine Säule mit 500 bis 750 ml IMAdSEC-Gel-Kupfer es gestatten
würde,
250 mg ß2-Mikroglobulin
zu entfernen, eine Menge, die 5 Litern Blut mit einer β2-Mikroglobulin-Konzentration von
50 mg/l entspricht.
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BEISPIEL 2
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Abtrennung und Reinigung
von β2-Mikroglobulin
mit einer Vorrichtung mit Kopplung eines Ultrafiltrationsmoduls
und einer IMAdSEC-Säule
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BETRIEBSWEISE
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Es wird die in 7 dargestellte Anordnung verwendet. Das
verwendete Ultrafiltrationsmodul (1) besteht aus 100 Hohlfasern
aus Polysulfon aus einem handelsüblichen
Ultrafiltrationsmodul des Modells Fresenius F80.
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Es werden 50 ml Ultrafiltrat eines
Urämiepatienten
(β 2-Mikroglobulin-Konzentration
= 7 μg/ml) im
geschlossenen Kreislauf 3 h lang über die Anordnung aus Mini-Ultrafiltrationsmodul/Säule mit
IMAdSEC-Gel (0,65 ml IMAdSEC-Gel) geleitet. Die Chromatographiebedingungen
sind diejenigen von Beispiel 1, d. h.: Puffer, MMA 25 mM, pH 6,0,
dann pH 5,0, dann pH 4,0 und Glycin 25 mM bei pH 3,0, darauf hin
EDTA 50 mM zum Eluieren des auf dem Gel chelierten Kupfers.
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Nach 3 h wird die β2-Mikroglobulin-Konzentration
im Speicher mittels Nephelometrie gemessen.
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RESULTATE
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Man gelangt von einer β2-Mikroglobulin-Konzentration
von 7 μg/ml
(bzw. einer Ausgangsmenge von 350 μg) zu ca. 1 μg/ml (50 μg β2-Mikroglobulin verbleibend).
Folglich wurden ca. 300 μg ß2-Mikroglobulin
auf den 0,65 ml IMAdSEC-Gel fixiert, einer Fixierungskapazität des IMAdSEC-Gels für β2-Mikroglobulin
von 461 μg/ml
entspricht.
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Die ESI-MS- (8) und SDS-PAGE-Analyse (9) der Fraktionen zeigt, daß das β2-Mikroglobulin
auf spezifische Weise von dem IMAdSEC-Gel adsorbiert wurde. Es wurde
in zwei Hauptfraktionen bei pH 4,0 und pH 5,0 eluiert.
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Diese Resultate deuten darauf hin,
daß das IMAdSEC-Gel für die Abtrennung
von Biomolekülen und
ihren Isoformen wie z. B. normalem β2-Mikroglobulin und glycosyliertem β2-Mikroglobulin
von Nutzen sein könnte.