DE4440805A1

DE4440805A1 - Verfahren und Vorrichtungen zur effektiven Trennung gelöster und ungelöster Stoffgemische

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Publication number: DE4440805A1
Application number: DE4440805A
Authority: DE
Original assignee: BRETTSCHNEIDER HENNER; KAISSLING KOSCHNICK ROSWITHA
Current assignee: BRETTSCHNEIDER HENNER; KAISSLING KOSCHNICK ROSWITHA
Priority date: 1993-11-16
Filing date: 1994-11-15
Publication date: 1995-07-20
Anticipated expiration: 2014-11-16
Also published as: WO1995014220A3; AU8139294A; WO1995014220A2; DE4440805C2

Description

Gegenstand der Erfindung sind Extraktions-, Filtrations- und Chromatographieverfahren sowie deren Optimierung und Kombination zur präparativen Auftrennung gelöster und ausgefällter Stoffgemische, insbesondere in durch Molekularsiebe stabilisierten Fällungsmittelgradienten bei der fraktionierenden Kristallisation. Es werden die Verfahren, sowie die Vorrichtungen zu deren effektiven Durchführung beschrieben.

Stand des Wissens und der Technik

Die meisten biochemischen Reinigungsverfahren beginnen mit einer Konzentrierung der Inhaltsstoffe aus einer verdünnten Ausgangslösung.

Der erste Verfahrensschritt besteht oft in der Aufarbeitung von Suspensionen, zum Beispiel Zellhomogenaten oder Proteinfällungen. Diese Prozeßschritte beinhalten meist eine arbeitsintensive und verlustreiche Zentrifugation, Filtration sowie Extraktion, um Feststoffe und Flüssigkeit voneinander zu trennen.

Interessiert der Feststoff, so ist es äußerst mühsam ihn quantitativ zu gewinnen und wieder in Lösung zu bringen; interessiert hingegen das Filtrat, ist dessen vollständige Gewinnung nur durch wiederholtes Nachwaschen möglich. Dies erfordert einen erheblichen Aufwand und führt oft zu unerwünschten Verdünnungen und Verlusten.

Das hier beschriebene Verfahren erlaubt durch direktes Aufbringen einer ausgefällten Stoffsuspension sowohl den festen als auch den flüssigen Teil der Suspension verlustfrei in einem Arbeitsschritt zu gewinnen.

Nach dem Stand der Technik geschieht dies gegenwärtig in mehreren getrennten Arbeitsschritten. Das ausgefällte Produkt wird durch Zentrifugation abgetrennt, dann in Puffer gelöst, um es anschließend der nächsten Reinigungsprozedur unterwerfen zu können. Heute herrscht die Meinung vor, daß Suspensionen in chromatographischen Verfahren nicht handhabbar seien. Bei Proteinextraktionen und Solubisierungen wurden allerdings in kleinem Maßstab auch chromatographieähnliche Verfahren verwendet:
Zille, C.A.; DellaMonica, E.S.: Arch. Biochem. Biophys. 58 (1955) 31-36, Separation of Proteins by Gradient Solvent Extraction of a Protein Precipitate,
Zahn, R.K.; Stahl, I.: Hoppe Seyl. Z. physiol. Chem. 293 (1953) 1-10, Die kontinuierliche Extraktion von Stoffgemischen unter Änderung eines Parameters nach dem Volum-Ersatzprinzip.
King, T.P.: Biochem. 11 (1972) 367-371, Separation of Proteins by Ammonium Sulfate Gradient Solubisation.

Ein gängiges Verfahren besteht darin, Antikörper im Serum durch Ammonium- oder Natriumsulfat auszufällen, die Antikörper durch Zentrifugation abzutrennen, und das Serum anschließend durch Gelchromatographie zu entsalzen, um es z. B. für Zellkulturzwecke einsetzen zu können.

Man hat Proteinfällungen direkt auf gelchromatographischen Säulen durchgeführt, indem man Proteine in gelöster Form auftrug und in einen auf der Säule vorgeformten Fällungsmittelgradienten hineinwandern ließ. Auf diese Weise wurden Serumproteine fraktioniert, allerdings nicht, wie von uns angestrebt, um das Serum gleichzeitig zu entsalzen und zurückzugewinnen:
Sargent, R.N.; Graham, D.L.: Anal. Chim. Acta 30 (1964) 101-104, Salting-out Chromatography of Serum Proteins.
Epstein, W.V.; Tan, M.: J. Chrom. 6 (1961) 258-263, Chromatographic Study of Human Serum by Gel Filtration.

Diesen Verfahren ist gemeinsam, daß sie von löslichem Material ausgehen und mit säulenförmiger Trennmatrix arbeiten. Dies gilt auch für die nachfolgenden beiden Arbeiten, bei denen es sich strenggenommen um fraktionierende Kristallisationen handelt:
Porath, J.: Nature 196 (1962) 47-48: Zone Precipitation,
Ehrlich, H.P.: Prep. Biochem. 9 (1979) 407-425; Zone Precipitation Chromatography: Its use in the Isolation of different Collagens.

Beide Autoren gehen von gelösten Proteinen und einem vorgeformten Gradienten aus. Diese Entwicklung führte dann weiter in Richtung der hydrophoben Adsorption gelöster Stoffgemische in großporigen Gelen:
Porath, J.O.; Rosengren, J.G.: DE 24 13 362 C2, Gelprodukt auf Basis von Agarose sowie Verwendung desselben für hydrophobe Entsalzungsadsorption.

Zur Bedeutung hydrophober Wechselwirkungen vergleiche:
Melander, W.; Horvath, C.: Arch. Biochem. Biophys. 183 (1977) 200-215, Salt Effects on Hydrophobic Interactions in Precipitation and Chromatography of Proteins: An Interpretation of the Lyotropic Series.

Sowohl die Proteinfällung als auch die hydrophobe Chromatographie beruhen auf Assoziationsgleichgewichten, die sich durch Salze und Lösungsmittel steuern lassen.

Gehen wir nicht wie Porath und Ehrlich es getan haben von einem vorgeformten Gradienten aus, sondern reduzieren diesen auf eine enge Zone Fällungsmittelpuffer in der Auftragszone und tragen darüberhinaus die Stoffe im ausgefällten Zustand als Suspension ohne vorgeformten Gradienten auf, so haben wir den Lösungsansatz der erfinderischen Aufgabe vor uns.

Lösung der erfinderischen Aufgabe

Die zu lösende erfinderische Aufgabe bestand darin, aus Serum ausgefällte Antikörper effektiv und damit auch kostengünstig so abzutrennen, daß salz- und antikörperfreies Serum neben den ausgefällten Proteinen gewonnen werden kann. Da dies eine äußerst komplexe Fragestellung ist, wurde sie in Teilaufgaben unterteilt:

1. Die Entwicklung einer leistungsfähigen gegen Blockierung wenig anfälligen Chromatographie.
2. Die Entwicklung der Vorrichtungen, um die neue Chromatographie effektiv durchführen zu können.
3. Die optimale Abstimmung von Verfahren und Vorrichtungen, um in einem Arbeitsschritt die ausgefällten Proteine durch Filtrieren abzutrennen und gleichzeitig das Filtrat, z. B. Serum, entsalzt in konzentrierter Form möglichst verlustarm zu gewinnen.

Lösungsansätze gegliedert nach Teilaufgaben

1. Die zu entwickelnde leistungsstarke Chromatographie sollte eine große ebene Auftragsfläche besitzen, um das Risiko des Verstopfens zu minimieren. Es bot sich deshalb an, ein trichterförmig gepacktes Entsalzungsgel zu wählen (die Packungsform erinnert an den Unterteil einer Nutsche) und die Proteinsuspension, nur durch ein Filter getrennt, unmittelbar aufs Gelbett aufzutragen.

Da im technischen Maßstab zu arbeiten war, ist in dieser konischen Chromatographie mit starken Verzerrungen der Elutionsfront zu rechnen. Dieser Nachteil mußte behoben werden:

2. Die Vorwölbung der Elutionsfront in der konischen Chromatographie wurde bei der Verfahrensentwicklung dadurch kompensiert, daß ein Chromatographieboden gleicher Krümmung wurden die Vorrichtungen und Verfahren geschaffen, um verschiedengeformte "Böden" und Trennrohre schnell auswechseln und somit auch austesten zu können. Dies ist eine wichtige Voraussetzung zur Verfahrensoptimierung. Da die Krümmung der Elutionsfront eng mit der Trennrohrgestalt zusammenhängt, wurde das Trennrohr in Modulbauweise aufgebaut, um es so flexibler auf seine Trennaufgaben hin in seiner Gestalt optimieren zu können.

3. Die Kombination von Vorrichtung und Verfahren führte zur gewünschten Aufgabelösung der gleichzeitigen Filtration und Chromatographie, mit der speziellen Anwendung Serum zu entsalzen und in einem Arbeitsschritt gleichzeitig von Antikörpern zu befreien und diese auch zu gewinnen.

Die dritte Schwerpunktsetzung erbrachte folgende Nebenergebnisse:

- konische Chromatographie,
- Erhöhung der Trennschärfe in der herkömmlichen Chromatographie,
- Fraktionierende Kristallisation mittels Molekularsieb,
- Ionenaustausch- bzw. Ionenausschluß-Chromatographie im Anschluß an die fraktionierende Kristallisation.

Detailbeschreibung der Aufgabenlösung

In der konischen Chromatographie steht durch die Rohrerweiterung an der Probenauftragsstelle, im Vergleich zu einem zylindrischen Rohr, eine vielgrößere Auftragsfläche zur Verfügung. Hierdurch wird die Gefahr einer Blockierung gesenkt. Insgesamt kann also bei vergleichsweise gleichen Füllmengen eine größere Stoffmenge als bisher aufgearbeitet werden. Dies gilt sowohl für den ersten Filtrationsschritt, als insbesondere auch für die anschließende Chromatographie. In dieser paßt sich das Trennbodenvolumen den fallenden Kapazitätsansprüchen bei fortschreitender Auftrennung an.

Die Trennmatrix wird also insgesamt effektiver genutzt. Dies äußert sich in vergleichsweise geringeren Füllmengen, kürzeren Zykluszeiten und geringerer trennbedingter Verdünnung. Voraussetzung für die effektive Nutzung der Trennmatrix ist allerdings eine Kompensation der verzerrten Elutionsfront durch eine entsprechende Wölbung des Fließadaptors. Wie in Fig. 3 dargestellt ist es hierfür belanglos, wo diese Wölbung liegt und in welcher Richtung sie durchströmt wird. Die Anordnung A eignet sich wegen der ebenen Auftragsfläche besonders zu der Kombination von Filtration, Extraktion und Chromatographie, wohingegen die Anordnung B für die Chromatographie von Lösungen günstiger ist, weil die Trennmatrixmenge am Auftrag durch die Wölbung zusätzlich erhöht ist.

Die konische Chromatographie im Vergleich zu anderen Chromatographieformen

Durch die nicht von vornherein festgelegte Rohrgestalt in der konischen Chromatographie gibt es im Vergleich zur konventionellen axialen Chromatographie zusätzliche Möglichkeiten für eine Optimierung des Trennvorganges. Das spielt besonders für die als teuer geltende industrielle Chromatographie eine Rolle.

Beim Recherchieren zum Strömungsverhalten von Lösungen in der klassischen präperativen Chromatographie wurde deutlich, daß hier die Wandeffekte meist außer Acht gelassen werden. Bei genauerer Analyse zeigt sich, daß auch im zylindrischen Trennrohr der axialen Chromatographie die Strömungsfront nach hinten gekrümmt ist. Vergleiche auch:
Nicoud, R.M.; Perrut, M.: Chromatogr. Science Ser. 61 (1993) 47-77, Hydrodynamics of Preparative Chromatography Columns.

Damit haben die von uns für die konische Chromatographie entwickelten gewölbten Chromatographieböden auch für die klassische axiale Chromatographie Bedeutung. Ihr Einsatz im Bereich der klassischen Chromatographie führt dort ebenfalls zu einer Verbesserung der Trenneigenschaften.

Wir haben zur Bestimmung der geeigneten Chromatographieböden den praktischen Ansatz des Ausprobierens gewählt. In der konischen Chromatographie spielen die Wandeffekte eine bedeutende Rolle. Bei einem theoretischen Lösungsansatz muß man hier im Vergleich zur klassischen Chromatographie mit erhöhten Schwierigkeiten rechnen. Weiterhin kommt erschwerend hinzu, daß die Durchströmungsgeschwindigkeit in axialer Richtung nicht konstant ist, und die radiale Dispersion sowie der Massentransfer von ihr abhängen. Hierin bestehen Parallelen zur radialen Chromatographie:
Gu, T.; Tsai, G.-J.; Tsao, G.T.: Chem. Eng. Science 46 (91) 1279-1288^A, Theoretical Study of Multicomponent Radial Flow Chromatography.

Fraktionierende Kristallisation

Trägt man unter Hochsalzbedingungen eine ausgefällte Proteinsuspension auf ein Entsalzungsgel auf, so bleibt die Proteinsuspension auf dem Gel liegen und kann dort mit dem Fällungspuffer frei von löslichen "Verunreinigungen" (hier z. B. Serum) gewaschen werden. Dies funktioniert allerdings nur dann ohne störende Rücklösung, wenn die Auftragszone zuvor mit Fällungspuffer equilibriert wurde. Bei einer sich anschließenden Absenkung der Salzkonzentration im Elutionspuffer werden die ausgefällten Stoffe in der Reihenfolge ihrer Löslichkeit aus dem Prezipitat in der Auftragzone extrahiert und wandern, weil sie nicht ins Gel eindringen können, im Ausschlußvolumen des Gelbettes bis zu der Position, an der sie wieder die Grenze ihrer Löslichkeit erreichen. Hier kristallisieren sie und fallen aus. Nacheinander bilden sich verschiedene Prezipitationsbanden in der Reihenfolge ihrer Löslichkeiten. Das Extrahieren in Kombination mit dem beschleunigten Wandern im Ausschlußvolumen führt hier zu einer Verschärfung der Prezipitationsbanden. Da der Elutionsgradient in unserem Falle durch ein Molekularsieb stabilisiert wird, bilden sich in diesem scharfabgegrenzte Prezipitationszonen aus, die mit Fortschreiten des Gradienten schließlich als Suspension eluieren. Die Gradientenlänge (sein Volumen in Relation zum Trennmatrixvolumen) ist nicht durch das Trennmatrixvolumen begrenzt. Diese Art der Trennung kann also analog zu einem Ionenaustauscher gehandhabt werden.

Bei einem von außen angelegten Gradienten mit abnehmender Fällungsmittelkonzentration laufen im Trennrohr folgende Einzelprozesse ab:

Im Inneren der Gelpartikel stellt sich bereits in der Auftragszone eine geringfügig niedrigere Konzentration als im Äußeren ein. Solange die Fällungsmittelkonzentration abnimmt, befindet sich im Geläußeren immer eine höhere Konzentration des älteren Puffers, also bei der Art dieses Gradienten auch an Salz. Das bedeutet, daß die ausgefällten Stoffe dem Gradienten im äußeren Volumen folgen - ins Gelinnere können sie ja nicht - sie ordnen sich dort in der Reihenfolge ihrer Löslichkeit als Precipitationszonen ab.

Bei den verwendeten Salzkonzentrationen darf man die hydrophobe Adsorption nicht außer Acht lassen nochzumal Prezipitation und hydrophobe Adsorption im Mechanismus sehr eng verwandte Prozesse sind. Beide haben Einfluß auf die fraktionierende Kristallisation:

1. die hydrophobe Ausfällung des Proteins und in Folge das mechanische Zurückhalten der Kristalle.
2. die hydrophobe Adsorption der Proteine (bzw. der Proteinkristalle) an einer hydrophoben Matrix.

Deshalb geht es hier darum beide optimal aufeinander abzustimmen. Der Hydrophobizität der Matrix kommt deshalb eine zentrale Bedeutung zu, weil sie gezielt eingestellt werden kann und dadurch den Bereich festlegt wird, in dem der Trennprozeß durch Fällungsmittelgradienten gesteuert werden kann.

Zur Verbesserung des Trennverhaltens in der fraktionierenden Kristallisation kann die hydrophobe Adsorption an der Gelmatrix gezielt verändert werden. Hierzu ist allerdings eine Feinabstimmung der Hydrophobizität zwischen der Oberfläche der Trennmatrix sowie dem zu reinigenden Protein notwendig. Für diese Feinabstimmung werden in den Beispielen verschiedene Lösungen gezeigt.

1. Beispiel Ermittlung der optimalen Trennrohrgestalt

Zur Ermittlung der optimalen Form für die Trennvorrichtung wurden drei verschieden trichterförmige Rohre mit gleichem Volumen (73 ml) Entsalzungsgel gefüllt (Fig. 1) und die zugehörigen Elutionsprofile eines niedermolekularen Farbstoffes (Bromphenolblau) ermittelt (Fig. 2). Das Elutionsprofil des Rohres A zeigte das steilste Elutionsprofil. Dies bedeutet, daß die Elutionsfront in diesem Beispiel am geringsten von einer planen Fläche abweicht. Nach dem gleichen Verfahren kann der Boden eines beliebiggeformten Chromatographierohres der Gestalt der Elutionsfront angepaßt werden.

Grundsätzlich hat ein Flüssigkeitsstrom durch ein konisch ausgeformtes Chromatographierohr an der Wand einen längeren Weg zurückzulegen als im Zentrum. Skizziert man verschiedene stromlinienförmige Trennrohre und trägt man auf den Stromlinien gleiche Abstände ab und verbindet diese, so bekommt man eine Vorstellung, wie die Strömungsfront zeitabhängig voranrückt (Fig. 3A). Hieraus wird deutlich, daß bei ebener Auftragsfläche in einem beliebig geformten konischen Chromatographierohr durch eine Außenkrümmung des Bodens die verschieden langen Trennstrecken während der Chromatographie kompensiert werden können.

Zur einfachen Handhabung, sowie zur Verwendung kommerziell erhältlichen Chromatographiematerials, wie Adaptoren (deren Endplatten einfach auf die jeweils ermittelte Krümmung umgearbeitet werden), ist es zweckmäßig, den Konus nach beiden Seiten durch zylindrische Rohre zu verlängern.

2. Beispiel Ausbildung eines stromlinienförmigen Trennrohres

Das gesamte Trennrohr bildet man zweckmäßigerweise stromlinienförmig aus. Als Maximalmaß sollte man einen Durchmesser von 120 cm nicht überschreiten. Dies ist die Obergrenze bis zu der man Zubehör noch relativ leicht erhält.

Trennrohre bis 40 cm Innendurchmesser werden am zweckmäßigsten aus Glas oder sterilisierbarem und durchsichtigem Kunststoff hergestellt, insbesondere die großen Durchmesser werden am besten aus CrNiMoTi-Stahl (Werkstoff 1.4571=316Ti) gefertigt.

Konstruktion des Trennrohres

1. Oberer und unterer Tubus von mindestens 10 cm Höhe werden auf den gewünschten Abstand gebracht. Deren Außenränder werden mit einer gestrichelten Hilfslinie verbunden. Deren Mittelpunkt wird später zum Wendepunkt der Krümmung im stromlinienförmig ausgeformten Trennrohr. Die Tangente im Wendepunkt Fig. 4 dient hierbei als Konstruktionshilfslinie.

2. Mit den unter 1 bezeichneten Hilfslinien wird, wie in Fig. 4 beschrieben, das konische Trennrohr konstruiert.

Bei der Wahl einer geringen Höhe bei gleichzeitig großem Durchmesser (rechte Seite der Fig. 4) ist es zweckmäßig die starke Krümmung über einen größeren Bereich auszugleichen. Anderenfalls würde dies zu einer unnötig starken und uneinheitlichen Verzerrung beim Austritt der Flüssigkeitsfront im unteren Tubus führen.

Dies gilt natürlich auch für jeden abrupten Wandkrümmungswechsel des Trennrohres, wie es zum Beispiel ein einfacher Konus darstellen würde.

Nur in der Chromatographie, nicht so sehr in der Filtration, ist ein gleichförmiger Stromlinienverlauf von Bedeutung. Aus diesem Grunde wird man Vorrichtungen mit großer Wandkrümmung bevorzugt zur Filtration (Fig. 5A) und solche mit kleiner Krümmung zur Chromatographie (Fig. 5B) einsetzen.

3. Beispiel Variable Gestaltung konischer Trennrohre durch Modulbauweise

Für die Verrohrung im Lüftungsanlagenbau gibt es bis zu einem Innendurchmesser von 629 mm ein vielfältiges Angebot von Rohrmodulen, die den variablen Anforderungen für unsere Trennrohre gerecht werden. Es gibt sie auch in Kegelmantelgestalt. Diese Rohrsegmente können ohne jegliches Schweißen durch Dichtungen und Spannringe zusammengefügt werden und sind dann für die Filtration und Chromatographie im Niederdruckbereich hinreichend dicht. Solche Module lassen sich zur Konstruktion unterschiedlich geformter konischer Trennrohre einsetzen.

Ausgehend von einem einfachen Bausatz von Rohrmodulen und unterschiedlich ausgeformten Fließadaptoren läßt sich so mit verhältnismäßig geringem Kostenaufwand das optimale konische Trennrohr für das jeweilige Trennproblem ermitteln.

4. Beispiel Ermittlung der optimalen Bodenkrümmung

Ein Trennrohr wie in Fig. 1A abgebildet (oberer Innendurchmesser 10 cm, unterer Innendurchmesser 5 cm) wurde mit ca. 700 ml Biogel P6 fine gefüllt und mit physiologischem Puffer equilibriert. Zur Ermittlung der optimalen Bodenkrümmung wurde der Einfluß drei verschiedener Krümmungen auf das Elutionsverhalten von 20 ml Bromphenolblau analysiert. Die Elutionsprofile sind mit den zugehörigen maßstabsgerechten Bodenkrümmungen in Fig. 6 dargestellt. Nur die stärkste Krümmung zeigt ein schärferes Elutionsprofil. Nach diesem Verfahren kann die am besten passende Bodenkrümmung für ein beliebig geformtes Trennrohr ermittelt werden.

Eine noch genauere Analyse der Elutionsfront läßt sich dadurch erreichen, daß man Farbstoffe mit unterschiedlichem optischen Adsorptionsmaximum getrennt konzentrisch aufträgt und die Ergebnisse dieser Chromatographie mit denen einer zweiten Chromatographie vergleicht, bei der zuvor die Farbstoffe durchmischt wurden. Durch den Vergleich der Elutionszeiten für die verschiedenen optischen Adsorptionsmaxima erhält man so einen direkten Hinweis darauf, wie sich die Strömung über den Rohrquerschnitt verteilt und in welcher Richtung die Krümmung des Chromatographiebodens verbessert werden muß, damit eine optimale Auftrennung erzielt werden kann.

5. Beispiel Vorrichtung zum Entzerren der Elutionsfront

Die gekrümmte Elutionsfront wird dadurch entzerrt, daß der Boden des Chromatographierohres so ausgeformt wird, daß er die gleiche Krümmung aufweist wie die verzerrte Elutionsfront.

Will man allerdings nur chromatographisch mit gelösten Stoffgemischen arbeiten, ist es unerheblich, ob sich die Siebbodenkrümmung oben oder unten befindet und in welcher Richtung das beliebig ausgeformte Trennrohr durchströmt wird (vergl. Fig. 3A & B). Die Vorrichtung zum Entzerren der Elutionsfront ist einem Teesieb vergleichbar (Fig. 7), dessen flexibler Rand (1) sich dem Inneren des Chromatographierohres (9) anpreßt. Ein feinmaschiger Filter (8) wird vom Gehäuse aufgenommen und durch Auflagerippen unterstützt und mittels einer Hakenvorrichtung (2) in Position gehalten. Im Gehäuse wird das Filtrat gesammelt (7) und abgeleitet (4).

Die Halterung ist so konstruiert, daß sie z. B. über eine Steck- bzw. Luer-lock-Verbindung (5) leicht gegen andere Filtergehäuse mit unterschiedlicher Filterkrümmung ausgetauscht werden kann, so auch mit Teilen von "flow adaptoren" (10), die bereits auf dem Markt erhältlich sind.

Hierdurch sind alle bestehenden konventionellen Chromatographiesysteme einfach auf die neuen Chromatographieböden umrüstbar.

Erläuterungen zu den Einzelabbildungen der Fig. 7:
A: Siebböden verschiedener Krümmung: "laminare Strömungsfront"
B: Siebböden verschiedener Krümmung: "turbulente Strömungsfront"
C: Seitenaufriß eines Siebbodens mit Halterung incl. Installation
D: Sicht auf die Unterseite der Halterung
E: Aufsicht der Halterung mit entferntem Siebboden

6. Beispiel Gleichzeitige Gewinnung von entsalztem Serum und Antikörpern

Ein konisches Chromatographierohr nach Fig. 1A, mit großem Durchmesser von 5 cm und kleinem Durchmesser von 2,5 cm wird unten mit einem Flußadaptor als Boden abgeschlossen, dessen Krümmung in beschriebener Weise verändert wurde.

Das Rohr wird mit Entsalzungsgel auf Acrylamidbasis gefüllt (73 ml: Biorad, PG6, fine), weil dieses Gel wegen seiner niedrigen Ausschlußgrenze keine Proteine in die Gelpartikel eindringen läßt. Das Gel wurde in physiologischem Salzpuffer gequollen und das gepackte Chromatographierohr wurde mit einem Filter abgedeckt und mit gleichem Puffer equilibriert. Der überstehende Puffer, welcher sich durch Setzen des Gelbettes gebildet hat, wird bei geöffnetem Rohr vorsichtig abgelassen. Der Filter wird mit möglichst geringer Volumenmenge einer 12gewichtsprozentigen Na₂SO₄-Lösung vorsichtig überschichtet. Dabei ist wichtig, daß der Filter sehr eben dem Gel aufliegt. Die Salzlösung läßt man vorsichtig vom Gelbett aufsaugen - achtet aber darauf, daß zwischen Gel und Filter keine Luft eindringt. Der gleiche Überschichtungsvorgang wird wiederholt, bevor die Serumsuspension (20 ml Ausgangsvolumen) mit den ausgesalzten Antikörpern, mit 1/10 des Serumgewichtes an trockenen Gelpartikeln versetzt und dann aufs Filter aufgetragen und glattgestrichen wird. Das Versetzen mit Entsalzungsgel hat mehrfache Vorteile. Die Proteinkonzentration wird erhöht, vergl.:
McGrath, Anal. Biochem. 16 (1966) 402-408, Method of Concentrating Proteins on Sephadex prior to Gel Filtration.

Dies verbessert die Effektivität der Proteinfällung und führt zu konzentrierterem entsalztem Serum. Darüber hinaus wird die Proteinsuspension mit Gelpartikel durchsetzt, was die Pufferdurchdringung und Filtration in der anderenfalls sehr kompakten Auftragszone erleichtert. Das Serum wird mit der 12%igen Natriumsulfatlösung solange eluiert, bis der Chloridnachweis (Silbersulfat) negativ ist. Dann wird das Gelbett mit physiologischem Puffer regeneriert und die Antikörper eluieren nach der Salzabsenkung anfangs als Suspension und dann als Lösung.

7. Beispiel Serumgewinnung frei von Antikörpern, Pyrogenen und Viren

20 Liter Serum werden zur Inaktivierung von Viren mit verdünnter Salzsäure bei 4°C unter langsamem Rühren auf pH 5 eingestellt. Nach Erreichen des pH-Wertes wird 1 kg trockenes Entsalzungsgel zugegeben, das zuvor mit quartären Aminen derivatisiert worden war. Nach beendetem Zerstreuen rührt man mit verminderter Geschwindigkeit, die gerade dazu ausreicht, daß sich keine Partikel absetzen, mindestens drei Stunden weiter. Dann beginnt man langsam eine Mischung von feinpulverisiertem Trinatriumcitrat und Citronensäure zuzustreuen, so daß sich innerhalb einer Stunde ein Volumen von 24 Litern mit einem pH von 8,2 einstellt. Diese Suspension wird nach einer Fällzeit von mindestens einer halben Stunde auf die ebene Auftragszone einer Trennvorrichtung, die 60 Liter faßt und mit konventionellem Entsalzungsgel gefüllt ist, gegeben. Die Abmessungsverhältnisse und die Vorbehandlung der Trennvorrichtung sind die gleichen wie in Beispiel 6 beschrieben - nur daß diese Trennvorrichtung ca. das 1000fache Volumen faßt.

Das Serum wird mit Citratpuffer eluiert, dessen Konzentration dem Fällungspuffer entspricht. Das Serum eluiert nach dieser Vorbehandlung frei von Antikörpern, Pyrogenen und Viren. Sobald am Pufferauslaß die Proteinkonzentration abfällt und die Citratkonzentration ansteigt, wird die Serumelution beendet.

Die Elution wird unterbrochen und das Trennrohr wird zur Equilibrierung und Antikörperrücklösung mit PBS-Puffer rückgespült. Bei Bedarf können die Antikörper gesammelt werden, weil sie, im Gegensatz zu den inaktivierten Viren, unter Niedrigsalzbedingungen nicht an die quartären Amine binden.

Das mit quartärem Amin derivatisierte Entsalzungsgel wird an der Filtertrennschicht abgehoben und kann nach Regeneration und Trocknung erneut benutzt werden. Die nach oben offene Trennvorrichtung steht nun für die nächste Serumauftrennung bereit.

8. Beispiel Vollständige Fällung von Serumproteinen und ihre Auftrennung und Gewinnung durch fraktionierende Kristallisation

In diesem Beispiel wird die selbe Vorrichtung wie in Beispiel 6 benutzt.

Zur vollständigen Fällung der Serumproteine wird 20 ml Serum bei 23°C mit Na₂SO₄ bis zur Sättigung versetzt und 1/10 des Serumgewichtes wird als wasserfreies Entsalzungsgel (Biorad, P6, fine) hinzugegeben.

Das Chromatographiegel wird in gesättigtem Na₂SO₄ gequollen, ins Chromatographierohr gefüllt, mit dem selben Puffer equilibriert und mit einem Filter abgedeckt. Das Gel zeigt unter diesen Hochsalzbedingungen einen niedrigeren Quellungsgrad, als bei physiologischer Salzkonzentration. Dementsprechend muß man ein Ausgleichsvolumen im oberen zylindrischen Rohr zur Ausdehnung des Geles vorsehen.

Auf das Filter der Vorrichtung wird die Suspension der ausgefällten Serumproteine aufgetragen und glattgestrichen. Das mit Gel gefüllte Chromatographierohr wird solange mit gesättigter Natriumsulfatlösung gewaschen, bis kein Natriumchlorid mehr im Eluat nachweisbar ist. Danach wird ein Gradient, bestehend aus gesättigter Natriumsulfatlösung im Mischgefäß und physiologischem Puffer im Zulauf angeschlossen.

Der Gradient läßt sich an das jeweilige Trennproblem anpassen. Dies gilt für die Gradientenform, als auch dessen Zusammensetzung und darüberhinaus auch für die Ausformung des Trennrohres.

9. Beispiel Hydrophobierung von Entsalzungsgelen für die fraktionierende Kristallisation

Zur Verbesserung der fraktionierenden Kristallisation werden zusätzlich hydrophobe Gruppen an das Entsalzungsgel gekoppelt. Hydroxypropylierter Sephadex (LH20) ist entsprechend einsetzbar und führt zu anderen Prezipitationsprofilen im Vergleich zum unmodifizierten G25 Sephadex. Dies trifft auch für deren Modifikation mit aliphatischen Epoxiden zu, wie mit anderer Schwerpunktsetzung beschrieben wurde:
Gelfiltration mit Sephadex LH-20 in organischen Lösungsmitteln Uppsala: Pharmacia.

In analoger Weise können die Amide des Acrylamids (z. B. BioRad: Biogel P6 und IBF Trisacryl GF05 als Entsalzungsgele) mit Alkylhydrazinen bzw. Alkylaminen durch Austausch des amidischen Stickstoffes in die entsprechenden Amide und Hydrazide überführt werden. Diese hydrophobierten Entsalzungsgele auf Acrylamidbasis werden zur fraktionierenden Kristallisation mit verbesserter Trennung eingesetzt. Zur Herstellung der Alkylhydrazide und Alkylamide wird nach bekannter Methode vorgegangen:
Inman, J.K.; Dintzis, H.W.: Biochem. 8 (1969) 4074-4082, The Derivatization of Cross-Linked Polyacrylamid Beads.
Controlled Introduction of Funktional Groups für the Preparation of Special-Purpose, Biochemical Adsorbents.

Die verbesserte Auftrennung äußert sich in einer Erhöhung der Bandenschärfe sowie einem größeren Elutionsvolumen zwischen zwei Prezipitationsbanden im gewünschten Bereich des Elutionsprofiles.

10. Beispiel Hydrophilierung von Entsalzungsgelen und ihre Verwendung in der fraktionierenden Kristallisation

Bei der von uns detailliert beschriebenen kristallisierenden Fraktionierung streben wird an, daß weder das Prezipitat noch die rückgelöste Substanz in das Gelpartikel eindringen können. Dies zwingt einen, bei der Auftrennung von niedermolekularen Stoffen, wie beispielsweise biologisch wirksamen Peptiden oder auch Wachstumsfaktoren, Gele höheren Polymerisationsgrades zu verwenden, die zum Beispiel für Trisacryl leider nicht erhältlich sind. Es ist aber bekannt, daß die Hydrophobizität der kleinporigen Gele mit ihrem Vernetzungsgrad drastisch zunimmt. Aus diesem Grunde ist es für einige Anwendungen notwendig, diese kleinporigen Entsalzungsgele zu hydrophilieren, um die Hydrophobizität abzuschwächen.

Methodisch wird in Analogie zum vorherigen Beispiel vorgegangen, nur daß man in diesem Falle hydrophile Amine und Hydrazine mit dem amidischen Stickstoff austauscht. Die hierzu notwendigen chemischen Reaktionen sind in der Literatur beschrieben. Die Hydrazine der Desoxyzucker werden beispielsweise unter Umsetzung der Desoxyzucker mit Hydrazinüberschuß zu den mono-Osazonen und anschließender Reduktion mit Natriumborhydrid oder Natriumcyanoborhydrid erhalten. Die anderen Stoffe sind käuflich erhältlich.

11. Beispiel Modifikation von Entsalzungsgelen mit starken Ionenaustauschgruppen und deren Verwendung

Die in Beispiel 10 genannten Modifikationsreaktionen erhöhten in einigen Fällen, insbesondere bei der Trennung hydrophober Peptide, nur unzureichend die Hydrophilität kleinporiger Gele. Da für die fraktionierende Kristallisation die Bindung über starke Ionenaustauschgruppen aber vernachlässigt werden können, bietet es sich an, für diese spezielle Anwendung solche geladenen ionischen Gruppen in hochvernetzte Gele einzuführen. Zur Modifikation der Acrylamidgele bieten sich beispielsweise die Aminomethan- sowie Aminoethansulfonsäure an, die über die Aminogruppe durch Austauschreaktion mit Acrylamid umgesetzt werden können, wodurch ein starker Kationenaustauscher entsteht.

Die Entsalzungsgele auf Polysaccharidbasis lassen sich wiederum im Alkalischen mit einem Epoxid wie 2,3-Epoxypropyltrimethylammoniumchlorid umsetzen, wodurch ein starker Anionenaustauscher entsteht. Beide Arten der Modifikation vermindern drastisch die Hydrophobizität der oben aufgeführten Entsalzungsgele und schaffen die Voraussetzung dafür, mit diesen Gelen auch sehr hydrophobe Substanzen fraktioniert zu kristallisieren.

Claims

1. Die Vorrichtung zur Durchführung von Filtrationen, Extraktionen bzw. der Chromatographie ist dadurch gekennzeichnet, daß in einem Trennrohr zwischen zwei wenigstens teilweise nach außen gewölbten porösen Abschlußstücken eine Trennmatrix so eingebettet ist, daß die Elutionsfront nach Durchwandern der Matrix die Austrittsfläche zum selben Zeitpunkt mit seiner maximalen Konzentration an allen Stellen durchströmt.

2. Das Trennrohr nach Anspruch 1 ist dadurch gekennzeichnet, daß es trichterförmig ausgebildet ist.

3. Das trichterförmige Trennrohr nach Anspruch 2 ist dadurch gekennzeichnet, daß es in Modulbauweise aus Kegelmantelsegmenten zusammengesetzt wird und sich deshalb dem jeweiligen Trennproblem variabel anpassen läßt.

4. Die trichterförmigen Trennrohre nach Anspruch 2 und 3 sind dadurch gekennzeichnet, daß sie nach oben und unten durch ein zylindrisches Chromatographierohr verlängert sind. Die Tubusansatzstellen sind dabei vorzugsweise stromlinienförmig ausgebildet.

5. Die Trennvorrichtungen nach Anspruch 1 bis 4 sind dadurch gekennzeichnet, daß die Probenauftragsfläche eben ist und der Chromatographiematrix aufliegen. Das Abschlußstück für den Austritt der Elutionsfront bildet den Boden und ist nach außen gekrümmt.

6. Die Trennvorrichtung nach Anspruch 5 ist dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Filter enthält, der in ein Gehäuse eingepaßt ist, welches die Filterkrümmung stabilisiert und das Eluat sammelt und ableitet.

7. Die Trennvorrichtung nach Anspruch 6 ist so ausgebildet, daß die Gehäuse mit ihren gewölbten Filtern leicht wechselseitig als auch gegen die Frontpartie der im Handel erhältlichen Fließadaptoren ausgetauscht werden kann.

8. Die Trennvorrichtung nach Anspruch 7 ist dadurch gekennzeichnet, daß in ihr ein beliebiges Chromatographiematerial verwendet werden kann.

9. Die Trennvorrichtungen nach Anspruch 1 bis 4 sind dadurch gekennzeichnet, daß ihre Probenauftragsfläche nach außen gekrümmt ist, wohingegen die Austrittsfläche der Elutionsfront eben ist.

10. Die Vorrichtung nach Anspruch 9 ist dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Filter enthält, das in ein Gehäuse eingepaßt ist, welches die Filterkrümmung stabilisiert und den Auftrag zuleitet und verteilt.

11. Die Chromatographievorrichtung nach Anspruch 10 ist so ausgebildet, daß die Gehäuse mit Filtern unterschiedlicher Krümmung leicht wechselseitig sowie auch gegen die Frontteile der im Handel erhältlichen Fließadaptoren ausgetauscht werden können.

12. Die Chromatographievorrichtung nach Anspruch 11 ist dadurch gekennzeichnet, daß in ihr ein beliebiges Chromatographiematerial verwendet werden kann.

13. Die Chromatographievorrichtung nach Anspruch 12 ist dadurch gekennzeichnet, daß sie sich besonders für solche Chromatographieverfahren eignet, in denen eine Verdünnung vermieden werden muß.

14. Die Trennvorrichtung nach Anspruch 5 eignet sich wegen ihrer Anordnung und Ausformung der Filter besonders für das Arbeiten im nach oben geöffneten Zustand. Dies hat den Vorteil, daß mit dieser Vorrichtung gleichzeitig sowohl extrahiert, filtriert als auch chromatographiert werden kann.

15. Das Verfahren der fraktionierenden Kristallisation ist dadurch gekennzeichnet, daß als Trennmatrix ein Molekularsieb verwendet wird, dessen Porengröße das Fällungsmittel aber nicht die zu trennenden Substanzen ins Innere der porösen Matrix eindringen läßt und ferner dadurch, daß es mit der Extraktion eines ausgefällten Stoffgemisches gekoppelt ist.

16. Das Verfahren nach Anspruch 15 ist dadurch gekennzeichnet, daß zumindest die Probenauftragzone mit dem Fällungspuffer equilibriert wird, sonst aber ohne vorgeformten Fällungsmittelgradienten auskommt.

17. Die fraktionierende Kristallisation nach Anspruch 16 ist dadurch gekennzeichnet, daß unter Zuhilfenahme der Trennvorrichtung nach Anspruch 14 eine ausgefällte Stoffgemischsuspension durch Absenkung der Fällungsmittelkonzentration erheblich effektiv in einem Arbeitsschritt extrahiert, filtriert und chromatographiert werden können.

18. Das Trennverhalten der fraktionierenden Kristallisation nach Anspruch 16 und 17 ist dadurch gekennzeichnet, daß bei zeitabhängiger Senkung der Fällungsmittelkonzentration im Elutionspuffer sich im Trennrohr ein Gradient aufbaut, der systeminhärent zu einer Verschärfung der Prezipitationsbanden führt.

19. Die Effektivität der fraktionierenden Kristallisation nach dem Anspruch 18 läßt sich dadurch steigern, daß die aufgetragene Suspension des ausgefällten Stoffgemisches vor dem Auftragen mit trockenem Molekularsieb versetzt wird.

20. Die fraktionierende Kristallisation nach Anspruch 19 ist dadurch gekennzeichnet, daß sowohl entsalztes Serum als auch Antikörper in einem Arbeitsschritt unter Verwendung eines Entsalzungsgeles gewonnen werden.

21. Die fraktionierende Kristallisation nach Anspruch 20 ist dadurch gekennzeichnet, daß mit einer Vorinkubation des Serums bei pH 5 für mindestens 3 Stunden eventuell im Serum enthaltene Viren inaktiviert werden.

22. Das Verfahren nach Anspruch 21 ist dadurch gekennzeichnet, daß durch Verwendung gemäß Anspruch 19 eines mit quartären Aminen gemäß Anspruch 33 modifizierten Entsalzungsgeles die Pyrogene sowie inaktivierte Viren festgehalten werden, so daß sie durch Regeneration des Entsalzungsgeles leicht entfernt werden können.

23. Das Verfahren nach Anspruch 19 ist dadurch gekennzeichnet, daß vollständig ausgefällte Serumproteine auf ein Entsalzungsgel aufgetragen werden. Die Proteine werden dann durch Absenkung der Fällungsmittelkonzentration als Suspension im Elutionspuffer gewonnen.

24. Das Verfahren nach Anspruch 19 ist dadurch gekennzeichnet, daß ausgefällte Stoffe beliebigen Ursprungs aufgetrennt werden.

25. Das Verfahren nach Anspruch 19 ist dadurch gekennzeichnet, daß ein Gemisch ausgefällter und unlöslicher Stoffe, insbesondere Fällungen von Zellhomogenaten, sich ohne weitere Vorreinigung auftrennen lassen.

26. Die Reinigungsverfahren nach Anspruch 23 bis 25 sind dadurch gekennzeichnet, daß ein Molekularsieb verwendet wird, dessen Oberfläche eine ähnlich starke Hydrophobizität zeigt wie die zu reinigende Substanz.

27. Das Reinigungsverfahren nach dem Anspruch 26 ist dadurch gekennzeichnet, daß als Molekularsieb ein Entsalzungsgel verwendet wird, dessen Hydrophobizität gemäß einer der Ansprüche 30 bis 33 auf die gewünschte Hydrophobizität eingestellt wurde.

28. Die Reinigungsverfahren nach Anspruch 23 bis 25 sind dadurch gekennzeichnet, daß ein Molekularsieb verwendet wird, dessen Oberfläche eine ähnlich starke Hydrophobizität zeigt wie die schwer abzutrennende Begleitsubstanz.

29. Das Reinigungsverfahren nach dem Anspruch 28 ist dadurch gekennzeichnet, daß als Molekularsieb ein Entsalzungsgel verwendet wird, dessen Hydrophobizität gemäß einer der Ansprüche 30 bis 33 auf die gewünschte Hydrophobizität eingestellt wurde.

30. Die Gelhydrophobisierung nach den Ansprüchen 27 und 29 ist dadurch gekennzeichnet, daß kommerziell erhältliche Entsalzungsgele auf Acrylamidbasis bzw. auf Trishydroxymethylacrylamidbasis mit Alkylaminen bzw. Alkylhydrazinen unter Austausch des amidischen Stickstoffes so umgesetzt werden, daß sich die Hydrophobizität der Geloberfläche erhöht.
Die Hydrazine haben die allgemeine Formel: H₂NNH-R₁Die Amine haben die allgemeine Formel:H₂N-R₁Die Bedeutung des Restes ist jeweils:
R₁: -(CH₂)_nO_mH; n=0 bis 8; m=0 oder 1.

31. Die Gelhydrophilisierung nach Anspruch 27 und 29 ist dadurch gekennzeichnet, daß kommerziell erhältliche Entsalzungsgele auf Acrylamidbasis mit den Hydrazinen der Desoxyzucker bzw. mit Aminozuckern oder Aminopolyalkoholen unter Austausch des amidischen Stickstoffes so umgesetzt werden, daß die Geloberfläche hydrophiler wird.
Die Hydrazinodesoxyzucker haben die allgemeine Formel: H₂NNH-CH₂-(HCOH)_h-H; h=1 bis 5.Die Aminozucker sind Glucosamin und Galactosamin.
Die Aminopolyalkohole sind:
C₃H₉NO₂: 1-Amin 2,3-propandiol, 2-Amino 1,3-propandiol
C₄H₁₁NO₃: Trishydroxymethylamin
C₄H₁₁NO₂: 2-Amino 2-methyl 1,3-propandiol
C₅H₁₃NO₂: 2-Amino 2-ethyl 1,3-propandiol
C₆H₁₅NO₂: Diisopropanolamin.

32. Die Gelhydrophobisierung nach Anspruch 27 und 29 ist dadurch gekennzeichnet, daß kommerziell erhältliche Entsalzungsgele auf Polysaccharidbasis mit Epoxiden unterschiedlicher Hydrophobizität im Alkalischen umgesetzt werden.
Folgende Epoxide steigender Hydrophobizität finden Verwendung:
C₃H₆O₂: Epoxypropanol
C₃H₅O: Propenoxid
C₄H₈O₂: 2,3-Epoxy 2-Methyl-1-propanol
C₄H₈O₂: 2,3-Epoxypropyl-methylether
C₄H₈O: Butenoxid
C₅H₈O: Cyclopentenoxid
C₆H₁₂O₂: 2,3-Epoxypropyl-isopropylether
C₈H₈O: Styroloxid.

33. Eine ausreichende Gelhydrophilierung nach den Ansprüchen 22, 27 und 29 macht insbesondere bei engporigen Gelen wie Sephadex G10 und G15 sowie BioGel P2 und P4 Schwierigkeiten. Die hydrophile Modifikation dieser Gele ist deshalb dadurch gekennzeichnet, daß Ionenaustauschfunktionen eingeführt werden, deren störender Einfluß sich unter Hochsalzbedingungen nicht bemerkbar macht.
Für die Acrylamide sind dies die Austauschreaktion mit Aminosäuren:
Glycin, beta-Alanin, gamma-Aminopropionsäure sowie Aminomethansulfonsäure und Aminoethansulfonsäure (Taurin).
Außerdem sind dies die Austauschreaktionen mit den Diaminen:
Ethylendiamin, 1,3-Propandiamin, 1,4-Butandiamin sowie entsprechende tertiäre Amine wie N,N-Dimethyl-N′-ethylendiamin und quartäre Amine wie (2-Aminoethyl)-trimethylammoniumchlorid.
Für die Modifikation der Entsalzungsgele auf Polysaccharidbasis eignen sich folgende Epoxide: Epoxybernsteinsäure, Epoxytricarballylsäure und Epoxysulfonsäuren sowie 2,3-Epoxy-propyl- trimethylammoniumchlorid.

34. Die gemäß Anspruch 33 mit Ionenaustauschgruppen modifizierten Gele sind dadurch gekennzeichnet, daß sie unter Hochsalzbedingungen zunächst der Stabilisierung des Salzgradienten in der fraktionierenden Kristallisation dienen, bei Absenken der Ionenkonzentration dann zu einer Auftrennung nach dem Ionenaustauschprinzip übergehen.