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Allgemeiner
Stand der Technik
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Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung
sowie ein Verfahren zur Trennung menschlicher oder tierischer Zellenfraktionen
verschiedener Dichte von in Zellendispersionen vorhandenen Zellbevölkerungen.
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Es ist bekannt, daß menschliche
oder tierische Zellen verschiedene Dichten aufweisen (im allgemeinen
zwischen 1,04 g/cm3 und 1,1 g/cm3), und daß jeder Zellentyp seine eigene
charakteristische Dichte besitzt.
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Es ist ebenfalls bekannt, daß es häufig wichtig
und notwendig ist, unterschiedliche Zellentypen zwecks ihrer möglichen
Konzentrierung oder Klärung von
einer Dispersion einer heterogenen Zellbevölkerung zu trennen. Dies ist
entscheidend, um biochemische und funktionelle Analysen sowohl an
normalen Zellen sowie an neoplastischen Populationen ausführen zu
können.
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Je feiner und sorgfältiger die
Trennung der Zellen unterschiedlicher Dichte, um so rascher erfolgt die
Trennungsoperation, und die erhaltenen Daten sind gleichermaßen gut
und nützlich,
mit entsprechenden Vorteilen für
das praktische Verfahren.
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Wenn man beispielsweise bedenkt,
daß gewisse
Zellentypen im Blut bzw. im menschlichen Gewebe in äußerst geringen
Mengen vorkommen, ist es augensichtlich, daß sich aus ihrer effizienten
und raschen Kennzeichnung die Möglichkeit
eines chemischen, biologischen oder medizinischen Eingriffes ergeben
könnte,
der sonst unmöglich
oder nur hypothetisch bleiben würde.
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Die derzeit gebräuchliche fortschrittlichste Zellentrennungstechnik
verwendet eine aus einem Gehäuse
mit einer inneren Hohlkammer bestehende Trennvorrichtung. Die letztere
ist seitlich durch geneigte Wände
begrenzt, wobei der größte Querschnitt in
der Nähe
des Endes bzw. der Basis liegt, wovon eine Rohr- bzw. eine Leitungsöffnung an
eine peristaltische Pumpe anschließbar ist. Der Hohlraum verengt
sich in der Richtung des entgegengesetzten Gehäuse-Endes bzw. -Kopfes, der
eine Ausgangsöffnung
aufweist. Eine Flüssigkeit
wird erst durch die peristaltische Pumpe und einen Gradientenmischer in
den unteren Hohlraum der Trennvorrichtung eingeführt. Die Flüssigkeitsdichte steigt allmählich mit
der im Hohlraum zunehmenden Flüssigkeitsmenge
an, bis dieser gefüllt
ist. Der Hohlraum der Trennvorrichtung ist daher mit einer Flüssigkeit
gefüllt,
die sich praktisch aus aufeinanderfolgenden und kontinuierlichen
Flüssigkeitsschichten
zusammensetzt, die in ihrer Dichte vom Kopf zur Basis der Vorrichtung
hin zunehmen. Zu diesem Zeitpunkt wird die Flüssigkeitszufuhr eingestellt
und eine zur Trennung in homogene Dichtefraktionen bestimmte Dispersion
der Zellbevölkerung
wird durch die Öffnung
im Kopf eingeführt, bis
der obere Hohlraumbereich gefüllt
ist; gleichzeitig mit der Einführung
der Dispersion, wird ein entsprechendes Volumen der anfänglich eingeleiteten
Flüssigkeit
an der Basis der Trennvorrichtung abgeleitet, so daß die Dispersion
der Zellbevölkerung
in den Vorrichtungshohlraum fallen kann.
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Die Trennvorrichtung wird alsdann
in eine Zentrifuge eingeschlossen, deren Drehachse während der
Zentrifugierung senkrecht zur Achse und in der Nähe des Kopfendes der Trennvorrichtung
liegt. In der Zentrifuge wird auf der in der Vorrichtung eingeschlossenen
Flüssigkeit
eine sehr hohe Kraft (beispielsweise 400 g) ausgeübt, die
eine Verteilung der Dispersion der Zellbevölkerung in der Flüssigkeit
in Form von Zellenbändern
(oder Schichten) verschiedener Dichte ergibt.
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Die Trennvorrichtung wird anschließend der Zentrifuge
entnommen und eine sehr dichte, mit Wasser unmischbare Flüssigkeit
wird in die Basis eingeleitet, die eine Ausstoßung (durch die Öffnung im
Kopf derselben Vorrichtung) der schon beschriebenen fraktionierten
Zellendispersion zur Folge hat: die gewünschte Anzahl (beispielsweise
10 oder 12) unterschiedlicher Dispersionsfraktionen mit zunehmendem
Dichtegradienten wird durch den Kopf der Trennvorrichtung extrahiert,
wobei die in der jeweiligen Fraktion vorhandenen Zellen zu den benachbarten
Fraktionen unterschiedliche Dichten aufweisen.
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Die obenerwähnte kurz dargestellte Vorrichtung
und Verfahrensweise sind im Einzelnen von Giammaria Sitar und Piermaria
Fornasari in HAEMATOLOGICA, Vol. 74, N1, Jan.–Feb. 1989; und von Pretlow
II TG und Pretlow TP, eds. Cell Separation: method and selected
applications, New York, Academic Press, 1982 (5 volumes) beschrieben.
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Das obenerwähnte Rückgewinnungssystem unterschiedlicher
getrennter Zellenfraktionen hat jedoch seine Grenzen und weist einige
ernste Probleme auf. Tatsächlich
erfolgt die Gewinnung der verschiedenen und aufeinanderfolgenden
Zellenfraktionen durch eine kleine Öffnung im Kopfende der Trennvorrichtung
und unter dem Druck einer in die Basis eingepumpten dichten Flüssigkeit.
Dies erzeugt eine hydrodynamische Störung in den verschiedenen benachbarten
Schichten mit unterschiedlicher Zellendichte, und verursacht die
(Feldtechnikern wohlbekannte) Ausweitung der Schichten oder Bänder, worin
die Zellen verschiedener Dichte gesammelt bzw. verteilt sind, was
eine Kontraktion der Flüssigkeitsdichten
zur Folge hat, die die Bänder trennen,
in welchen die Zellen mit vorwiegender homogener Dichte gesammelt
sind und die von Band zu Band unterschiedlich sind, was sogar zu
einem Wiedervermischen der verschiedenen, während der Zentrifugierung getrennten
Zellenfraktionen führen
kann. Dieses Phänomen
ist um so ernster und unakzeptierbarer, um so enger die Bänder in
denen die Zellen gesammelt worden sind, und um so kleiner der Abstand
ist, der eine Zelle von der anderen absondert.
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Bei einem Versuch, diese Probleme
zu mindern, wird die Druckflüssigkeit
in die Basis der Trennvorrichtung mit äußerster Langsamkeit eingeführt, ein
Umstand, der aber längere
und unannehmbare Zeitfristen zur Einsammlung der verschiedenen Zellenfraktionen
bedingt. Siehe die bereits erwähnten Veröffentlichungen
von Giammaria Sitar und Piermaria Fornasari; sowie TULP, Anal. Biochem.
1981, Vol. 117, Seiten 354–365.
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Beschreibung
der Erfindung
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Der Hauptzweck dieser Erfindung liegt
darin, eine Vorrichtung und ein Verfahren ausfindig zu machen, das
eine einfache und sehr klare Gewinnung von Zellenfraktionen zuläßt, die
in der Vorrichtung nach der Zentrifugierung getrennt worden sind.
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Ein weiterer Zweck liegt darin, die
Rückgewinnung
der verschiedenen Zellenfraktionen in kürzerer Zeit als derzeit möglich zuzulassen
und dadurch die Gewinnung nützlicher
Daten zu ermöglichen,
die ansonsten unbrauchbar gewesen wären.
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Die oben erwähnten Zwecke werden unter anderem
durch eine Trennvorrichtung mit Basis und Kopf erreicht, die eine
verlängerte
Kammer mit einem von der Basis zum Kopf der Vorrichtung hin abnehmenden
Querschnitt umfaßt,
wobei der Kopf mindestens einen ersten Kanal, dessen eines Ende
in das Innere der erwähnten
Kammer in der Nähe
der Basis mündet,
und dessen anderes Ende an eine Druckflüssigkeitsquelle anschließbar ist,
sowie einen zweiten Kanal enthält,
dessen eines Ende sich in dieselbe Kammer in einer dem Kopf der
Vorrichtung entsprechenden Höhe öffnet und
dessen anderes Ende sich zu einer Röhre außerhalb der erwähnten Vorrichtung hin öffnet, dadurch
gekennzeichnet, daß in
der erwähnten
Vorrichtung noch mindestens ein zusätzlicher Kanal enthalten ist,
dessen eines Ende sich in einer Zwischenhöhe der erwähnten Kammer öffnet und
dessen anderes Ende sich außerhalb
der Vorrichtung öffnet,
und daß in
der Nähe
der erwähnten Basis
ein Flußdeflektor
vorgesehen ist, um die vom erwähnten
ersten Kanal einkommende Flüssigkeit gleichmäßig über den
gesamten Querschnitt der erwähnten
Kammer zu verteilen.
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Die Erfindung betrifft außerdem ein
Verfahren zur Trennung von Zellenfraktionen aus Dispersionen menschlicher
oder tierischer Zellbevölkerungen,
wobei die Dispersion einer Zellbevölkerung zunächst in die Kammer der Trennvorrichtung
eingeführt
wird, die vorerst durch eine Flüssigkeit
mit einer von einem Höchstwert
in der Nähe
der Vorrichtungsbasis zu einem Mindestwert in der Nähe des Kopfs variierenden
Dichte gefüllt
worden ist. Die Vorrichtung wird anschließend einer Zentrifugierung
unterworfen, wodurch die Zellen in gesonderte Fraktionen unterschiedlicher
Dichte aufgeteilt werden, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet
ist, daß die Rückgewinnung
der getrennten Fraktion durch die Einführung in die Basis der Vorrichtung
einer sehr dichten, wasser-unmischbaren Flüssigkeit bei gleichzeitigem
Einpumpen eines Gases, das den gleichen Förderdruck wie die sehr dichte
Flüssigkeit
aufweist, durch den Kanal in den Kopf der Vorrichtung erfolgt, so
daß die
geschichteten Zellenfraktionen innerhalb der Kammer komprimiert
und durch das Ende mindestens eines zusätzlichen Kanals an einer Zwischenhöhe der erwähnten Kammer
ausgestoßen werden.
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Es ist bei dem Vorgehen in der oben
beschriebenen Weise festgestellt worden, daß die in der Trennvorrichtung
geschichtet vorgefundenen Zellenbänder nach der Zentrifugierung
in derselben Kammer komprimiert worden waren (anstatt sich auszudehnen,
wie dies bei dem herkömmlichen
Verfahren geschieht) so daß die
verschiedenen Bänder klar
gesondert rückgewonnen
werden konnten, wobei sie von der Kammer (durch die seitlich in
derselben Kammer angebrachten Öffnungen)
ohne jede hydrodynamische Störung,
d. h. ohne Wiedervermischen der Zellenbänder mit den unmittelbar danebenliegenden
Zellenbändern
ausgestoßen
werden konnten.
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Es hat sich weiterhin erwiesen, daß die verschiedenen
Zellenfraktionen bei dem Vorgehen in der beschriebenen Weise mit
größer als
bei der herkömmlichen
Technik möglichen
Geschwindigkeiten getrennt und rückgewonnen
werden konnten, und daß die
Zellenfraktionen, wie schon erwähnt,
sich nicht vermischen.
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Um den Aufbau der Vorrichtung und
das Verfahren der Erfindung besser zu klären folgt nun die Beschreibung
einer als unbeschränktes
Beispiel gebotenen potentiellen Ausführung, unter Bezugnahme zu
beiliegenden Abbildungen.
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Beschreibung der Zeichnungen
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Es zeigen:
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1 eine
schematische Ansicht einer bekannten Zellen-Trennvorrichtung;
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2 eine
schematische Ansicht einer Trennvorrichtung nach der Erfindung;
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3 und 4 in der Längsrichtung
nach den jeweiligen Linien 3-3 und 4-4 der 2 genommene Querschnitte der Vorrichtung.
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Es wird zunächst auf die 1 hingewiesen, die eine Trennvorrichtung
bekannten Aufbaus beschreibt, die aus einem länglichen Gehäuse 1 mit
einem im Innern glockenförmigen
Hohlraum 2, der von einer im wesentlichen konischen Oberfläche (gestrichelte
Linie) begrenzt ist und der einen größeren Querschnitt in Richtung
der Basis aufweist (in Bezug auf das Diagramm), woran der Basiskörper 3 befestigt
ist, der den Hohlraum 2 dicht abschließt. Das Gehäuse 1 ist von einem
Leitungskanal 4 durchquert, aus dessen oberem Ende sich
eine Röhre 5 erstreckt,
und dessen unteres Ende sich in den Hohlraum 2 hinein durch
die im Basiskörper 3 liegenden Kanäle 6 öffnet, wobei
dieser an das Gehäuse 1 in geeigneter
Weise, beispielsweise durch eine Reihe von (nicht dargestellten)
Bolzen oder Schraubverbindungen befestigt ist.
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Gemäß dieser Erfindung ist in der
Nähe der Basis
der Vorrichtung ein Flußdeflektor 11 vorgesehen,
um die von den Kanälen 6 einkommende
Flüssigkeit über den
gesamten Querschnitt der Innenkammer 2 zu verteilen.
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Der Hohlraum 2 ist gegen
den Kopf des Gehäuses 1 hin
verjüngt,
der von einem den Hohlraum mit der Röhre 8 verbindenden
Leitungskanal 7 durchquert wird.
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Wenn man die beschriebene Vorrichtung
zu benutzen wünscht,
wird der Hohlraum 2 in der bekannten Weise unter Verwendung
der Röhre 5,
des Leitungskanals 4 und der Kanäle 6 mit einer Flüssigkeit
gefüllt,
deren Dichte während
der Einführung
in den Hohlraum allmählich
zunimmt, bis dieser gefüllt ist.
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Auf diese Weise wird der Hohlraum 2 mit
einer Flüssigkeit
gefüllt,
die praktisch aus aufeinanderfolgenden und kontinuierlichen Schichten
einer Flüssigkeit
mit vom Kopf zur Basis der Vorrichtung zunehmenden Dichten besteht.
Die Flüssigkeitszufuhr durch
die Röhre 5 wird
darauf eingestellt und die in homogene Zellenfraktionen je nach
Dichte zu trennende Dispersion der Zellbevölkerung wird in den Hohlraum 2 eingeführt, während ein
entsprechendes Flüssigkeitsvolumen
durch die Röhre 5 abgezogen wird.
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Die Trennvorrichtung wird anschließend in eine
Hochgeschwindigkeits-Zentrifuge eingelegt, bis in der Flüssigkeit
die Verteilung der Dispersion der Zellbevölkerung in Form von Zellenschichten
unterschiedlicher Dichte erreicht ist.
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Zu diesem Zeitpunkt wird eine sehr
dichte und mit Wasser unmischbare Flüssigkeit durch die Röhre 5 in
den Hohlraum 2 eingeführt,
was die Ausstoßung
der in der beschriebenen Weise fraktionierten Zellendispersionen
aus der Röhre 8 verursacht und
damit die gewünschte
Anzahl gesonderter Zellendispersionsfraktionen mit zunehmendem Dichtegradienten
sammelt.
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Das mit Bezugnahme auf 1 oben beschriebene Rückgewinnungssystem
der verschiedenen Zellenfraktionen weist das ernstliche Problem auf,
daß die
Ausstoßung
der verschiedenen Zellenfraktionen durch die Röhre 8 gänzlich durch
den Druck der dichten, aus den Kanälen 6 in die Basis
der Vorrichtung eintretenden Flüssigkeit
erfolgt, was demzufolge die wohlbekannte Kontraktion bzw. Ausdünnung der
flüssigen,
die Bänder
trennenden Schichten zufolge hat, worin die Zellen von in sich homogener
aber von Band zu Band unterschiedlicher Dichte gesammelt werden
(was Schwierigkeiten bei der getrennten Sammlung der verschiedenen
Bänder zur
Folge hat). Dies kann zu ernstem und unakzeptierbarem Vermischen
der verschiedenen Zellenfraktionen führen, die während der Zentrifugierung getrennt
worden waren.
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Um obiges Problem zu mindern, wird
die Einführung
der Flüssigkeit
in die Basis des Hohlraumes 2 mit äußerster Langsamkeit ausgeführt, was
bedeutet, daß lange
Zeitfristen für
die Rückgewinnung
verschiedener Zellenfraktionen benötigt werden, was sich, wie
Feldtechnikern schon bekannt, sehr ernstlich auswirken kann.
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Die 2 bis 4 sind Darstellungen einer Trennvorrichtung
gemäß dieser
Erfindung.
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Diese Trennvorrichtung ähnelt der
in 1: der Klarheit wegen
sind dieselben in der 1 verwendeten
Bezugszeichen zwecks Bezeichnung der verschiedenen Teile auch in
den 2 bis 4 übernommen worden.
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Die Trennvorrichtung der 2 bis 4 unterscheidet sich von der in 1 dadurch, daß zwei zusätzliche
Leitungskanäle 9 im
Gehäuse 1 untergebracht
sind (in Wirklichkeit könnten
es mehr als zwei, oder auch nur einer allein sein), wovon sich eine
Röhre 10 aus
dem oberen Ende erstreckt, deren unteres Ende sich auf halber Höhe in das
Innere des Hohlraums 2 hinein öffnet.
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Das Füll- und Zentrifugierungsverfahren
der Vorrichtung in den 2 bis 4 ist unter Bezugnahme auf 1 schon beschrieben worden,
und es soll daher nicht weiter darauf eingegangen werden. Die Rückgewinnungsphase
der verschiedenen getrennten Zellenfraktionen aus der Vorrichtung
ist sehr unterschiedlich. In der Tat erfolgt die Sammlung der getrennten
Fraktionen mittels Einführens
einer sehr dichten wasser-unmischbaren Flüssigkeit in die Basis des Hohlraums 2 (wie
bei der schon bekannten Technik), während gleichzeitig ein Gas
(beispielsweise Luft) durch die Röhre 8 in den Kopf
mit demselben Druck der dichten Flüssigkeit eingepumpt wird, so daß die geschichteten
Fraktionen im Inneren des Hohlraums 2 komprimiert und durch
die Leitungskanäle 9 ausgepreßt werden.
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Es ist beim Vorgehen in der obenerwähnten Weise
festgestellt worden, daß nicht
nur die Rückgewinnung
der verschiedenen im Hohlraum 2 geschichteten Zellenbänder mit
einer viel höheren
Geschwindigkeit als mit der bekannten Technik ausgeführt wird,
sondern auch so geschieht, daß die
Bänder
im Hohlraum 2 (anstatt wie in der bekannten Technik ausgedehnt)
komprimiert und daher in klarer Weise gesondert gesammelt werden
können,
wobei sie vom Hohlraum 2 ohne Erleiden hydrodynamischer
Störungen,
d. h. ohne Wiedervermischung der Zellenbänder mit unmittelbar benachbarten
Bändern,
nach außen
ausgestoßen
werden und dadurch eine klare und rasche Individualisierung von
anfänglich
in der untersuchten Zellbevölkerung
vorhandenen Zellen unterschiedlicher Dichte ermöglichen.
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Um die Verwendung der Vorrichtung
zu erläutern,
soll die Trennung von Zellbevölkerungen
aus dem menschlichen Rückenmark
als Beispiel angeführt
werden.
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Es ist bekannt, daß menschliches
Rückenmark
verschiedene Zellbevölkerungen
unterschiedlicher Dichte enthält
(siehe „Haematologica", Januar–Februar
1997): gewisse Zellentypen sind leicht (niedriger Dichte), andere
mittlerer Dichte und weitere sind schwer (hoher Dichte). Um die
erwähnten Zellbevölkerungen
zu trennen und gesondert zu gewinnen, wird eine wie schon unter
Bezugnahme zu den 2 bis 4 oben beschriebene Trennvorrichtung
verwendet, worin der Hohlraum 2 ein Volumen von 90 ml,
und die verschiedenen Leitungskanäle einen 2 mm Durchmesser aufweisen.
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90 ml Flüssigkeit (mit einem kontinuierlichen Dichtegradienten
zwischen 1.050 und 1.100 g/l) werden durch den Leitungskanal 4 in
die Trennvorrichtung eingeführt.
Dann werden 5 ml einer monodispergierten Zellensuspension des Rückenmarks
durch den Kanal 8 oberhalb der bereits vorhandenen Flüssigkeit
eingeführt.
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Die so gefüllte Zellentrennvorrichtung
wird darauf eine Stunde lang bei 400 g zentrifugiert, um eine aufeinanderfolgende
Schichtung der verschiedenen Zellbevölkerungen in gesonderte Bänder der im
Inneren des Hohlraums 2 der Vorrichtung befindlichen Suspension
zu erreichen. Zur gesonderten Gewinnung der verschiedenen derart
getrennten Zellenfraktionen wird durch den Leitungskanal 4 in
die Basis eine schwere, mit Wasser nicht-vermischbare Flüssigkeit
bei einer Geschwindigkeit von 2 ml/Min eingeführt, während gleichzeitig, durch die
Röhre 8, über den
Kopf Luft mit der selben Flußmenge
(2 ml/Min.) eingepumpt wird. Die Zellenfraktion mittlerer Dichte,
auf der Höhe
der Ausgangsöffnungen
des Leitungskanals 9 auf halber Höhe des Hohlraums 2 wird
dabei komprimiert, aus ihnen herausgepreßt und binnen weniger Minuten
(etwa 5 Minuten) ohne Wiedervermischung mit den übrigen Zellenfraktionen infolge
hydrodynamischer Störungen
gewonnen.
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In ähnlicher Weise genügt es, um
die leichten im oberen Teil der Suspension bzw. die schweren im
unteren Teil derselben Suspension befindlichen Zellenfraktionen
zu gewinnen, die Schichten unterschiedlicher Dichten gegen den Kopf
bzw. die Basis (unter Verwendung der mit den Leitungskanälen 4 und
der Röhre 8 verbundenen
peristaltischen Pumpe) zu bewegen, so daß die gewünschte Zellenfraktion, auf
der Höhe
der seitlichen Ausgangsöffnungen (Leitungskanäle 9)
erhalten wird, worauf in den Hohlraum 2 von der Basis eine
schwere Flüssigkeit
(unter Verwendung der peristaltischen Pumpe) und vom Kopf Luft eingeführt wird,
um die gewünschte
Zellenfraktion durch die erwähnten
seitlichen Ausgangslöcher
zu gewinnen.