ITMI972457A1

ITMI972457A1 - Dispositivo e metodo per la separazione di cellule umane od animali aventi densita' diverse da dispersioni cellulari che le contengono

Info

Publication number: ITMI972457A1
Application number: IT002457A
Authority: IT
Inventors: Giammaria Sitar
Original assignee: Giammaria Sitar
Priority date: 1997-10-31
Filing date: 1997-10-31
Publication date: 1999-05-01
Also published as: AU1486999A; JP2001521755A; WO1999023471A1; DE69817389T2; JP3985185B2; EP1027589B1; ATE247823T1; US6309606B1; CA2307626A1; IT1295939B1; DE69817389D1; EP1027589A1

Description

Descrizione di un'invenzione industriale

DESCRIZIONE

L'invenzione si riferisce sia ad un dispositivo che ad un metodo per la separazione di frazioni cellulari umane od animali aventi densità diverse da popolazioni di cellule presenti in dispersioni cellulari .

E' noto che le cellule umane od animali hanno densità diverse (in generale comprese tra 1,04 g/cm3 e 1,1 g/cm3) e che ogni tipo di cellula ha una sua densità caratteristica.

E' pure noto che è spesso importante e necessario separare da una dispersione di una popolazione eterogenea di cellule, tipi di cellule diverse per eventualmente concentrarle e purificale. Ciò può essere essenziale per rendere possibili le analisi biochimiche e funzionali sia sulle cellule normali che su popolazioni neoplastiche.

Tanto più la separazione di cellule aventi densità diversa è fine ed accurata e tanto più rapida è questa operazione di separazione, altrettanto corrispondentemente buoni e sfruttabili saranno i dati rilevati con conseguenti benefici all'atto pratico. Se si pensa, ad esempio, che alcuni tipi di cellule sono presenti nel sangue o nei tessuti umani in quantitativi estremamente ridotti, è evidente che dalla possibilità di una loro efficace e rapida identificazione possono conseguire possibilità di intervento chimico, biochimico o medico altrimenti impossibile o solo ipotetico .

La tecnica attualmente più evoluta per separare le cellule fa uso di un dispositivo separatore costituito da un corpo avente una"cavità interna delimitata lateralmente da superfici sagomate sostanzialmente coniche con sezione trasversale maggiore in prossimità di una estremità o base in corrispondenza della quale si apre l'estremità di un tubicino o condotto collegabile ad una pompa peristaltica. La cavità si restringe verso la contrapposta estremità o sommità del corpo ove è previsto un foro di scarico. Inizialmente mediante la pompa peristaltica ed un dispositivo formatore di gradienti di densità (noto come " gradient mixer" ) si alimenta alla base della cavità del dispositivo separatore un liquido la cui densità aumenta man mano che aumenta la quantità di liquido immesso nella cavità stessa, fino a riempirla. In tal modo, la cavità del dispositivo separatore risulta riempita con un liquido che è praticamente formato da strati successivi e continui di liquido aventi densità crescenti dalla sommità alla base della cavità del dispositivo. A questo punto si cessa l'alimentazione di nuovo liquido ed attraverso il foro previsto alla sommità della cavità stessa si introduce una dispersione della popolazione cellulare che si vuole separare in frazioni cellulari omogenee per densità fino a riempire la parte superiore della cavità: contemporaneamente alla introduzione della dispersione, dalla base del dispositivo separatore viene prelevato un corrispondente volume di liquido inizialmente introdotto, in modo che la dispersione della popolazione cellulare possa scendere nella cavità del dispositivo.

Il dispositivo separatore viene poi chiuso in una centrifuga il cui asse di rotazione, durante la centrifugazione, risulta perpendicolare all'asse del dispositivo separatore e prossimo alla sua sommità. Nella centrifuga si trasmette una forza molto alta (ad esempio di 400 g) al liquido racchiuso nel dispositivo, con la conseguente distribuzione della dispersione della popolazione cellulare nel liquido sotto forma di bande (o strati) cellulari di densità diverse.

Il dispositivo separatore viene tolto dalla centrifuga ed alla sua base viene alimentato un liquido molto denso non miscibile con acqua che provoca la fuoriuscita {dal foro previsto alla sommità della cavità dello stesso dispositivo separatore) della dispersione cellulare frazionata nel modo descritto: in tal modo, attraverso la sommità del dispositivo separatore viene prelevato il numero desiderato (ad esempio 10 o 12) di distinte frazioni di dispersioni aventi un crescente gradiente di densità, le cellule presenti in ciascuna frazione avendo densità diverse da quelle delle frazioni ad essa adiacenti.

Il dispositivo e la metodologia sopra brevemente menzionate, sono dettagliatamente ed esaurientemente descritte da Giammaria Sitar e Piermaria Fornasari in HAEMATOLOGICA, Voi. 74, N.

1, Jan-Feb. 1989; e da Pretlow II TG e Pretlow TP eds. Celi Separation: method and selected applications, New York, Academic Press, 1982 (5 volumi).

Il sistema di ricupero delle diverse frazioni di cellule separate sopra descritto, presenta però dei limiti e dei gravi inconvenienti. Infatti, il prelievo delle diverse e successive frazioni di cellule avviene attraverso un piccolo foro previsto alla sommità del dispositivo separatore sotto la spinta di un liquido denso che viene pompato alla base del dispositivo stesso. Ciò provoca un disturbo idrodinamico ai diversi strati contigui ove la densità delle cellule è diversa e provoca un allargamento (ben noto ai tecnici del ramo) degli strati, bande o fasce ove sono raccolte e distribuite le cellule a densità diverse, con il conseguente restringimento degli strati di liquido separante le fasce ove sono raccolte le cellule di densità sostanzialmente omogenea e diverse da fascia a fascia il che può addirittura portare al rimescolamento delle varie frazioni cellulari che si erano separate durante la centrifugazione. Questo fenomeno è tanto più grave ed inaccettabile quanto più strette sono le fasce in cui sono state raccolte le cellule e quanto minore è la distanza che separa una cellula dall'altra.

Per cercare di minimizzare questi inconvenienti si cerca di immettere liquido in pressione alla base del dispositivo separatore, con grandissima lentezza, il che però rende inaccettabili ed estremamente lunghi i tempi necessari per procedere alla raccolta delle diverse frazioni cellulari. Si vedano le pubblicazioni di Giammaria Sitar e Piermaria Fornasari già citata; e TULP, Anal. Biochem. 1981, Voi. 117, pages 354-365.

Scopo principale della presente invenzione è quello di realizzare un dispositivo ed un metodo che permettano di prelevare facilmente ed in modo molto netto le diverse fasce di frazioni cellulari che si sono separate nel dispositivo dopo l'operazione di centrifugazione .

Altro scopo è quello di permettere il recupero delle diverse frazioni cellulari in tempi molto più brevi di quelli attualmente possibili, rendendo così possibile di sfruttare in pratica una raccolta di dati che sarebbe altrimenti inutile.

I suddetti ed altri scopi ancora vengono conseguiti con un dispositivo separatore avente una base ed una sommità e delimitante una camera allungata la cui sezione trasversale diminuisce dalla base alla sommità del dispositivo ne quale sono ricavati almeno un primo canale una cui estremità si apre all'interno di detta camera in prossimità di detta base e la cui altra estremità è collegabile ad una sorgente di liquido in pressione ed un secondo canale una cui estremità si apre nella stessa camera in corrispondenza della sommità del dispositivo, caratterizzato dal fatto che in detto dispositivo è ricavato almeno un ulteriore canale una cui estremità si apre in una zona intermedia della lunghezza di detta camera e la cui altra estremità si apre all'esterno del dispositivo.

L'invenzione riguarda anche il metodo di separazione di frazioni cellulari da dispersioni di popolazioni di cellule umane od animali, secondo il quale si introduce anzitutto una dispersione di una popolazione di cellule nella camera di un dispositivo separatore preventivamente riempita con un liquido la cui densità varia da un massimo in prossimità della base del dispositivo ad un minimo in prossimità della sua sommità, e si sottopone quindi il dispositivo con la dispersione cellulare ad una centrifugazione tale da provocare la distribuzione delle cellule in distinte frazioni aventi densità diverse, il metodo essendo caratterizzato dal fatto che il recupero delle frazioni separate avviene alimentando alla base del dispositivo separatore un liquido molto denso non miscibile con acqua e simultaneamente pompando alla sommità della camera dello stesso dispositivo un gas sostanzialmente alla stessa pressione di alimentazione del liquido molto denso, e che le frazioni cellulari che si erano stratificate in tale camera vengono fatte fuoriuscire attraverso almeno un foro ricavato in una zona intermedia della lunghezza di detta camera.

Si è trovato che, procedendo nel modo sopra citato, le fasce di cellule che dopo la centrifugazione si trovavano stratificate nella camera del dispositivo separatore vengono compresse (anziché allargarsi, come avviene invece con la tecnica nota) nella camera stessa, di modo che le varie fasce possono essere recuperate separatamente in modo molto netto, venendo espulse dalla camera (attraverso i fori previsti lateralmente alla camera stessa) senza subire alcun disturbo idrodinamico, il che significa che non si ha alcun rimescolamento delle cellule di una fascia con cellule di una fascia ad essa adiacente.

Si è pure accertato che, procedendo nel modo descritto, le varie frazioni cellulari possono essere separate e recuperate a velocità notevolmente maggiore di quanto non avvenga (con risultati peggiori con la tecnica nota, pur evitando che le frazioni cellulari si- rimescolino tra di loro, come già detto.

Al fine di rendere più chiara la comprensione della struttura del dispositivo e dell'attuazione del metodo secondo l'invenzione, ne sarà ora descritta una preferita realizzazione data a titolo puramente esemplificativo e non limitativo con riferimento agli uniti disegni in cui:

- la Figura 1 è la vista laterale, prospettica e schematica di un dispositivo separatore di cellule di tipo noto

la Figura 2 è analoga alla Fig. 1, ma rappresenta, sempre in modo schematico, un dispositivo separatore secondo l'invenzione e di cui

- le Figure 3 e 4 sono sezioni longitudinali del dispositivo secondo le linee 3-3 e rispettivamente 4-4 di Fig. 2.

Si faccia anzitutto riferimento alla Fig. 1 schematizzante un dispositivo separatore di struttura nota formata da un corpo allungato 1 avente una cavità interna a bicchiere 2 delimitata da una superficie (rappresentata tratteggiata) sostanzialmente conica con sezione trasversale maggiore in prossimità della sua estremità inferiore (rispetto al disegno) ove e fissato un corpo di base 3 che chiude a tenuta la cavità 2. Il corpo 1 è attraversato da un condotto 4 dalla cui estremità superiore si estende un tubicino 5 e la cui estremità inferiore si apre all'interno della cavità 2 attraverso dei canali 6 ricavati nel corpo di base 3 che è fissato al corpo 1 in qualsiasi modo opportuno, ad esempio mediante una pluralità di bulloni (non rappresentati) o mediante un accoppiamento a vite.

La cavità 2 si restringe verso la sommità del corpo 1 che è attraversato da un condotto 7 che pone in comunicazione tale cavità con un tubicino 8.

Allorché si vuole utilizzare il dispositivo illustrato, attraverso il tubicino 5, il condotto 4 ed i canali 6 si riempie in modo noto la cavità 2 con un liquido la cui densità aumenta man mano che tale liquido viene immesso nella cavità, fino a riempirla.

In tal modo, la cavità 2 risulta riempita con un liquido che è praticamente formato da strati successivi e continui di liquido avente densità crescenti dalla sommità alla base del dispositivo. Si cessa quindi l'alimentazione di nuovo liquido attraverso il tubicino 5 ed attraverso il tubicino 8 si introduce nella cavità 2 la dispersione della popolazione cellulare che si vuole separare col dispositivo, mentre un corrispondente volume di liquido viene fatto fuoriuscire attraverso il tubicino 5.

Si· pone quindi il dispositivo in una centrifuga ruotante ad elevata velocità, fino ad ottenere la distribuzione della dispersione della popolazione cellulare nel liquido, sotto forma di bande o strati cellulari di densità diverse.

A questo punto, attraverso il tubicino 5 viene pompato nella cavità 2 un liquido molto denso non miscibile con acqua che provoca la fuoriuscita -attraverso il tubicino 8 - della dispersione cellulare frazionata nel modo descritto, prelevando il numero desiderato di distinte frazioni di dispersioni cellulari aventi un crescente gradiente di densità.

Il metodo di ricupero delle diverse frazioni di cellule sopra descritto con riferimento alla Fig. 1 presenta il grave inconveniente che l'espulsione delle diverse frazioni cellulari separate attraverso il tubicino 8 avviene unicamente sotto la spinta del liquido denso fuoriuscente dai canali 6 alla base del dispositivo, col conseguente ben noto restringimento od assottigliamento degli strati di liquido che separano le diverse fasce ove sono raccolte le cellule di densità omogenea ma diversa da fascia a fascia (con conseguente difficoltà di raccolta separata delle diverse fasce) , il che può portare alla grave ed inaccettabile conseguenza che le diverse frazioni cellulari che erano state separate possono rimescolarsi tra di loro.

Per ridurre al minimo il problema sopra menzionato, l'immissione di liquido denso alla base della cavità 2 viene effettuata molto lentamente, il che significa che le diverse frazioni cellulari possono essere recuperate in tempi molto lunghi, il che è spesso molto grave, come è noto ai tecnici del ramo .

Si faccia ora riferimento alle Figg. da 2 a 4 ove è rappresentato un dispositivo separatore analogo a quella della Fig. 1: per semplicità e chiarezza, per indicare parti strutturali sostanzialmente uguali od equivalenti a quelle del dispositivo di Fig. 1, si sono utilizzati gli stessi numeri di riferimento e le parti così identificate non verranno ulteriormente descritte.

Il dispositivo separatore delle Figg. da 2 a 4 si differenzia da quello della Fig. 1 per il fatto che nel corpo 1 sono ricavati due condotti supplementari 9 {in verità tali condotti potrebbero essere più di due, od anche uno solo) dalla cui estremità superiore si estende un tubicino 10 e la cui estremità inferiore si apre all'interno della cavità 2 in una zona intermedia della sua lunghezza .

Le procedure di riempimento e centrifugazione del dispositivo secondo le Figg. da 2 a 4 sono le stesse già descritte con riferimento alla Fig. 1 e non verranno quindi qui ripetute.

Ben diversa è invece la fase di prelevamento dal dispositivo delle diverse frazioni cellulari in esso separate e raccolte.

Infatti, il recupero delle frazioni separate avviene alimentando alla base della cavità 2 un liquido molto denso non miscibile con acqua (come avviene con la tecnica nota) e simultaneamente pompando alla sommità di tale camera, attraverso il tubicino 8, un gas (ad esempio aria) sostanzialmente alla stessa pressione di alimentazione del liquido denso: in tal modo, le diverse frazioni cellulari che si erano stratificate nella cavità 2 vengono fatte fuoriuscire attraverso i condotti 9. Si è accertato che, procedendo nel modo sopra descritto, non solo il recupero delle varie fasce di cellule che si erano stratificate nella cavità 2 viene effettuato a velocità notevolmente maggiore di quanto non fosse possibile secondo la tecnica nota, ma anche che tali fasce vengono compresse nella cavità 2 (anziché allargarsi, come avviene invece con la tecnica nota) e possono quindi essere recuperate separatamente in modo molto netto, venendo espulse all'esterno della cavità 2 senza subire alcun disturbo idrodinamico, cioè senza che si abbia rimescolamento delle cellule di una fascia con le cellule di una fascia ad essa adiacente. Ciò in definitiva, permette una chiara e rapida individuazione delle cellule di densità diversa inizialmente presenti nella popolazione di cellule sottoposte ad esame.

Come esempio pratico di utilizzazione del dispositivo si supponga di volere effettuare una separazione di popolazioni cellulari da midollo osseo umano.

E' noto che nel midollo osseo umano sono presenti popolazioni cellulari diverse aventi densità diverse ( si veda "Haematologica", Gennaio-Febbraio 1997) : alcuni tipi cellulari sono leggeri ( a bassa densità), altri hanno densità intermedia ed altri ancora sono pesanti (ad alta densità). Al fine di separare tra loro queste popolazioni cellulari e raccoglierle separatamente, si utilizza un separatore cellulare quale quello sopra descritto con riferimento alle Figure da 2 a 4, in cui la cavità 2 ha un volume di 90ml ed i vari condotti hanno un diametro di 2 mm.

Attraverso il condotto 4 si introducono nel dispositivo separatore 90ml di un liquido avente un gradiente continuo di densità compresa tra 1.050 e 1.100g/l: attraverso il canale 8 si introducono poi, al di sopra del liquido già presente nel dispositivo separatore, 5ml di sospensione cellulare monodispersa del midollo osseo.

Il dispositivo separatore cellulare così caricato viene quindi centrifugato a 400 gravità per 1 ora, in modo da avere una successiva stratificazione delle diverse popolazioni cellulari in bande discrete della sospensione presente all'interno della cavità 2 del dispositivo. Al fine di raccogliere separatamente le diverse frazioni cellulari, così separate, si procede alimentando dal basso, attraverso il condotto 4, un liquido pesante non miscibile con acqua, alla velocità di flusso di 2 ml/min. e simultaneamente pompando dall'alto, attraverso il tubicino 8 dell'aria, alla stessa velocità di flusso (2ml/min). In tal modo la frazione cellulare di densità intermedia, presente all'altezza dei fori di uscita dei condotti 9 posizionati a metà altezza della cavità 2, viene compressa e forzata ad uscire attraverso di essi e viene raccolta nel giro di pochissimi minuti (circa 5 minuti), senza che si produca un rimescolamento con le altre frazioni cellulari a causa di disturbi idrodinamici .

Analogamente, per raccogliere le frazioni cellulari leggere, poste nella parte superiore della sospensione, o quelle pesanti, poste nella parte inferiore della stessa sospensione, è sufficiente spostare gli strati aventi densità diverse verso l'alto o verso il basso (mediante la pompa peristaltica collegata ai condotti 4 ed al tubicino 8) in modo da avere la frazione cellulare che si vuole raccogliere, all'altezza dei fori di uscita laterali (condotti 9), dopo di che nella cavità 2 si alimentano (sempre tramite la pompa peristaltica) liquido pesante dal basso ed aria dall'alto, in modo da raccogliere, attraverso i fori di uscita laterali citati, la frazione cellulare che interessa.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Dispositivo per la separazione di cellule umane od animali aventi densità diverse da dispersioni cellulari che le contengono, avente una base ed una sommità e delimitante una camera allungata la cui sezione trasversale diminuisce dalla base alla sommità del dispositivo ne quale sono ricavati almeno un primo canale una cui estremità si apre all'interno di detta camera in prossimità di detta base e la cui altra estremità è collegabile ad una sorgente di liquido in pressione ed un secondo canale una cui estremità si apre nella stessa camera in corrispondenza della sommità del dispositivo, caratterizzato dal fatto che in detto dispositivo è ricavato almeno un ulteriore canale una cui estremità si apre in una zona intermedia della lunghezza di detta camera e la cui altra estremità si apre all'esterno del dispositivo .
2. Metodo di separazione di cellule umane od animali aventi densità diverse da dispersioni cellulari che le contengono, secondo il quale si introduce anzitutto una dispersione di una popolazione di cellule nella camera di un dispositivo separatore preventivamente riempita con un liquido la cui densità varia da un massimo in prossimità della base del dispositivo ad un minimo in prossimità della sua sommità, e si sottopone quindi il dispositivo con la dispersione cellulare ad una centrifugazione tale da provocare la distribuzione delle cellule in distinte frazioni aventi densità diverse il metodo essendo caratterizzato dal fatto che il recupero delle frazioni separate avviene alimentando alla base del dispositivo separatore un liquido molto denso non miscibile con acqua e simultaneamente pompando alla sommità della camera dello stesso dispositivo un gas sostanzialmente alla stessa pressione di alimentazione del liquido molto denso, e che le frazioni cellulari che si erano stratificate in tale camera vengono fatte fuoriuscire attraverso almeno un foro ricavato in una zona intermedia della lunghezza di detta camera.