IT201900009831A1

IT201900009831A1 - Eritrociti per la veicolazione di farmaci

Info

Publication number: IT201900009831A1
Application number: IT102019000009831A
Authority: IT
Inventors: Maria Laura Costantino; Giustina Casagrande; Monica Piergiovanni; Elena Bianchi; Clara Bernardelli
Original assignee: Milano Politecnico
Priority date: 2019-06-21
Filing date: 2019-06-21
Publication date: 2020-12-21
Also published as: WO2020255060A1; US20220257844A1; EP3987007A1

Description

Titolo: “Eritrociti per la veicolazione di farmaci” Descrizione

Si descrive un metodo per introdurre almeno un composto in globuli rossi, un dispositivo di caricamento che comprende una matrice microporosa, un circuito fluidico e una macchina per l’attuazione di detto metodo e globuli rossi incapsulati secondo la metodica qui descritta.

Stato dell’arte

Il caricamento di composti all’interno di cellule, in particolare dei globuli rossi, è un passo centrale nella ricerca e nello sviluppo di nuove terapie.

Le tecnologie esistenti mirate alla somministrazione intracellulare di composti si basano su campi elettrici, nanoparticelle o prodotti chimici che inducono la formazione di pori delle membrane cellulari consentendo ad un composto di entrare nella regione intracellulare. Questa metodica è comunemente definita “incapsulamento” e le cellule così trattate sono definite “incapsulate”. Tuttavia, questi metodi soffrono di numerose complicazioni, tra cui la modifica o il danneggiamento dei composti da veicolare, l’alta mortalità delle cellule carrier, il contatto con materiali potenzialmente tossici, la scarsa efficienza.

A titolo di esempio, WO2017041050 descrive un sistema per il caricamento di cellule mediato dal passaggio forzato di dette cellule attraverso fori di diametro inferiore al diametro delle stesse cellule.

W2017008063 descrive un canale microfluidico che presenta una costrizione avente un lume inferiore a 4 micrometri, e comunque mai superiore al 90% della dimensione della cellula utilizzata. Attraverso detto canale vengono fatte passare le cellule creando, in seguito al contatto con detta costrizione del canale microfluidico, una deformazione sulla parete delle stesse che favorisce l’ingresso nelle cellule di materiale di interesse. Per poter operare, la pressione richiesta all’ingresso del dispositivo è necessariamente superiore a 90 Psi, ovvero 6,1 atm.

WO2017123663 descrive anch’esso un metodo per caricare cellule, dove detto metodo è basato sul passaggio di dette cellule in una costrizione che le deforma così da permettere l’ingresso nelle stesse di molecole di interesse.

Casagrande G. et al., in Artif Organs 2016, 40(10): 959-970, descrivono una metodica basata sul passaggio di una sospensione che comprende le cellule da caricare e il composto in un lungo tubo capillare di vetro. I risultati ottenuti mostrano una scarsa efficienza di caricamento, unitamente ad un elevato numero di echinociti, indicativi dell’alterazione cellulare provocata dalla metodica stessa che non risulta pertanto applicabile nella pratica clinica.

È fortemente avvertita la necessità della messa a disposizione di una metodica efficace per introdurre composti in cellule, dove la metodica microfluidica possa gestire portate tali da renderla integrabile in un circuito macrofluidico, anche nel caso specifico dell’uso biomedicale.

Descrizione dell’invenzione

Forma oggetto della presente invenzione un metodo per introdurre composti in uno o più globuli rossi, dove detto metodo è basato su fenomeni di fluidodinamica e diffusione che, in condizioni chimico-fisiche controllate, portano sorprendentemente all’apertura temporanea dei pori su parti della superficie della membrana cellulare dei globuli rossi attraverso i quali detti composti, aggiunti alla sospensione cellulare, diffondono all’interno dei globuli rossi.

Forma ulteriore oggetto della presente invenzione un circuito fluidico che comprende una matrice microporosa per l’attuazione di detto metodo.

Descrizione delle figure

Figura 1: grafico che riporta, in scala logaritmica, la relazione tra la sollecitazione agente sulla membrana del globulo rosso e il tempo per cui tale sollecitazione perdura. L’area rettangolare evidenziata indica la regione che soddisfa le condizioni della metodica secondo la presente invenzione.

Figura 2: A) vista prospettica di una matrice microporosa secondo una forma di realizzazione, nell’esploso vista prospettica schematica ingrandita di una porzione di detta matrice; B) vista prospettica dall’alto di una porzione di detta matrice microporosa. Figura 3: Immagini acquisite al microscopio ottico (ingrandimento 40X) di globuli rossi incapsulati secondo la metodica della presente invenzione. Le immagini mostrano che i globuli rossi non subiscono eccessiva deformazione quando sollecitati microfluidicamente nel dispositivo secondo la presente invenzione (l’esempio riporta il campione sollecitato a portate pari a 1300 µl/min) e non sono danneggiati dalla presenza del destrano incapsulato. WW = sospensione di globuli rossi senza aggiunta di destrano. W = stessa sospensione di globuli rossi aggiunta di destrano (controllo diffusivo). 1300 µl/min = globuli rossi dopo esposizione a destrano secondo la metodica della presente invenzione.

Figura 4: Fluorescenza osservata nei campioni caricati con destrano a concentrazioni definite e a portate crescenti in un dispositivo di caricamento che comprende una matrice microporosa secondo la presente invenzione (A); in un condotto avente una sezione 50 µm * 50 µm (B); in un condotto avente una sezione 100 µm * 100 µm (C).

Figura 5: schema della macchina secondo una forma di realizzazione.

Figura 6: schema di un circuito fluidico chiuso.

Figura 7: schema di un circuito fluidico aperto.

Descrizione dettagliata dell’invenzione:

Definizioni:

Ai fini della presente descrizione, dove non diversamente indicato, i termini utilizzati sono da intendersi con il significato che segue:

Con il termine “composti” si intendono tutti quei materiali che l’esperto del settore intende introdurre, incapsulare, in un globulo rosso. A titolo esemplificativo e non esaustivo sono composti piccole molecole, peptidi, acidi nucleici, anticorpi monoclonali.

Con il termine “globuli rossi incapsulati” o “sangue incapsulato” si intendono qui i globuli rossi caricati di uno o più composti, o il sangue i cui globuli rossi sono caricati di uno o più composti.

Con il termine “matrice microporosa” si intende una matrice solida attraversata da una rete interconnessa di vuoti (pori) attraverso i quali è possibile la presenza e il movimento di un fluido.

Con “porosità” si intendono la dimensione e forma dei pori.

Detta matrice microporosa ha porosità omogenee o eterogene, opzionalmente detta matrice ha porosità disposte in maniera preferenziale, così da indirizzare il flusso in una direzione preferenziale. Alternativamente, detto flusso è direzionato confinando detta matrice in una sede opportuna.

Detta matrice microporosa è caratterizzata da cavità interconnesse tra di loro e connesse con l’esterno, così da definire un passaggio di fluido da una superficie di ingresso ad una di uscita, attraverso le cavità della matrice. La dimensione della sezione normale alla direzione principale del flusso deve essere sufficientemente grande (le dimensioni h e w nell’ipotesi di una sezione rettangolare, o d diametro in caso di sezione circolare) da permettere al fluido di seguire percorsi anche trasversali, definiti dalle tortuosità caratteristiche delle cavità.

L’alternanza di pieni e vuoti è generata disponendo nello spazio elementi pieni quali a titolo di esempio fibre, sfere, sferoidi o qualsivoglia altro elemento di forma e materiale omogeneo o eterogeneo e sfruttando come ‘vuoti’ le cavità non riempite dai suddetti elementi.

In un’ulteriore forma di realizzazione, detta matrice microporosa è caratterizzata da cavità generate dalla presenza di gas o di un secondo materiale liquido o solido, rimosso in fase di produzione del dispositivo. In questa forma di realizzazione, detta matrice microporosa è assimilabile ad una schiuma.

In un’ulteriore forma di realizzazione, la matrice microporosa è costituita da capillari/tubi caratterizzati dall’avere almeno una porzione di parete porosa, ad esempio da canali concentrici, caratterizzati da pareti almeno parzialmente porose, o da canali con superficie almeno parzialmente porosa, disposti nello spazio di modo che il fluido possa scorrere in un canale e passare all’esterno dello stesso o all’interno di un altro, attraverso opportuni pori sulle pareti.

Detta matrice microporosa è ottenuta con metodiche note all’esperto del settore. A titolo di esempio, è ottenuta per evaporazione di solvente/rilascio di particelle, Fiber bonding, Gas foaming, Emulsione-liofilizzazione, Separazione di fase, 3D printing, Elettrospinning.

Con il termine “cella elementare”, si definisce qui il volume di matrice microporosa che, ripetuto per rototraslazione attraverso i vettori che generano la matrice, riempie tutta la matrice stessa, ovvero la parte più piccola di detta matrice che, ripetuta nello spazio, forma l’intera matrice.

In una forma di realizzazione, la matrice microporosa è costituita da celle elementari uguali che si ripetono, in altre forme di realizzazione, la matrice microporosa è un insieme di matrici microporose, dove ciascuna matrice che costituisce l’insieme di matrici è costituita da celle elementari, dette celle elementari essendo uguali o diverse tra le diverse matrici che costituiscono l’insieme.

Il termine “materiale polimerico” include, ma non è limitato a, omopolimeri, copolimeri, come ad esempio, blocchi, innesti, copolimeri casuali e alternati, terpolimeri, e loro miscele e modifiche. Inoltre, se non diversamente specificatamente limitato, il termine "polimero" include anche tutte le possibili configurazioni geometriche della molecola. Queste configurazioni includono, tra l'altro, simmetrie isotattiche, sindiotattiche, atattiche e casuali.

Forma un primo oggetto della presente invenzione un metodo per introdurre composti all’interno dei globuli rossi.

Detto metodo comprende:

-mettere a disposizione globuli rossi da un soggetto; -mettere a disposizione uno o più composti da incapsulare in detti globuli rossi;

-mettere a disposizione un dispositivo di caricamento che comprende una matrice microporosa;

-alimentare detto dispositivo di caricamento con una sospensione che comprende detti globuli rossi e detto uno o più composti;

-raccogliere i globuli rossi in uscita da detto dispositivo di caricamento che sono globuli rossi incapsulati;

caratterizzato dal fatto che:

- detti globuli rossi e detto uno o più composto sono in sospensione a pH compreso tra 6,8 e 7,8, preferibilmente tra 7,35 e 7,45;

- i pori in detta matrice microporosa hanno una dimensione minima che è di almeno 3 volte la dimensione di un globulo rosso, ovvero una dimensione minima di almeno 20 µm;

- i pori in detta matrice microporosa hanno una dimensione media compresa tra 30 e 500 µm, o tra 40 e 400 µm, o tra 50 e 350 µm, o tra 100 e 250 µm; - detta matrice porosa ha una lunghezza l di almeno 1 mm e una larghezza ed un’altezza tali da comprendere almeno una cella elementare;

dove detto dispositivo di caricamento è alimentato con detta sospensione così da ottenere una velocità media del fluido compresa tra 10-4 e 10 m/s.

Detta matrice microporosa è in materiale polimerico, e/o in materiale ceramico e/o metallico. In un’ulteriore forma di realizzazione, detta matrice microporosa è un gel e/o un materiale biologico, ad esempio è una matrice decellularizzata.

In una forma preferita, detta matrice microporosa ha una lunghezza compresa tra 5 e 5000 mm, preferibilmente tra 6 e 500 mm, o tra 8 e 300 mm o tra 100 e 200 mm. Preferibilmente, detta matrice ha un’altezza pari a 2-1000 volte, oppure 10-500 volte, la cella elementare che la compone e/o una larghezza pari a 2-1000 volte, oppure 10-500 volte, la stessa cella elementare.

Detto dispositivo di caricamento comprende una matrice microporosa opportunamente alloggiata in un alloggiamento che non consente trafilamento del sangue tra il mezzo poroso e l’alloggiamento stesso e una porta di ingresso e una porta di uscita. In una forma di realizzazione, dette porta di ingresso e porta di uscita sono collocate alle due estremità longitudinali di detta matrice microporosa.

In una ulteriore forma di realizzazione, detto dispositivo di caricamento comprende altresì un condotto avente una lunghezza l e una sezione descritta dalle dimensioni w e h, dove detta lunghezza l è compresa tra 5 e 500 mm, preferibilmente tra 40 e 200, ancor più preferibilmente tra 40 e 130, ancor più preferibilmente di circa 60 mm e detta sezione ha dimensioni tali per cui la dimensione minore di detta sezione è compresa tra circa 20 e 500 µm, o tra 30 e 200 µm; in una forma preferita, detta sezione è costante lungo detto condotto, in forme di realizzazione alternative, detta sezione varia lungo il condotto, senza tuttavia mai restringersi al di sotto dei 20 µm.

Detta velocità media di flusso è ottenuta con una portata di ingresso sufficientemente alta da evitare deposito di globuli rossi nel dispositivo di caricamento.

L’ematocrito di detta sospensione è compreso tra 1 e 50%. In una forma di realizzazione, detta sospensione è ottenuta in PBS, ottenendo un ematocrito di circa 1%, oppure di circa il 5%. In forme di realizzazione alternative, l’ematocrito di detta sospensione è compreso tra il 25 e il 40%.

Preferibilmente, a detto PBS è aggiunta albumina così da preservare nella sospensione i livelli fisiologici nel sangue dell’albumina, pari a circa 5 g/dl.

Alternativamente, detta sospensione comprende altresì un anticoagulante, ad esempio CPD e/o un conservante, ad esempio mannitolo.

In una forma di realizzazione ulteriore, detta sospensione di globuli rossi è sangue intero.

Preferibilmente, detto soggetto è un mammifero, in una forma di realizzazione è un uomo.

In una forma di realizzazione, detto soggetto è un donatore. In una forma di realizzazione alternativa, detto soggetto è lo stesso paziente che necessita di globuli rossi incapsulati.

Gli autori della presente invenzione hanno sorprendentemente dimostrato che, operando con la metodica oggetto della presente invenzione, i globuli rossi sono sottoposti ad un campo di sollecitazione tale per cui sulla membrana degli stessi si assiste all’apertura di pori transitori per un tempo sufficiente ad incapsulare i composti di interesse. Nel contempo, detto campo di sollecitazione non è tale da impattare la vitalità dei globuli rossi che, dopo il caricamento, mostrano un’ottima vitalità e conservazione della caratteristica forma biconcava. Tali sollecitazioni sono definite sub-emolitiche. La soluzione a matrice microporosa qui descritta permette la lavorazione di volumi di sangue nell’unità di tempo tali da rendere la stessa adatta ad applicazioni cliniche. A titolo di esempio, la metodica secondo la presente invenzione permette di incapsulare con alta efficienza un volume di sangue pari a circa 1 l in un’ora.

Detto campo di sollecitazione è generato dallo sforzo di taglio Tau (τ), nel caso particolare di moti laminari in condotti circolari è per esempio approssimabile con la formula (1) e misurato in Pascal, Pa = kg/(m*s<2>).

τ = 4µ Q/(piri<3>) (1)

dove µ è la viscosità del fluido, Q la portata, e ri il raggio interno del condotto cilindrico.

Il perdurare nel tempo di detto sforzo di taglio oltre un valore minimo di tempo (tmin), permette una “stress accumulation” (SA) sufficiente alla formazione di porosità temporanee sulla membrana dei globuli rossi. Tali porosità sono reversibili se la sollecitazione cessa entro un tempo massimo (tMAX). tmin e tMAX variano in base alle caratteristiche meccaniche dei globuli rossi di ogni individuo. Sono disponibili in letteratura diagrammi che mostrano statisticamente la probabilità di emolisi in base alle condizioni di sollecitazione (tau) e al perdurare della stessa sollecitazione (t). A titolo esemplificativo, nel grafico in figura 1, la retta τ = f(t) rappresenta lo sforzo di taglio τ nel tempo, come proposto da Tillmann W et al., J Biomechanics 1984, 17: 263-279. Nello stesso grafico di figura 1, l’area racchiusa nel rettangolo è indicativa delle coppie sforzo di taglio- tempo ottenute operando nei range di velocità secondo la presente invenzione, ovvero tra 10<-4 >e 10 m/s. In particolare, operando in condizioni tali da restare al di sotto dell’area definita dalla retta τ = f(t) l’integrità dei globuli rossi viene preservata. Le coppie sforzo di taglio /tempo ricomprese nell’area rettangolare di figura 1 sono state sorprendentemente dimostrate essere tali da consentire il caricamento dei globuli rossi senza impattarne la vitalità. Sforzi di taglio compresi tra 1 e 500 Pa e tempo compreso tra 0.01 e 100 s sono stati mostrati in grado di risolvere il problema tecnico secondo la presente invenzione. Ancor più preferibilmente, le condizioni operative ricadono sotto la retta τ = f(t) di figura 1.

“Stress accumulation” è il parametro che permette di dimensionare il dispositivo di caricamento e i suoi parametri di funzionamento. Per evitare di emolizzare i globuli rossi, SA deve essere inferiore rispetto alla soglia di emolisi meccanica definita, per esempio, dal citato Tillman come dove τ è lo shear stress applicato alla membrana della cellula e t è il tempo di applicazione dello stress. La sollecitazione alla quale sono esposti i globuli rossi nel dispositivo di caricamento secondo la presente invenzione è continua, ovvero, in una ulteriore forma di realizzazione, variabile. Nella forma di realizzazione a sollecitazione continua, i globuli rossi percorrono un percorso assimilabile ad un condotto a sezione costante e tale da esporre gli stessi ad uno sforzo di taglio continuo e costante che permette la formazione di porosità temporanee sulla membrana degli stessi. Nella forma di realizzazione a sollecitazione variabile, i globuli rossi attraversano un percorso assimilabile ad un condotto a sezione variabile, detto percorso permettendo una SA tale da permettere la formazione di porosità temporanee sulla membrana degli stessi. Con percorso assimilabile ad un condotto si intende qui il percorso del fluido in cui i globuli rossi sono sospesi all’interno del dispositivo di caricamento secondo la presente invenzione, dove almeno parte di detto percorso avviene all’interno di una matrice microporosa e la sezione del condotto corrisponde quindi alla dimensione dei pori che il fluido attraversa nella matrice microporosa.

Detta metodica microfluidica, operando con perdite di carico dell’ordine delle 2,50-3 atm, mai oltre le 5 atm, permette alla stessa di essere operata in un circuito macrofluidico, detti circuiti essendo in grado di supportare le pressioni necessarie alla metodica stessa. A titolo di esempio, il circuito tipicamente utilizzato per la dialisi è un esempio di circuito macrofluidico. La matrice microporosa compresa nel dispositivo di caricamento secondo la presente invenzione è alloggiata in un opportuno alloggiamento ed è opportunamente sigillata così che non si assiste a trafilamento di sangue tra la matrice microporosa e l’alloggiamento stesso. Grazie al fatto che la metodica secondo la presente invenzione opera a pressioni contenute, non sono necessari accorgimenti costruttivi o materiali particolari per garantire la tenuta, che sarebbero invece necessari per garantire la tenuta laddove la metodica dovesse operare a pressioni maggiori. La soluzione, rispetto a soluzioni dello stato dell’arte che necessitano di lavorare a pressioni elevate, porta un vantaggio costruttivo rilevante.

Forma un secondo oggetto della presente invenzione una matrice microporosa per l’attuazione del metodo secondo la presente invenzione.

Detta matrice microporosa è caratterizzata da pori aventi una dimensione minima che è di almeno 3 volte la dimensione di un globulo rosso, ovvero una dimensione minima di almeno 20 µm; i pori in detta matrice microporosa hanno una dimensione media compresa tra 30 e 500 µm, o tra 40 e 400 µm, o tra 50 e 350 µm, o tra 100 e 250 µm; detta matrice porosa ha una lunghezza l di almeno 1 mm e una larghezza ed un’altezza tali da comprendere almeno una cella elementare. Il volume di detta matrice microporosa è funzionale a creare, all’interno della stessa, un percorso sufficientemente lungo e con caratteristiche tali da esporre i globuli rossi sospesi nel fluido che lo percorre ad una SA inferiore alla soglia di emolisi e sufficiente all’ottenimento di un caricamento efficiente.

Forma ulteriore oggetto della presente invenzione un dispositivo di caricamento (1) che comprende una matrice microporosa secondo la presente invenzione opportunamente alloggiata in un alloggiamento che non consente trafilamento del sangue tra il mezzo poroso e l’alloggiamento stesso e una porta di ingresso e una porta di uscita. Opzionalmente, detto dispositivo di caricamento comprende altresì un condotto avente una lunghezza l e una sezione descritta dalle dimensioni w e h, dove detta lunghezza l è compresa tra 5 e 500 mm, preferibilmente tra 40 e 200, ancor più preferibilmente tra 40 e 130, ancor più preferibilmente di circa 60 mm e detta sezione ha dimensioni tali per cui la dimensione minore di detta sezione è compresa tra circa 20 e 500 µm, o tra 30 e 200 µm; in una forma preferita, detta sezione è costante lungo detto condotto, in forme di realizzazione alternative, detta sezione varia lungo il condotto, senza tuttavia mai restringersi al di sotto dei 20 µm.

Detto dispositivo di caricamento è realizzato in materiale polimerico, e/o in materiale ceramico e/o metallico. In un’ulteriore forma di realizzazione, è un gel e/o un materiale biologico.

Forma un ulteriore oggetto della presente invenzione un circuito fluidico per l’attuazione del metodo secondo la presente invenzione.

In una forma di realizzazione, detto circuito è un circuito fluidico chiuso (Figura 6). In un’ulteriore forma di realizzazione, è un circuito fluidico aperto (Figura 7). Detto circuito è alimentato con detto almeno un composto e con detti globuli rossi.

Con riferimento a dette figure 6 e 7, detto circuito comprende: un dispositivo di caricamento (1), un dispositivo pompante (7), un miscelatore (9), un sistema di controllo (20).

Detto dispositivo di caricamento (1) è un dispositivo microfluidico secondo la presente invenzione, che comprende almeno una matrice microporosa e, opzionalmente, un canale microfluidico. Detto almeno un canale microfluidico è un condotto avente una sezione di dimensioni tali per cui la dimensione minore (w o h) di detta sezione è compresa tra circa 20 e 500 µm. In una forma di realizzazione preferita, detta sezione è costante per l’intera lunghezza di detto canale. In una forma di realizzazione alternativa, la sezione varia lungo detto condotto, senza tuttavia mai restringersi al di sotto dei 20 µm. Detto canale ha una lunghezza l compresa tra 5 e 500 mm, preferibilmente tra 40 e 200, o tra 50 e 130, ancor più preferibilmente di circa 60 mm. In detta matrice microporosa, i pori hanno una dimensione minima che è di almeno 3 volte la dimensione di un globulo rosso, ovvero una dimensione minima di almeno 20 µm e una dimensione media compresa tra 30 e 500 µm, o tra 40 e 400 µm, o tra 50 e 350 µm, o tra 100 e 250 µm. Detta matrice porosa ha una lunghezza l di almeno 1 mm e una larghezza ed un’altezza tali da comprendere almeno una cella elementare. In una forma preferita, detta matrice microporosa ha una lunghezza compresa tra 5 e 5000 mm, preferibilmente tra 6 e 500 mm, o tra 8 e 300 mm o tra 100 e 200 mm. Preferibilmente, detta matrice ha un’altezza pari a 2-1000 volte, oppure 10-500 volte, la cella elementare che la compone e/o una larghezza pari a 2-1000 volte, oppure 10-500 volte, la stessa cella elementare.

Prima di essere inseriti in detto dispositivo di caricamento (1), detti globuli rossi e detto almeno un composto passano da un miscelatore (9). Il miscelatore si rende necessario laddove il flusso che si genera nel circuito fluidico secondo la presente invenzione è un flusso di tipo laminare, che non consente quindi la miscelazione dei componenti la sospensione. Il miscelatore consente di migliorare il contatto tra i globuli rossi e l’almeno un composto, così da aumentare l’efficienza di caricamento.

Nella forma di realizzazione a circuito fluidico aperto, detto miscelatore (9) riceve detto almeno un composto (3) da un reservoir (10) e detti globuli rossi (2) da una sacca (11). Detta sacca (11) contiene sangue intero, o una frazione del sangue intero che comprende globuli rossi o, preferibilmente, globuli rossi risospesi in PBS. In detta forma di realizzazione, detta sospensione comprende preferibilmente almeno un anticoagulante e almeno un conservante.

Nella forma di realizzazione a circuito fluidico chiuso, detto miscelatore (9) riceve detto almeno un composto (3) da un reservoir (10) e detti globuli rossi (2) in sospensione nel sangue intero prelevato dal paziente (12). In questa forma, detto almeno un composto è preferibilmente risospeso in PBS, così da diluire detto sangue intero in ingresso in detto miscelatore.

Detto miscelatore, attraverso detto dispositivo pompante (7) immette detta sospensione di almeno un composto (3) e globuli rossi (2) in detto dispositivo di caricamento (1). All’interno di detto dispositivo di caricamento, detta miscela si distribuisce in detta almeno una matrice microporosa e avviene il caricamento di detto almeno un composto (3) in detti globuli rossi (2). Nella forma di realizzazione a circuito aperto, i globuli rossi così processati fuoriescono da detto dispositivo di caricamento (1) e vengono raccolti in una sacca per sangue incapsulato (14).

Nella forma di realizzazione a circuito chiuso, detto sangue incapsulato viene re-infuso nel paziente (12). Detto dispositivo pompante (7) è selezionato, ad esempio, tra una pompa a siringa, una pompa peristaltica, una pompa centrifuga.

Detto dispositivo pompante (7) è controllato da detto sistema di controllo (20) e detto sistema di controllo (20) impone in detta almeno una matrice microporosa compresa in detto dispositivo di caricamento (1) una velocità media di flusso compresa tra 10<-4 >e 10 m/s.

In un ulteriore aspetto, forma oggetto della presente invenzione una macchina (70) per il trattamento extracorporeo del sangue che comprende, con riferimento allo schema di figura 5:

un dispositivo di caricamento (71);

almeno un dispositivo pompante (77) per creare un flusso ematico extracorporeo tra un soggetto o una sacca di sangue e il dispositivo di caricamento (71);

almeno un reservoir (80) che contiene almeno un composto da caricare in detto sangue;

almeno un miscelatore (79) per miscelare detto sangue con detto almeno un composto;

opzionalmente, almeno una pompa (81) per immettere in detto miscelatore (79) detto almeno un composto da detto reservoir (80);

sensori (82) per il controllo di parametri chimico fisici della sospensione di sangue prima e/o dopo il passaggio attraverso detto dispositivo di caricamento; un dispositivo di controllo (90) per regolare un valore del flusso sanguigno in dipendenza dal valore target del flusso sanguigno, in cui il dispositivo di controllo (90) comprende:

un'unità di controllo / regolazione per adattare il flusso sanguigno corrente al flusso predeterminato o selezionato;

opzionalmente, un’unità di controllo / regolazione per definire la quantità di detto almeno un composto da immettere in detto miscelatore (79) da detto almeno un reservoir (80);

un'unità di comunicazione elettronica (91) che serve all'utente, da un lato, a visualizzare e, dall'altro, a immettere i parametri di trattamento (corrispondenti ai parametri della macchina per il trattamento del sangue), come il flusso di sangue, quantità di detto almeno un composto da miscelare, parametri chimico-fisici della sospensione prima e/o dopo il passaggio attraverso detto dispositivo di caricamento (71). Questo è fatto ad esempio tramite un'interfaccia grafica della macchina. Detta macchina riceve sangue da una pompa per il sangue che estrae sangue dal corpo di un soggetto attraverso un accesso al paziente, oppure da una sacca che contiene sangue intero o una sua frazione, preferibilmente una frazione di sangue intero che comprende i globuli rossi, più preferibilmente una sospensione di globuli rossi. Detto dispositivo di caricamento (71) è un dispositivo microfluidico che comprende almeno una matrice microporosa e/o un canale microfluidico, dove detto almeno un canale microfluidico, laddove presente, è un condotto avente una sezione di dimensioni tali per cui la dimensione minore di detta sezione (descritta dalle dimensioni w e h) è compresa tra circa 20 e 200 µm. Detto almeno un canale ha una lunghezza l compresa tra 5 e 500 mm, preferibilmente tra 40 e 200, o tra 50 e 130, ancor più preferibilmente di circa 60 mm.

In detta matrice microporosa, i pori in detta matrice microporosa hanno una dimensione minima che è di almeno 3 volte la dimensione di un globulo rosso, ovvero una dimensione minima di almeno 20 µm; detti pori hanno una dimensione media compresa tra 30 e 500 µm, o tra 40 e 400 µm, o tra 50 e 350 µm, o tra 100 e 250 µm e detta matrice porosa ha una lunghezza l di almeno 1 mm e una larghezza ed un’altezza tali da comprendere almeno una cella elementare. In una forma preferita, detta matrice microporosa ha una lunghezza compresa tra 5 e 5000 mm, preferibilmente tra 6 e 500 mm, o tra 8 e 300 mm o tra 100 e 200 mm. Preferibilmente, detta matrice ha un’altezza pari a 2-1000 volte, oppure 10-500 volte, la cella elementare che la compone e/o una larghezza pari a 2-1000 volte, oppure 10-500 volte, la stessa cella elementare.

Detta unità di controllo (90) regola la portata in ciascuno di detti microcanali compresi in detto dispositivo di caricamento così da avere una velocità media compresa tra 10<-4 >e 10 m/s

I globuli rossi caricati in accordo con la presente invenzione trovano applicazione nella pratica clinica o nella ricerca sperimentale. A titolo di esempio, detti composti possono essere DNA, RNA, anticorpi monoclonali, molecole inorganiche, molecole organiche usati a scopo terapeutico, per esempio nel trattamento dei tumori oppure a scopo diagnostico, ad esempio per eseguire una marcatura intracellulare.

La metodica secondo la presente invenzione offre una serie di vantaggi rispetto a quanto disponibile nello stato dell’arte.

Il caricamento dei globuli rossi è mediato da fenomeni di fluidodinamica e diffusione. L’effetto che si ottiene è quello di un’apertura temporanea di alcuni dei pori presenti sulla membrana cellulare dei globuli rossi che permette l’ingresso negli stessi per diffusione del/dei composto/i presenti nella soluzione in cui si trovano i globuli rossi, operando in condizioni sub-emolitiche. Sorprendentemente, la metodica, grazie all’identificazione di una combinazione sforzi di taglio/ tempi di sollecitazione, induce il passaggio del/dei composto/i all’interno della cellula senza causare alcuna alterazione permanente allo stato fisiologico della membrana. Le porosità infatti non sono distribuite omogeneamente sulla membrana dei globuli rossi ma sono localizzate esclusivamente nelle regioni caratterizzate da specifici sforzi di taglio.

Il metodo secondo la presente invenzione permette inoltre di evitare contatti forzati con materiali esterni (superfici di dispositivi, fluidi diversi quali i fluidi isotonici/ipertonici da utilizzare per il caricamento di cellule con composti basato sull’osmosi). Gli esempi che seguono hanno lo scopo di meglio chiarire l’invenzione, non sono da considerarsi in alcun modo limitativi dell’ambito di tutela.

Esempio 1: dispositivo di caricamento a matrice microporosa

La figura 2 riporta la raffigurazione schematica di un dispositivo di caricamento a matrice porosa secondo una forma di realizzazione.

La matrice porosa, una rappresentazione schematica prospettica ingrandita nel pannello B, è stata stampata con 3D printing in PLA (acido polilattico). Detta matrice microporosa è a porosità omogenee, dove le dimensioni dei pori sono pari a 50 µm x 400 µm, altezza totale della matrice 1.5 mm, larghezza totale 3 mm, lunghezza 50 mm.

Detta matrice microporosa è opportunamente alloggiata in un alloggiamento che non consente trafilamento del sangue tra il mezzo poroso e l’alloggiamento stesso.

Detta matrice microporosa è aperta verso l’esterno da un inlet ed un outlet collocati alle due estremità longitudinali di detta matrice microporosa.

Esempio 2: efficienza di incapsulamento

Le prove di caricamento sono state effettuate sulla matrice microporosa di cui all’esempio 1 con sangue bovino con ematocrito Ht = 10%, a portate fino a 1.3 ml/min con tempi di sollecitazione fino a 0.9 s, con valori di SA stimati dell’ordine di 700 Pa<4>s, calcolati con formula di Tillman.

La geometria della matrice microporosa implica una sollecitazione variabile per i globuli rossi che si trovano ad attraversare un percorso a sezione pari a 50 µm per poi passare a tratti a sezione maggiore. La sollecitazione che si ottiene con la geometria qui testata è nel range da 1 Pa a 10 Pa. La figura 4A mostra le percentuali di incapsulamento ottenute come incremento della fluorescenza della molecola marcatore FITC-destrano 40 kDa (destrano di peso molecolare 40 kDa marcato con un fluoroforo) rispetto al controllo. Come controllo (bianco), è stata utilizzata sia la stessa sospensione di globuli rossi alla quale non veniva aggiunto destrano (WW), sia la stessa sospensione di globuli rossi con destrano (controllo diffusivo, W) ma non inserita nel dispositivo di caricamento, indi non sollecitata fluidodinamicamente. Dopo il passaggio nella matrice microporosa, 100 µl della soluzione processata sono stati risospesi in PBS, lavati e centrifugati per rimuovere il destrano eccedente rimasto in soluzione o attaccato alla membrana esterna dei globuli rossi e quindi l’incapsulamento di destrano è stato misurato mediante misurazione della fluorescenza.

I campioni sono stati analizzati allo spettrofotometro per verificare l’intensità della fluorescenza. La fluorescenza viene valutata misurando l’intensità di fluorescenza di una quantità costante di globuli rossi, separati dalla soluzione in cui è avvenuto il caricamento e lisati in acqua distillata al fine di mettere in soluzione ciò che si trova all’interno delle cellule.

Per valutare l’efficienza di processo, la fluorescenza del campione (sample) è calcolata dal confronto con un campione non trattato (control, corrispondente al controllo diffusivo), assunto come riferimento

Il grafico mostra un incremento dipendente dalla portata di sangue nei valori di incapsulamento.

Si noti che, utilizzando la matrice microporosa oggetto della presente invenzione, si ottiene un’alta efficienza di caricamento, raggiungendo il 275% rispetto al controllo diffusivo, con portate di 1300 µl/min. Le portate, e quindi i volumi di sangue che il metodo secondo la presente invenzione rende possibili trattare, sono compatibili per un uso clinico. Con una matrice microporosa di dimensioni 1.5 mm * 3 mm * 50 mm si è infatti qui dimostrato un efficiente caricamento di circa 60 ml di sangue in un’ora. Le dimensioni della matrice possono essere opportunamente aumentate, consentendo così di trattare volumi di sangue maggiori nell’unità di tempo. A titolo di esempio, la metodica secondo la presente invenzione permette un efficiente caricamento di un volume di 500 ml di sangue in un’ora. A scopo comparativo, è stata effettuata una prova di caricamento sempre con sangue bovino al 10% di ematocrito, utilizzando un dispositivo di caricamento che consiste in un condotto a sezione costante di 50 µm * 50 µm. I tempi di sollecitazione sono stati fino a 2 s, con valori di SA stimati dell’ordine di 10<5 >Pa<4>s. In questo dispositivo, la sollecitazione è costante, dell’ordine dei 10 Pa. In figura 4B sono riportate le percentuali di incapsulamento ottenute come incremento della fluorescenza della molecola probante FITC-destrano 40 kDa rispetto ai controlli, come sopra descritti. Il dispositivo porta ad un incapsulamento con un’efficienza inferiore e con portate decisamente più contenute, laddove, protraendo la procedura per circa un’ora, si riuscirebbero a trattare solo 4 ml.

Un ulteriore esperimento è stato effettuato utilizzando un dispositivo di caricamento che consiste in un condotto a sezione costante di 100 µm * 100 µm. In questo caso, l’esperimento è stato condotto su sangue intero umano. I tempi di sollecitazione sono stati fino a 1 s, con valori di SA stimati dell’ordine di 10<5 >Pa<4>s. In questo dispositivo, la sollecitazione è costante, dell’ordine dei 10 Pa. In figura 4C sono riportate le percentuali di incapsulamento ottenute come incremento della fluorescenza della molecola probante FITC-destrano 40 kDa rispetto ai controlli, come sopra descritti. Il dispositivo porta ad un incapsulamento con un’efficienza circa tripla rispetto a quella ottenuta con la matrice microporosa secondo la presente invenzione ma con portate decisamente inferiori, non compatibili con applicazioni in clinica. Protraendo la procedura per circa un’ora, si riuscirebbe infatti a trattare soltanto un volume di circa 4 ml. È importante notare come l’efficienza di caricamento, nell’esperimento di cui alla figura 4C, sia più alta rispetto a quanto osservato nell’esperimento che precede, che pur avveniva in un condotto a sezione costante e inferiore. L’aumento di efficienza è qui ottenuto poiché si opera con sangue intero, e non con una sospensione di globuli rossi. Il sangue intero, presentando una viscosità maggiore, aumenta la SA migliorando l’efficienza di incapsulamento. Un miglioramento di efficienza paragonabile lo si ottiene facendo fluire sangue intero in una matrice microporosa secondo la presente invenzione (dato non mostrato).

Esempio 3: analisi morfologia cellulare dopo l’incapsulamento.

La figura 3 mostra i risultati ottenuti dopo processamento dei globuli rossi, confrontati con il riferimento, laddove il processamento è operato facendo attraversare alla sospensione di globuli rossi una matrice microporosa secondo la presente invenzione ad una portata di 1300 µl/min. Le immagini mostrano che i globuli rossi non subiscono eccessiva deformazione quando sollecitati microfluidicamente nel dispositivo secondo la presente invenzione (l’esempio riporta il campione sollecitato a portate pari a 1300 µl/min) e non sono danneggiati dalla presenza del destrano incapsulato.

Le cellule processate sono state visualizzate al microscopio ottico. I globuli rossi conservano la conformazione a disco biconcavo.

Claims

RIVENDICAZIONI 1) Un metodo per introdurre composti all’interno dei globuli rossi che comprende: -mettere a disposizione globuli rossi da un soggetto; -mettere a disposizione uno o più composti da incapsulare in detti globuli rossi; -mettere a disposizione un dispositivo di caricamento che comprende una matrice microporosa; -alimentare detto dispositivo di caricamento con una sospensione che comprende detti globuli rossi e detto uno o più composti; -raccogliere i globuli rossi in uscita da detto dispositivo di caricamento che sono globuli rossi incapsulati; caratterizzato dal fatto che: - detti globuli rossi e detto uno o più composto sono in sospensione a pH compreso tra 6,8 e 7,8, preferibilmente tra 7,35 e 7,45; - i pori in detta matrice microporosa hanno una dimensione minima che è di almeno 3 volte la dimensione di un globulo rosso, ovvero una dimensione minima di almeno 20 µm; - i pori in detta matrice microporosa hanno una dimensione media compresa tra 30 e 500 µm, o tra 40 e 400 µm, o tra 50 e 350 µm, o tra 100 e 250 µm; - detta matrice porosa ha una lunghezza l di almeno 1 mm e una larghezza ed un’altezza tali da comprendere almeno una cella elementare, detta cella elementare essendo pari al volume di matrice microporosa che, ripetuto per rototraslazione attraverso i vettori che generano la matrice, riempie tutta la matrice stessa; dove detto dispositivo di caricamento è alimentato con detta sospensione così da ottenere una velocità media del fluido compresa tra 10<-4 >e 10 m/s.
2) Il metodo secondo la rivendicazione 1, dove detto dispositivo di caricamento comprende altresì almeno un condotto avente una lunghezza l parallela al flusso di detta sospensione in detto canale e una sezione, descritta dalle dimensioni w x h, trasversale al flusso stesso, dove detta sezione ha una sezione di dimensioni tali per cui la dimensione minore tra w e h di detta sezione è compresa tra circa 20 e 200 µm.
3) Il metodo secondo la rivendicazione 1 o 2, dove detti globuli rossi sono sospesi in PBS, oppure detti globuli rossi sono sospesi nel sangue intero e l’ematocrito di detta sospensione è compreso tra 1 e 50%.
4) Il metodo secondo la rivendicazione 3, dove detti globuli rossi sono sospesi in PBS addizionato di albumina.
5) Una matrice microporosa per il caricamento di globuli rossi, caratterizzata da pori aventi una dimensione minima che è di almeno 3 volte la dimensione di un globulo rosso, ovvero una dimensione minima di almeno 20 µm; i pori in detta matrice microporosa hanno una dimensione media compresa tra 30 e 500 µm, o tra 40 e 400 µm, o tra 50 e 350 µm, o tra 100 e 250 µm; detta matrice porosa ha una lunghezza l di almeno 1 mm e una larghezza ed un’altezza tali da comprendere almeno una cella elementare, detta cella elementare essendo pari al volume di matrice microporosa che, ripetuto per rototraslazione attraverso i vettori che generano la matrice, riempie tutta la matrice stessa.
6) Un dispositivo di caricamento che comprende una matrice microporosa secondo la rivendicazione 5 opportunamente alloggiata in un alloggiamento che non consente trafilamento del sangue tra detta matrice microporosa e l’alloggiamento stesso e una porta di ingresso e una porta di uscita.
7) Il dispositivo di caricamento secondo la rivendicazione 6, che comprende altresì almeno un condotto avente una lunghezza l parallela al flusso di detta sospensione in detto canale e una sezione, descritta dalle dimensioni w x h, trasversale al flusso stesso, dove detta sezione ha una sezione di dimensioni tali per cui la dimensione minore tra w e h di detta sezione è compresa tra circa 20 e 200 µm.
8) Il dispositivo di caricamento secondo la rivendicazione 6 o 7, in cui dette porta di ingresso e porta di uscita sono collocate alle due estremità longitudinali di detta matrice microporosa.
9) Un circuito fluidico per il caricamento di globuli rossi con almeno un composto, dove detto circuito è un circuito fluidico aperto che comprende: almeno un dispositivo di caricamento (1), almeno un dispositivo pompante (7), almeno un miscelatore (9), almeno un sistema di controllo (20), caratterizzato dal fatto che detto dispositivo di caricamento (1) comprende almeno una matrice microporosa secondo la rivendicazione 5 e detto sistema di controllo (20) impone in detta matrice microporosa compresa in detto dispositivo di caricamento (1) una velocità media compresa tra 10- <4 >e 10 m/s.
10) Una macchina (70) per il trattamento extracorporeo del sangue che comprende: - un dispositivo di caricamento (71); - almeno un dispositivo pompante (77) per creare un flusso ematico extracorporeo tra un soggetto o una sacca di sangue e il dispositivo di caricamento (71); - almeno un reservoir (80) che contiene almeno un composto da caricare in detto sangue; - almeno un miscelatore (79) per miscelare detto sangue con detto almeno un composto; - opzionalmente, una pompa (81) per immettere in detto miscelatore (79) detto almeno un composto da detto reservoir (80); - sensori (82) per il controllo di parametri chimico fisici della sospensione di sangue prima e/o dopo il passaggio attraverso detto dispositivo di caricamento; - un dispositivo di controllo (90) per regolare un valore del flusso sanguigno in dipendenza dal valore target del flusso sanguigno, in cui il dispositivo di controllo (90) comprende: un'unità di controllo / regolazione per adattare il flusso sanguigno corrente al flusso predeterminato o selezionato; opzionalmente, un’unità di controllo / regolazione per definire la quantità di detto almeno un composto da immettere in detto miscelatore (79) da detto almeno un reservoir (80); un'unità di comunicazione elettronica (91) che serve all'utente, da un lato, a visualizzare e, dall'altro, a immettere i parametri di trattamento, dove detto dispositivo di caricamento (71) è un dispositivo microfluidico che comprende almeno una matrice microporosa secondo la rivendicazione 5 e detta unità di controllo (90) regola la portata in detta matrice microporosa compresa in detto dispositivo di caricamento così da avere una velocità media compresa tra 10<-4 >e 10 m/s.
11) La matrice polimerica e/o il dispositivo di caricamento e/o il circuito e/o la macchina secondo una delle rivendicazioni da 5 a 10, dove detto dispositivo di caricamento (1, 71) è in materiale polimerico e/o in materiale ceramico e/o metallico e detta matrice microporosa è in materiale polimerico e/o in materiale ceramico e/o metallico oppure è un gel e/o un materiale biologico, ad esempio è una matrice decellularizzata.
12) Globuli rossi incapsulati con almeno un composto secondo il metodo di una delle rivendicazioni da 1 a 4.
13) Globuli rossi incapsulati secondo la rivendicazione 12 per l’uso nel trattamento di patologie.