CN108369224B - 利用磁性悬浮的生物和非生物组分分选 - Google Patents

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Abstract

提供了在微流体环境中用一种或多种磁体使组分、细胞、或其他这样的单元的群体悬浮的系统和方法。这些系统能够和方法可用于例如异质单元群彼此之间的分离和分选，以在单元悬浮的时候形成多单元集合，并实时在看护点评估样品。这些系统和方法还可利用框体，使得成像设备例如智能手机能够在系统内操纵时实时捕获单元。

Description

利用磁性悬浮的生物和非生物组分分选
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年10月2日提交的美国临时申请系列号62/236,692，题为“利用磁性悬浮的生物和非生物组分分选”的优先权，其内容在此完整引入以供参考。
联邦资助研究或开发的声明
联邦政府对本发明的资助本发明在政府支持的国家科学基金授予的资助号1150733以及国立卫生研究院授予的EB015776和HG000205下作出。政府对本发明享有某些权利。
背景技术
本公开涉及在微流体环境中用一种或多种磁体使组分(moiety)、细胞、或其他这样的单元群体悬浮的系统和方法。这些系统和方法可用于异质单元群彼此分离和分选，在单元悬浮过程中形成多单元集合。这些系统和方法还可利用框体，使得成像设备例如智能手机能够在系统内操纵时实时捕获单元。
磁性悬浮常规用于分析单个宏观物体的密度和磁化率，并且作为在分离食物中有效的手段，确定牛奶、奶酪和花生酱中的脂肪含量，基于其固有密度比较多种颗粒，引导物体的自组装，和表征法医学相关证据。这些较早的基于磁性悬浮的实验使用不与显微术相容或不适合显微术的大装置来进行。
由于胞内顺磁性活性物质，例如活性氧物质(ROS)或活性氮物质(RNS)的形成或猝灭，广泛的生理和病理细胞过程伴随着细胞的体积质量密度或磁性特征的瞬时或永久变化。这些事件包括细胞周期阶段、分化、细胞死亡(凋亡/坏死)、恶性、疾病状态、激活、吞噬、体内和离体细胞衰老、病毒感染、以及对药物的特异性和非特异性应答。
发明内容
显现出对便携、强大、低廉以及便于使用的疾病诊断和预后检测平台的需要，用于在生活点，包括临床和家庭布置下分享健康信息。本文中，提供了基于磁性悬浮的诊断系统，其中不同的单元(例如白和红血细胞或其他组分)悬浮在磁力梯度下，并由于其在磁力梯度中的独特密度而分离。另外，公开了相应分析的便于使用的结合智能手机的悬浮系统。已显示使用便携成像磁性悬浮(i-LEV)系统，可鉴别白和红血细胞，且不需要使用任何标记即可对细胞数进行定量。此外，可在单一单元分辨率下(例如单细胞)下鉴别i-LEV内悬浮的细胞或其他组分，实现诊断和监测，以及临床和研究应用。除此之外，这还实现了通过智能手机在各种布置下，包括家庭和临床布置下进行疾病诊断和监控。
本公开系统有许多潜在应用。这样的系统可用作例如微流体平台，毋需标签即可从全细胞中高通量分离循环肿瘤细胞(CTC)。平台利用磁性悬浮原理，在细胞漂在微通道内时基于其密度概况分离细胞。癌细胞通常比血细胞的固有密度小，其可在微通道内于较高水平悬浮，其中自顶部至底部三种不同的顺磁流体流过(顶部和中间的流体：载体缓冲液，底部流体：含有癌细胞的样品血液)。然后从样品血液流体中提取悬浮的癌细胞，收集在顶部流动的载体缓冲液内。因此，平台能够例如从病人血液中高通量分离稀有的CTC，从而便于进行CTC衍生的生物标记和分子靶标的临床研究。
因此，如一些实施例所示，本公开系统特别用于从全血分离血浆，以及从全血分离CTC。
此外，该系统提供的分离和分选还有许多其他的应用。例如，其引发了基于磁信号的多细胞集合方法，实现了立体细胞培养技术。它还可用于磁性悬浮细胞，作为可能的基于地面的微重力刺激。此外，这些工具还可用于基于磁力/密度性质和成像/分子概况分析的分选、回收和表征方法。
根据本发明的一个方面，提供了基于磁性悬浮的诊断系统。基于磁性悬浮的系统包括用于分离异质组分群的悬浮装置，其中组分中的差异是根据其一种或多种磁化率和固有密度的不同。装置包括至少一个产生磁场的磁体，其中该磁场的大小根据接收含有异质组分群的样品的微毛细或微流体通道确定。通过多层确定微毛细或微流体通道，在所述多层中形成微毛细或微流体通道的部分，多层中的至少之一提供进入微毛细或微流体通道的入口通道，多层中的至少两个提供自微毛细或微流体通道的独立出口。
在一些形式中，多层可包括至少两层，每一层包括在其中形成的各自入口和各自出口。
在一些形式中，可从激光加工材料形成每层。
在一些形式中，可在多层的至少两层之间安置薄膜，形成顶部和底部出口。
根据本发明的另一个方面，该系统可用于分选方法。该方法包括使包含异质组分群的样品和顺磁介质流入入口，微毛细或微流体通道。在包含异质组分群的样品上施加磁场，以根据异质组分群的个体成员以及顺磁介质之间的磁化率和固有密度中至少一种的差异分离异质群。此后，样品的第一部分从顶部出口流出，样品的第二部分从底部出口流出，从而将异质组分群的第一组与异质组分群的第二组分开。
在该方法的一些形式中，多层可包括至少三层，包括顶层、中间层和底层，这三层中的每一层都包括在其中形成的各自入口和各自出口。在这种形式中，考虑样品流入入口、微毛细或微流体通道的步骤可包括将包括异质组分群的样品和顺磁介质引入底部入口，将顺磁介质引入顶部和中间入口。考虑到可在系统中加入尽可能多的层、入口和/或出口，而上面提到三或多层时，三层仅仅是可提供的层数的一个例子，类似的，可以有多于或少于三个出口。
在一些形式中，样品可以是混有顺磁介质的血液样本。血液样本可包括循环肿瘤细胞(CTC)或循环肿瘤簇/血栓(CTM)，CTC或CTM可在接触微毛细或微流体通道内的磁场后分离，并流入顶部通道。
在一些形式中，该方法还可包括在温度和交联至少之一的帮助下稳定分离的组分群体的步骤。
在本发明的另一个方面，提供了用包括用于分离生物或非生物组分群的装置的系统分选的方法，其中该装置包括至少一个产生磁场的磁体，其中该磁场的大小根据接收含有组分群的样品的微毛细或微流体通道确定。在该方法中，包含组分群的样品和顺磁介质从入口流入微毛细或微流体通道，向出口流动。当样品在微毛细或微流体通道内时，用磁体对样品施加磁场。磁场的施加阻止了至少一些，但非全部的组分群的成员流向出口，从而分离了组分群。
在本发明的一些形式中，对至少一些而非全部组分群的成员的阻止可能由于高磁力感应而在磁场的磁力边缘发生。
在一些形式中，组分群可包括血液样品，其中磁体阻止血细胞通过磁场，而血浆能够流过磁体产生的磁场，通过微毛细或微流体通道流向出口。
在一些形式中，该方法还可包括在温度和交联至少之一的帮助下稳定分离的组分群的步骤。
根据本发明的另一个发明，提供了用包括悬浮装置的基于磁性悬浮的诊断系统根据磁场特性组装多组分集合，其中磁体靠近接收含组分群的样品的微毛细或微流体通道。将包含组分群的样品和顺磁介质引入微毛细或微流体通道。当样品在微毛细或微流体通道中时，用磁体对样品施加磁场，磁场的施加使得至少一部分组分群悬浮，使组分群彼此形成空间关系，其中组分群聚集形成多分子集合。
在该方法的一些形式中，形成多组分集合的组分群的聚集可自发在一段时间内发生，同时组分群体仍然基本处于磁场感应悬浮建立的空间关系中。
在一些形式中，磁场可由顺磁体产生。在其他形式中，磁场可由电流感应线圈产生。还可使用其他方式产生磁场。
组分可以是许多不同类的单元或物质。在该方法的一些形式中，组分可以是细胞。在该方法的其他形式中，组分可以是多聚的。
在该方法的一些形式中，可发生组分群聚集形成多组分集合，并可在温度和交联至少之一的帮助下导致稳定化。
根据本发明的另一个方面，提供了与成像装置一起使用的基于磁性悬浮的诊断系统。该系统包括用于分离异质细胞群的悬浮装置，其中细胞中的差异是基于磁化率的不同。装置包括至少一个产生磁场的磁体，其中该磁场位于接收含有异质组分群的样品的微毛细或微流体通道附近。系统还包括光源、镜头(在该系统的一些形式中镜头也可省略)、以及框体。框体支持悬浮装置、光源，以及如存在作为系统部分的镜头。该框体还配置成支持成像装置。框体支持光源，其位置能将光传递通过悬浮装置，以及如存在，成像装置的镜头，其位置用于实时观察至少一部分异质细胞群。
在一些形式中，成像装置可以是智能手机、CMOS照相机以及CCD照相机之一。成像装置收集的数据可以通过蓝牙或无线网或蜂窝网络传送，特别是当操作点在监护的遥远地点时。
在一些形式中，系统还可包括框体支持的中性密度滤膜，其中中性密度滤膜安置在光源和悬浮装置之间。
在一些形式中，系统还可包括框体支持的成像装置，其中成像装置包括照相机。成像装置可配置成实时观察异质细胞群的分离。成像装置可配置成异质细胞群的分离。
在一些形式中，框体可以具有一个紧凑位置，以减少框体的尺寸便于携带，以及扩展位置，其中框体可扩展。当框体在扩展位置时，框体可配置成在其顶部表面的凹陷处接受成像装置。
当框体接受了成像装置时，成像装置的照相机可面对镜头，成像装置的显示器可保持可见，用于观察包含异质细胞群的样品。
根据本发明的另一个方面，提供了用于在基于磁性悬浮的系统内观察异质细胞群的方法。在悬浮装置的微毛细或微流体通道细胞群体中接收或安置细胞群体的样品。成像装置置于框体内。在悬浮装置内分离细胞群体。当在悬浮装置内分离细胞群体时，用成像装置收集细胞群体分离的图像。
在该方法的一些形式中，细胞群体分离的图像收集可实时进行。
在该方法的一些形式中，样品可以是血液。在该方法的其他形式中，样品可以是体液，包括唾液、尿液、血浆、血清和粪便；拭样包括皮肤、肛门、鼻腔和阴道拭样，或门把手的环境拭样；以及近端液体，包括泪液、肺部的洗液，乳腺的间隙组织液。当然，应理解这些例子是示范性的，而非限制性的。
在一些形式中，该方法还包括从细胞群收集的图像对至少一些细胞群进行计数和/或定量的步骤。
根据该发明的另一个方面，基于磁性悬浮的系统包括用于分离异质组分群的悬浮装置，其中组分的差异是根据磁化率和/或固有密度的差异。装置包括至少一个产生磁场的磁体，其中该磁场的大小根据接收含有异质组分群的样品的微毛细或微流体通道确定。该系统还包括微毛细或微流体通道入口和/或出口的至少一个针头，用于在微毛细或微流体通道高度和宽度的各自的预定位置引入或抽出液体。
在一些形式中，在入口或出口之一或两者中可有多个针头，多个针头中的每一个可以与微毛细或微流体通道在不同的空间位置流体联通。
在一些形式中，为了促进分选，入口的第一注射针头可以与出口的第二抽吸针头位于不同高度。如上所述，在其之间的样品内的组分可磁性分离。
根据另一个方面，公开了评估生殖医学中的单个胚胎和卵母细胞质量的方法。该方法包括将包括一个或多个胚胎或卵母细胞的样品置于悬浮装置的微毛细或微流体通道中，使包含胚胎或卵母细胞的样品在悬浮装置内悬浮。根据一种多种密度和悬浮概貌对胚胎或卵母细胞质量进行分级。
在一些形式中，方法还可包括根据一个或多个密度和悬浮概貌对胚胎或卵母细胞质量进行的分级来选择一个或多个胚胎或卵母细胞，和用一个或多个选出的胚胎或卵母细胞进行体外授精的步骤。
根据另一个方面，公开了将液滴中包封的多个组分悬浮在磁性悬浮系统中的方法。该方法包括将多个组分包封在多个液滴中，将多个液滴悬于样品中，将包含多个液滴的样品置于磁性悬浮系统的微毛细或微流体通道中，在磁性悬浮系统中悬浮多个液滴。
在该方法的一些形式中，样品还可包括多个没有包封所述多个组分任一的液滴。
可通过以下详细描述和附图了解本发明的这些和其它优势。下述内容只是关于本发明的优选实施方式的描述。为了评定本发明的整个范围，对于权利要求书应理解这些优选的实施方式并非指的是权利要求书范围内的仅有的实施方式。
附图简要说明
图1显示了细胞定量和快速细胞分离的i-LEV平台。图1A显示了悬浮装置内磁体、毛细管通道和镜子的排列。图1B显示(I)将来自病人的小体积(30μl)血样装到或收集入微毛细管，(II)用毛细力使血样装载到微毛细通道中，(III)用CritosealTM密封微毛细通道，和(IV)毛细通道引入两个彼此对置的永久钕磁铁之间。图1C显示了包括智能手机、镜片、悬浮装置、光源和滤波器，被包围框体支持的i-LEV布置。
图2显示了i-LEV拍摄的白血细胞(WBC)和红血细胞(RBC)分离图像。图2B显示了悬浮在不同高度的RBC和WBC由亮视野常规显微镜成像。图2C显示了CD45标记的WBC的荧光图像。图2D显示了亮视野和CD45图像的重叠，以确认WBC和RBC的分离。图2E显示了i-LEV对RBC和WBC活-死试验成像，其中活的RBC悬浮，而死亡WBC在毛细管底部聚集。图2F显示了亮视野。图2G显示了DAPI标记，而图2H显示了使用荧光显微镜的WBC的重叠图像。
图3显示了不同稀释度和时间点的红和白血细胞的宽度。图3A包括了在不同时间点的RBC带宽度图像，显示悬浮细胞带的宽度随时间改变。图3B是i-LEV分析的，在30分钟内两种不同浓度(90和450百万细胞/ml)下RBC的宽度图。图3C包括了不同RBC浓度，从250百万细胞/ml至0.8百万细胞/ml的悬浮红血细胞图像，而图3D描绘了这些RBC浓度中每一个的血带宽度，该图在50-250百万细胞/ml之间的细胞浓度范围内是线性的。图3E包括了不同浓度的悬浮WBC图像，而图3F描绘了血带宽度与WBC浓度成反比。
图4显示了单细胞检测和密度测定。图4A是100,000细胞/ml浓度下的RBC图像，图4B显示了用图像算法检测单血细胞。图4C显示了聚乙烯珠在磁性悬浮平台内的密度测量，其中显示不同密度(1.025g mL-1,1.031g mL-1,1.044g mL-1,和1.064g mL-1)的直径在10-100μm的珠在30mMGd+下具有不同的悬浮高度。图4D显示在不同Gd+浓度下1.064ml-1密度的珠具有不同的悬浮高度。图4E显示了线性拟合曲线，其提供测定颗粒密度的标准函数。
图5显示了不同Gd+浓度下分离的RBC和WBC。图5A-5C是不同Gd+浓度(30,60和90mM)的WBC和RBC分离的荧光显微镜图像，而图5D-5F是使用i-LEV系统成像的相同过程。两个成像平台都显示提高Gd+浓度能提高悬浮高度，而分离分辨率会下降。
图6显示了用基于智能手机的悬浮系统监测RBC上的氯喹的效果。
图7显示了用悬浮装置监测药物效果，特别是疟疾药物(氯喹)对红血细胞的效果。图7A显示掺入75mg/ml氯喹红血细胞随时间的悬浮。图7B显示氯喹浓度为1.25、2.5和7.5mg/ml时的悬浮高度和影像分析。图7C是图7B的放大图，显示更详细的图像，以显示每个浓度下的效果。图7D是分析产生图7B和7C的数据组的实际图像，其中在校正试验的每个时间点加入密度珠。
图8显示了各种血样对氯喹的不同反应。
图9显示了悬浮系统进行机械生物学研究的应用。
图10显示了使用悬浮系统研究胚胎分化和评估胚胎健康。
图11显示了为三种不同用途和三种不同手机设计的i-LEV框体元件。底部的三行是不同应用的i-LEV的不同高度(即基础成像对荧光成像对高等荧光成像)。顶部行显示三种不同手机和基部的接合件。
图12显示了以更便携和紧凑方式组合了许多特征的更新颖的i-LEV设计。
图13显示了另一种基于手机成像的更新的i-LEV设计。
图14图示了如何将i-LEV整合和应用于护理系统。可通过整合的手机应用在各种布置(即在家庭和工作时，或在旅行或度假时)下进行血液计数。手机应用向医护提供者报告测量值。医护提供者分析结果，通过在线系统提供反馈。
图15描述了高通量磁性悬浮细胞(或其他组分)分选的平台的设计和原理。
图16描述了高通量磁性悬浮分选装置的试验结果，其中分选了不同密度的珠。
图17描述了高通量磁性悬浮分选装置的试验结果，其中从血样中分选了癌细胞。
图18描述了另一种高通量磁性悬浮分选装置。
图19显示了用高通量磁性悬浮分选装置进行血浆血液分析的结果。
图20显示了荧光活化细胞分选(FACS)分析，以建立血浆分离的效果。
图21显示了从全血中分离RBC和WBC。
图22描述了用一对磁铁以反亥姆霍兹构造从血液的血浆中分离细胞的示意图，其中磁体从血浆中分离细胞。
图23是基于高磁场感应诱导细胞阻滞的血浆分离装置。
图24是细节图，显示了顺磁介质Ga3+浓度的优化，用于使用图23的装置，在50mMGa3 +(图24A)和100mMGa3+(图24B)下有效分离血浆。
图25显示了在图25A中，血样加到图23装置的入口内，和在图25B中，血浆流出出口。
图26显示了球体装配法。
图27显示了另一种基于磁场特性的多细胞3D装配法。
图28显示了一种基于磁性悬浮的细胞分选、回收和表征的方法。
图29提供了聚集时间研究的图像。
图30提供了一系列的图像，描述了钆浓度和悬浮对细胞活力的效果。
图31描述了不同类型的球状体随着时间的汇聚。
图32显示了NIH 3T3球状体的生长研究和免疫染色。
图33描述了促进球状体高通量装配的示范性磁性悬浮系统。
图34描述了对一对病人血样的概貌使用悬浮平台以鉴定慢性疾病的存在。
图35显示了在患有慢性疲劳综合征的病人内随时间RBC的连续监测。
图36显示了在患有慢性疲劳综合征的病人内随时间WBC的连续监测。
图37显示了用悬浮装置对代谢物、化学物的筛选和效果监测。
图38描述了细菌细胞的磁性悬浮。
图39提供了用要测试的表面拭得的样品经磁性悬浮获得的细菌细胞条带的图像。
图40显示了在高顺磁条件下，可在5分钟内迅速从表面检测细菌细胞。
图41显示了磁性悬浮系统内孢子的悬浮和检测。
图42显示了植物细菌细胞可在悬浮系统内悬浮和检测。
图43显示了卵母细胞的悬浮概况。
图44显示了未感染和HIV感染的血CD4T细胞在基于磁性悬浮的平台内具有显著不同的悬浮概况。
图45显示了用抗-CD3/CD28/IL2珠和抗-CD3/CD28/IL2抗体刺激改变HIV感染的血CD4T细胞的悬浮概况。
图46显示了在通道末端包括针头的微流体高通量磁性悬浮装置的设计。
图47显示了微流体磁性悬浮系统内细胞的操纵和收集。
图48显示了补充有150mM的顺磁溶液(即钆)的胎牛血清(FBS)中液滴的悬浮。
图49显示了补充有150mM的顺磁溶液(即钆)的胎牛血清(FBS)+PBS-Tween20中液滴的悬浮。
图50显示了补充有150mM的顺磁溶液(即钆)的胎牛血清(FBS)+PBS-Tween20中液滴的悬浮，其中液滴包封有不同的生物组分。
图51显示了癌症研究中无化学物质和无标签的磁性悬浮芯片的表征。
图52显示了肾癌(肾细胞癌)病人血样的磁性悬浮概况。
具体实施方式
以下提供了多个分离和分选生物和非生物组分，例如细胞的示范性结构。在下文描述的各方面的每个小节中，都包括构造“i-LEV”装置，其是便携式悬浮系统，其可整合成像装置(例如智能手机)以提供含有组分群的样品的看护点(POC)成像和分析。下文进一步对组分分选和阻隔技术进行描述。最后，描述了这些悬浮系统在构建3-D自装配系统中的应用。
以下仅以举例方式提供，且用于描述概念，或通过实验数据提供概念验证。本领域普通技术人员应理解这些实施例不是限制性的，而仅仅帮助说明在权利要求范围内的一些应用和结构。
手机成像和磁性悬浮的结合(i-LEV)
本文公开了基于磁性悬浮的诊断系统，其提供能够在任何位置方便组装的构建模块，以提供便携式配置，用于血液或其他类型样品的成像和分析。
这是一种便携、强大、低廉以及便于使用的疾病诊断和预后检测平台，用于在生活点，包括临床和家庭布置下分享健康信息。数码健康技术的近来发展已经改善了早期诊断、药物治疗和个人化药物。当与诊断装置结合时，具有高解析度相机和高数据处理能力的智能手机能实现复杂的生物医学应用。此外，当存在对于便携、迅速、毋需标记、便于使用和能够负担的生物医学装置的需要时，这些装置能以资源有限的配置强有力地贡献于公共健康，其能够诊断和连续监测需要精准医药的病人，特别是那些患有镰刀细胞贫血症、地中海贫血和慢性疲劳综合征等稀有疾病的病人。
在此提供了基于磁性悬浮的诊断系统，其中不同的细胞类型(例如白和红血细胞)或其他组分悬浮在磁力梯度下，并由于其独特密度而分离。另外，引入整合便于使用的智能手机的悬浮系统，用于细胞和组分分析。已显示使用该便携成像磁性悬浮系统(其中一个例子是i-LEV，在此如此称呼)，可鉴别白和红血细胞，且不需要使用任何标记即可对细胞数进行定量。此外，可在单一细胞分辨率下鉴别i-LEV内悬浮的细胞，可能实现诊断和监测，以及临床和研究应用。
和i-LEV一起，可收集手指针刺采血样品，将血液悬浮在系统的毛细管中。然后，系统中装入的智能手机能够拍摄影像，用于分析血液。该配置包括多个元件来适用不同的应用。
在许多领域内使用迅速诊断工具，包括化学和兽医学药物，以及食品安全。看护点(POC)装置实现了低廉、迅速、便携、毋需标签、可接近和方便使用的诊断方案。此外，POC装置可用于监测依从性和疾病进展。然而，大多数系统需要昂贵的样品制备和标记步骤，其限制了它们的使用。精准医疗根据病人的基因数据定制对病人病情的处理。研究机构和制药公司正越来越多地用细胞和分子分析来实现更有效的药物开发和改善早期诊断。在该方面，具有高像素相机、快速运算能力、图像处理、数据储存和连接特性的智能手机被用于各种医护平台，包括远程医疗和POC诊断。
作为例子之一，红血细胞(RBC)和白血细胞(WBC)计数是病理实验室评估的一个诊断参数。目前，血细胞计数、库尔特计数或流式细胞计数是最广泛使用的血细胞计数和分类方法。在表1中，将i-LEV装置与这些已经建立的方法进行了比较。
表1
Figure BDA0001683537310000101
Figure BDA0001683537310000111
库尔特和流式细胞计数复杂而昂贵，而血液细胞计数低廉，但耗费极大劳力，费时，且对于POC测试并不实际。近来开发的方法已经通过提供灵敏和强大的技术改善了该领域。然而，对于POC处理仍然缺少低廉和准确的血液计数分析仪。
近年来，已使用磁性悬浮原理对细胞和细胞事件进行监测和生物学表征。较早的研究显示，用悬浮平台可以将具有不同的大小，乃至亚微米水平的不同细胞类型排列在特有的高度。在此，公开了例如基于智能手机的磁性悬浮系统，毋需标记就可鉴定和定量血细胞。该系统通过分析高磁场下血液条带的宽度评估全血样品中的RBC和WBC计数。先前，不经标记分离血细胞对于临床诊断形成了极大的挑战。使用公开的系统，可根据其独特的密度概况分离RBC和WBC。i-LEV是血细胞计数的易于使用和易于接触的POC方案，其可在家庭配置下监测疾病进程和药物效力。
实施例I：i-LEV构建和设计
如下构建基于磁性悬浮的诊断系统的实验配置，使用图1C所示的i-LEV系统形式。用激光切割器切出的3mm厚聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)片装配成尺寸为160，100，205mm的i-LEV系统，如图1C所示。设计具有3mm间隔的线适应不同应用插入的部件。i-LEV系统顶层具有几种不同形式，与不同品牌的智能手机相容，如图11顶行所示。配置的高度在简单实验中可以减半，其不需要广泛的光学系统和光源。完全大小的i-LEV系统可通过插入宽频LED以及激发和发射滤波器来适应荧光显像硬件。微毛细管通道(1mmx1mm横截面，50mm长和0.2mm壁厚)，N52钕磁体(NdFeB)(50mm长，2mm宽和5mm高)，以及侧边镜用于构建如图1B所示的磁性悬浮装置。
如图1C中最佳所见，悬浮装置置于可包含镜头适配器的智能手机下3cm处。能够自动对焦的手机能够调解聚焦平面，而毋需将样品上下移动。在每次独立测量之前，将微毛细通道置于磁体之间，然后在100W，0.5托耳下处理血浆3分钟。两面镜子呈45°放置，使光通过悬浮通道，因为磁体阻挡了直接入射光。通道照明与智能手机像机匹配。
读取样品测量值。在含有不同浓度的顺磁介质(30mM、60mM和90mM Gd+)的PBS中掺混RBC、WBC和聚乙烯珠。将30μl样品滴入微毛细管，用CritosealTM密封通道。悬浮样品30分钟，直到它们到达系统内的平衡高度。如图3A和3B所示，进行校准测量以定量稳定化时间。用imageJ对细胞的宽度和高度进行成像和分析。
如下悬浮红血细胞(RBC)。从斯坦福大学血液中心获得健康捐献者的血样。用含有30mM Gd+的PBS以不同比例稀释全血。结果中描述了浓度。用450和90百万细胞/ml的血液浓度测量血液稳定化时间。用不同浓度，从250到0.8百万细胞/ml的血液与血液条带宽度及细胞浓度相关联。
如下悬浮白血细胞(WBC)。以1:10比例将全血与RBC裂解缓冲液混合。孵育5分钟后，RBC裂解，血样在1,500rpm悬浮3分钟。得到的WBC沉淀重悬于PBS。用1-5百万WBC/ml的递增浓度将WBC悬浮条带宽度与细胞浓度关联。
用活的白血细胞进行实验。用偶联有FITC抗-CD45抗体(1:20BD Pharmingen)标记WBC30分钟。然后用PBC洗涤WBC两次，重悬于PBS。在该过程终点，将活WBC和1xRBC在1,500rpm下悬浮于含有30mM Gd+的PBS中3分钟。悬浮细胞30分钟并成像。
用死亡白血细胞进行实验。RBC裂解后，WBC在未添加冷冻保护剂的PBS内-80℃冷冻过夜，以杀死WBC。过夜孵育后，用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)(1:1000Invitrogen)室温染色死亡WBC细胞15分钟。染色后，用PBC洗涤死亡WBC两次，重悬于PBS。最后，混合死亡WBC和1.000xRBC，在1,500rpm下悬浮于含有30mM Gd+的PBS中3分钟。悬浮细胞30分钟并成像。
进行图像分析。用ImageJ对RBW进行逐步图像分析。简单说，将智能手机拍摄的图像上传到ImageJ。然后裁剪出悬浮血液条带，扣除背景。将图像转换成16位，阈值调节成“默认-BW”配置。测量面积、物质中心和边界矩形。用测得的面积除以边界矩形获得血液条带的平均高度。图像分析的每一步在补充信息中更详细解释。
图1所示的基于磁性悬浮的便携式成像平台具有几个组件，包括：i.前面板，其具有数根导线以装载系统组件；ii.镜头，其置于智能手机正下方，将图像聚焦在相机上；iii.悬浮装置，其具有置于镜头正下方的毛细管，以对悬浮血细胞的条带宽度进行显像；和iv.额外的组件例如简单的LED光源和ND滤波器，以改善图像。前面板具有滑入式(slide-in)门，以阻隔外部光线。用激光切割制造的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)结构模块设计配置。悬浮装置由磁体、镜子和通道制备。两块永磁体(50mm长，2mm宽和5mm高)配置成朝向为相同极彼此相对。可在磁体之间插入毛细通道(长50mm，横截面为1mmx1mm，壁厚0.2mm)。用侧边镜照明和观察悬浮通道。掺入顺磁介质(在这种情况下是钆布醇(Gadavist))的样品在介质内悬浮在浮力和磁力相等的位置。样品的悬浮高度用公式1计算：
Figure BDA0001683537310000131
公式第一部分代表施加于颗粒的磁力，而第二部分代表浮力。磁场感应、重力加速度、细胞和介质之间体积密度的差，和自由空间的磁导率分别由B,g,ρ,和μo代表。样品主要根据其密度悬浮在特有的高度，与其质量和体积无关。为了证明i-LEV系统分离各种样品物种的能力，将RBC和WBC以相同浓度(5百万细胞/ml)混合，并根据图2A中所示的不同悬浮特征分离。还用常规镜检对相同的样品进行显像，以确定悬浮在不同高度的细胞类型，如2B-2D所示。用CD45标记的WBC的重叠图像和混合的RBC和WBC样品的亮视野图像清楚证实了i-LEV结果，如图2A-2D所示。此外，用WBC和RBC进行活-死试验。首先，WBC染色和冷冻过夜。然后将这些死亡细胞以相等的浓度掺入RBC样品。i-LEV系统显示仅RBC悬浮在通道中部，而死亡WBC聚集在底部，如图2E所示。为了验证结果，将死亡WBC用DAPI染色，并用荧光显微镜对其呈像。图2F中可见的重叠的亮视野图像和图2G中可见的DAPI染色的WBC确证了如图2F-2H所示的死－活试验。
另外，用两种其他的钆(Gd+)浓度悬浮和分离RBC和WBC混合物，以鉴定细胞分离试验最佳的Gd+浓度，如图5所示。随着Gd+浓度的增加(例如从60和90mM)，悬浮高度增加，而且条带彼此变得难以辨认。结果表明该例证试验中理想的Gd+浓度是约30mM，该浓度能允许最佳悬浮，同时使细胞与毛细管壁保持适当距离。在该条件下，得到的条带易于辨认。
然后用i-LEV来定量掺入磷酸缓冲盐(PBS)内的RBC。为了评估平衡时间，首先在不同时间点进行校准测量。最终浓度为450百万细胞/ml的掺入PBS的全血样品悬浮30分钟。悬浮过程中，每3分钟对样品显像，显示在大约15分钟后细胞平衡于其独特悬浮高度，如图3A所示。用90百万细胞/ml血液进行试验，测试不同浓度的稳定时间。稳定曲线的外推时间常数对于450百万细胞/ml为4.8分钟，对于90百万细胞/ml是3.3分钟。如图3B进一步所示，血细胞浓度对时间曲线显示曲线的平衡时间也是15分钟。更高浓度的血细胞需要更长的平衡时间。进行进一步的验证实验，来评估不同浓度的血液带宽变化。用i-LEV系统对浓度为250,125,63,50,25和0.8百万细胞/mL的RBC进行成像。用血细胞计数器对每个样品定量，确认计算出的血液计数。为了评估细胞浓度，将血液总面积除以照明区域的宽度来测量横跨通道的悬浮血液条带的宽度。在较高的浓度(50-250百万细胞/ml之间)，血液宽度对浓度曲线是线性的，斜率为0.6μm/百万细胞/ml。然而，随着细胞浓度下降(例如从0.8到25百万细胞/ml)，曲线线性消失，如图3D所示。对于高于50百万细胞/ml的血细胞浓度，观察到悬浮过程中的血液条带与细胞浓度相关。以1-5百万细胞/ml的浓度对WBC进行成像，并将浓度对血带宽度作图，如图3E-3F所示。WBC浓度也与血液带宽呈线性关系。
使用i-LEV平台，可不用任何标记检测单个细胞。在将RBC浓度稀释到100,000细胞/ml或以下后，用简单的图像处理工具对照明区域进行个体细胞定量，如图4A-4B所示。最后，将聚乙烯珠悬浮在毛细管内以检查平台的悬浮分辨率，并显示其计算不同样品和细胞的密度的能力。直径在10-100μm之间，密度为1.025gmL-1,1.031g mL-1,1.044g mL-1或1.064g mL-1的不同尺寸的珠在30mM Gd+中显示不同的悬浮高度，如图4C所示。还观察到密度为1.064g ml-1的珠在不同Gd+浓度下(10mM,30mM,60mM)有不同的悬浮高度，如图4D所示。
早期研究对于不同的磁性悬浮系统引入了几种相关的生物学应用。在此，提供了i-LEV，其代表将磁性悬浮与智能手机设备结合的新颖平台。i-LEV系统可靠地分析血细胞计数，还可检测独立细胞。它是一种迅速、便携、便于使用和可负担的平台，其利用智能手机的可利用性克服了从未处理的全血对RBC和WBC计数的需要。在本技术领域，血液处理是临床过程，并需要广泛的物质和设备，以及受过训练的职业人员。因此，目前不能在POC设置中实现。然而本公开的系统能够在家中实现血液分析，并方便疾病诊断和监测。
i-LEV设备还可进行荧光成像，因为配置携带几个可插入荧光LED、镜头、激发滤波器和发射滤波器的槽，如图1C所示。虽然该平台是静态的，其也可扩展成实现动态流体试验和监测药物对某些在毛细管内分离的细胞类型的实时效果。该系统的其他应用可包括进阶测试，例如监测循环血细胞或镰刀细胞病，尤其是在资源有限的配置下。整合入智能手机的悬浮系统可提供对大规模群体的简单的血液测试，因为智能手机在世界范围内广泛使用。估计在全球有大约5,000,000,000人使用移动电话。在该方面，整合智能手机的医疗技术，例如i-LEV能够有利地在健康服务，特别是经济和物流资源有限的发展中国家发挥重要作用。
可用app分析和评估i-LEV测试结果，也可将其通过整合的云平台传递到健康护理提供者，如图14所示。该平台的便携性、负担能力和简易性得到了在家庭布置以及生物学或临床学实验室中易于使用的血细胞技术配置。
这类基于磁性悬浮的诊断系统可用于各种不同类型的应用。作为一个例子，可进行对几种疾病诊断和监控的血液计数。作为另一个例子，可分离白血细胞和红血细胞用于评估疾病，例如镰刀细胞贫血症、地中海贫血症和慢性疲劳综合征。而且，该计数还能用于克服使用POC法诊断和监测疾病的其他医学相关问题。例如，已显示病毒感染的细胞有不同的悬浮特征，再一次代表了特别与发展中国家有关的i-LEV系统的另一项具有前景的用途。
该装置利用智能手机的能力，在家庭布置以及各种资源有限的布置下实现便携、迅速、毋需标记、便于使用、和负担得起的血液计数和分析。智能手机悬浮装置的能力和连续样品流动结合，能在资源有限的布置下实现感兴趣细胞的高通量分离。
在此提供了一些额外的例子来显示概念验证，即i-LEV的基于手机的磁性悬浮系统形式可以扩展到许多其他应用，包括(1)监测药物、代谢物和化学物质的效果；(2)研究细胞在不同条件下的机械生物学；和(3)研究胚胎和卵母细胞分化，并评估胚胎/卵母细胞的健康。
实施例II：用悬浮装置监测药物效果
现在根据图7,用悬浮装置监测药物效果。特别用该悬浮系统研究疟疾药物，称作氯喹对红血细胞的效果。在图7A中将75mg/ml氯喹掺入红血细胞中，用i-LEV装置监测其悬浮。可见随着接触时间增加，红血细胞的悬浮高度在血样中加入氯喹后下降。如图7B-7D所示，还成像了不同浓度的氯喹对全血的效果，其中可见1.5和7.5mg/ml具有相似效果，而2.5和5mg/ml是相似的。在图7B和7C(图7C是图7B一个区域的放大图)中，1.25、2.5、5和7.5mg/ml浓度的氯喹被掺入血液，分析这些图像的悬浮高度。图7D显示了用于分析制成图7B和7C的图表的实际图像。在图7D中，每次校准测试时加入一定密度的珠。
现在参考图8，显示了不同血样(即不同的血样“样品-1”、“样品-2”和“样品-3”)对给予7.5mg/ml和75mg/ml氯喹的反应，后者是非常高浓度的药物。可见血液样品在毛细通道内降到非常低的高度，尤其在高剂量处理后。因此磁性悬浮系统提供了非常迅速发现药物对不同血液类型的效果的方法。
另见图6，显示了用基于智能手机的悬浮系统监测RBC上的氯喹效果。在i-LEV中，提高氯喹浓度导致更小的面积。在60分钟内拍摄图像。如图6A所示，最初24分钟显示使用1.25和5mg/ml氯喹浓度。然后图6B显示了面积分析。用实验室开发的ImageJ脚本测量血液面积。面积显示了细胞的活力。随着细胞随时间凋亡，面积也变小。观察图6C，高度用同一脚本测量。高度与细胞密度呈正比。在50分钟内，越高的药物浓度导致血液更高的密度。
实施例III：使用悬浮系统的机械生物学研究
图9显示了机械生物学研究中悬浮系统的应用。在图9A中，乳癌细胞被置于不同的胶原凝胶中。在该研究中使用20％和40％的胶原浓度。在此种情况下，放大(overlaid)图像不能提供太多细节，然而在图9B中(以及图9C提供的9B的放大细节中)，密度作图提供了更多细节，而且能看到鞍状差异(saddle differences)。因此，i-LEV装置可用于细胞机械研究，包括老化和干细胞分化。
实施例IV：胚胎分化研究和胚胎健康的评估
现在参考图10，显示悬浮系统被用于研究胚胎分化和评估胚胎健康。在不同的天数悬浮混合的胚胎群。每个胚胎的密度随着时间下降。因此，该系统可用于监测和理解健康胚胎，其悬浮在不同的高度。
实施例V：i-LEV设计的更新示意图
图13显示了另一种基于手机成像的更新的i-LEV设计。在图13中，显示了没有镜子的设计，其比图1、11和12中提供的早期形式更加紧凑。应理解基于磁性悬浮的诊断系统可以采取许多物理形式。
高通量磁性悬浮细胞分离
高通量磁性悬浮细胞分选平台的设计和原理示于图15A和15B。该平台包括与三组入口和出口连接的微通道，它们配置成从顶部至底部(顶部/中央/底部)，以及置于微通道底部基座下的钕磁体。装配三个不同的聚碳酸酯层制造微通道装置，每层用双面粘合剂纳入激光切割形成的微通道切割件。芯片装配后，将管线(
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微孔管线，0.010)接到入口和出口孔上，随后用两个PMMA夹持器安置磁体。将掺有顺磁钆(Gd+)的血样通过底部入口用注射泵以恒定流速连续引入平台，含有Gd+的缓冲溶液单独注入顶部和中央入口。
不加磁场效应，由于微流体的层流性质，仅通过弥散允许颗粒在三个不同的流体之间迁移。当在整个微通道上施加磁场，细胞或其他组分以及周围顺磁介质之间的磁化率差异导致细胞从较高(例如邻近磁体)移到较低磁场强度的位置(即离开磁体)。例如，由于癌细胞较低的固有密度以及比血细胞体积大，CTC比其他血细胞悬浮得更快，结果使CTC移到顶部流体内，可单独收集用于随后的下游分析。
实施例VI：测试珠的密度分离
为了测试分离系统，现根据图16，测试平台分离两种具有不同密度的珠，绿色＝1.031g/ml(上部条带)，红色＝1.089g/ml(下部条带)。图16A显示了处理和收集前的样品混合物，而图16B显示了基于磁性悬浮的细胞成像配置中处理后的顶部/中部/底部出口。从顶部流体中收集大部分绿色珠，而在底部收集物中观察到红色珠，显示平台通过密度分离颗粒的能力。
实施例VII：乳癌细胞的密度分离
为了测试更实际的应用，现参考图17,用10倍稀释的，以2000细胞/ml掺有乳癌细胞(MDA-MB-231)的血样测试了平台。图17A显示了处理和收集前的样品，而图17B显示了处理后的顶部/中部/底部出口的收集物各自被引入基于磁性悬浮的细胞成像配置。从顶部液流收集了大部分癌症细胞，其中其他血细胞在处理后被耗竭，证明不需要使用抗体或其他标记从血液中分离癌细胞。
实施例VIII：另选的双磁体设计
在一另选设计中，第一微流体平台可掺入一长直的通道，其在靠近出口处由一薄膜一分为二(即顶部和底部通道)，该通道与一个入口和两个出口连接。该装置使用磁性悬浮原理基于顺磁介质中的独特密度分离细胞。对于装置的制造，首先用激光切割机切出聚碳酸酯片层，并用双面粘合带装配。制成的微流体芯片的底部和顶部通道各高200μm和700μm。第一微流体设计掺入了长而直的通道，其在靠近出口处由薄膜一分为二(顶部和底部通道)，各自连接一出口。两个永久NdFeB磁体分别被置于通道顶部和底部，相同极彼此相对。这样的基于磁性悬浮的高通量血细胞分选装置可见例如图18，其包括一对磁体。
实施例IX：血浆血液测试
现在参考图19，显示了在如图18的装置中进行的血浆血液分析。现在根据图19A、19B和19C，观察到5、10、20μl/分钟流速下的血细胞分选，在顶部通道不回收血细胞。然而，在例如30和50μl/分钟的更高流速下未发现血细胞分选，因为血细胞也从顶部通道回收。由于较高流速下的持续时间不足，血细胞未悬浮和分离成在两个通道中流动的均匀层。因此，选择20μl/分钟作为进行测试的示范性系统中血细胞分选的最佳流速。在图19D中，从顶部通道收集的血浆进行总蛋白分析，并与血浆比较，其通过离心收集，发现从顶部通道回收的血浆的蛋白浓度与常规离心方法回收的一致。结论是，在最佳条件下，开发的高通量基于MagLev的装置(即先前描述的那些分选装置)有效分选血细胞。
实施例X：荧光活化细胞分选(FACS)分析
现在根据图20,用荧光活化细胞分选(FACS)分析评估了基于MagLev的高通量血细胞分选装置的血浆分离效率。首先，将Maglev分离的全血和血细胞用CD45Alexa 488以及CD36FITC抗体染色，并进行FACS分析。如图20A所示，在全血中同时观察到RBC和WBC，如图20B所示，Maglev装置底部通道分离的血细胞，而如图20C所示，装置顶部通道处未观察到血细胞。获得的结果再次证明在最佳调价下，开发的Maglev装置能够从全血分离血细胞和血浆。
实施例XI：从全血分离RBC和WBC
现在参考图21，还用开发的Maglev装置从全血分离RBC和WBC，显示从全血分离稀有细胞的能力，因为稀有细胞的密度与WBC相等或更大。为了分离血细胞，将底部通道的高度减少到100μm，在底部和顶部通道之间装入间隔件，如图21A所示。悬浮后，所有的RBC流过底部通道，悬浮在100μm高度以下，在顶部通道中没有发现，如图21B所示。图21C也显示约70％的WBC从顶部通道收集，这可能是由于大部分WBC悬浮在流过顶部通道的高于100μm的高度。获得的结果证明开发的高通量MagLev装置能够从全血和肿瘤中分离稀有细胞，例如CTC和胎儿红血细胞。
实施例XII：血液中的癌细胞分选
当混合类型的细胞流过通道时，两个永磁体产生的磁场梯度将独立的细胞类型分到通道内由细胞密度决定的独特垂直位置。例如，从复杂的混合物(例如血液中)由于较大的固有密度差异，可轻易分离癌细胞。在公开的微流体设计中，可从顶部通道收集通常悬浮在血细胞上方的CTC/CTM。我们首先测试了血浆分离的平台，其中含有30mM Gd3+的全血以恒定流速20μl/分钟流过通道。在磁场下，细胞从高磁场感应移到低磁场感应处，并根据其密度概况悬浮在通道内的特定高度。由于密度高，血细胞RBC和WBC在分隔器下流动，并在底部出口收集，而血浆在上方流动，并从顶部通道出口收集。类似地，通过将底部通道高度减到100μm，从顶部通道分离和收集WBC，显示该装置还能从全血样品分离CTC。
实施例XIII：用磁场分离/阻隔细胞
现在参考图22以示意图显示了该平台的第三种设计和原理。该基于Maglev的血浆分离利用在高浓度的顺磁介质下高磁场感应细胞阻隔原理。当血样流入通道时，由于磁体边缘的高磁场在顺磁介质中产生高磁力感应，细胞移入低感应位置，并在入口腔内堆积。微流体通道可以是长直通道，高1mm、长50mm，宽4mm，其与一个入口和出口连接。用激光切割机切出的具有理想通道性质的聚碳酸酯片层通过简单的微制造技术制造所提供的微流体血浆分离装置，并用双面粘胶带装配。将两个永久钕磁体置于顶部和底部通道上，相同极朝向彼此。对于血浆分离实验，用注射泵以恒定流速使掺有顺磁介质钆(Gd3+)的血样流入入口。由于靠近磁体边缘的强磁力感应，细胞被阻隔，并在入口腔内堆积，仅使得血浆流入通道，并在出口被收集。
在图23中，以侧视图(图23A)和俯视图(图23B)显示了基于高磁力感应诱导的细胞阻隔的血浆分离装置。图24和25显示了从血样有效分离血浆的顺磁介质Gd3+浓度的优化。在图25A中，显示血液被装入基于细胞阻隔的血浆分离装置(即Maglev),在图24中，显示了阻隔的详细图，而在图25B中显示了出口处的血浆收集(根据下面的实验，掺入100mMGd3+的用PBS以10倍稀释的血样，其在恒定流速20μl/分钟流动)
在该实验中，掺有50mMGd3+(图23A中)和100mM Gd3+(在图23B中)的以PBS10倍稀释的全血在恒定流速20μl/分钟流过图22的装置。如图24所示，随着Ga3+浓度增加，磁性相斥力增加，其与低浓度50mM Gd3+相比产生有效阻隔细胞的高磁力感应。
基于磁力概貌和微重力模拟的多细胞3D装配
可用磁性悬浮迅速产生形状可控的多细胞3D细胞装配该方法通过提供模拟体内细胞-细胞和细胞-ECM相互作用和组织的细胞培养条件，超越了常规2D组织培养。与其他方法相比，本文所述的磁性悬浮方法不需要工程构建的支架或者磁性纳米颗粒(用于悬浮)。装配的细胞聚集物可用于组织工程、疾病建模、药物筛选和细胞/组织生物学研究。
此外，该系统能实现调查微重力如何影响细胞生物学的研究，用于空间应用，而毋需昂贵和复杂的研究设备。其能在微重力条件下对细胞进行基因组学、转录学和蛋白质组的分析。
此外，该方法允许了同时利用磁力/密度性质和成像/分子概貌的分选、回收和表征。可回收在装置中磁力分离的细胞，并在不存在磁场的条件下用活和非存活成像方法(例如透射光、荧光显微镜、免疫染色)对其进行表征，而不丧失磁力/密度分选。此外，可从悬浮装置中选择性回收感兴趣的细胞用于分析(例如基因组、转录组和蛋白质组)，或进一步培养，视成像方法而定。该方法可广泛用于细胞/组织生物学研究。还考虑该方法可用于除了细胞外的其他目的。
实施例XIV：球状体装配法
图26显示了球体装配法。参考图26A和26B，由于磁力感应(B)和重力(g)，细胞悬浮并集中在平衡平面中，其中磁力(Fmag)和浮力(Fb)彼此平衡。介质(Xm)的磁化率比细胞的磁化率(Xc)大。如图26A和26B中第0日和第2日的图像之间比较显示，细胞随时间自行装配成稳定的球状聚集物。图26C提供了各种细胞类型，NIH-3T3、GFP人脐带静脉内皮细胞(GFP-HUVEC)、MDA-MB-231和间充质干细胞(MSC)的图像。细胞浓度为50千细胞/ml细胞介质，Gd+为50mM。白色比例尺表示100μm。
实施例XV：基于磁力概貌的多细胞3D装配的第二个实施例
图27显示了另一种基于磁场特性的多细胞3D装配法。Corning Synthemax II聚苯乙烯微载体悬浮在50mM钆浓度中，如图27A所示。图27B显示了10分钟后聚苯乙烯微载体和3T3NIH细胞的共悬浮图像。图27C显示了3天后相同的情形。如图27D所示，将250-300μm聚合物带插入100mM钆浓度的悬浮装置。图27E中的图像显示聚合物条带和GFP-HUVEC细胞在10分钟后共悬浮，图27F的图像显示了1天后在75mM钆浓度下的同样情形。在所有这些图像中，比例尺为200μm。
实施例XVI：基于磁性悬浮的细胞分选、回收和表征的方法
现在根据图28，显示了一种基于磁性悬浮的细胞分选、回收和表征的方法。该方法的说明如图28A所示。细胞(例如NIH-3T3)悬浮在琼脂糖凝胶中，然后从毛细管上通过温和吹出的氮气流回收固化/交联的凝胶，如图28B所示。回收后，感兴趣的细胞可通过切割，冲孔和激光捕获显微切割而分离，如图28C所示。还可固定和免疫染色凝胶。结果显示，含有来自小鼠大脑的悬浮神经细胞部分的琼脂糖切片的免疫染色，如图28D所示。可融化或降解凝胶切片，释放要分析的细胞样品，如图28E所示。
实施例XVII：球状体聚集时间研究
参考图29，提供了聚集时间研究的图像。在2、4和8小时组装细胞，回收和成像。比较了磁性悬浮(LEV)和悬滴(HD)。8小时后，在磁性悬浮装置中形成稳定的细胞聚集物。这些图像中的白色比例尺是200μm。
实施例XVIII：Gd浓度和悬浮对细胞活力的效果
现在根据图30，显示了Gd浓度和悬浮对细胞活力的效果。在磁性悬浮(LEV)和悬滴(HD)过程中，3T3细胞接触不同的Gd+浓度(0,25,50,100mM)48小时。然后用活/死试验(钙黄绿素/溴乙菲啶同二聚物-1)评估球状体活力。获得的结果显示聚集体内的大部分细胞存活。白色比例尺表示100μm。
实施例XIX：球状体汇合
现在根据图31，图31A描述了DIO染色(绿色)和DII染色的3T3(红色)球状体的汇合。图31B描述了HUVEC-GFP(绿色)和DII染色的3T3(红色)球状体的汇合。先前用磁性悬浮(48小时，50mM Gd)制备球状体，然后都插入一个悬浮装置中。监测球状体相互作用3日。在图31C中，HUVEC-GFP(绿色)和DII-染色的3T3(红色)细胞引导到一起形成多细胞球状体。显示了亮视野和荧光图像。
获得的结果显示悬浮系统能迅速装配具有受控几何学和细胞组织的多细胞球状体。白色比例尺为200mm。
实施例XX：3T3球状体的功能性研究
现在参考图32，用磁性悬浮(LEV)和悬滴(HD)法装配3T3球状体(48小时，50千细胞/ml,50mM Gd+)。然后将球状体置于无粘性96孔板中，包埋在纤维蛋白凝胶(20mg/ml)中，培养5日，如图32A所示。每日收集球状体的亮视野图像。在图32A中，0-2日比例尺为200μm，3-5日比例尺为500μm。图32B显示了悬浮后球状体的免疫染色，图32C显示了纤维蛋白凝胶后5日。核(DAPI，蓝色)，细胞增殖(ki67，品红)，胶原I(红色)分泌和肌动蛋白丝(绿色)(以灰度显示颜色)。获得的结果显示装配的球状体有功能。白色比例尺表示200μm。
实施例XXI：用于装配的微流体磁性悬浮系统
现在根据图33A，提供了装配球状体的微流体磁性悬浮系统的示意图。在该提出的系统中，在磁性悬浮时，细胞在微流体装置壁之间区室化。因此，可以高通量方式获得多个球状体(每个区室一个)。图33B描述了在弯曲处形成的一个这样的球状体。使用150千细胞/ml的细胞浓度(48小时,60mM Gd+)。在图33B中，比例尺为200mm。
这些磁性悬浮系统和工具的各种其他应用
应理解，本文所述的各种工具、方法、和系统可用于广泛的应用。现在提供这些应用中的一些，以显示本文提供的工具、方法、和系统的一些可利用性
实施例XXII：磁性悬浮对靶细胞(即细菌、酵母、病毒、病原体、循环肿瘤细胞、循环表皮细胞等)鉴定和富集的磁性条带策略
可将磁性微米/纳米颗粒与物种特异性抗体偶联。抗体和分子靶标的结合将改变靶细胞(即导致感染的细菌)的磁性概貌。用磁性颗粒捕获特定的病原体后，其磁性概貌将提高，导致靶细胞/分子/病原体向微通道底部沉降。然后可将捕获的细胞/分子冲出，富集用于进一步分析(即抗生素敏感性分析)。
实施例XXIII来自临床样品的高通量细菌细胞分离和抗生素敏感性测试
细菌细胞比起红和白血细胞要显著更致密。样品注射入微流体悬浮系统后，细菌和血细胞根据其密度概貌悬浮，并分成均匀的层。由于其更高的密度，细菌细胞悬浮在不同高度，将从另一个(例如底部)出口收集，而红和白血细胞悬浮在不同高度，将从其他出口收集。高通量微流体平台还具有独特的能力，能重新使用分离的病原体，对同一样品进行重复的抗生素敏感性测试。使用现在的临床实验，由于分离的细菌细胞为约10-100细胞/ml，需要培养和扩增细菌。在微流体悬浮平台中，可用一种抗生素测试细菌细胞并调查悬浮概貌中的迅速改变。如果细菌群体对处理是抗性的，细菌细胞能够流出通道，用PBS洗涤腔以除去剩余的抗生素溶液，并用另一种候选抗生素测试同一细菌群体。因此，这种能力能够显著消除培养数量非常少的病原体的需要，以用于未来的抗生素敏感性测试。
实施例XXIV用于对患有慢性病的患者血细胞进行概述的悬浮平台
参考图34，悬浮平台可用于对患有慢性病的患者血细胞进行概述。例如，病症严重的慢性疲劳综合征(CFS)患者的血细胞(即红血细胞(RBC)和白血细胞(WBC))的悬浮概貌与健康对照的WBC的概貌显著不同。
实施例XXV：患有慢性疾病的患者红血细胞的连续监测和悬浮概述
图35和36描述了患有慢性疾病(即慢性疲劳综合征)的患者红血细胞和白血细胞分别的连续监测和悬浮概述。这样的连续监测可有助于鉴定根本原因或血液概貌随时间的改变。
实施例XXVI：用悬浮装置对代谢物、化学物效果的筛选和监测
图37显示了用悬浮装置筛选和监测代谢物、化学物的效果。图37A显示了用于研究加入ATP对白血细胞的效果的悬浮系统，这些白血细胞来自患有慢性疾病(即慢性疲劳综合征、癌症、感染性疾病)的患者。图37B显示了可根据其悬浮概貌实时地以单细胞分辨率监测、检测和计算细胞活力、活和死亡白血细胞的数量。
实施例XXVII：抗微生物用途
此外，该磁性悬浮系统可用于许多抗微生物用途，包括但不限于：检测土壤中的细菌细胞，对来自表面(即拭样)的细菌细胞的便携和快速检测，对医疗器械表面或在医院管理系统中微生物的调查，检测和分离植物细菌细胞的孢子。
实施例XXVIII细菌细胞的悬浮
参考图38，可在不同生物介质和土壤(即胎牛血清)中悬浮和检测细菌。将大肠杆菌(E.coli)(Dh5α)的过夜培养物稀释于FBS，悬浮在100mMGd+溶液中。悬浮1小时后，细菌细胞形成其固有悬浮条带。
实施例XXIX：来自表面的细菌细胞的迅速检测
图39和40显示了可从表面迅速检测细菌细胞。将100μl液体大肠杆菌(Dh5α)培养物倾倒到载玻片上，用棉拭子清洁表面。然后，在PBS内旋转棉拭子，将30μl拭样悬浮在200mM Gd+溶液中。细菌细胞在30分钟内形成其固有悬浮条带。因此，可用便携悬浮系统迅速检测来自表面的细菌。
现在参考图40，显示了在高顺磁条件下，可在5分钟内迅速从表面检测细菌细胞。将100μl液体大肠杆菌(Dh5α)培养物倾倒到载玻片上，用棉拭子清洁表面。然后，在PBS内旋转棉拭子，将30μl拭样悬浮在900mM Gd+溶液中。细菌细胞在5分钟内形成其固有悬浮条带。因此，可用便携悬浮系统迅速检测来自表面的细菌。
实施例XXX：其他类型组分和细胞的悬浮
可在适当悬浮设置条件下在本公开系统内悬浮其他类型的细胞。如在一些其他的实施例中，图41显示了磁性悬浮系统内孢子的悬浮和检测(见浅色斑点条带)。类似的图42显示了植物细菌细胞可在悬浮系统内悬浮和检测。
实施例XXXI：用磁性悬浮预测卵母细胞质量
可根据悬浮和密度概况预测卵母细胞的质量，用于生殖研究，例如体外授精(IVF)。参见图43，显示了各种卵母细胞的悬浮概况。分离自小鼠的卵母细胞悬浮在不同顺磁溶液中(10mM、15mM和30mM Gd+)。可从悬浮概貌监测和计算不同阶段卵母细胞的密度。
实施例XXXII：未感染对HIV感染的CD4T细胞的悬浮概貌还用磁性悬浮装置研究了未感染对感染的CD4T细胞的悬浮概貌。100,000个未感染和HIV-感染的血液CD4T细胞分别悬浮在含有30mM顺磁溶液的磷酸缓冲盐(PBS)中。样品悬浮20分钟，比较了悬浮概貌。如图44A和44B所示，未感染和HIV感染的血CD4T细胞在基于磁性悬浮的平台内具有显著不同的悬浮概况。
出于比较目的，在图45中显示了对感染细胞刺激的作用。用抗CD3/CD28/IL2珠刺激100,000个HIV-感染的CD4T细胞，将抗-CD3/CD28/IL2抗体分别悬浮在含有30mM顺磁溶液的PBS溶液中，如图45A所示(在图45B中定量)。用HIV-感染的血液CD4T细胞作为对照。样品悬浮20分钟，比较了悬浮概貌。显示了用抗-CD3/CD28/IL2珠和抗-CD3/CD28/IL2抗体刺激改变HIV感染的血CD4T细胞的悬浮概况。
实施例XXXIII：微流体高通量磁性悬浮平台的其他设计(即加入针头和抽吸)
现在参考图46，显示了微流体悬浮平台(μMagLev)的图像，其包括微毛细通道，入口，在微毛细通道末端的两个或多个针头：a)一个或多个针头在通道顶部，b)一个或多个针头在通道底部，以及收集出口。此外，这些针头可位于通道或外侧的3D空间区域的任何位置。样品(即珠、癌细胞、血液等)可在入口内混合，然后可用各种负压和流速根据密度回收样品。具有较低密度或较低磁化率的样品可通过具有底部针头的微流体泵回收和收集在底部出口管内。具有较高密度或较高磁化率的样品可通过底部针头回收，收集在底部出口管内。可据此进一步修改磁力平台的其他设计参数(例如磁场强度、磁体的几何位置、尺寸)，实现迅速处理和更好的分选。
在图46A，两个针头位于微毛细通道末端。接着，在图46B中，显示了珠和细胞可通过流动时的负压同时流动、分选、回收和收集。在图46C，显示了微流体maglev系统原型的照片。
现在参考图47，显示了微流体磁性悬浮系统内细胞的操纵和收集。在图47A中，具有较低密度或较低磁化率的样品可通过具有顶部针头的微流体泵和回收，收集在顶部出口管内。此外，可通过保持顶部针头的抽吸高于底部针头的抽吸(抽吸顶部针头>抽吸底部针头),将样品抽取至顶部收集针头。可相对操纵多个抽吸端口的流速来确定从哪处收集悬浮的样品。在图47B中，可从底部针头抽取较高密度的样品，收集在与底部收集针头连通的出口管内。此外，可通过保持顶部针头的抽吸低于底部针头的抽吸(抽吸顶部针头<抽吸底部针头),将样品抽取至底部收集针头。
实施例XXXIV：液滴分选和液滴测序的结果
可在磁性悬浮系统内悬浮液滴，提供各种不同的分析和诊断方法。液滴可悬浮在含有顺磁溶液的不同溶液和去污剂(例如胎牛血清、血浆、含PBS-Tween的胎牛血清、含PBS-Tween的血浆)内。可分选和分离包封生物组分(即细胞、RNA、DNA、病毒、细菌等)的液滴。包封不同类型细胞的液滴可具有不同的悬浮概貌，然后可对其分选和收集用于进一步的基因组、转录组、蛋白组、和代谢分析的表征。含有活和死细胞的液滴可具有不同的悬浮概貌。这可用于Drop-Seq用途，以分离含有死细胞和含有活细胞的液滴。然后可将仅包封活细胞的液滴用于Drop-Seq(液滴测序)。这种能力显著减少了液滴测序法的成本和处理时间。
首先看图48，液滴悬浮在补充有150mM的顺磁溶液(即钆)的胎牛血清(FBS)中。在图49中，液滴悬浮在补充有150mM的顺磁溶液(即钆)的胎牛血清(FBS)+PBS-Tween20中。PBS-Tween溶液帮助分散液滴。在图50中，液滴悬浮在补充有150mM的顺磁溶液(即钆)的胎牛血清(FBS)+PBS-Tween20中。可悬浮、分选和分离包封不同生物组分的液滴。可悬浮空液滴和含荧光标记病毒颗粒的液滴，并对其进行成像。可在悬浮系统中分选荧光和非荧光液滴。
实施例XXXV：癌症研究的数据采集
图51表征了无化学和无标记的磁性悬浮芯片。悬浮芯片能在同一装置内同时分离循环肿瘤细胞和循环肿瘤簇。如图51A所示，描述了可用于测试钙黄绿素标记的单个细胞(CTC)和癌细胞聚集物(CTM)的存在的过程。可在与WBC的掺入实验中在同一装置内同时分离和分选肾癌细胞的单个细胞(CTC)和肾癌细胞的簇(CTM)，而不用任何标记检测。接着，在图51B中，通过磁力蓝图显示了从血液分离癌细胞的效率。就不同的癌细胞类型(即肺、乳腺和肾癌)分析并比较了不同浓度的掺入癌细胞(100细胞/ml、1,000细胞/ml，100,000细胞/ml)的效力。分离效率定义为血细胞条带上方悬浮的癌细胞对掺入的癌细胞总数的比例。(N＝3个独立实验，数据表示成平均值±平均值的标准误差(SEM))。
以1:20比例将来自肾癌患者的血样稀释在FBS中，然后悬浮在磁性悬浮装置内的30mM Gd+溶液中。悬浮20分钟后，CTC和CTC簇(蓝色圆圈，即右侧的三个圆圈)悬浮在由RBC和WBC组成的条带上方，如图51A所示，最右侧的图像。观察到这些推定的CTC密度非常轻，因为它们悬浮在微毛细通道顶部。
图52显示了肾癌(肾细胞癌)病人血样的磁性悬浮概况。血液样品以1:20比率稀释在FBS中，然后悬浮在30mM Gd+溶液中。CTC簇(在两幅图中圈出的区域)悬浮在包含RBC和WBC的条带上方。
已通过一个或多个优选的实施方式描述了本发明，但应理解除了明确描述的那些方案之外，许多等同方案、替代方案、变化方案和修改方案是可能实现的并在本发明范围内。

Claims (35)

1.基于磁性悬浮的诊断系统，其包含：
分离异质组分群的悬浮装置，其中组分中的差异基于磁化率和/或固有密度的不同，所述装置包括至少一个产生磁场的磁体，其中该磁场的大小确定为与接收含有所述异质组分群的样品的微毛细或微流体通道相互作用；
其中通过多层确定微毛细或微流体通道，在所述多层内形成微毛细或微流体通道的部分，所述多层中的至少之一提供进入微毛细或微流体通道的入口通道，所述多层中的至少两个提供自微毛细或微流体通道的独立出口，其配置成通过微流体泵从独立出口抽吸液体，相对操纵多个独立出口的流速来确定从哪处收集悬浮的样品。
2.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述多层包括至少两层，所述至少两层的每一层包括在其中形成的各自入口和各自出口。
3.如权利要求1所述的系统，其特征在于，从激光加工材料形成每层。
4.如权利要求1所述的系统，其特征在于，在所述多层的至少两层之间安置薄膜，形成顶部和底部出口。
5.一种使用如权利要求1所述的系统进行分选的方法，所述方法包括：
使包含异质组分群的样品和顺磁介质流入至少一个入口和微毛细或微流体通道；
在所述包含异质组分群的样品上施加磁场，以根据所述异质组分群的个体成员以及顺磁介质之间的至少一种磁化率和固有密度的差异来分离异质群；
然后，样品的第一部分从顶部出口流出，样品的第二部分从底部出口流出，从而将所述异质组分群的第一组与所述异质组分群的第二组分开。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述多层包括至少三层，包括顶层、中间层和底层，其中三层中的每一层都包括在其中形成的各自入口和各自出口，和其中样品流入入口、微毛细或微流体通道至少一个的步骤包括将包含所述异质组分群的样品和顺磁介质引入底部入口，将顺磁介质引入顶部和中间入口。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述样品是混有顺磁介质的血液样本，所述血液样本包括循环肿瘤细胞(CTC)或循环肿瘤簇/血栓(CTM)，其中CTC/CTM在接触微毛细或微流体通道内的磁场后分离，并流入顶部通道。
8.如权利要求5所述的方法，还包括在温度和交联的至少一种的帮助下稳定分离的组分群体的步骤。
9.一种用包括用于分离生物或非生物组分群体的装置的系统进行分选的方法，其中该装置包括至少一个产生磁场的磁体，其中该磁场的大小确定为与接收含有所述组分群体的样品的微毛细或微流体通道相互作用，其中通过多层确定微毛细或微流体通道，在所述多层内形成微毛细或微流体通道的部分，所述多层中的至少之一提供进入微毛细或微流体通道的入口通道，所述多层中的至少两个提供自微毛细或微流体通道的独立出口；该方法包括：
使包含组分群的样品和顺磁介质从入口流入微毛细或微流体通道，向出口流动；
当样品在微毛细或微流体通道内时，用至少一个磁体对样品施加磁场，其中磁场的施加阻止了至少一些，但非全部的组分群体的成员流向出口，从而分离了组分群体；
和，
通过微流体泵从两个或多个独立出口抽吸液体，相对操纵多个独立出口的流速来确定从哪处收集悬浮的样品。
10.如权利要求9所述的方法，其中阻止至少一些而非全部组分群体的成员由于高磁力感应而在磁场的磁力边缘发生。
11.如权利要求9所述的方法，其中组分群体包括血液样品，其中血细胞被阻止通过所述至少一个磁体产生的磁场，而血浆能够流过所述至少一个磁体产生的磁场，通过微毛细或微流体通道流向出口。
12.如权利要求9所述的方法，还包括在温度和交联的至少一种的帮助下稳定分离的组分群体的步骤。
13.与成像装置一起使用的基于磁性悬浮的诊断系统，该系统包括：
用于分离异质细胞群的悬浮装置，其中细胞中的差异是基于磁化率的不同；该装置包括至少一个产生磁场的磁体，其中该磁场位于接收含有异质细胞群的样品的微毛细或微流体通道附近，其中通过多层确定微毛细或微流体通道，在所述多层内形成微毛细或微流体通道的部分，所述多层中的至少之一提供进入微毛细或微流体通道的入口通道，所述多层中的至少两个提供自微毛细或微流体通道的独立出口；
光源；
框体，该框体支持悬浮装置和光源，还配置成支持成像装置，该框体支持光源，其位置能将光传递通过悬浮装置到达成像装置，用于实时观察异质细胞群的至少一部分；和
与微毛细或微流体通道的独立出口流体联通微流体泵，其中所述微流体泵配置成从独立出口抽出液体，相对操纵多个独立出口的流速来确定从哪处收集悬浮的样品。
14.如权利要求13所述的系统，还包括镜头，其中框体支持镜头，光源的位置还能将光传递通过镜头到达成像装置。
15.如权利要求13所述的系统，其中成像装置是智能手机、CMOS照相机以及CCD照相机之一。
16.如权利要求13所述的系统，其中成像装置收集的数据通过蓝牙、无线网和蜂窝网络的至少一种传送。
17.如权利要求13所述的系统，还包括框体支持的中性密度滤膜，其中中性密度滤膜安置在光源和悬浮装置之间。
18.如权利要求13所述的系统，还包括框体支持的成像装置，其中成像装置包括照相机，框体接受成像装置的位置使照相机位于接受通过镜头传递的图像的位置。
19.如权利要求18所述的系统，其中成像装置配置成实时观察异质细胞群的分离。
20.如权利要求13所述的系统，其中框体具有紧凑位置，以减少框体的尺寸便于携带，以及扩展位置，其中框体经扩展。
21.如权利要求20所述的系统，其中当框体在扩展位置时，框体配置成在其顶部表面的凹陷处接受成像装置。
22.如权利要求21所述的系统，其中成像装置是紧凑的，并插入了智能手机样的保护壳，从而将成像装置与成像通路连接，并在框体内建立智能手机的位置。
23.如权利要求13所述的系统，其中当框体接受了成像装置时，成像装置的照相机面对镜头，成像装置的显示器保持可见，用于观察包含异质细胞群的样品。
24.如权利要求23所述的系统，其中该系统还配置成对悬浮物体的数量进行计数和定量。
25.如权利要求13所述的系统，其中所述成像装置能用该成像装置进行白视野和荧光类型的成像。
26.一种在基于磁性悬浮的诊断系统中观察异质细胞群的方法，其特征在于，该方法包括步骤：
将细胞群的样品置于悬浮装置的微毛细或微流体通道内，其中通过多层确定微毛细或微流体通道，在所述多层内形成微毛细或微流体通道的部分，所述多层中的至少之一提供进入微毛细或微流体通道的入口通道，所述多层中的至少两个提供自微毛细或微流体通道的独立出口；
将成像装置置于框体内；
在悬浮装置中分离细胞群；
当在悬浮装置内分离细胞群时，用成像装置收集细胞群分离的图像；和
用微流体泵从所述独立出口抽出样品，其中，相对操纵多个独立出口的流速来确定从哪处收集悬浮的样品。
27.如权利要求26所述的方法，其中细胞群分离的图像的收集实时进行。
28.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述样品是血液。
29.如权利要求26所述的方法，其中样品选自体液，包括唾液、尿液、血浆、血清和粪便；拭样，包括皮肤、肛门、鼻腔和阴道拭样，或门把手的环境拭样；以及近端液体，包括泪液、肺部的洗液，乳腺的间隙组织液。
30.如权利要求26所述的方法，还包括从收集的细胞群图像对至少一些细胞群进行计数和定量至少之一的步骤。
31.一种将液滴中包封的多个组分悬浮在磁性悬浮系统中，用于液滴测序的方法，该方法包括步骤：
将多个组分包封在多个液滴中，将多个液滴悬于样品中；
将包含多个液滴的样品置于磁性悬浮系统的微毛细或微流体通道中；
在磁性悬浮系统中悬浮多个液滴，其中通过多层确定微毛细或微流体通道，在所述多层内形成微毛细或微流体通道的部分，所述多层中的至少之一提供进入微毛细或微流体通道的入口通道，所述多层中的至少两个提供自微毛细或微流体通道的独立出口；和
用微流体泵从独立出口抽出样品，相对操纵多个独立出口的流速来确定从哪处收集悬浮的样品。
32.如权利要求31所述的方法，其中样品还包括多个没有包封所述多个组分中任一的液滴。
33.一种分离异质细胞群的方法，包括：
获得包含结合于单个磁体的微毛细或微流体通道的系统,其中通过多层确定微毛细或微流体通道，在所述多层内形成微毛细或微流体通道的部分，所述多层中的至少之一提供进入微毛细或微流体通道的入口通道，所述多层中的至少两个提供自微毛细或微流体通道的独立出口；
对微毛细或微流体通道提供异质细胞群；
基于异质细胞群的磁化率和密度在微毛细或微流体通道内悬浮异质细胞群；和
用微流体泵从独立出口抽出细胞，相对操纵多个独立出口的流速来确定从哪处收集细胞群。
34.一种分离和收集异质细胞群的方法，该方法包括：
获得包含两个或多个出口的微毛细或微流体通道，其中通过多层确定微毛细或微流体通道，在所述多层内形成微毛细或微流体通道的部分，所述多层中的至少之一提供进入微毛细或微流体通道的入口通道，所述多层中的至少两个提供自微毛细或微流体通道的独立出口；
在微毛细或微流体通道内安置在顺磁介质内的异质细胞异质群；
基于异质细胞群的磁化率和密度在微毛细或微流体通道内分离异质细胞群；和
用微流体泵从两个或多个出口抽出含有经分离的细胞的液体，相对操纵多个独立出口的流速来确定从哪处收集细胞群。
35.从血样中分离细胞的方法，其包括：
将血样和顺磁介质置于磁场下的微毛细和微流体通道内，其中通过多层确定微毛细或微流体通道，在所述多层内形成微毛细或微流体通道的部分，所述多层中的至少之一提供进入微毛细或微流体通道的入口通道，所述多层中的至少两个提供自微毛细或微流体通道的独立出口；
基于细胞的磁化率和密度在微毛细或微流体通道内悬浮细胞；
用微毛细或微流体通道的悬浮高度阈值分离胚胎细胞；和
用微流体泵从独立出口抽出血样，相对操纵多个独立出口的流速来确定从哪处收集血样。
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