DE3334902A1

DE3334902A1 - Verfahren zum packen einer saeule mit kleinem innendurchmesser und nach diesem verfahren gepackte saeule

Info

Publication number: DE3334902A1
Application number: DE19833334902
Authority: DE
Inventors: Frank Jiann-Fu Danville Calif. Yang
Original assignee: Varian Associates Inc
Current assignee: Varian Medical Systems Inc
Priority date: 1982-10-04
Filing date: 1983-09-27
Publication date: 1984-04-05
Also published as: CA1226249A; JPS5970963A; GB2128099A; IT8323130A0; GB8321160D0; FR2534027A1; FR2534027B1; IT1172412B; GB2128099B

Description

-X-er ■ - · - *

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Packen von Chromatographiesäulen und das resultierende Produkt, und insbesondere ein Verfahren zum Packen einer Chromatographiesäule mit kleinem Innendurchmesser, die mit Mikropartikeln gepackt ist, zur Verwendung in der Gas- oder Flüssigkeitschromatographie, und das resultierende Produkt.

In der Chromatographie gibt es einen Trend hin zu höheren Drucken und Säulen mit kleinerem Durchmesser, zur besseren Ausnutzung des Lösungsmittels in der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC nach "High Performance Liquid Chromatography") und zum höheren Säulenwirkungsgrad in der Gaschromatographie (GC). Zusätzlich kann der Wunsch nach höherer Auflösungsleistung durch Verwendung längerer Säulen realisiert werden. Aufgrund dieser Entwicklungen können komplexe Mischungen effektiv getrennt werden, während kleinere Mengen an mobilem Lösungsmittel in LC und eine minimale Analysezeit in GC verwendet werden. Eine Diskussion dieser Entwicklungen findet sich in F.J. Yang "Fused-Silica Narrow-Bore Microparticle-Packed-Column High-Performance Liquid Chromatography", Journal of Chromatography, Band 236, S. 265 (1982). Die Resultate dieser Entwicklungen sind, daß neue Chromatographiegeräte und leistungsfähigere Chromatographietechniken geschaffen worden sind.

Während in der Gaschromatographie die höchste Auflösung und Analysegeschwindigkeit unter Verwendung von offenen rohrförmigen Säulen mit engem Innendurchmesser erreicht worden sind (vergl. beispielsweise US-PS 42 93 415), wurde in der Flüssigkeitschromatographie die höchste Auflösung hauptsächlich mit mit Mikropartikeln gepackten Säulen mit engem Innendurchmesser erzielt. Dieser letztere Umstand für die Flüssigkeitschromatographie ist darauf zurückzuführen, daß kleine Partikel (beispielsweise <_ 10 pm) wirksam in langen Stücken von Säulen mit engem Innendurchmesser gepackt werden können. Eine Diskussion dieser Entwicklungen in der HPLC, im Gegensatz zu Entwicklungen in der Gaschromatographie findet sich beispielsweise in F.J. Yang "Narrow-Bore Microparticle-Packed Column High-Performance Liquid Chromatography", J. Chromatography, Proceedings, The VI International Liquid Column Chromatography Conference (1982).

Da mit Mikropartikeln gepackte Säulen mit kleinem Innendurchmesser Leistungsvorteile bei HPLC und sogar bei GC bieten, ist es deshalb erforderlich, daß befriedigende Säulen und Packungsmaterialien und -techniken entwickelt werden, um solche Säulen zu packen. Die älteren Schwerkraftverfahren zum Packen von Säulen haben sich bei Säulen mit engem Innendurchmesser nicht als befriedigend erwiesen. Vergl. G.H. Lathe et al. "Separation of Substance and Estimation of Their Relative Molecular Sizes by the Use of Columns of Starch in Water", Biochemical Journal, Band 62, S. 665 (1950) und P. Flodin, "Methodological Aspects of Gel Filtration with Special Reference to Desalting Operations", Journal of Chromatography, Band 5, Nr. 2, S. 103 (1961). Eine Technik zum Packen von Säulen mit engem Durchmesser besteht darin, eine konventionelle Glassäule zu packen und dann die Säule zu erwärmen und auf einen kleineren Durchmesser zu ziehen. Stationäre Phasen für LC wurden dann in situ gebunden. Vergl. M. Novotny et al. "Packed Microcapillary Columns in High Performance Liquid Chromatography", Anal. Chem., 5(3 271 (1978). Mit dieser Technik erhaltene Produkte unterscheiden sich von konventionell gepackten Säulen darin, daß die Säulen ein kleines Verhältnis Säulendurchmesser zu Partikel größe haben, im Bereich von-etwa 2 bis 3. Der Nachteil dieses Lösungsweges besteht darin, daß aufgrund der verwendeten relativ großen Partikel größen das Betriebsverhalten der gepackten Mikrokapillarsäulen deutlich schlechter als das von Säulen mit konventionellem Durchmesser von 4 bis 5 mm ist, die mit 5 pm Partikeln gepackt sind. Partikel größen kleiner als 30 pm können unter Verwendung dieser Technik nicht gepackt werden, und zwar aufgrund von Verstopfung und der Schwierigkeit, eine gleichförmige Packung zu erzielen. Ersichtlich wird es allgemein schwierig, immer engere Säulen mit Mikropartikeln zu packen, da der Innendurchmesser der Säulen sich der Partikelgröße nähert, so daß eine ungleichförmige Packung und ein Verstopfen der Säulen auftreten kann, oder das Produkt kann hohen Strömungswiderstand für das Lösungsmittel aufweisen, und wenn die Säulenlängen vergrößert werden, verschärft sich das Problem noch.

Andere Säulenpackungstechniken zum Packen von LC-Säulen mit 4 bis 5 mm ID sind ebenfalls bekannt. Dazu gehört die balancierte Aufschlämmungs-

packung, die von R.E. Jamors, Anal. Chem. 44 1722, 1723 (1972) und J.J. Kirkland, J. Chromatogr. Sei., _9 206, 207 (1971) für gepackte LC-Säulen entwickelt worden ist, und konventionelle Trockenbettpackung mit Hochdruck-Luftkompression, wie sie mit GC-Säulen verwendet wird. Für Säulen mit kleinem Durchmesser, beispielsweise Säulen mit Innendurchmessern von 500 ym oder weniger, ist es bekannt, die Partikel in eine Aufschlämmung einzubringen und die Aufschlämmung durch die Säule strömen zu lassen. Vergl. beispielsweise die Broschüre "LC Slurry Packing Kit", Scientific Systems, Inc. State College, PA 16801. Die Aufschlämmungspackungstechnik wird typischerweise in der Weise durchgeführt, daß eine Strömung der Aufschlämmung durch die Säule herbeigeführt wird, die Strömung gestoppt wird, man die Flüssigkeit ablaufen läßt und die dann in der Säule vorhandenen Partikel behält. Studien dieser Technik haben die Beziehung zwischen der Packungsgeschwindigkeit und der Säulengröße bewertet, vergl. beispielsweise Y. Kato et al., "Packing of Toyopearl Column For Gel Filtration", J. Chromatography, Band 205, Seite 185 (1981), Band 206, S. 135 (1981),und haben gezeigt, daß Packen mit semikonstantem Druck mit variabler Strömungsgeschwindigkeit zum Packen von Säulen für die Gelfiltration bevorzugt werden können (vergl. Y. Kato et al., "Packing of Toyopearl Columns For Gel Filtration, 111, Semi-Constant Pressure Packing", J. Chromatography, Band 208, S. 71 (1981).

Gemäß D. Ishii et al., "Development of Technique for Miniaturization of High-Performance Liquid Chromatography", J. Chromatography, Band 144, S. 157, 1977, wurde eine Säule aus PTFE-Schlauch von 0,5 mm ID und 1,0 mm Außendurchmesser mit einer Aufschiämmungspackungstechnik präpariert. Es wurde ein Schlauch ausgewählt, der mehrere Male länger war als für die endgültige Säule benötigt. Die stationäre Phase wurde in einem geeigneten Lösungsmittel als Aufschlämmung suspendiert, und die Aufschlämmung wurde in eine kleine Flasche gegeben. Eine luftdichte Spritze von 250 Mikrouter wurde mit dem Schlauch verbunden und sie wurden mit dem Lösungsmittel gefüllt, das zum Präparieren der Aufschlämmung verwendet war. Das untere Ende des Schlauches wurde dann in die Aufschlämmung eingetaucht, die Spritze wurde an einen Mikrofeeder angeschlossen und die Aufschlämmung wurde zum oberen Ende des Schlauches entweder durch manuelle oder elektrische Betätigung des Feeders gesaugt. Das untere

Ende des Rohres wurde dann dicht mit einer kleinen Menge Quarzwolle verstopft, um das Packungsmaterial daran zu hindern, herauszulecken. Der Mikrofeeder wurde manuell oder elektrisch betätigt, um das Lösungsmittel zu entladen. Die resultierenden Säulen haben eine schlechte Stabilität des gepackten Bettes und werden bei hohen Durchflussraten und hohen Säuleneinlaßdrucken leicht verformt. Für die Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) sind sie nicht geeignet.

Durch die Erfindung soll deshalb ein Verfahren zum Packen von Säulen mit hohem Wirkungsgrad und kleinem Innendurchmesser verfügbar gemacht werden, die aus geschmolzenem Quarz, Glas, rostfreiem Stahl oder mit Glas ausgekleidetem rostfreiem Stahl bestehen.

Weiter soll durch die Erfindung ein Verfahren zum gleichförmigen Packen einer Chromatographiesäule mit engem Innendurchmesser über ihre Länge mit Mikropartikeln mit einem Durchmesser im Bereich von 3 Mikron bis 10 Mikron für die Flüssigkeitschromatographie und 3 Mikron bis 100 Mikron für die Gaschromatographie verfügbar gemacht werden.

Weiter soll durch die Erfindung eine Chromatographiesäule mit engem Innendurchmesser, die mit Mikropartikeln gepackt ist, mit gleichförmig niedriger Porosität und einem stabil gepackten Bett verfügbar gemacht werden.

Ferner soll durch die Erfindung eine Säule mit Enden zum Anschluß an die Injektor- und Detektor-Schnittstelle verfügbar gemacht werden, die einen optimalen Säulenwirkungsgrad und optimale Stabilität des gepackten Bettes erreicht.

Die Erfindung soll anhand der Zeichnung näher erläutert werden; es zei gen:

Fig. 1 einen Schnitt durch eine Vorrichtung zum Packen einer Chromatographiesäule mit engem Innendurchmesser nach dem erfindungsgemäßen Verfahren;

Fig. 2a-2e Längsschnitte durch alternative Endstücke zur Verwendung am Ende einer Chromatographiesäule mit kleinem Innendurchmesser, wenn diese nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gepackt wird;

Fig. 3 ein Flußdiagramm des erfiηdungs gemäßen Säulenpackverfahrens;

Fig. 4a eine Wiedergabe einer Photographie eines vollständigen

Querschnittes durch eine Säule;

Fig. 4b eine Wiedergabe einer Photographie eines Tei!-Querschnitts

durch eine Säule am Einlaßende der Säule nahe der Mitte der Säule;

Fig. 4c eine Wiedergabe einer Photographie eines Teil-Querschnitts

durch eine Säule am Einlaßende der Säule nahe der Wand;

Fig. 4d-4e Wiedergaben von Photographien von Tei!-Schnitten durch eine Säule am Auslaßende der Säule nahe der Wand;

Fig. 5 eine Van Deemter-Leistungskurve für eine mit Mikropartikeln

gepackte Säule mit kleinem Innendurchmesser mit 330 ym ID und 3 ym C^gBonded-Phase-Partikeln, wobei die Testverbindung Pyren war;

Fig. 6 ein Chromatogramm, das die Trennung einer Mischung aus

polynuklearen aromatischen Kohlenwasserstoffen zeigt; und

Fig. 7 ein Chromatogramm, das die Trennung einer EPA-Priorität-

Verunreinigung-PNA-Probe unter Verwendung einer 320 ym χ Im, 3 ym C,g Revers-Phasen-Säule zeigt.

-fi-40-

Zusammenfassung der Erfindung

Es wird ein Verfahren zum Packen von Chromatographiesäulen mit enger Bohrung vorgesehen. Eine flexible Säule mit einem Innendurchmesser kleiner als 500 Mikrometer wird ausgewählt. Eine Aufschlämmung wird in einem Reservoir aus einem mobilen Lösungsmittel und Partikeln spezifizierten Durchmessers gewählt. Für die Flüssigkeitschromatographie liegt die Partikel größe im Bereich von 3 pm bis 10 pm, für die GasChromatographie reicht die Partikel größe von 3 pm bis 100 ym. Am Ende der Säule wird eine End-Behinderung oder -Verengung vorgesehen, um den Durchfluß des mobilen Lösungsmittels zu erlauben und den Durchtritt von Partikeln aus dem Ende der Säule heraus zu behindern. Das Reservoir wird an der Säule angebracht und die Aufschlämmung strömt unter Druck in die Säule. Eine zweistufige Drucksequenz wird dazu verwendet, zunächst das Partikel bett aufzufüllen und zu formen, und dann das Bett gleichförmig zu komprimieren. Es wird also ein Anfangsdruck für eine Anfangszeitspanne aufrechterhalten, vorzugsweise weniger als 10 Min. Anschließend wird der Druck vom Anfangsdruck auf einen Maximaldruck für eine zweite Zeitspanne angehoben. Das Produkt ist eine stabile, jedoch lose gepackte Säule mit einer hohen Plattenzahl pro Längeneinheit.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Das letzte Ziel beim Packen von Säulen besteht darin, reproduzierbar gleichförmige Verteilungen des Packungsmaterials sowohl quer zu den Säulen als auch längs der Länge der Säulen zu erhalten. Solche gleichförmig gepackten Säulen neigen dazu, ein hohes Auflösungsvermögen zu haben, und sind zum Gebrauch bei der Hochgeschwindigkeitsanalyse geeignet. Wie oben besprochen, sind bereits Schwerkrafts-, Trockenpackungsund Aufs chiämmungspackungs-Techniken verwendet worden. Als die Säulendurchmesser enger wurden, beispielsweise <^500 pm, wurden sie immer schwieriger in reproduzierbarer Weise zu packen. Eine schlechte Gleichförmigkeit war das Resultat aufgrund von Wandeffekten, wenn konventionelle Aufschlämmungspackungstechniken verwendet worden sind.

Mikropartikel kleiner als 5 Mikrometer waren besonders schwierig zu packen und eine ungleichförmige Packungsdichte sowie eine geringe Porosität waren das Resultat.

Wie sich aus Tabelle I ergibt, haben sich bei der Entwicklung von mit Mikropartikelη gepackten Säulen mit engem Innendurchmesser für HPLC gewisse Säulenkategorien herausgeschält.

Tabelle I

Bezeichnung ' Innendurchmesser Partikel größe Strömungs-

der Säule (pm) (pm) rate (yl/min)

Ungepackte Mikro- ~ """ <<0_;01 kapillare

Gepackte Mikro- ⁵⁰~ 200 10-100 <o,l kapi11 are

Gepackt, kleiner 500-1000 5- 20 20-100

Innendurchmesser ^{κυ 1UU}

Gepackt, enger

"Innendurchmesser 50- 500· . 3- io LC ο 1-20

3- 100 GC

Jede Kategorie hat ihren eigenen Bereich für Säuleninnendurchmesser, Partikel größe und Strömungsrate. Die Mikrokapillarsäulen sind zwar potentiell schwierig herzustellen, sie erfordern jedoch nur kleine Mengen Packungsmaterial und sind im Betrieb wirtschaftlich, da sie nur kleine Mengen Lösungsmittel brauchen. Beim Packen von Säulen mit engen Innendurchmessern ist es, wie bereits betont, notwendig, über die volle Länge der Säule gleichförmig zu packen; es ist auch notwendig, zu vermeiden, daß die Säule an irgendeiner speziellen Position längs der Säule zu eng gepackt wird, da eine solche enge Packung den Fluß des mobilen Lösungsmittels durch die Säule im Betrieb unzulässig behindern könnte. Zusätzlich ist es auch erwünscht, eine gleichförmige Packungsdichte über den Durchmesser der Säule zu erhalten, um eine hochwirksame Trennung zu erzielen, Die Charakteristiken der speziellen, nach dem erfindungsgemäßen gepackten Säulen bestehen darin, daß (a) lange Säulen mit enger Bohrung effizient mit Partikeln von nur 3 pm gepackt werden und (b) daß sie eine Porosität haben, die klein genug ist, um eine wirksame Trennung zu erlauben, aber daß (c) aufgrund der gleichförmigen und stabilen Partikel verteilung die Säulen doch mit einer hohen Strömungsrate (0,1 - 20 μΐ/nrin) betrieben werden können.

In der bevorzugten Au sflih rungs form des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Säule mit einem Innendurchmesser im Bereich von weniger als 500 ym aus geschmolzenem Quarz, Glas, rostfreiem Stahl oder mit Glas ausgekleidetem rostfreien Stahl ausgewählt. Die Säule wird an eine Aufschlämmungs-Reservoir-Vorrichtung der in Fig. 1 gezeigten Art angeschlossen. Eine Säule 10 mit engem Innendurchmesser, die aus einem Kapillarrohr 11 aus geschmolzenem Quarz besteht, ist in ein Rohr 13 aus rostfreiem Stahl eingesetzt. Ein Ende des Rohres 13 sitzt in einem Verbindungsstück 12, und das andere Ende sitzt in einem Verbindungsstück 16 und wird mit einer Zwinge 15 an Ort und Stelle gehalten. Das Aufschiämmungsreservoir 17 ist ebenfalls in das Verbindungsstück 16 eingesetzt; das Aufschlämmungsreservoir 17 steht über Verbindungsstück 20 mit einer nicht dargestellten Pumpe in Verbindung. Das Ende der Säule 10 ist damit durch Rohr 13 so eingesetzt, daß sie an das untere Ende des Aufschlämmungsreservoirs 17 anstößt. Das unter Ende der Wand

des Reservoirs 17 ist so geformt, daß sie mit der Innenwand 14 des Verbindungsstückes 16 fluchtet. In der bevorzugten Ausführungsform, die in Fig. 1 dargestellt ist, ist die Innenwand des Verbindungsstückes 16 in der Mitte trichterförmig, und so ist der untere Teil der Wand in ähnlicher Weise trichterförmig. Am Ende trifft die Wand 19 auf das obere Ende des Rohres 13. Das obere Ende des Kapillarrohrs 11 steht deshalb nur mit der Aufschlämmung 18 in Verbindung, so daß während des Packens die Aufschlämmung glatt in das Ende der Säule 10 strömt. Wie dargestellt, hat das untere Ende des Trichters vorzugsweise einen dem Innendurchmesser der Säule 10 vergleichbaren Durchmesser, so daß ein Strömungswiderstand aufgrund des Türeffektes vermieden wird; während des Packens strömt die Aufschlämmung gleichförmig in das Ende der Säule 10.

Während des Packungsprozesses ist ein Partikelrestriktor mit dem stromabwärtigen Ende der Säule verbunden. Wie noch erläutert und in den Photographien Fig. 4a bis 4e dargestellt ist, erlaubt der Restriktor, eine Packung mit gleichförmig niedriger Porosität zu erhalten. Im Gegensatz zu der einleitend erwähnten Lösung von Ishii u.a. wird der Partikelstrom in der Aufschlämmung unter Hochdruck am Ende der Säule gestoppt, und die Partikel werden im Bett gesammelt und gleichförmig gepackt. Während des Packungsprozesses sorgt der Restriktor für einen Gegendruck und erlaubt es dem Lösungsmittel, aus dem Ende der Säule herauszuströmen, hält jedoch die Packungsmaterialien in der Säule zurück. Typischerweise haben die Packungsmaterialien einen Durchmesser im Bereich von 3 bis 10 ym für LC und 3 bis 100 pm für GC.

Als Restriktoren können verschiedene Formen verwendet werden. Gemäß Fig. 2a wird ein Draht 28 nach oben in das Ende der Säule 25 eingeschoben, die über ihre ganze Länge eine äußere Schutzschicht 26 trägt. Der Drahteinsatz 28 hat einen Durchmesser, der geringfügig kleiner ist als der Innendurchmesser der Säule 25, so daß Lösungsmittel aus der ringförmigen öffnung 29 aus der Säule ausströmen kann. Die Abmessung der ringförmigen öffnung 29 ist klein genug, so daß die Säulenpackungspartikel 27 nicht hindurchtreten. Wenn einmal die Säule entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren voll gepackt ist, kann der Draht abgezogen und

ein poröser Stopfen eingesetzt werden. Die Forderung an den Stopfen besteht darin, daß mobiles Lösungsmittel hindurchströmen muß, er muß jedoch die Partikel permanent auf den Säulenkörper beschränken. Eine zweite Type .eines Strömungsrestriktors ist in Fig. 2b dargestellt. Eine dickwandige Säule 30 aus geschmolzenem Quarz (fused silica), die eine kleine Zentral bohrung 32 hat und deren Außendurchmesser etwa gleich dem Innendurchmesser der Säule 25 ist, wird in das Ende der Säule 25 eingesetzt und haftet dort. Lösungsmittel strömt durch die Zentralbohrung der Säule 30, aber die Packungspartikel 27 werden daran gehindert, aus der Säule 31 auszutreten, und zwar durch die Enge der zentralen öffnung 32. Eine dritte Art Restriktor ist in Fig. 2c dargestellt. Die Säule ist in einen Anschlußschlauch 33, beispielsweise Teflonschlauch (Polytetrafluorethylen) eingesetzt, dessen Innendurchmesser etwa gleich der Größe des Außendurchmessers der Säule 25 ist. Ein Einsatzstopfen 31 ist gegen das Ende der Säule 25 gezwängt. Eine Säule oder ein Schlauch ist mit dem Einsatz 31 als Detektorschnittstelle verbunden. Die öffnung durch den Stopfeneinsatz 31 ist ausreichend eng, um den Durchtritt von Partikeln 27 zu verhindern. Zusätzlich zum Stopfeneinsatz 31 gemäß Fig. 2c kann der Einsatz ein Draht 39 in einer Säule 37 sein, wie in Fig. 2d dargestellt. Ein anderer Typ eines Restriktors ist in Fig. 2e dargestellt. Es handelt sich hier um eine Variante, die bei jeder der oben genannten Konfigurationen angewandt sein kann. Hier werden zunächst größere Partikel 35 in das Ende der Säule oder an die Schnittstelle zum Endrestriktor 31 (oder irgendeine der eben erläuterten Restriktoranordnungen) gepackt. Die größeren Partikel werden so ausgewählt, daß sie groß genug sind, um nicht durch die Öffnung hindurchzutreten, sei es eine ringförmige öffnung (Fig. 2a, 2d),der Innendurchmesser einer Säule (Fig. 2b) oder die zentrale öffnung eines 'Einsatzstopfens (Fig. 2c). Die kleineren Partikel, die den Arbeitsteil der Säule bilden, werden dann entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren durch die Säule geströmt und füllen die Länge der Säule auf. Die kleineren Partikel werden durch die Schicht aus größeren Partikeln effektiv gestoppt. Der Restriktor, der beim Packungsprozeß für lange Säulen verwendet werden kann, kann auch eine kurze gepackte Säule (beispielsweise eine Säule 4 cm χ 2 mm mit 10 pm Partikeln gepackt)

sein. Nach Beendigung des Packens kann die gepackte Restriktorsäule entfernt werden und ein permanenter Restriktor-Endansatz an Ort und Stelle eingesetzt werden.

Das Aufschlämmungsreservoir wird vorzugsweise mit einer hohen Konzentration (größenordnungsmäßig >_ 20 % Partikel/Volumen) an Packungsmaterial in einem Lösungsmittel, beispielsweise Methanol oder Azeton. Das obere Ende des Reservoirs ist mit einem konventionellen Verbindungsstück 20 mit einer Hochdruckpumpe verbunden, um das Lösungsmittel unter Druck als mobile Phase während des Packens zu liefern. Die Orientierung des Reservoirs 17 und der Säule 10 kann gemäß Fig. getroffen sein; daraus ergibt sich eine Abwärtspackung. Vorzugsweise wird die Säule 10 oberhalb des Reservoirs 17 für einen Aufwärts-Packbetrieb angeordnet, so daß die Mikropartikel sich im Reservoir nicht absetzen und ungleichförmig packen. Um eine gleichförmige Packung zu gewährleisten, wird die Aufschlämmung im Reservoir vorzugsweise bewegt, vorzugsweise durch kontaktfreie Mittel, wie Ultraschalleinrichtungen (nicht dargestellt). Die Aufschlämmung wird dann im Reservoir unter Druck gesetzt, und zwar auf einen Anfangspackdruck. Der anfänglicht Reservoirdruck ist proportional (a) der Säulenlänge, (b) dem Innendurchmeser der Säule und (c) der Partikel größe. Der Druck wird entsprechend Tabelle II für Säulen mit einer Anfangslänge von 50 cm oder länger ausgewählt.

	Tabelle	II	Anfangsdruck (bar)
Säulenlänge (cm)	Säuleninnen durchmesser (mm)		50
50	0.5		150
50	0.3		300
50	0.2		400
50	0.1		200
200	0.5		300
200	0.3		400
200	0.2		500
200	0.1

Wenn der Anfangsdruck erreicht ist, beginnt die Aufschlämmung, durch die Säule zu strömen. Der Reservoirdruck und die Strömung werden auf dem Anfangsdruck für nicht mehr als 10 Minuten gehalten. Dann wird der Druck schrittweise oder linear vom Anfangsdruck, im Bereich von 50 bis 500 bar, bis zu einem Druck von 200 bis 800 bar angehoben. Während der Zeitspanne, in der der Anfangsdruck aufrechterhalten wird, während der Zeitspanne des Druckanstiegs, und während der Betriebszeitspanne mit maximalem Druck strömt das mobile Phase-Lösungsmittel und Partikel werden in die Säule gefegt und gepackt. Am Beginn der Zeitspanne, in der Anfangsdruck aufrechterhalten wird, nähert sich die Strömungsrate 1 ccm/min. Wenn sich die Säule mit Packungsmaterial füllt, verringert sich die Strömungsrate allmählich. Die zweischrittige Drucksequenz (Anfang, dann Maximum) erlaubt es dem Bett, sich gleichmäßig zu formen, und dann enger komprimiert zu werden, bis der Kompressionspegel, der dem Maximaldruck zugeordnet ist, asymptotisch angenähert wird. Die zweistufige Sequenz erlaubt es, Gleichförmigkeit zu erreichen, da das Bett bei nichtturbulenten niedrigen Drucken geformt wird und dann die volle Kompression erreicht wird, sobald die Partikel einmal an Ort und Stelle sind. Wenn der Maximaldruck anfänglich benutzt würde, dann könnten Ungleichförmigkeiten längs der Länge der Säule resultieren. Nach Betrieb beim Maximaldruck für 10 bis 30 Min. wird dann die Pumpe abgeschaltet und der Druck allmählich durch die Säule schrittweise oder linear reduziert. Da die Druckreduktion allmählich erfolgt, ergibt sich keine merkliche Rückwärtskraft, mit der das Packungsmaterial versetzt werden könnte. Die Säule 10 wird dann aus dem Rohr 13 entfernt und wird damit vom Aufschlämmungäreservoir gelöst. Das gepackte Bett wird dann mit einem Chromatographielösungsmittel gespült, um die Säule für die Nutzung in der chromatographischen Analyse vorzubereiten.

Um Säulen etwas dichter zu packen, können kürzere Säulenlängen und höhere Anfangsdrucke verwendet werden. Die Grenze für einen höheren Anfangsdruck wird durch die Nichtgleichförmigkeit hervorgerufen, die eingeführt würde, wenn sich anfangs turbulente Strömung ergäbe. Der Prozeß nach der Erfindung wird in der gleichen Weise durchgeführt,

nur daß der Anfangs-Startdruck entsprechend Tabelle III gewählt wird.

Tabelle III

Säulenlänge im]	Säuleninnen- durchmesser (mm)	Anfangsdruck (bar)
25	0^5	300
25	0,3	400
25	0,2	500
25	0,1	600
50	0,5	400
50	0,3	500
50	0,2	700
50	0,1	800

Nur kurze Säulen können mit solchen höheren Anfangsdrucken gepackt werden, da mit solch hohen Anfangsdrucken gepackte Säulen dichter werden und die Strömung des mobilen Lösungsmittels bei den letzten Längenzunahmen der Länge behindert wurden.

Säulen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren entsprechend Tabelle II gepackt sind, haben geringen Strömungswiderstand. Strömungswiderstandsfaktoren werden im Bereich von 50 bis 400 erhalten, wie durch φ definiert:

A _ ^tAE

Hierin bedeuten: d = Partikel größe

Δρ = Druckgradient über die Säule

u = lineare Strömungsrate des mobilen Lösungsmittels

η = Viskosität des mobilen Lösungsmittels, und L = Säulenlänge

Das Produkt hat eine Porosität >_0,5 und wird als locker gepackte Säule klassifiziert. Für LC-Säulen sind kleine Partikel, beispielsweise 3 bis 10 μπι, die bevorzugten Packungsmaterialien; für GC-Säulen werden Partikel im .Bereich von 3 bis 100 ym bevorzugt. Die Produkte haben im wesentlichen gleichförmige Porosität längs der Länge und über den Durchmesser der Säule, wie in Fig. 4a bis 4d dargestellt. Fig. 4b und 4c zeigen Scanning-Elektronen-Mikroskop-iSEM-J-Aufnahmen von Partikel Verteilungen am Einlaßende einer Säule 1 m χ 0,3 mn ID, die mit 3 pm-Partikeln gepackt ist. Die Figuren zeigen, daß die Partikel-Verteilungen in der Mitte und nahe der Wand des Säulenquerschnittes keine merklichen Unterschiede haben. Die gleichförmige Verteilung der Partikel über den Säulendurchmesser ist evident. Figuren 4d und 4e zeigen Scanning-Elektronen-Mikroskop-Aufnahmen von Partikel Verteilungen am Auslaßende der Säule. Die SEM-Aufnahmen zeigen, daß Partikel größe und -dichte der Verteilung über den Säulendurchmesser am Säulenende gleich sind. Und die Dichte und Gleichförmigkeit der Partikelverteilung gemäß Fig. 4a-b und 4c-d sind gleich. Das deutet die Gleichförmigkeit der Packung längs der Länge der Säule an. Diese Gleichförmigkeit wird durch die Aufnahme des gesamten Querschnittes gemäß Fig. 4a unterstützt. Diese Gleichförmigkeit steht im Kontrast zu Säulen, die mit konventionellen Techniken gepackt sind, bei denen größere Partikel dazu neigen, sich längs der Wände anzusammeln, weil die Wände höhere Widerstandskräfte auf die größeren Partikel ausüben. Diese Gleichförmigkeit ist vorteilhaft, weil keine Extraband-SpreizSffökte auftreten, wenn Proben analysiert werden, und damit sind die Säulen hoch effizient. Für Säulenlängen größer als oder gleich 50 cm werden solche locker gepackten Säulen bevorzugt, weil sie es dem mobieln Lösungsmittel erlauben, mit vernünftigen Strömungsraten in der Größenordnung von 0,1 bis 20 μΐ/min während der Durchführung einer chromatographischen Analyse zu strömen. Obwohl die Porosität hoch ist, wurde festgestellt, daß die Packungsmaterialien sich im Gebrauch nicht absetzen. Das ist darauf zurückzuführen, daß, obwohl die Säulen mit hohem Druck betrieben werden, die gesamte auf das gepackte Bett ausgeübte Kraft klein ist, da die Querschnittsfläche klein ist. Solche Säulen erlauben es, eine schnelle Analyse durchzuführen, weil bei hohen Drucken hohe Strömungsraten erreicht werden können. Da Säulen

mit großer Länge mit Partikeln von 3 pm oder kleiner für LC gepackt werden können, kann ein sehr hohes Auflösungsvermögen erreicht werden.

über die technischen Daten von nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gepackten Säulen einschließlich deren Leistung wird im einzelnen berichtet in F.J. Yang, "Fused-Silica Narrow-Bore Microparticle-Packed-Column High-Performande Liquid Chromatography", J. Chromatography, Band 235, S. 265 (1982) auf Seite 266. Einige der bemerkenswerten Vergleiche zwischen bekannten Säulen und diesen Säulen sind in der folgenden Tabelle IV aufgeführt:

Tabelle IV

Merkmal	Stand der Technik	Erfindung
Säulenplatten- zahl	20.000-30.000 (4,6 mm ID, 25 cm)	200.000 (300 pm ID, 2m)
Spitzen kapazität	50	150 - 200
Lösungsmittel- verbrauch	1 cc/min	2 μl/ml η
Probengröße	1 mg	10 Mikrogramm

Quarzrohr (fused silica) mit Innendurchmessern zwischen 57 und 376 pm und mit Längen bis hinaus zu 2 m wurde mit 3, 5 und 10 ym C^g "Bonded-Phase"-Partikeln unter Verwendung der Packungstechnik nach der Erfindung gepackt. Revers-Phase Octadecylsiloxan wurde chemisch auf das Mikropartikel-Silica gebunden, ehe es in die Mikrobohrungssäulen gepackt wurde. Die mobile Phase war 70 : 30 Azetonitril-Wasser unter isokratischen Bedingungen. Das Auflösungsvermögen der Säulen ist durch die Van Deemter-Kurve in Fig. 5 für Säulen 1 m χ 330 pm ID mit sphärischen 3 pm-C^g "bonded" Silicapartikeln angegeben. Sie zeigt keinen merklichen Strömungsrateneffekt. Für den Strömungsratenbereich zwischen 0,3 und 1,6 mm/sec bleibt die Säuleneffizienz auf ihrem hohen Wert dank der Gleichförmigkeit des gepackten Bettes der Säule.

Die Gesamt-Säulen-Plattenzahl überschritt für den untersuchten Strömungsratenbereich 110.000. Das ist zu vergleichen mit Säulenplattenzahlen von 20.000 für konventionelle Säulen.

Das Auflösungsvermögen des Produkts des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ferner durch die Chromatogramme in Fig. 6 und 7 gezeigt. Fig. 6 zeigt die Trennung einer Mischung von polynuklearen aromatischen Kohlenwasserstoffen mit einer Quarzsäule 320 ym χ 2m, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren mit 3 ym C,g "bonded reverse phase silica"-Partikeln gepackt war. Das mobile Lösungsmittel war 70 % Azetonitril: H₂O und die Strömungsrate betrug 1,8 yl/min. Für die 2 m -Säule war die Gesamt-Säulen-Plattenzahl, gemessen für Pyren mit k¹ = 10 144.000 Platten. Die Gesamteffizienz einer Einzelsäule von 144.000 Platten ist bisher für eine 3 ym-C<₈ -Säule berichtet worden. .Sie demonstriert die Wirksamkeit der Packungstechnik zum Packen langer Säulen mit kleinen Partikeln. In Fig. 7 wurde eine EPA-Prioritäts-Verunreinigungs-PNA-Probe unter Verwendung einer "fused siIica"-Säule 320 ym χ 1 m getrennt, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren mit 3 ym "reverse phase bonded silica"-Partikeln gepackt war. Das mobile Lösungsmittel war 70 % Azetonitril: HoO und die Strömungsrate betrug 0,9 yl/min. Es ist zu beachten, daß die Grundlinienauflösung der PNA-Mischung erhalten wurde. Insbesondere ist die Trennung von Benzo(a)anthrazenund Chrysen zu beachten, die normalerweise in isokratischen Revers-Phasen-Systemen verborgen ist. Die Vorteile der Verwendung von langen, mit Mikropartikeln gepackten Säulen mit enger Bohrung bei der Analyse von komplexen Proben und hinsichtlich der Einsparung an Lösungsmittel sind evident.

Die Auswahl der Säulenmaterialien für Mikropartikelpackungs-Engbohrungs-Flüssigkeits- und Gas-Chromatographie kann aus folgenden Materialien erfolgen: Geschmolzenes Silica, Glas, rostfreier Stahl und mit Glas ausgekleideter rostfreier Stahl. Die Forderung ist, daß das Material inert ist und zu den erforderlichen engen Durchmessern geformt werden kann. Vorzugsweise sind die Materialien, wenn sie mit engen Durchmessern geformt werden, flexibel, so daß große Längen gewickelt werden

werden können, um einen kleinen Raumbedarf zu erhalten. Zusätzlich haben die Materialien vorzugsweise glatte Innenflächen und zeigen sie keine Wandeffekte. Es wurde festgestellt, daß Fused Silica ein bevorzugtes Material ist wegen der extremen Glätte der Innenwände und der Fähigkeit» Wärme durch die Wände abzuleiten; mit dieser Wärmeableitung ergibt sich kein merklicher Temperaturgradient über die Säule. Säulen aus Fused Silica sind auch ideal zum direkten Anschluß an Detektoren, wie Detektoren auf Flammenbasis, Massenspektrographen und Fourier-Transformations-Infrarotdetektoren, da die Strömungsraten an die Strömungsforderungen dieser Detektoren angepaßt sind. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gepackte Säulen haben typischerweise einen Durchmesser kleiner als etwa 500 μπι. Für die Flüssigkeitschromatographie haben sie eine Partikelgröße kleiner als 10 ym und eine Länge größer als 10 cm. Für die Gaschromatographie haben sie eine Partikelgröße kleiner als 100 ym. Die Partikel können körperlich beschichtet sein oder es können irgendwelche Phasen an sie gebonded sein, die für die Gas-, Flüssigkeits-, Gel- oder Ionenaustausch-Chromatographie brauchbar sind.

Claims

VERFAHREN ZUM PACKEN EINER SÄULE MIT KLEINEM INNENDURCHMESSER UND NACH DIESEM VERFAHREN GEPACKTE SÄULE Priorität: 4. Oktober 1982 - USA - Serial No. 432 470 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zum Aufschlämmungspacken einer Säule mit enger Bohrung, bestehend aus folgenden Schritten:

Auswählen einer flexiblen Säule mit einem Innendurchmesser kleiner als 500 μηι;

Verstopfen des Austrittsendes der Säule mit einem Endrestriktor, der es mobilem Lösungsmittel erlaubt, auszuströmen, der den Durchtritt des Packungsmaterials jedoch beschränkt;

Präparieren einer Aufschlämmung aus einem mobilen Lösungsmittel und einem Packungsmaterial;

Einströmen der Aufschlämmung durch die Säule unter Druck auf folgende Weise:

Es wird ein Anfangsdruck angelegt und dieser Anfangsdruck für

eine Anfangsperiode aufrechterhalten;

der Druck wird vom Anfangsdruck auf einen Maximaldruck angehoben;

und

der Maximal druck wird für eine zweite Zeitspanne aufrechterhalten.

2. Verfahren zum AufschTämmungspacken einer Engbohrungssäule speziell für die Gaschromatographie nach Anspruch 1, bei dem das in der Aufschlämmung verwendete Packungsmaterial aus Partikeln zusammengesetzt ist, die einen Durchmesser im Bereich von 3 um bis 100 pm haben.

3. Verfahren zum Aufschlämmungspacken einer Engbohrungssäule speziell für die Flüssigkeitschromatographie nach Anspruch 1, bei dem die Aufschlämmung mit einem Packungsmaterial hergestellt wird, das aus Partikeln zusammengesetzt ist, die einen Durchmesser im Bereich von 3 um bis 10 μπι haben.

4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, bei dem ein Anfangsdruck entsprechend der folgenden Tabelle angelegt wird und dieser Anfangsdruck für eine Anfangszeitspanne von weniger als 10 Minuten aufrechterhalten wird:

Säulenlänge (cm) Säuleninnendurchmesser (mm) Anfangsdruck (bar)

50 0,5 50 50 0,3 150 50 0,2 300 50 0,1 400 200 0,5 200 200 0,3 300 200 0,2 400 200 0.1 500

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4 ,bei dem der Maximaldruck für eine Zeitspanne von mehr als 10 Minuten aufrechterhalten wird.

dem

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5,bei/nach dem Präparieren

der Aufschlämmung und vor dem Einströmen der Aufschlämmung durch die Säule unter Druck die Aufschlämmung bewegt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6^ bei dem die Aufschlämmung durch Ultraschall bewegt wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche λ-7_} bei dem zum Verstopfen des Ausgangsendes der Säule ein Rohr mit enger Bohrung verwendet wird., das die Strömung des mobilen Lösungsmittels erlaubt, den Durchtritt des Packungsmaterials jedoch beschränkt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7, bei dem das Ausgangsende der Säule mit einem Draht in der Weise verstopft wird, daß eine Ringpassage zwischen dem Draht und der Säule gebildet wird, um das Strömen des mobilen Lösungsmittels zu ermöglichen und den Durchtritt des Packungsmaterials zu beschränken.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche I^bei dem zum Verstopfen des Ausgangsendes der Säule eine Hülse über dem Ende der Säule aufgebracht wird und ein Stopfen mit enger Bohrung in die Hülse eingesetzt wird, der an das Ende der Säule anstößt.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7, bei dem zum Verstopfen des Ausgangsendes der Säule eine Hülse über das Ende der Säule geschoben wird, eine Verlängerungssäule in die Hülse bis zum Anstoßen an das Ende der Säule eingesetzt wird, und in das Ende der Verlängerungssäule eine Nadel eingesetzt wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8-11_;bei dem nach dem Verstopfen des Endes der Säule und vor dem Einströmen der Aufschlämmung unter Druck durch die Säule an das Ende der Säule angrenzend an den Endrestriktor eine Sammlung von Partikeln gebracht wird, deren Durchmesser größer ist als derjenige der das Packungmaterial bildenden Partikel, um auf diese Weise eine Sperrschicht für das Packungsmaterial zu bilden.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche i-^bei dem die flexible Säule aus den Werkstoffen Quarz (Fused Silica), rostfreier Stahl oder mit Glas ausgekleideter rostfreier Stahl ausgewählt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13^bei dem eine flexible Säule aus Quarz mit einer Länge größer als 50 cm ausgewählt wird.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-14_>bei dem nach dem Aufrechterhalten des Maximaldrucks für eine zweite Zeitspanne der Druck der Aufschlämmung in der Säule allmählich reduziert wird.