KR20180061336A - 자기 부상을 이용한 생물학적 및 비-생물학적 모이어티의 분류 - Google Patents

자기 부상을 이용한 생물학적 및 비-생물학적 모이어티의 분류 Download PDF

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세미 카라마크
우트칸 데미르시
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라르스 슈타인메츠
재영 양
티룹파티라자 친나사미
알레싼드로 토치오
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Abstract

미세유체 환경에서 하나 이상의 자석을 이용하여 모이어티, 세포, 또는 다른 그러한 유닛의 집단을 부상시키기 위한 시스템 및 방법이 제공된다. 이러한 시스템 및 방법은, 예를 들어, 유닛의 부상 중에 다중-유닛 어셈블리를 어셈블링하고, 샘플을 포인트 오브 케어에서 실시간으로 평가하기 위해, 유닛의 이종 집단을 서로에게서 분리 또는 분류하는데 이용될 수 있다. 이러한 시스템 및 방법은 또한 유닛이 시스템에서 조작될 때 스마트폰과 같은 이미징 디바이스가 실시간으로 유닛을 캡쳐할 수 있게 하는 프레임을 이용할 수 있다.

Description

자기 부상을 이용한 생물학적 및 비-생물학적 모이어티의 분류
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2015년 10월 2일 출원된 "Sorting Biological and Non-Biological Moieties Using Magnetic Levitation"이라는 명칭의 미국 가특허 출원 일련 번호 62/236,692의 이익을 주장하며, 이의 내용은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로서 포함된다.
연방 후원 연구 또는 개발의 진술
본 발명은 국립 과학 재단에 의해 수여된 계약 1150733 및 국립 보건원에 의해 수여된 계약 EB015776 및 HG000205 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 가진다.
배경
본 개시내용은 미세유체 환경에서 하나 이상의 자석을 이용하여 모이어티, 세포, 또는 다른 그러한 유닛의 집단을 부상시키기 위한 시스템 및 방법에 관한 것이다. 이러한 시스템 및 방법은 유닛의 부상 중에 다중-유닛 어셈블리를 어셈블링하기 위해, 유닛의 이종 집단을 서로에게서 분리 또는 분류하는데 이용될 수 있다. 이러한 시스템 및 방법은 또한 유닛이 시스템에서 조작될 때 스마트폰과 같은 이미징 디바이스가 실시간으로 유닛을 캡쳐할 수 있게 하는 프레임을 이용할 수 있다.
자기 부상은 개별적인, 거시적인 물체의 밀도 및 자화율의 분석 및 음식을 분리하는데 있어서 효과적인 수단으로서 전통적으로 사용되어 왔고, 우유, 치즈, 및 땅콩 버터의 지방 함량을 측정하고, 이들의 고유 밀도를 기준으로 다양한 곡물을 비교하고, 물체의 자가-어셈블리를 유도하고, 법의학-관련 증거의 특성을 분석한다. 이러한 초기의 자기 부상-기반 실험은 현미경과 상용되지 않거나 현미경에 대해 설계되지 않은 대형 셋업을 이용하여 수행되었다.
생리학적 및 병리학적 둘 모두의 광범위하게 다양한 세포 과정은 세포내 상자성 반응 종, 예를 들어, 반응성 산소 종(ROS) 또는 반응성 질소 종(RNS)의 형성 또는 켄칭으로 인해 세포의 용적 질량 밀도 또는 자기 시그니처에서의 일시적 또는 영구적 변화를 수반한다. 이러한 사건은 세포-주기 단계, 분화, 세포 사멸(아폽토시스/괴사), 악성종양, 질병 상태, 활성화, 포식작용, 생체내 및 생체외 세포 노화, 바이러스 감염, 및 약물에 대한 특이적 반응 뿐만 아니라 비-특이적 반응을 포함한다.
발명의 개요
임상 및 가정 환경을 포함하는 생활 지점에서 건강 정보를 공유하기 위해 휴대 가능하고, 견고하며, 저렴하고, 사용하기 쉬운 질병 진단 및 예후 모니터링 플랫폼에 대한 새로운 필요성이 대두되고 있다. 본원에서, 상이한 유닛(예를 들어, 백혈구 및 적혈구 및 다른 모이어티)이 자기 구배에서 부상하고 자기 구배에서의 이들의 독특한 밀도로 인해 분리되는 자기 부상-기반 진단 시스템이 제공된다. 더욱이, 상응하는 분석을 위해 사용하기 쉬운 스마트폰 통합된 부상 시스템이 기재된다. 휴대 가능한 이미징 자기 부상(i-LEV) 시스템을 이용하여, 예를 들어, 백혈구 및 적혈구가 확인될 수 있고, 세포 수가 임의의 라벨을 사용하지 않고 정량될 수 있는 것으로 보여진다. 또한, i-LEV에서 부상된 세포 또는 다른 모이어티는 단일 유닛 해상도(예를 들어, 단일 세포)로 구별될 수 있어서, 진단 및 모니터링, 뿐만 아니라 임상 및 연구 응용을 가능하게 한다. 무엇보다도, 이것은 가정-환경 및 임상 환경을 포함하는 다양한 환경에서 스마트폰을 사용한 질병 진단 및 모니터링을 가능하게 한다.
그러한 기재된 시스템의 많은 가능한 응용이 존재한다. 이와 같은 시스템은 또한, 예를 들어, 라벨-비함유용 미세유체 플랫폼으로서, 전혈로부터 순환 종양 세포(CTC)의 고효율 분리에 이용될 수 있다. 플랫폼은 세포가 미세채널에서 흐르는 동안 이들의 밀도 프로파일에 기반하여 세포를 분리하는 자기 부상의 원리를 사용한다. 전형적으로 혈액 세포보다 낮은 고유 밀도를 갖는 암 세포는 3개의 상이한 상자성 유체가 위부터 아래까지(top-on-bottom) 흐르는 미세채널 내에서 더 높은 수준으로 부상할 수 있다(상부 및 중간 흐름: 담체 완충제, 바닥 흐름: 암 세포를 함유하는 샘플 혈액). 이후 그렇게 부상한 암 세포를 샘플 혈액 흐름으로부터 추출할 수 있고, 상부에 흐르는 담체 완충제 유체 내에 수집한다. 따라서, 플랫폼은 CTC-유래된 바이오마커 및 분자 표적에 대한 임상 연구를 용이하게 하는, 예를 들어, 암 환자의 혈액으로부터 희귀 CTC의 고효율 분리를 가능하게 한다.
따라서, 기재된 시스템은 몇 가지 예로서 전혈로부터 혈장의 분리 및 또한 전혈로부터 CTC의 분리에서의 사용에 고도로 적용될 수 있다.
여전히, 시스템에 의해 제공된 분리 및 분류는 다양한 다른 응용을 갖는다. 예를 들어, 이것은 3차원 세포 배양을 위한 기술을 가능하게 하므로, 자기 시그니처에 기반한 다중-세포 어셈블리를 위한 방법에 적용된다. 이것은 추가로 미세중력의 가능한 지상-기반 시뮬레이션으로서 세포의 자기 부상에 이용될 수 있다. 또한 추가로, 이러한 도구는 자기/밀도 특성 및 이미징/분자 프로파일링에 기반한 분류, 회수 및 특성화를 위한 방법에 사용될 수 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 자기 부상-기반 진단 시스템이 제공된다. 자기 부상-기반 진단 시스템은 모이어티의 이종 집단을 분리하기 위한 부상 장치를 포함하며, 모이어티의 변동은 자화율 및 고유 밀도 중 하나 이상의 차이에 기반한다. 장치는 자기장을 생성하는 적어도 하나의 자석을 포함하며, 자기장은 모이어티의 이종 집단을 함유하는 샘플의 수용을 위해 미세유체 채널 또는 미세모세관과 상호작용하는 크기이다. 미세모세관 또는 미세유체 채널은 그 안에 형성된 미세모세관 또는 미세유체 채널의 부분을 갖는 복수의 층에 의해 한정되며 복수의 층들 중 적어도 하나는 미세모세관 또는 미세유체 채널로의 입구 채널을 제공하고 복수의 층들 중 적어도 2개는 미세모세관 또는 미세유체 채널로부터의 분리된 출구를 제공한다.
일부 형태에서, 복수의 층은 적어도 2개의 층을 포함할 수 있고, 각각의 층은 그 안에 형성된 개별 입구 및 개별 출구를 포함한다.
일부 형태에서, 각각의 개별 층은 레이저-가공 물질로부터 형성될 수 있다.
일부 형태에서, 박막은 상부 및 바닥 출구를 설정하기 위해 복수의 층들 중 적어도 2개 사이에 배치될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 이 시스템은 분류 방법에 사용될 수 있다. 상기 방법은 모이어티의 이종 집단 및 상자성 매질을 포함하는 샘플을 입구(들) 및 미세모세관 또는 미세유체 채널로 유동시키는 것을 포함한다. 자기장을 모이어티의 이종 집단을 포함하는 샘플에 적용시켜, 모이어티의 이종 집단의 개개 구성원과 상자성 매질 사이의 자화율 및 고유 밀도 중 적어도 하나에서의 차이에 기반하여 이종 집단을 분리한다. 그 후, 샘플의 제1 부분은 상부 출구로부터 흘러 나오고, 샘플의 제2 부분은 바닥 출구로부터 흘러 나와, 모이어티의 이종 집단의 제1 그룹을 모이어티의 이종 집단의 제2 그룹으로부터 분리시킨다.
상기 방법의 일부 형태에서, 복수의 층은 상부, 중간 및 바닥 층을 포함하는 적어도 3개의 층을 포함할 수 있는데, 3개의 층 각각은 그 안에 형성된 개별 입구 및 개별 출구를 포함한다. 이러한 형태에서, 샘플을 입구(들) 및 미세모세관 또는 미세유체 채널로 유동시키는 단계는 모이어티의 이종 집단 및 상자성 매질을 포함하는 샘플을 바닥 입구로 도입시키고 상자성 매질을 상부 및 중간 입구로 도입시키는 것을 포함할 수 있는 것으로 고려된다. 요망되는 만큼 많은 층, 입구, 및/또는 출구가 시스템에 첨가될 수 있고; 상기 형태에서 3개 이상의 층이 파악되지만, 3개의 층은 제공될 수 있는 층의 단지 한 예시적인 수이며 마찬가지로 3개 초과 또는 미만의 출구가 존재할 수 있는 것으로 고려된다.
일부 형태에서, 샘플은 상자성 매질과 혼합된 혈액 샘플일 수 있다. 혈액 샘플은 순환 종양 세포(CTC) 또는 순환 종양 클러스터/색전(CTM)을 포함할 수 있고 CTC 또는 CTM은 미세모세관 또는 미세유체 채널에서 자기장에 노출 후 분리되어 상부 채널로 흐를 수 있다.
일부 형태에서, 상기 방법은 온도 및 가교 중 적어도 하나의 도움으로 모이어티의 분리된 집단을 안정화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 생물학적 또는 비-생물학적 모이어티의 집단을 분리하기 위한 장치를 포함하는 시스템을 이용한 분류 방법이 제공되고, 장치는 모이어티의 집단을 함유하는 샘플의 수용을 위해 미세모세관 또는 미세유체 채널과 상호작용하는 크기의 자기장을 생성하는 적어도 하나의 자석을 포함한다. 이러한 방법에서, 모이어티의 집단 및 상자성 매질을 포함하는 샘플은 입구에서 미세모세관 또는 미세유체 채널을 지나 출구 쪽으로 유동한다. 샘플이 미세모세관 또는 미세유체 채널에 있는 동안, 자기장은 자석(들)을 사용하여 샘플에 적용된다. 자기장의 적용은 모이어티의 집단의 구성원들 중 전체가 아닌 적어도 일부가 출구를 향해 흐르는 것을 차단하여, 모이어티의 집단을 분리시킨다.
이 방법의 일부 형태에서, 모이어티의 집단의 구성원들 중 전체가 아닌 적어도 일부의 차단은 고 자기 유도로 인해 자기장의 자기 에지에서 발생할 수 있다.
일부 형태에서, 모이어티의 집단은 혈액 샘플을 포함할 수 있고, 혈액 세포는 자석(들)에 의해 생성된 자기장을 지나 이동하는 것이 차단되지만, 혈장은 자석(들)에 의해 생성된 자기장을 지나 미세모세관 또는 미세유체 채널을 통해 출구로 흐를 수 있다.
일부 형태에서, 상기 방법은 온도 및 가교 중 적어도 하나의 도움으로 모이어티의 분리된 집단을 안정화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 자기장을 생성하는 적어도 하나의 자석을 포함하는 부상 장치를 포함하는 자기 부상-기반 진단 시스템을 사용하여 자기 시그니처에 기반한 다중-모이어티 어셈블리를 어셈블링하는 방법이 제공되고, 자석(들)은 모이어티의 집단을 함유하는 샘플의 수용을 위해 미세모세관 또는 미세유체 채널에 근접해 있다. 모이어티의 집단 및 상자성 매질을 포함하는 샘플은 미세모세관 또는 미세유체 채널로 도입된다. 샘플이 미세모세관 또는 미세유체 채널에 있는 동안, 자기장이 자석(들)을 사용하여 샘플에 적용되고, 이로써 자기장의 적용은 모이어티의 집단의 적어도 부분을 부상시켜 모이어티의 집단을 서로에 대해 공간적 관계에 놓으며, 이 때 모이어티의 집단은 응집하여 다중-모이어티 어셈블리를 형성한다.
상기 방법의 일부 형태에서, 다중-모이어티 어셈블리를 형성하는 모이어티의 집단의 응집은 일정 기간 동안 자발적으로 발생할 수 있고 그 동안 모이어티의 집단은 자기장에 의해 유도된 부상에 의해 확립된 공간적 관계로 실질적으로 유지된다.
일부 형태에서, 자기장은 영구 자석에 의해 생성될 수 있다. 다른 형태에서, 자기장은 전류에 의해 유도된 코일에 의해 생성될 수 있다. 또 다른 형태의 자기장 생성이 또한 사용될 수 있다.
모이어티는 다수의 상이한 유형의 유닛 또는 물질일 수 있다. 상기 방법의 일부 형태에서, 모이어티는 세포일 수 있다. 상기 방법의 다른 형태에서, 모이어티는 중합체일 수 있다.
상기 방법의 일부 형태에서, 다중-모이어티 어셈블리를 형성하는 모이어티의 집단의 응집이 발생할 수 있고 온도 및 가교 중 적어도 하나의 도움으로 안정화를 초래할 수 있다.
본 발명의 여전히 또 다른 양태에 따르면, 자기 부상-기반 진단 시스템은 이미징 장치와 함께 사용하기 위해 제공된다. 시스템은 세포의 변동이 자화율의 차이에 기반한 세포의 이종 집단을 분리하기 위한 부상 장치를 포함한다. 상기 장치는 자기장을 생성하는 적어도 하나의 자석을 포함하고, 자석(들)은 세포의 이종 집단을 함유하는 샘플의 수용을 위해 미세모세관 또는 미세유체 채널에 근접해 있다. 상기 시스템은 광원, 렌즈(시스템의 일부 형태에서, 렌즈는 생략될 수 있지만), 및 프레임을 추가로 포함한다. 프레임은 부상 장치, 광원, 및, 시스템의 일부로 존재하는 경우, 렌즈를 지지한다. 이 프레임은 이미징 장치를 지지하도록 추가로 구성된다. 프레임은 세포의 이종 집단의 적어도 일부에 대한 실시간 관찰을 위해 광을 부상 장치 및, 존재하는 경우, 렌즈를 통해 이미징 장치로 전송하는 위치에서 광원을 지지한다.
일부 형태에서, 이미징 장치는 스마트폰, CMOS 카메라, 및 CCD 카메라 중 하나일 수 있다. 이미징 장치에 의해 수집된 데이터는, 특히 작업 장소가 원격 관리 지점일 때 블루투스 또는 와이파이 또는 전화 네트워크를 통해 전송될 수 있다.
일부 형태에서, 상기 시스템은 프레임에 의해 지지되는 중성 농도 필터를 추가로 포함할 수 있고, 중성 농도 필터는 광원과 부상 장치 사이에 위치한다.
일부 형태에서, 상기 시스템은 프레임에 의해 지지되는 이미징 장치를 추가로 포함할 수 있고, 이미징 장치는 카메라를 포함한다. 이러한 형태에서, 프레임은 카메라가 렌즈를 통해 전송된 이미지를 수신할 수 있게 정위되는 위치에 이미징 장치를 수용할 수 있다. 이미징 장치는 세포의 이종 집단의 분리를 실시간으로 관찰하도록 구성될 수 있다.
일부 형태에서, 프레임은 휴대성을 위해 프레임의 크기를 줄인 압축된 상태 및 프레임이 확장된 확장된 상태를 가질 수 있다. 프레임이 확장된 상태일 때, 프레임은 이의 상부 표면의 리세스에 이미징 장치를 수용하도록 구성될 수 있다.
이미징 장치가 프레임에 수용될 때, 이미징 장치의 카메라는 렌즈를 향할 수 있고 이미징 장치의 디스플레이는 세포의 이종 집단을 함유하는 샘플의 관찰을 위해 계속 볼 수 있다.
본 발명의 여전히 또 다른 양태에 따르면, 자기 부상-기반 시스템에서 세포의 이종 집단을 관찰하기 위한 방법이 제공된다. 세포 집단의 샘플은 부상 장치의 미세모세관 또는 미세유체 채널에 수용되거나 배치된다. 이미징 장치는 프레임에 배치된다. 세포 집단은 부상 장치에서 분리된다. 세포 집단이 부상 장치에서 분리되는 동안, 이미징 장치는 세포 집단의 분리 이미지를 수집하는데 이용된다.
상기 방법의 일부 형태에서, 세포 집단의 분리 이미지의 수집은 실시간으로 발생할 수 있다.
상기 방법의 일부 형태에서, 샘플은 혈액일 수 있다. 상기 방법의 다른 형태에서, 샘플은 타액, 소변, 혈장, 혈청 및 대변을 포함하는 체액; 피부, 항문, 비강 및 질 면봉 또는 손잡이로부터의 환경 면봉을 포함하는 면봉; 눈물, 폐로부터의 라바쉬(lavash)액, 유방으로부터의 사이질 조직액을 포함하는 근위 유체일 수 있다. 물론, 이 샘플 목록은 예시적인 것이고 비제한적인 것임이 이해될 것이다.
일부 형태에서, 상기 방법은 세포 집단의 수집된 이미지로부터 세포 집단의 적어도 일부를 계수 및/또는 정량하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 자기 부상-기반 시스템은 모이어티의 이종 집단을 분리하기 위한 부상 장치를 포함하고, 모이어티의 변동은 자화율 및/또는 고유 밀도에서의 차이에 기반한다. 장치는 자기장이 모이어티의 이종 집단을 함유하는 샘플의 수용을 위해 미세모세관 또는 미세유체 채널과 상호작용하는 크기인 자기장을 생성하는 적어도 하나의 자석을 포함한다. 상기 시스템은 미세모세관 또는 미세유체 채널로부터의 유체를 미세모세관 또는 미세유체 채널의 높이 및/또는 폭에 걸쳐 각기 소정의 위치에 도입하거나 회수하기 위해 미세모세관 또는 미세유체 채널의 입구 및/또는 출구에 적어도 하나의 바늘을 추가로 포함한다
일부 형태에서, 복수의 바늘은 입구 또는 출구 중 하나 또는 둘 모두에 있을 수 있고, 각각의 복수의 바늘은 상이한 공간 위치에서 미세모세관 또는 미세유체 채널과 유체 연통될 수 있다.
일부 형태에서, 분류를 촉진하기 위해, 입구의 첫 번째 주입 바늘은 출구의 두 번째 흡입 바늘과 다른 높이에 있을 수 있다. 앞서 논의한 대로, 샘플 중 그 사이에서 모이어티의 자기 분리가 있을 수 있다.
또 다른 양태에 따르면, 생식 의료에 사용하기 위한 개개 배아 및 난모세포의 품질을 평가하는 방법이 기재된다. 상기 방법은 부상 장치의 미세모세관 또는 미세유체 채널에 하나 이상의 배아 또는 난모세포를 포함하는 샘플을 배치하고, 배아 또는 난모세포를 포함하는 샘플을 부상 장치에서 부상시키는 것을 포함한다. 배아 또는 난모세포의 품질은 밀도 및 부상 프로파일 중 하나 이상에 따라 등급이 매겨진다.
일부 형태에서, 상기 방법은 밀도 및 부상 프로파일 중 하나 이상에 따른 배아 또는 난모세포의 품질 등급에 기반하여 배아 또는 난모세포 중 하나 이상을 선택하고, 선택된 하나 이상의 배아 또는 난모세포를 체외 수정 절차에서 적용시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 양태에 따르면, 자기 부상 시스템에서 점적으로 캡슐화된 복수의 모이어티를 부상시키기 위한 방법이 기재된다. 상기 방법은 복수의 모이어티를 복수의 점적으로 캡슐화시키는 단계 및 복수의 점적을 샘플에서 현탁시켜, 복수의 점적을 함유하는 샘플을 자기 부상 시스템의 미세모세관 또는 미세유체 채널에 배치하는 단계, 및 복수의 점적을 자기 부상 시스템에서 부상시키는 단계를 포함한다.
상기 방법의 일부 형태에서, 샘플은 임의의 복수의 모이어티를 캡슐화하지 않은 복수의 점적을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 및 또 다른 이점은 상세한 설명 및 도면으로부터 명백해질 것이다. 이어지는 것은 단지 본 발명의 바람직한 구체예에 대한 설명이다. 본 발명의 전체 범위를 평가하기 위해, 청구 범위는 바람직한 구체예가 청구 범위의 범주 내에서 유일한 구체예로서 의도되지 않는 것으로 보아야 한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 세포 정량 및 신속한 샘플 제조를 위한 i-LEV 플랫폼을 예시한다. 도 1A는 부상 장치에서 보여지는 자석, 모세관 채널 및 미러의 배열을 보여준다. 도 1B는 (I) 환자로부터 미세모세관으로 로딩되거나 수집되는 적은 부피(30 μL)의 혈액 샘플, (II) 모세관 힘을 이용하여 미세모세관 채널로 로딩되는 혈액 샘플, (III) Critoseal™으로 미세모세관 채널의 밀봉, 및 (IV) 동일한 극이 서로 마주하는 2개의 영구적 네오디뮴 자석 사이에 도입된 모세관 채널을 예시한다. 도 1C는 스마트폰, 렌즈, 부상 장치, 광원, 및 주변 프레임에 의해 지지된 필터를 포함하는 i-LEV 셋업을 예시한다.
도 2는 i-LEV 플랫폼 내에서 적혈구 및 백혈구의 분리를 예시한다. 도 2A는 i-LEV에 의해 촬영된 WBC 및 RBC 분리 이미지를 보여준다. 도 2B는 명시야를 이용한 통상적인 현미경에 의해 이미징된 상이한 높이로 부상된 RBC 및 WBC를 보여준다. 도 2C는 CD45-라벨링된 WBC의 형광 이미지를 보여준다. 도 2D는 WBC 및 RBC의 분리를 확인하기 위한 명시야 및 CD45 이미지의 중첩을 보여준다. 도 2E는 i-LEV에 의한 RBC 및 WBC의 산-죽은(live-dead) 검정 이미징을 보여주며, 살아 있는 RBC는 부상하는 한편 죽은 WBC는 모세관의 바닥에서 응집된다. 도 2F는 명시야를 보여주고, 도 2G는 DAPI-라벨링된 것을 보여주며, 도 2H는 형광 현미경을 이용한 WBC의 중첩된 이미지를 보여준다.
도 3은 상이한 희석율 및 시점에 적혈구 및 백혈구의 폭을 보여준다. 도 3A는 시간에 따른 부상된 세포 밴드의 폭의 변화를 보여주는 상이한 시점에서의 RBC 밴드 폭의 이미지를 포함한다. 도 3B는 30분 동안 i-LEV에 의해 분석되는 2개의 상이한 농도(9천만개 및 4억5천만개 세포/mL)에서의 RBC의 폭을 플롯팅한다. 도 3C는 2억5천만개 세포/mL에서 80만개 세포/mL로 변화하는 상이한 RBC 농도에서 부상된 적혈구의 이미지를 포함하고, 도 3D는 이러한 RBC 농도 각각에 대한 혈액 밴드의 폭을 플롯팅하는데, 그래프는 5천만개 내지 2억5천만개 세포/mL의 세포 농도 범위 내에서 선형이다. 도 3E는 상이한 농도에서 부상된 WBC의 이미지를 포함하고, 도 3F는 혈액 밴드의 폭을 WBC 농도에 대해 플롯팅한다.
도 4는 단일 세포 검출 및 밀도 측정을 예시한다. 도 4A는 100,000개 세포/mL 농도의 RBC의 이미지이고 도 4B는 이미지 알고리즘을 이용한 단일 혈액 세포의 검출을 예시한다. 도 4C는 자기 부상 플랫폼에서 폴리에틸렌 비드의 밀도 측정을 예시하며, 직경이 10-100 ㎛이고 상이한 밀도(1.025 g mL-1, 1.031 g mL-1, 1.044 g mL-1, 및 1.064 g mL-1)를 갖는 비드는 30 mM Gd+에서 별개의 부상 높이를 갖는 것으로 나타났다. 도 4D는 1.064 g mL-1 밀도를 갖는 비드가 상이한 Gd+ 농도(10 mM, 30 mM, 60 mM)에서 다른 부상 높이를 지님을 예시한다. 도 4E는 입자의 밀도를 측정하기 위한 표준 함수를 제공하는 선형 핏팅 곡선을 도시한다.
도 5는 상이한 Gd+ 농도에서 RBC 및 WBC 분리를 예시한다. 도 5a-5c는 상이한 Gd+ 농도(30, 60 및 90 mM)에서 WBC 및 RBC 분리의 형광 현미경 이미지이고, 반면 도 5d-5f는 i-LEV 시스템을 이용하여 이미징된 동일한 과정이다. 둘 모두의 이미징 플랫폼은 상승하는 Gd+ 농도가 부상 높이를 증가시키는 반면, 분리 해상도는 감소함을 보여준다.
도 6은 휴대폰 기반 부상 시스템을 이용한 RBC에 대한 클로로퀸의 모니터링 효과를 보여준다.
도 7은 부상 장치를 이용하여 약물의 효과, 특히 적혈구에 대한 말라리아 약물(클로로퀸)의 효과를 모니터링하는 것을 보여준다. 도 7a는 75 mg/mL의 클로로퀸이 스파이킹된 적혈구의 시간에 따른 부상을 보여준다. 도 7b는 클로로퀸 농도 1.25, 2.5, 5 및 7.5 mg/mL의 부상 높이 및 이미지 분석을 보여준다. 도 7c는 각 농도의 효과를 보여주는 보다 상세한 그래프를 보여주는 도 7b의 확대된 그래프이다. 도 7d는 도 7b 및 7c의 데이터 세트를 생성하기 위해 분석된 실제 이미지이며, 이 때 교정 실험을 위해 밀도 비드가 매회 첨가되었다.
도 8은 클로로퀸에 대한 다양한 혈액 샘플의 차등적인 반응을 보여준다.
도 9는 기계생물학 연구를 수행하기 위한 부상 시스템의 이용을 예시한다.
도 10은 배아 분화를 연구하고 배아의 건강에 접근하기 위한 부상 시스템의 이용을 예시한다.
도 11은 3개의 상이한 응용 및 3개의 상이한 폰에 대한 i-LEV 프레임 구성요소 설계를 예시한다. 아래의 세 줄은 상이한 응용에 대한 i-LEV의 상이한 높이에 대한 것이다(즉, 기본 이미징 v. 형광 이미징 v. 고급(advanced) 형광 이미징). 맨 위 줄은 3개의 상이한 스마트폰 및 베이스에 대한 어댑터 부분을 예시한다.
도 12는 보다 휴대 가능하고 소형인 방식으로 많은 피쳐를 결합시킨 새로운 i-LEV 설계를 예시한다.
도 13은 휴대폰 기반 이미징을 위한 i-LEV의 또 다른 업데이트된 설계를 예시한다.
도 14는 i-LEV가 어떻게 구현되어 헬스케어 시스템에 기여할 수 있는지를 보여주는 다이아그램이다. 혈구 계수는 다양한 설정의 통합된 모바일 애플리케이션으로 수행될 수 있다(즉, 가정이나 직장, 또는 여행 또는 휴가 중). 모바일 애플리케이션은 측정치를 헬스케어 제공자에게 보고한다. 헬스케어 제공자는 결과를 분석하여 온라인 시스템을 통해 피드백을 제공한다.
도 15는 고효율 자기 부상 세포(또는 다른 모이어티) 분류를 위한 플랫폼의 설계 및 원리를 나타낸다.
도 16은 상이한 밀도의 비드가 분류된 고효율 자기 부상 분류 장치의 실험 결과를 나타낸다.
도 17은 암 세포가 혈액 샘플로부터 분류된 고효율 자기 부상 분류 장치의 실험 결과를 나타낸다.
도 18은 대안적인 고효율 자기 부상 분류 장치를 나타낸다.
도 19는 고효율 자기 부상 분류 장치를 이용한 혈장 혈액 분석의 결과를 예시한다.
도 20은 혈장 분리의 효율을 확립하기 위한 형광-활성화 세포 분류(FACS) 분석을 예시한다.
도 21은 전혈로부터 RBC 및 WBC의 분리를 예시한다.
도 22는 자석이 혈장으로부터 세포를 분리하는 항-헬름홀츠 구성에서 한 쌍의 자석을 이용한 혈액의 혈장으로부터 세포 분리의 도식을 나타낸다.
도 23은 고 자기 유도로 유도된 세포 차단 기반 혈장 분리 장치이다.
도 24는 도 23의 장치를 이용하여 50 mM Ga3+(도 24A) 및 100 mM Ga3+(도 24B)의 혈액 샘플로부터 효율적인 혈장 분리를 위한 상자성 매질 Ga3+ 농도의 최적화를 예시하는 상세도이다.
도 25는, 도 25A에서, 도 23의 장치 입구로의 혈액 샘플의 로딩 및 도 25B에서, 출구로 빠져 나가는 혈장을 예시한다.
도 26은 스페로이드 어셈블링 방법을 예시한다.
도 27은 자기 시그니처에 기반한 다중-세포 3D 어셈블리의 또 다른 방법을 예시한다.
도 28은 자기 부상에 기반한 세포 분류, 회수 및 특성화를 위한 방법을 예시한다.
도 29는 응집 시간 연구의 이미지를 제공한다.
도 30은 세포 생존력에 대한 가돌리늄 농도 및 부상의 효과를 나타내는 일련의 이미지를 제공한다.
도 31은 시간에 따른 다양한 유형의 스페로이드의 병합을 나타낸다.
도 32는 NIH 3T3 스페로이드의 성장 연구 및 면역염색을 예시한다.
도 33은 스페로이드의 고효율 어셈블리를 촉진하기 위한 예시적인 자기 부상 시스템을 나타낸다.
도 34는 만성 질환의 존재를 확인하기 위해 한 쌍의 환자 혈액 샘플의 프로파일에 적용된 부상 플랫폼의 이용을 나타낸다.
도 35는 만성 피로 증후군 환자에서 시간에 따른 RBC의 지속적인 모니터링을 예시한다.
도 36은 만성 피로 증후군 환자에서 시간에 따른 WBC의 지속적인 모니터링을 예시한다.
도 37은 부상 장치를 이용하여 대사산물, 화학물질의 효과를 스크리닝하고 모니터링하는 것을 보여준다.
도 38은 박테리아 세포의 자기 부상을 나타낸다.
도 39는 시험하려는 표면으로부터 면봉으로 채취된 샘플에 대해 자기 부상을 이용하여 수득된 박테리아 세포 밴드의 이미지를 제공한다.
도 40은 박테리아 세포가 고 상자성 조건 하에서 5분 이내에 표면으로부터 신속하게 검출될 수 있음을 예시한다.
도 41은 자기 부상 시스템에서 포자의 부상 및 검출을 예시한다.
도 42는 식물 박테리아 세포가 부상 시스템 내에서 부상하여 검출될 수 있음을 예시한다.
도 43은 난모세포의 부상 프로파일을 예시한다.
도 44는 비감염된 그리고 HIV-감염된 혈액 CD4 T 세포가 자기 부상-기반 플랫폼에서 현저하게 상이한 부상 프로파일을 지님을 입증한다.
도 45는 항-CD3/CD28/IL2 비드 및 항-CD3/CD28/IL2 항체에 의한 자극이 HIV-감염된 혈액 CD4 T 세포의 부상 프로파일을 변화시킴을 보여준다.
도 46은 채널의 단부에 바늘을 포함하는 미세유체, 고효율 자기 부상 장치의 설계를 보여준다.
도 47은 미세유체 자기 부상 시스템 내에서의 세포 조작 및 수집을 보여준다.
도 48은 150 mM 상자성 용액(즉, 가돌리늄)을 지닌 우태아 혈청(FBS)에서 점적의 부상을 예시한다.
도 49는 150 mM 상자성 용액(즉, 가돌리늄)을 지닌 우태아 혈청(FBS)+ PBS-Tween 20에서 점적의 부상을 예시한다.
도 50은 150 mM 상자성 용액(즉, 가돌리늄)을 지닌 우태아 혈청(FBS)+ PBS-Tween 20에서 점적의 부상을 예시하며, 점적은 상이한 생물학적 모이어티로 캡슐화된다.
도 51은 암 연구에서 화학- 및 라벨-비함유 자기 부상 칩의 특성화를 예시한다.
도 52는 신장암(신세포 암종) 환자로부터의 혈액 샘플의 자기 부상 프로파일링을 보여준다.
발명의 상세한 설명
아래에서, 예를 들어, 세포와 같은 생물학적 및 비-생물학적 모이어티의 분리 및 분류를 위한 다양한 예시적인 구조가 제공된다. 아래의 각 하위-섹션에는 "i-LEV" 장치의 구성을 포함하는 다양한 양태가 개시되는데, 이는 모이어티의 집단을 함유하는 샘플의 포인트 오브 케어(point of care)(POC) 이미징 및 분석을 제공하기 위한 이미장 장치(예를 들어, 스마트폰)를 통합할 수 있는 휴대 가능한 부상 시스템이다. 이후 모이어티 분류 및 차단 기술의 후속 설명이 추가로 기술된다. 마지막으로, 3-D 자가-어셈블링된 시스템의 구성에서 그러한 부상 시스템의 사용이 설명된다.
다음은 단지 예로서 제공되며 개념을 설명하거나 실험 데이터를 통해 개념 증명을 제공하기 위한 것이다. 당업자는 이러한 예들이 제한적인 것이 아니며, 단지 청구 범위의 범주 내에 있는 응용 및 구조들 중 일부의 예시를 돕는다는 것을 이해할 것이다.
자기 부상(i-LEV)에 의한 휴대폰 이미징 통합
혈액 또는 다른 유형의 샘플을 이미징하고 분석하기 위한 휴대 가능한 셋업을 제공하기 위해 어떤 위치에서도 용이하게 어셈블링될 수 있는 빌딩 블록을 제공하는 자기 부상-기반 진단 시스템이 본원에 제공된다.
이것은 임상 및 가정 환경을 포함하는 생활 지점에서 건강 정보를 공유하기 위한 휴대 가능하고, 견고하며, 저렴하고, 사용하기 쉬운 질병 진단 및 예후 모니터링 플랫폼이다. 최근 디지털 보건의료 기술의 발전은 조기 진단, 약물 치료, 및 맞춤 의학을 개선시켰다. 고해상도 카메라 및 높은 데이터 처리 능력을 지닌 스마트폰은 진단 장치와 통합될 때 아주 흥미로운 생의학적 응용을 가능하게 한다. 또한, 이러한 장치는 정밀 의학을 위한 환자, 특히 낫적혈구 빈혈, 지중해빈혈 및 만성 피로 증후군과 같은 희귀 질환으로 고통받는 환자를 진단하고 지속적으로 모니터링하기 위해 휴대 가능하고, 신속하며, 라벨이 없고, 사용하기 쉬우며, 가격이 적당한 생의학적 장치가 특히 필요한 자원-제한적인 환경에서 공중 보건에 기여할 엄청난 잠재력을 갖는다.
본원에서, 상이한 세포 유형(예를 들어, 백혈구 및 적혈구) 또는 모이어티 유형이 자기 구배에서 부상하고 이들의 독특한 밀도로 분리되는 자기 부상-기반 진단 시스템이 제공된다. 또한, 사용하기 쉬운, 스마트폰으로 통합된 부상 시스템이 세포 및 모이어티 분석을 위해 도입된다. 이러한 휴대 가능한 이미징 자기 부상 시스템(그 예가, 본원에서 명칭 i-LEV로 지칭됨)을 이용하여, 백혈구 및 적혈구가 확인될 수 있고, 세포 수가 어떤 라벨도 이용하지 않고 정량될 수 있음을 보여준다. 추가로, i-LEV에서 부상된 세포는 단일 세포 해상도에서 구별될 수 있는데, 이는 잠재적으로 진단 및 모니터링 뿐만 아니라 임상 및 연구 응용을 가능하게 한다.
i-LEV에 의해, 손가락 끝(finger prick) 혈액 샘플을 수집하고, 혈액을 시스템의 모세관에서 부상시킬 수 있다. 이후, 시스템에 수용된 스마트폰으로 혈액을 분석하기 위해 이미지를 촬영할 수 있다. 셋업은 상이한 애플리케이션을 수용하기 위한 여러 구성요소를 포함한다.
신속한 진단 도구는 임상 및 수의학 뿐만 아니라 식품 안전을 포함하는 여러 분야에서 사용된다. 포인트-오브-케어(POC) 장치는 저렴하고, 신속하며, 휴대 가능하고, 라벨이 없고, 접근 가능하며, 사용하기 쉬운 진단 솔루션을 제공한다. 더욱이, POC 장치는 순응도 및 질병 진행을 모니터링하기 위해 적용될 수 있다. 그러나, 대부분의 시스템은 이들의 사용을 제한하는 광범위한 샘플 준비 및 라벨링 단계를 필요로 한다. 정밀 의학은 환자의 유전 데이터에 기반한 이들의 프로파일로 치료를 조정한다. 연구 기관 및 제약 회사는 보다 효율적인 약물 개발 및 개선된 조기 진단을 달성하기 위해 점차 세포 및 분자 분석을 수행하고 있다. 이와 관련하여 고해상도 카메라, 빠른 컴퓨팅 성능, 그래픽 프로세서, 데이터 저장 및 연결 능력을 갖춘 스마트폰은 원격의료 및 POC 진단을 포함한 다양한 헬스케어 플랫폼에 사용된다.
한 예로, 적혈구(RBC) 및 백혈구(WBC) 수는 병리학 실험실에서 평가되는 진단 파라미터이다. 현재, 혈구계수법, 쿨터 계수 또는 유세포분석법은 혈액 세포를 계수하고 분류하기 위해 가장 광범위하게 사용되는 방법이다. 표 1에서, i-LEV 장치를 이러한 확립된 방법과 비교한다.
표 1
Figure pct00001
쿨터 및 유세포분석기는 복잡하고 비싼 반면, 혈구계수법은 저렴하지만 노동 집약적이고, 시간 소모적이며, POC 시험에서 실용적이지 않다. 최근 개발된 방법은 민감하고 강력한 기술을 적용시켜 이 분야를 발전시켰다. 그러나, POC 치료를 위한 저렴하고 정확한 혈구 계수 분석기는 아직 없다.
최근 몇 년 동안, 자기 부상 원리는 세포 및 세포 사건을 모니터링하고 생물학적으로 특성화하는데 사용되어 왔다. 초기 연구는 서브-마이크론 수준에 이르는 다양한 크기를 갖는 상이한 세포 유형이 부상 플랫폼을 사용하여 독특한 높이에서 정렬될 수 있음을 보여 주었다. 본원에서, 예를 들어, 라벨을 사용하지 않고도 혈액 세포를 식별하고 정량하는 스마트폰-기반 자기 부상 시스템이 기재된다. 시스템은 높은 자기장에서 혈액 밴드의 폭을 분석함에 의해 전체 혈액 샘플에서 RBC 및 WBC 수를 평가한다. 이전에는, 라벨링 없이 혈액 세포를 분리하는 것이 임상 진단에서의 중요한 도전 과제로 제기되었다. 기재된 시스템을 이용하여, RBC 및 WBC는 이들의 독특한 밀도 시그니처로 인해 분리될 수 있다. i-LEV 장치는 가정-환경에서 질병 진행 및 약물 효과를 모니터링하는데 이용될 수 있는 사용하기 쉽고 접근하기 쉬운 혈액 세포 계수용 POC 솔루션이다.
실시예 I: i-LEV 구성 및 설계
자기 부상-기반 진단 시스템의 실험 셋업은 도 1C에 예시된 대로 i-LEV 시스템의 한 형태를 구축하고 사용하기 위해 다음과 같다. 레이저 커터(VLS 2.30 Versa Laser)로 절단된 3 mm-두께의 폴리-메틸 메타크릴레이트(PMMA) 조각을 이용하여, 도 1C에 도시된 대로, 치수가 160, I00, 205 mm인 i-LEV 시스템을 어셈블링하였다. 상이한 응용을 위한 삽입 부품을 수용하기 위해 3 mm 단이 있는 스레드를 설계하였다. 도 11의 윗줄에서 볼 수 있듯이, i-LEV 시스템의 상부 층은 상이한 브랜드의 스마트폰과 호환되는 몇 가지 다른 버젼을 갖는다. 셋업의 높이는 광범위한 광학 시스템 및 광원을 필요로 하지 않는 간단한 실험을 위해 반으로 줄일 수 있다. i-LEV 시스템의 전체-크기는 광대역 LED 뿐만 아니라 여기 및 방출 필터를 삽입시킴에 의해 형광 이미징 하드웨어를 수용할 수 있다. 마이크로 모세관 채널(1 mm x 1 mm 단면, 50 mm 길이 및 0.2 mm 벽 두께), N52 등급 네오디뮴 자석(NdFeB)(50 mm 길이, 2 mm 폭 및 5 mm 높이), 및 사이드 미러를 이용하여 도 1B에 예시된 자기 부상 장치를 구축한다.
도 1C에서 가장 잘 볼 수 있듯이, 부상 장치는 렌즈 어댑터를 함유할 수 있는 스마트폰 아래 3 cm에 배치된다. 자동-초점 기능이 있는 폰은 샘플을 위아래로 움직이지 않으며 초점 평면을 조정할 수 있다. 각각의 별도 측정을 하기 전에, 혈장을 100 W, 0.5 Torr에서 3분 동안 처리한 후에 마이크로 모세관 채널을 자석 사이에 배치한다. 자석이 직접 들어오는 광을 차단하므로, 2개의 미러는 광이 부상 채널을 통해 지나가도록 45°로 배치되었다. 채널 조명은 스마트폰 카메라와 정렬된다.
샘플 측정을 수행하였다. RBC, WBC 및 폴리에틸렌 비드를 다양한 농도의 상자성 매질(30 mM, 60 mM 및 90 mM Gd+)을 함유하는 PBS에서 스파이킹시켰다. 30 μL의 샘플을 마이크로 모세관으로 피펫팅하고, 채널을 Critoseal™로 밀봉하였다. 샘플이 시스템 내에서 평형 높이에 도달할 때까지 샘플을 30분 동안 부상시켰다. 도 3A 및 3B에 도시된 대로 안정화 시간을 정량하기 위해 보정 측정을 수행하였다. 세포 및 비드의 폭 및 높이를 이미징하고 imageJ를 이용하여 분석하였다.
적혈구(RBC)의 부상은 다음과 같았다. 건강한 도너로부터의 혈액 샘플을 스탠포드 대학 혈액 센터로부터 받았더. 전혈을 30 mM Gd+를 함유하는 PBS에서 다양한 비율로 희석시켰다. 농도는 결과에 기술되었다. 혈액 안정화 시간을 측정하기 위해 4억5천만 및 9천만개 세포/mL 농도의 혈액을 사용하였다. 혈액 밴드의 폭 및 세포 농도의 연관성을 보여주기 위해 2억5천만 내지 80만개 세포/mL 범위의 다양한 농도의 혈액을 이용하였다.
백혈구(WBC)의 부상은 다음과 같았다. 전혈을 RBC 용해 완충제와 1:10 비로 혼합시켰다. RBC를 인큐베이션 5분 후에 용해시키고, 혈액 샘플을 1,500 rpm에서 3분 동안 현탁시켰다. 생성된 WBC 펠렛을 PBS에 재현탁시켰다. 100만 내지 500만 WBC/mL 사이의 점진적 농도를 사용하여 WBC 부상 밴드의 폭을 세포 농도와 연관시켰다.
실험은 살아 있는 백혈구로 수행되었다. WBC를 항-CD45 항체 컨쥬게이션된 FITC(1:20 BD Pharmingen)로 30분 동안 라벨링시켰다. 이후 WBC를 PBS로 2회 세척하고, PBS에 재현탁시켰다. 이 공정의 끝에, 살아 있는 WBC 및 lx RBC를 30 mM Gd+를 지닌 PBS에서 1,500 rpm으로 3분 동안 현탁시켰다(50:50). 세포를 30분 동안 부상시키고, 이미징하였다.
실험은 죽은 백혈구로 수행되었다. RBC 용해 후, WBC를 죽이기 위해 WBC를 동결방지제 없이 PBS에서 -80℃로 밤새 냉동시켰다. 밤새 인큐베이션 후, 죽은 WBC 세포를 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 디하이드로클로라이드(DAPI)(1:1,000 Invitrogen)로 15분 동안 실온에서 염색하였다. 염색 후, 죽은 WBC를 PBS로 2회 세척하고, PBS에 재현탁시켰다. 마지막으로, 죽은 WBC 및 l.000x RBC를 혼합시키고, 30 mM Gd+를 지닌 PBS에서 1,500 rpm으로 3분 동안 현탁시켰다(50:50). 세포를 30분 동안 부상시키고, 이미징하였다.
이미지 분석을 수행하였다. RBW의 단계별 이미지 분석을 ImageJ를 이용하여 수행하였다. 간단히 말해, 스마트폰으로 촬영한 이미지를 ImageJ에 업로드하였다. 그런 다음, 부상된 혈액 밴드를 잘라 내고, 배경을 삭제하였다. 이미지를 16-bit로 변환시키고, 임계값을 "디폴트-BW" 설정으로 조정하였다. 면적, 질량 중심, 및 경계 사각형을 측정하였다. 측정된 면적을 경계 사각형으로 나누어, 혈액 밴드의 평균 높이를 제공하였다. 이미지 분석의 각 단계는 보충 정보에서 보다 상세하게 설명된다.
도 1에 도시된 휴대 가능한, 자기 부상-기반 이미징 플랫폼은 다음을 포함하는 여러 구성요소를 갖는다: i. 시스템의 구성요소를 탑재한 여러 스레드가 있는 전면 패널; ii. 카메라의 이미지에 초점을 맞추기 위한 스마트폰 바로 뒤에 위치한 렌즈; iii. 부상된 혈액 세포의 밴드 폭을 이미징하기 위해 렌즈 바로 아래에 위치한 모세관을 지닌 부상 장치; 및 iv. 이미지를 개선시키기 위한 간단한 LED 광원 및 ND 필터와 같은 추가적인 구성요소. 전면 패널은 외부 광을 차단하기 위해 슬라이드-인 도어를 갖는다. 셋업은 레이저 커터로 준비된 폴리-메틸 메타크릴레이트(PMMA) 빌딩 블록을 이용하여 설계되었다. 부상 장치는 자석, 미러, 및 채널로 구성된다. 2개의 영구 자석(50 mm 길이, 2 mm 폭 and 5 mm 높이)은 동일한 극이 서로 마주 보는 배향으로 설치된다. 모세관 채널(50 mm 길이, 1 mm x 1 mm 단면, 0.2 mm 벽 두께)은 자석 사이에 삽입될 수 있다. 사이드 미러는 부상 채널을 조명하고 관찰하기 위해 사용된다. 상자성 매질(이 경우, Gadavist)로 스파이킹된 샘플은 매질 내부의 부력과 자기력이 같은 위치에서 부상된다. 샘플의 부상 높이는 방정식 1에 기반하여 계산된다.
Figure pct00002
방정식의 첫 번째 부분은 입자에 적용된 자기력을 나타내고, 두 번째 부분은 부력을 나타낸다. 자기 유도, 중력 가속도, 세포와 매질의 용적 밀도 사이의 차이, 및 자유 공간의 투과성은 각각 B, g, ρ, 및 μ o 로 표시된다. 샘플은 질량 및 부피와 무관하게 주로 이들의 밀도에 기반하여 독특한 높이에서 부상한다. 상이한 샘플 종을 분리하는 i-LEV 시스템의 잠재력을 입증하기 위해, RBC 및 WBC를 500만개 세포/mL의 동일한 농도로 혼합시키고, 도 2A에 예시된 대로 이들의 상이한 부상 특징에 따라 분리하였다. 또한 동일한 샘플을 보통의 현미경을 사용하여 이미징하여, 도 2B-2D에 예시된 대로 상이한 높이로 부상한 세포의 유형을 확인하였다. CD45로 라벨링된 WBC의 중첩된 이미지 및 혼합된 RBC 및 WBC 샘플의 명시야 이미지는 도 2A-2D에 예시된 바와 같이 대로 i-LEV 결과를 명확하게 검증하였다. 추가로, 산-죽은(live-dead) 검정을 WBC 및 RBC로 수행하였다. 먼저, WBC를 염색하고, 밤새 냉동시켰다. 그런 다음 이러한 죽은 세포를 동일한 농도의 RBC 샘플로 스파이킹하였다. 도 2E에 예시된 대로 i-LEV 시스템은 죽은 WBC가 기저에 응집된 반면, RBC만이 채널의 중간에 부상되었음을 보여준다. 결과를 검증하기 위해, 죽은 WBC를 DAPI로 염색하고, 이들을 형광 현미경에 의해 가시화시켰다. 도 2F에서 보여진 WBC 및 도 2G에서 보여진 DAPI-염색된 WBC의 중첩된 명시야 이미지는 도 2F-2H에 도시된 바와 같은 죽은-산 검정 결과를 확인시켜 주었다.
다음으로, RBC 및 WBC 혼합물을 부상시키고 2개의 다른 가돌리늄(Gd+) 농도를 이용하여 분리시켜 도 5에 예시된 대로 세포 분리 실험을 위한 최적의 Gd+ 농도를 확인하였다. Gd+ 농도가 증가함에 따라(예를 들어, 60에서 90 mM으로), 부상 높이는 상승하였고, 밴드를 서로 구분하는 것이 더 어려워졌다. 결과는 본 예시적인 실험에서의 이상적인 Gd+ 농도가 약 30 mM임을 나타내는데, 그 이유는 이 농도가 모세관 벽으로부터 적당한 거리에 세포를 유지하면서 최적의 부상을 허용하기 때문이다. 이 조건에서, 생성된 밴드는 구별하기 쉽다.
이후 i-LEV를 사용하여 포스페이트 완충된 염수(PBS)에 스파이킹된 RBC를 정량하였다. 평형 시간을 평가하기 위해, 보정 측정이 먼저 상이한 시점에 수행되었다. PBS에 4억5천만개 세포/mL의 최종 농도로 스파이킹된 전체 혈액 샘플을 30분 동안 부상시켰다. 부상 동안 샘플을 3분마다 이미징하였고, 이는 도 3A에 묘사된 대로 세포가 약 15분 후에 이들의 독특한 부상 높이에서 평형화되었음을 입증하였다. 상이한 농도에서의 안정화 시간을 시험하기 위해 9천만개 세포/mL 혈액에 의한 실험을 수행하였다. 안정화 곡선에 대한 지수 시간 상수는 4억5천만개 세포/mL에 대해 5.8분 및 9천만개 세포/mL에 대해 3.3분이었다. 도 3B에 추가로 도시된 바와 같이, 혈액 세포 농도 대 시간 곡선은 곡선에 대한 평형화 시간이 다시 15분이었음을 보여준다. 혈액 세포의 농도가 높을수록 평형을 이루는데 더 오래 걸렸다. 다양한 농도에서의 혈액 밴드 폭의 변화를 평가하기 위해 추가 검증 실험을 수행하였다. RBC를 2억5천만, 1억2천5백만, 6천3백만, 5천만, 2천5백만 및 80만개 세포/mL의 농도에서 i-LEV 시스템으로 이미징하였다. 계산된 혈구 수를 확인하기 위해 각각의 샘플을 혈구계수기를 이용하여 정량하였다. 세포 농도를 평가하기 위해, 혈액의 총 면적을 조명된 영역의 폭으로 나눔으로써 채널을 가로질러 부상된 혈액 밴드의 폭을 측정하였다. 더 높은 농도에서(5천만 내지 2억5천만개 세포/mL), 혈액 폭 대 농도 곡선은 100만개 세포/mL 당 0.6 마이크로미터의 기울기로 선형이었다. 그러나, 세포 농도가 감소함에 따라(예를 들어, 80만에서 2500만개 세포/mL), 곡선은 도 3D에서 볼수 있듯이 선형성을 잃었다. 혈액 세포 농도가 5천만개 세포/mL 이상인 경우, 부상 동안 혈액 밴드의 폭은 세포 농도와 연관성이 있는 것으로 관찰되었다. WBC를 또한 1 내지 500만개 세포/mL 범위의 다양한 농도에서 이미징하고, 도 3E-3F에 예시된 대로 혈액 밴드의 폭에 대한 농도로 플롯팅하였다. WBC 농도는 또한 선형 방식으로 혈액 밴드의 폭과 연관성이 있었다.
i-LEV 플랫폼을 이용하여, 어떤 라벨도 이용하지 않고 단일 세포를 검출하였다. 100,000개 세포/mL 또는 그 미만으로 RBC 농도를 희석시킨 후, 조명된 면적의 개별 세포를 도 4A-4B에 예시된 대로 단순 이미지 처리 도구를 사용하여 정량하였다. 마지막으로, 폴리에틸렌 비드를 모세관에서 부상시켜 플랫폼의 부상 해상도를 확인하고 상이한 샘플 및 세포에 대한 밀도를 계산하는 이의 가능성을 보여주었다. 1.025 g mL-1, 1.031 g mL-1, 1.044 g mL-1 또는 1.064 g mL-1의 밀도를 지닌 직경이 10-100 μm인 다양한 크기를 갖는 비드는 도 4C에 예시된 대로 30 mM Gd+에서 별개의 부상 높이를 나타내었다. 1.064 g mL-1의 밀도를 지닌 비드는 도 4D에 예시된 대로 상이한 Gd+ 농도(10 mM, 30 mM, 60 mM)에서 상이한 부상 높이를 가졌음이 또한 관찰되었다.
이전의 연구들은 상이한 자기 부상 자기 시스템에 대한 여러 적절한 생물학적 응용을 소개하였다. 본원에서, 자기 부상을 스마트폰 장치와 결합시킨 신규한 플랫폼을 나타내는 i-LEV가 제시된다. i-LEV 시스템은 혈액 세포 수를 확실하게 분석하고 또한 개별 세포를 검출할 수 있다. 이것은 의료적 필요성을 해결하고 처리되지 않은 전혈로부터 WBC는 물론 RBC까지 계수하기 위해 스마트폰의 유용성을 활용하는 신속하고, 휴대 가능하며, 사용하기 쉽고, 가격이 적당한 플랫폼이다. 현재의 기술 상태에서, 혈액 처리는 임상 절차이며, 광범위한 재료 및 장비 뿐만 아니라 숙련된 전문가를 필요로 한다. 따라서, 현재 POC 환경에서 구현될 수 없다. 그러나, 기재된 시스템은 가정에서 혈액 분석을 가능하게 하고, 질병 진단 및 모니터링을 용이하게 할 수 있었다.
i-LEV 장치는 또한 도 1C에서 볼 수 있는 바와 같이, 셋업이 형광 LED, 렌즈, 여기 필터 및 방출 필터를 삽입하기 위한 몇 개의 슬롯을 지니기 때문에, 형광 이미징을 수행할 수 있다. 비록 현재 플랫폼은 고정되어 있지만, 이것은 동적 유동 실험을 가능하게 하고 모세관 내에서 분리된 특정 세포 유형에 대한 약물의 실시간 효과를 모니터링할 수 있도록 확장될 수 있다. 시스템의 추가 응용은 특히 자원-제한된 환경에서, 예를 들어, 순환 혈액 세포 또는 낫적혈구 질환을 모니터링하기 위한 고급 검사를 포함할 수 있다. 스마트폰에 통합된 부상 시스템은 스마트폰이 전세계적으로 광범위하게 사용됨에 따라 대규모 집단에 대한 간단한 혈액 검사를 제공할 수 있었다. 전세계적으로 약 50억 인구가 휴대전화를 사용하는 것으로 추정된다. 이와 관련하여, i-LEV와 같은 스마트폰 통합 의료 기술은 공공의료 서비스, 특히 제한된 재정 및 물류 자원을 가진 개발 도상국에서 잠재적으로 중요한 역할을 할 수 있었다.
i-LEV 시험 결과는 도 14에 도식적으로 예시된 대로 앱을 사용하여 분석 및 평가될 수 있고 또한 통합 클라우드 플랫폼을 통해 헬스케어 제공자에게 전송될 수 이다. 이 플랫폼의 휴대성, 적정 가격 및 단순성은 가정 환경 뿐만 아니라 생물학적 또는 임상 실험실에서의 혈구 계수에 사용하기 쉬운 셋업을 제공한다.
이러한 유형의 자기 부상-기반 진단 시스템은 다양한 여러 유형의 응용에 이용될 수 있다. 한 예로, 여러 질병 진단 및 모니터링을 위한 혈구 계수가 수행될 수 있었다. 또 다른 예로, 백혈구 및 적혈구는 낫적혈구 빈혈, 지중해빈혈, 및 만성 피로 증후군과 같은 질병을 평가하기 위해 분리될 수 있다. 여전히 또한, 이 기술은 질병을 진단하고 모니터링 하기 위해 POC 접근법을 사용하여 의학적으로 관련된 추가 문제를 해결하는데 적용될 수 있었다. 예를 들어, 바이러스에 감염된 세포는 별개의 부상 특징을 지니는데, 이는 또 다시 개별 도상국과 특히 관련된 i-LEV 시스템에 대한 또 다른 유망한 응용을 나타내는 것으로 이전에 밝혀졌다.
이 장치는 가정-환경 뿐만 아니라 다양한 자원-제한된 환경에서 휴대 가능하고, 신속하며, 라벨이 없고, 사용하기 쉬우며 가격이 적당한 혈구 계수 및 분석을 가능하게 하는 스마트폰 기능을 활용한다. 지속적인 샘플 흐름과 결합된 스마트폰 부상 장치의 능력은 자원이 제한적인 환경에서 관심 세포의 고효율 분리를 가능하게 한다.
i-LEV의 휴대폰-기반 자기 부상 시스템 버젼은 (1) 약물, 대사산물, 화학물질의 효과를 모니터링하고; (2) 상이한 조건 하에서 세포의 기계생물학을 연구하고; (3) 배아 및 난모세포 분화를 연구하고 배아/난모세포의 건강에 접근하는 것을 포함하는 다양한 응용을 확장시킬 수 있다는 개념 증명을 설명하기 위해 몇 가지 추가 실시예가 지금부터 제공된다.
실시예 II: 부상 장치를 이용한 약물 효과의 모니터링
이제 도 7을 참조하면, 부상 장치를 이용하여 약물 효과를 모니터링하였다. 부상 시스템은 구체적으로 클로로퀸이라고 불리는 말라리아 약물의 적혈구에 대한 효과를 연구하는데 사용되었다. 도 7a에서, 75 mg/mL의 클로로퀸을 적혈구에 스파이킹하고, 이들의 부상을 i-LEV 장치로 모니터링하였다. 노출 시간이 증가할수록, 혈액 샘플에 클로로퀸의 첨가시 적혈구의 부상 높이는 감소하는 것을 확인할 수 있다. 전혈에 대한 상이한 농도의 클로로퀸의 효과를 또한 도 7b-7d에 묘사된 대로 이미징하였고, 이로부터 1.5 및 7.5 mg/mL가 유사한 효과를 나타내는 한편 2.5 및 5 mg/mL가 유사함을 확인할 수 있다. 도 7b 및 7c(도 7c는 도 7b의 섹션의 확대된 그래프이다)에서, 1.25, 2.5, 5 및 7.5 mg/mL 농도의 클로로퀸을 혈액에 스파이킹하고, 이들 이미지의 부상 높이를 분석하였다. 도 7d는 도 7b 및 7c의 플롯을 생성하기 위해 분석된 실제 이미지를 예시한다. 도 7d에서, 보정 실험을 위해 특정 밀도 비드를 매회 첨가하였다.
이제 도 8을 살펴보면, 7.5 mg/mL 및 75 mg/mL의 클로로퀸의 투여에 대한 상이한 혈액 샘플(즉, 상이한 혈액 샘플 "샘플-1", "샘플-2", 및 "샘플-3")의 반응이 예시되고, 후자는 매우 높은 농도의 약물이다. 볼 수 있듯이, 혈액 샘플은 모세관 채널 내의 매우 낮은 높이에서, 특히 고 투여량 처리 후에 평평해진다. 이에 따라, 자기 부상 시스템은 상이한 혈액형에 대한 약물 효과를 빠르게 볼 수 있는 방법을 제공한다.
또한 여전히, 도 6은 휴대폰 기반 부상 시스템(i-LEV)을 이용한 RBC에 대한 클로로퀸의 모니터링 효과를 보여준다. i-LEV에서, 증가된 농도의 클로로퀸은 더 작은 면적을 발생시켰다. 이미지는 60분 동안 시간에 따라 촬영되었다. 도 6a에 예시된 대로, 처음 24분은 1.25 및 5 mg/mL의 클로로퀸 농도를 이용하여 도시된다. 이후 도 6b는 면적 분석을 나타내는 그래프이다. 혈액의 면적은 실험실에서 현상되는 imageJ 스크립트를 이용하여 측정되었다. 면적은 세포의 생존력을 나타낸다. 시간에 따른 세포 아폽토시스로 인해, 면적은 점점 작아진다. 도 6c를 보면, 부상 높이는 동일한 스크립트를 사용하여 측정된다. 높이는 세포의 밀도와 직접 관련이 있다. 약물 농도가 높을수록 50분 이내에 혈액 밀도가 더 높다.
실시예 III: 부상 시스템을 이용한 기계생물학 연구
도 9는 기계생물학 연구에서 부상 시스템의 사용을 보여준다. 도 9a에서, 유방암 세포를 상이한 콜라겐 겔에 배치하였다. 20% 및 40%의 콜라겐 농도를 이 연구에 이용하였다. 이 경우, 오버레이된 이미지로는 많은 세부사항을 알 수 없을 것이다; 그러나, 도 9b(및 도 9c에 제공된 도 9b의 확대된 세부사항)에서, 밀도 플롯은 더 많은 세부사항을 제공하고 안장 차이가 확인될 수 있게 한다. 따라서, i-LEV 장치는 노화 및 줄기 세포 분화를 포함하는 세포 역학 연구에 사용될 수 있었다.
실시예 IV: 배아 분화 연구 및 배아 건강 평가
이제 도 10을 살펴보면, 부상 시스템은 배아 분화를 연구하고 배아의 건강에 접근하는데 사용되는 것으로 나타났다. 배아의 혼합된 집단은 다른 날에 부상되었다. 각 배아의 밀도는 시간에 따라 감소하였다. 따라서, 이 시스템은 상이한 높이로 부상되는 건강한 배아를 모니터링하고 이해하는데 적용될 수 있었다.
실시예 V: i-LEV 설계의 렌더링 업데이트
도 13은 휴대폰 기반 이미징을 위한 i-LEV 장치의 또 다른 업데이트된 설계를 예시한다. 도 13에서, 설계는 미러 없이 도시되며, 이것은 도 1, 11 및 12에서 발견된 이전 버젼보다 더 소형이다. 자기 부상-기반 진단 시스템은 많은 물리적 형태를 취할 수 있었음이 인지될 것이다
고효율 자기 부상 세포 분리
고효율 자기 부상 세포 분류에 대한 플랫폼의 설계 및 원리는 도 15a 및 도 15b에 개략적으로 도시되어 있다. 플랫폼은 상부에서 바닥(상부/중간/바닥)으로 구성된, 입구 및 출구의 3개 세트에 연결된 미세 채널을 포함하고, 단일 네오디뮴 자석은 미세채널의 바닥 기판 아래에 배치된다. 미세유체 장치는 레이저 가공에 의해 형성된 미세채널 절단부를 각각 포함하는 3개의 상이한 폴리카르보네이트 층을 양면 접착제를 사용하여 어셈블링함으로써 제작된다. 칩 어셈블리 후, 튜빙(Tygon® microbore tubing, 0.010)을 입구 및 출구 포트에 연결한 후 2개의 PMMA 홀더를 사용하여 자석을 배치한다. 상자성 가돌리늄(Gd+)으로 스파이킹된 혈액 샘플을 주사기 펌프를 사용하여 바닥 입구를 통해 일정한 유속으로 플랫폼에 연속적으로 도입시키고, Gd+을 지닌 완충액을 상부 및 중간 입구를 통해 별도로 주입한다.
자기 효과 없이, 입자는 미세유체 흐름의 층류 특성에 기인한 확산에 의해서만 3개의 상이한 유체 흐름 사이에서 이동할 수 있다. 자기장이 미세채널 전반에 걸쳐 적용되면, 세포 또는 다른 모이어티 및 주변 상자성 매질 사이의 자화율 차이는 세포를 더 높은 곳(즉, 자석에 가까운 부근)으로부터 더 낮은 자기장 강도 부위(즉, 자석에서 멀리) 이동시킨다. 예를 들어, 암 세포는 혈액 세포보다 고유 밀도가 낮고 크기가 더 크기 때문에, CTC는 다른 혈액 세포보다 훨씬 더 빠르게 부상하며, 이로 인해 CTC는 상부 유체 흐름으로 전달되고, 후속 다운스트림 분석을 위해 별도로 수집된다.
실시예 VI: 시험 비드의 밀도 분리
분리용 시스템을 시험하기 위해 이제 도 16을 살펴보면, 플랫폼은 상이한 밀도, 녹색 = 1.031 g/ml (상부 밴드) 및 적색 = 1.089 g/ml (하부 밴드)를 지닌 두 유형의 비드 사이의 분리에 대해 시험되었다. 처리 전의 샘플 혼합물이 제시되고 도 16a 및 도 16b에서의 수집은 자기 부상-기반 세포의 이미징 셋업에서의 처리 후 상부/중간/바닥 출구에서 도시된다. 대부분의 녹색 비드는 상부 유체 흐름에서 수집된 반면, 대부분의 적색 비드는 바닥 수집에서 관찰되었는데, 이는 밀도에 의한 입자 분리에 대한 플랫폼의 능력을 입증한다.
실시예 VII: 유방암 세포의 밀도 분리
더 실용적인 적용을 시험하기 위해 이제 도 17을 살펴보면, 2000개 세포/ml 농도의 유방암 세포(MDA-MB-231)로 스파이킹된 10배 희석된 혈액 샘플을 이용하여 플랫폼을 시험하였다. 도 17a는 처리 및 수집 전의 샘플을 보여주고, 도 17b는 자기 부상-기반 세포의 이미징 셋업으로 처리를 개별적으로 도입시킨 후 상부/중간/바닥 출구로부터의 수집을 도시한다. 대부분의 암 세포는 처리 후 다른 혈액 세포가 고갈된 상부 유체 흐름으로부터 수집되었는데, 이는 항체 또는 추가 라벨링을 사용하지 않고 혈액으로부터 암 세포의 분리를 입증한다.
실시예 VIII: 대안적인 2-자석 설계
한 대안적인 설계에서, 제1 미세유체 플랫폼은 하나의 입구 및 2개의 출구에 연결된, 박막에 의해 출구 근처에서 2개로 나뉜(즉, 상부 및 바닥 채널) 긴 직선 채널을 포함할 수 있다. 이 장치는 상자성 매질에서 세포의 독특한 밀도에 기반하여 세포를 분리하는 자기 부상의 원리를 이용한다. 장치 제작을 위해, 폴리카르보네이트 시트를 먼저 레이저 커터를 사용하여 절단하고, 양면 접착 테이프를 사용하여 어셈블링하였다. 제작된 미세유체 칩은 각각 200 μm 및 700 μm 높이의 바닥 및 상부 채널을 특징으로 한다. 제1 미세유체 설계는 출구 근처의 박막에 의해 2개(상부 및 바닥 채널)로 분할된 긴 직선 채널을 포함하며, 각각은 제각기 출구에 연결되어 있다. 2개의 영구 NdFeB 자석은 채널의 상부와 바닥에 각각 배치되어 있고, 동일한 극이 서로 마주 본다. 자기 부상-기반 고효율 혈액 세포 분류 장치에 대한 그러한 설계는 도 18에서 찾아볼 수 있고, 예를 들어, 한 쌍의 자석을 포함한다.
실시예 IX: 혈장 혈액 분석
이제 도 19를 살펴보면, 도 18에 묘사된 장치에서의 혈장 혈액 분석이 도시되어 있다. 여기서 도 19A, 19B, 및 19C를 참조하면, 5, 10, 20 μL/min의 유량에서 혈액 세포 분류가 관찰되었고, 혈액 세포는 상부 채널에서 회수되지 않았다. 반면, 혈액 세포 분류는 30 및 50 μL/min과 같은 더 높은 유량에서 발견되지 않았는데, 그 이유는 혈액 세포가 또한 상부 채널에서 회수되었기 때문이다. 더 높은 유량에서의 불충분한 지속시간으로 인해, 혈액 세포는 부상하지 않고 세포가 둘 모두의 채널로 흐르는 동종 층으로 분리된다. 따라서, 시험을 수행한 예시적인 시스템에서 20 μL/min이 혈액 세포 분류를 위한 최적의 유량으로서 선택된다. 도 19D에서, 상부 채널로부터 수집한 혈장의 총 단백질 분석을 수행하고, 원심분리에 의해 분리된 혈장과 비교함으로써, 상부 채널로부터의 혈장에서 단백질의 농도가 전통적인 원심분리 방법에서 발견된 바와 같이 회수됨을 확인하였다. 최적화된 조건 하에, 개발된 고효율 MagLev-기반 장치(즉, 종래에 기재된 분류 장치)는 혈액 세포를 효율적으로 분류한다는 결론을 내렸다.
실시예 X: 형광-활성화된 세포 분류(FACS) 분석
이제 도 20을 참조하면, Maglev 기반 고효율 혈액 세포 분류 장치의 혈장 분리 효율을 형광-활성화 세포 분류(FACS) 분석에 의해 평가하였다. 초기에, Maglev 장치에 의해 분리된 전혈 및 혈액 세포를 CD 45 Alexa 488 및 CD 36 FITC 항체로 염색하고, FACS 분석을 실시하였다. 도 20A에 도시된 대로, 둘 모두의 RBC 및 WBC가 전혈에서 관찰되었고, 도 20B에 도시된 대로, 혈액 세포는 Maglev 장치의 바닥 채널로부터 분리된 반면, 장치의 상부 채널에서는 도 20C에 도시된 바와 같이 혈액 세포가 관찰되지 않았다. 수득된 결과는 최적화된 조건 하에서 개발된 Maglev 장치가 전혈로부터 혈액 세포 및 혈장을 분리할 수 있음을 추가로 확인시켜 준다.
실시예 XI: 전혈로부터 RBC 및 WBC 분리
이제 도 21을 살펴보면, 개발된 Maglev 장치는 또한 전혈로부터 희귀 세포를 분리하는 능력을 나타내기 위해 전혈로부터 RBC 및 WBC를 분리하는데 사용되었는데, 희귀 세포의 밀도가 WBC보다 상대적으로 같거나 높기 때문이다. 혈액 세포를 분리하기 위해, 바닥 채널의 높이는 100 μm로 감소되었고, 분배기는 도 21A에 예시된 대로 바닥 및 상부 채널 사이에 어셈블링되었다. 부상시, 100 μm 아래 높이로 부상된 모든 RBC는 바닥 채널을 통해 흐르고, 이들은 도 21B에 표시된 대로 상부 채널에서 발견되지 않았다. 도 21C는 또한 WBC의 약 70%가 상부 채널로부터 수집되었음을 나타내며, 이는 대부분의 WBC가 상부 채널을 통해 흐르는 100 μm 초과의 높이로 부상되기 때문일 수 있다. 수득된 결과는 개발된 고효율 MagLev 장치가 전혈 및 종양으로부터 CTC 및 태아 적혈구와 같은 희귀 세포를 분리할 수 있음을 입증하였다.
실시예 XII: 혈액에서 암 세포 분류
세포 유형의 혼합물이 채널을 따라 흐를 때, 2개의 영구 자석에 의해 생성 된 자기장 구배는 개별 세포 유형을 세포의 밀도에 의해 결정되는 채널 내부의 독특한 수직 위치로 분리한다. 예를 들어, 암 세포는 이들의 큰 고유 밀도 차이로 인해 복잡한 혼합물(즉, 혈액)로부터 쉽게 분리될 수 있다. 기재된 미세유체 설계에서, 전형적으로 혈액 세포 위로 부상하는 CTC/CTM은 상부 채널로부터 수집될 수 있다. 본 발명자들은 먼저 혈장 분리를 위한 플랫폼을 시험하였는데, 여기서 30 mM Gd3+을 지닌 전체 혈액 샘플은 일정한 유량, 20 μL/min으로 채널을 통해 흐른다. 자기장 하에서, 세포는 고 자기 유도로부터 낮은 쪽으로 이동하고, 이들의 밀도 시그니처에 따라 채널의 특정 높이에서 부상한다. 혈액 세포 RBC 및 WBC는, 높은 밀도로 인해, 분배기 아래로 흐르고, 바닥 출구에서 수집되는 한편, 혈장은 위로 흐르고 상부 채널 출구로부터 수집된다. 유사하게, 바닥 채널 높이를 100 μm로 감소시킴에 의해, WBC가 상부 채널로부터 분리되고 수집되었는데, 이는 전혈 샘플로부터 또한 CTC를 분리할 수 있는 이 장치의 가능성을 보여준다.
실시예 XIII: 자기장을 이용한 세포 분리/차단
이제 도 22를 살펴보면, 이 플랫폼의 세 번째 설계 및 원리가 개략도에 도시된다. 본 Maglev 기반 혈장 분리는 높은 자기장이 고 농축된 상자성 매질에서 세포 차단을 유도하였다는 원리를 이용한다. 혈액 샘플이 채널로 흘러 들어감에 따라, 상자성 매질에서 고 자기 유도를 일으키는 자석(magnate) 에지의 높은 자기장으로 인해, 세포는 저 유도 부위로 이동하여 입구 챔버에 쌓인다. 미세유체 채널은 하나의 입구 및 출구에 연결되는 1 mm 높이, 50 mm 길이 및 4 mm 폭을 특징으로 하는 긴 직선 채널일 수 있다. 제시된 미세유체 혈장 분리 장치는 레이저 커터에 의해 요망되는 채널 피쳐로 절단되고, 양면 접착 테이프를 사용하여 어셈블링되는 폴리카르보네이트 시트를 이용한 단순 미세-제작을 이용하여 제작된다. 2개의 영구 네오디뮴 자석은 동일한 극이 서로 마주 보도록 채널의 상부 및 바닥에 배치된다. 혈장 분리 실험을 위해, 상자성 매질 가돌리늄(Gd3+) 스파이킹된 혈액 샘플을 일정한 유량으로 주사기 펌프를 이용하여 입구로 유동시킨다. 자기 에지 근처에서의 고 자기 유도로 인해, 세포가 차단되고, 입구 챔버에 다시 쌓이며, 출구에서 수집된 혈장만이 채널로 흐를 수 있다.
도 23에서, 고 자기 유도로 유도된 세포 차단 기반 혈장 분리 장치가 측면도(도 23A) 및 평면도(도 23B)로 도시된다. 도 24 및 도 25는 혈액 샘플로부터 효율적인 혈장 분리를 위한 상자성 매질 Gd3+ 농도의 최적화를 나타낸다. 도 25A에서, 혈액이 세포 차단 기반의 혈장 분리 장치(즉, MagLev)에 로딩되는 것이 도시되고, 도 24에는 차단을 예시하는 상세한 도면이 도시되어 있고, 도 25B는 출구에서의 혈장 수집을 보여준다(100 mM Gd3+ 스파이킹된, PBS로 10배 희석된 PBS 혈액 샘플을 하기 기술된 실험에 따라 일정한 유량, 20 μL/min으로 유동시켰다).
상기 실험에서, PBS로 10배 희석되고, 50 mM Gd3+(도 23A에서) 및 100 mM Gd3+(도 23B에서)로 스파이킹된 전혈은 일정한 속도, 20 μL/min으로 도 22의 장치를 통해 흘렀다. 도 24에 도시된 대로, 자기 척력은 Ga3+의 농도가 증가함에 따라 증가하며, 이는 50mM Gd3+의 낮은 농도에 비해 세포를 효과적으로 차단하는 고 자기 유도를 생성한다.
자기 시그니처 및 미세중력의 시뮬레이션에 기반한 다중-세포 3D 어셈블리
자기 부상은 제어된 형태의 다중세포 3D 세포 어셈블리를 신속하게 생성하는데 사용될 수 있다. 이 방법은 생체내 세포-세포 및 세포-ECM 상호작용 및 조직화를 모방할 수 있는 세포 배양 조건을 제공함으로써 통상적인 2D 조직 배양을 능가할 수 있었다. 다른 방법과 비교하여, 본원에 기재된 자기 부상 방법은 공학처리된 스캐폴드 또는 자기 나노입자(부상을 위한)를 요구하지 않는다. 어셈블링된 세포 응집물은 조직 공학, 질병 모델링, 약물-스크리닝 및 세포/조직 생물학 연구에 사용될 수 있다.
무엇보다 이 시스템은 고가의 복잡한 연구 장비를 사용하지 않고 미세중력이 공간 응용을 위한 세포 생물학에 어떠한 영향을 미치는 지를 조사하는 연구를 가능하게 하였다. 이것은 미세중력 조건 하에 세포의 유전체, 전사체 및 단백체 분석을 허용할 수 있었다.
특히, 이 방법은 자기/밀도 특성 및 이미징/분자 프로파일링 둘 모두를 활용하는 분류, 회수 및 특성화를 허용한다. 장치 내에서 자기적으로 분리된 세포는 제거되어, 자기장의 부재하에, 그러나 자기/밀도 분류를 잃지 않으며, 라이브 및 비-라이브 이미징 방법(예를 들어, 투과광, 형광 현미경, 면역염색) 둘 모두에 의해 특성화될 수 있다. 또한, 관심 세포는 분석(예를 들어, 유전체, 전사체 및 단백체)을 위해 부상 장치로부터 선택적으로 회수되거나, 이미징 방법에 따라 추가로 배양될 수 있다. 이 방법은 세포/조직 생물학 연구에 널리 사용될 수 있다. 또한, 이 방법은 세포와 상이한 대상에도 적용될 수 있을 것으로 계획된다.
실시예 XIV: 스페로이드 어셈블리 방법
도 26은 스페로이드 어셈블리 방법을 예시한다. 도 26A 및 26B를 참조하면, 자기 유도(B) 및 중력(g) 때문에 세포가 부상하여, 자기력(Fmag) 및 부력(Fb)이 서로 균형을 이루는 평형 평면에 집중된다. 매질의 자화율(χm)은 세포의 자화율(χc)보다 크다. 도 26A 및 26B의 0일 및 2일 이미지 사이에 비교적으로 예시된 바와 같이, 부상 동안, 세포는 시간에 따라 안정한 구형 응집물로 자가-어셈블링된다. 도 26C는 다양한 세포 유형 NIH-3T3, GFP 인간 탯줄 정맥 내피 세포(GFP-HUVEC), MDA-MB-231 및 중간엽 줄기(MSC)의 이미지를 제공한다. 세포 농도는 세포 배지에서 50 mM Gd+의 5만개 세포/ml였다. 흰색 눈금 바는 100 μm이다.
실시예 XV: 자기 시그니처에 기반한 다중-세포 3D 어셈블리의 두 번째 예
도 27은 자기 시그니처에 기반한 다중-세포 3D 어셈블리를 위한 또 다른 방법을 예시한다. Corning Synthemax II 폴리스티렌 미세담체를 도 27A에 묘사된 대로 50 mM 가돌리늄 농도에서 부상시켰다. 도 27B는 10분 후 폴리스티렌 미세 담체 및 3T3 NIH 세포의 공동-부상 이미지를 도시하고, 도 27C는 3일 후를 도시한다. 도 27D에 묘사된 대로, 250-300 μm 중합체 가닥을 100 mM 가돌리늄 농도에서 부상 장치에 삽입하였다. 도 27E의 이미지는 10분 후 중합체 가닥 및 GFP-HUVEC 세포의 공동-부상을 도시하고, 도 27F의 이미지는 75 mM 가돌리늄 농도에서의 1일 후를 도시한다. 이러한 모든 이미지에서, 눈금 바는 200 μm이다.
실시예 XVI: 자기 부상에 기반한 세포 분류, 회수 및 특성화 방법
이제 도 28을 참조하면, 자기 부상에 기반한 세포 분류, 회수 및 특성화 방법이 예시된다. 방법의 예시는 도 28A에 묘사되어 있다. 세포(예를 들어, NIH-3T3)를 아가로스 겔에서 부상시키고, 이후 응고/가교된 겔을 도 28B에 묘사된 대로 부드러운 질소 가스 흐름의 모세관으로부터 제거한다. 제거 후 관심 세포를 도 28C에 묘사된 대로 절단, 펀칭 및 레이저 포착 미세절제술에 의해 분리할 수 있다. 겔은 또한 고정되고 면역염색될 수 있다. 결과는 도 28D에 묘사된 대로 마우스 소뇌로부터의 부상된 신경 세포 분획을 함유하는 아가로스 섹션의 면역염색을 보여주었다. 겔 섹션은 용융되거나 분해되어 도 28E에 묘사된 바와 같이 분석되는 세포 샘플로 방출될 수 있다.
실시예 XVII: 스페로이드 응집 시간 연구
도 29를 참조하면, 응집 시간 연구의 이미지가 제공된다. 3T3 세포를 어셈블링하고, 추출하고, 2, 4 및 8시간에 이미징하였다. 자기 부상(LEV) 및 행잉 드롭(hanging drop)(HD)을 비교하였다. 8시간 후, 안정한 세포 응집물이 자기 부상 장치에서 형성되었다. 이러한 이미지의 흰색 눈금 바는 200 μm이다.
실시예 XVIII: 세포 생존력에 대한 Gd 농도 및 부상의 효과
이제 도 30을 참조하면, 세포 생존력에 대한 Gd 농도 및 부상의 효과가 예시된다. 3T3 세포를 자기 부상(LEV) 및 행잉 드롭(HD) 동안 상이한 농도의 Gd+(0, 25, 50, 100 mM)에 48시간 동안 노출시켰다. 이후 스페로이드 생존력을 산/죽은 검정(칼세인/에티듐 동종이합체-1)으로 평가하였다. 수득된 결과는 응집물 내의 세포의 대부분이 살아 있음을 보여준다. 흰색 눈금 바는 100 μm이다.
실시예 XIX: 스페로이드의 병합
이제 도 31을 참조하면, DIO-염색된(녹색) 및 DII-염색된 3T3(적색) 스페로이드의 병합이 도 31A에 묘사되어 있고, HUVEC-GFP(녹색) 및 DII-염색된 3T3(적색) 스페로이드의 병합이 도 31B에 묘사되어 있다. 스페로이드는 이전에 자기 부상(48시간, 50mM Gd)에 의해 제작되었고, 이후 하나의 부상 장치에 함께 삽입되었다. 스페로이드 상호작용을 3일 동안 모니터링하였다. 도 31C에서, HUVEC-GFP(녹색) 및 DII-염색된 3T3(적색) 세포를 함께 유도하여 다중세포 스페로이드를 형성한다. 명시야 및 형광 이미지가 제시된다.
수득된 결과는 부상 시스템이 제어된 기하학 및 세포의 조직화를 지닌 다중세포 스페로이드를 신속하게 어셈블링할 수 있음을 보여준다. 흰색 눈금 바는 200 mm이다.
실시예 XX: 3T3 스페로이드의 기능성 연구
이제 도 32를 살펴보면, 3T3 스페로이드는 자기 부상(LEV) 및 행잉 드롭(HD) 방법으로 어셈블링되었다(48시간, 5만개 세포/ml, 50 mM Gd+). 이어서, 스페로이드를 도 32A에 예시된 대로 비-접착성 96-웰 플레이트에 놓고, 피브린 겔(20mg/ml) 내에 임베딩하고, 5일 동안 배양하였다. 매일 스페로이드의 명시야 이미지를 수집하였다. 도 32A에서, 눈금 바는 0-2일 동안 200 μm이고 3-5일 동안 500 μm이다. 도 32B는 부상 후 스페로이드 면역염색을 예시하고, 도 32C는 피브린 겔에서의 5일 후를 예시한다. 핵(DAPI, 청색), 세포 증식(ki67, 마젠타), 콜라겐 I(적색) 분비 및 액틴 필라멘트(녹색)[컬러는 회색톤으로 묘사된다]. 수득된 결과는 어셈블링된 스페로이드가 기능성임을 보여준다. 흰색 눈금 바는 200 μm이다.
실시예 XXI: 어셈블리용 미세유체 자기 부상 시스템
이제 도 33A를 참조하면, 스페로이드의 어셈블리를 위한 미세유체 자기 부상 시스템의 개략도가 제공된다. 제안된 시스템에서, 자기 부상 동안, 세포는 미세유체 장치 벽 사이에서 구획화된다. 따라서, 다수의 스페로이드(각 구획마다 하나씩)가 고효율 양상으로 수득될 수 있다. 도 33B는 굴곡부에서 형성된 한 스페로이드를 묘사한다. 15만개 세포/ml의 세포 농도가 사용되었다(48시간, 60mM Gd+). 도 33B에서, 눈금 바는 200 mm이다.
이러한 자기 부상 시스템 및 도구의 분류된 추가적인 응용
본원에 기술된 다양한 도구, 방법 및 시스템은 광범위한 응용에 적용될 수 있는 것으로 고려된다. 본 개시내용에 제공된 도구, 방법 및 시스템의 다양한 유용성 중 일부를 나타내기 위해 이러한 응용 중 일부를 이제부터 제공한다.
실시예 XXII: 자기 부상에 의한 표적 세포(즉, 박테리아, 효모, 바이러스, 병원체, 순환 종양 세포, 순환 상피 세포 등) 확인 및 풍부화를 위한 자기 비드 전략
자기 미세/나노입자는 종-특이적 항체와 컨쥬게이션될 수 있다. 분자 표적에 대한 항체의 결합은 표적 세포(즉, 감염을 일으키는 박테리아 세포)의 자기 시그니처를 변화시킬 것이다. 자기 입자로 특정 병원체 유형을 포집한 후, 표적 세포/분자/병원체를 미세채널의 바닥으로 가라앉힐 이의 자기 시그니처가 증가할 것이다. 이후 포집된 세포/분자를 플러싱하고, 추가 분석(즉, 항생제 감수성 분석)을 위해 풍부하게 만들 수 있다.
실시예 XXIII: 임상 샘플로부터 고효율 박테리아 세포 분리 및 항생제 감수성 시험
박테리아 세포는 적혈구 및 백혈구에 비해 밀도가 현저히 높다. 고효율 미세유체 부상 시스템으로의 샘플 주입 후, 박테리아 및 혈액 세포는 이들의 밀도 시그니처에 따라 부상하고, 균일한 층으로 분리될 것이다. 박테리아 세포의 밀도가 더 높기 때문에, 박테리아 세포는 다른 높이로 부상하여 또 다른(즉, 바닥) 출구에서 수집되지만, 적혈구 및 백혈구는 다른 높이로 부상하여 다른 출구에서 수집될 것이다. 고효율 미세유체 플랫폼은 또한 분리된 병원체를 재사용하고 동일한 샘플에 대해 반복적인 항생제 감수성 시험을 수행하는 독특한 능력을 가능하게 한다. 현재의 임상 검정에서, 분리된 박테리아 세포의 수가 약 10-100개 세포/ml인 경우 박테리아를 배양하고 수를 늘려야 한다. 미세유체 부상 플랫폼에서, 박테리아 세포는 한 항생제로 시험되고 부상 프로파일에서의 신속한 변화에 대해 조사될 것이다. 박테리아 집단이 치료에 내성인 경우, 박테리아 세포는 채널 밖으로 흘러 나올 것이고, 챔버는 남아 있는 항생제 용액을 제거하기 위해 PBS로 세척될 것이며, 동일한 박테리아 집단이 또 다른 항생제 후보와 함께 시험될 것이다. 따라서, 이 능력은 미래의 항생제 감수성 시험을 위해 매우 적은 수의 병원체를 배양할 필요성을 상당히 제거할 것이다.
실시예 XXIV: 만성 질환으로 고통받는 환자의 혈액 세포를 프로파일링하는데 적용되는 부상 플랫폼
도 34를 참조하면, 부상 플랫폼은 만성 질환으로 고통받는 환자의 혈액 세포를 프로파일링하는데 적용될 수 있다. 예를 들어, 심하게 아픈 만성 피로 증후군(CFS) 환자로부터의 혈액 세포(즉, 적혈구(RBC) 및 백혈구(WBC))의 부상 프로파일은 건강한 대조군으로부터의 WBC의 프로파일과 현저히 다르다.
실시예 XXV: 만성 질환으로 고통받는 환자로부터의 적혈구의 연속 모니터링 및 부상 프로파일링
도 35 및 36은 만성 질환(즉, 만성 피로 증후군)으로 고통받는 환자로부터의 적혈구 및 백혈구 각각의 연속 모니터링 및 부상 프로파일링을 묘사한다. 그러한 연속 모니터링은 시간에 따라 혈액 프로파일의 근본 원인 또는 변화를 확인하는데 도움이 될 수 있다.
실시예 XXVI: 부상 장치를 이용한 대사산물, 화학물질 효과의 스크리닝 및 모니터링
도 37은 부상 장치를 이용하여 대사산물, 화학물질의 효과를 스크리닝하고 모니터링하는 것으 보여준다. 도 37a는 만성 질환(즉, 만성 피로 증후군, 암, 감염병)으로 고통받는 환자로부터 분리된 백혈구에 대한 ATP 첨가의 효과를 연구하기 위해 사용된 부상 시스템을 도시한다. 도 37b는 세포 생존력, 산 및 죽은 백혈구의 수가 이들의 부상 프로파일에 따라 실시간으로 단일-세포 해상도로 모니터링, 검출 및 계수될 수 있음을 예시한다.
실시예 XXVII: 항균 응용
추가로, 이 자기 부상 시스템은, 예를 들어, 토양으로부터 박테리아 세포의 검출, 표면으로부터 박테리아 세포의 휴대 가능한 신속한 검출(즉, 면봉 샘플), 의료 기기 표면 또는 병원 관리 시스템에서 미생물의 감시, 및 식물 박테리아 세포로부터 포자의 검출 및 분리를 비제한적으로 포함하는 다양한 항균 응용에 적용될 수 있다.
실시예 XXVIII: 박테리아 세포의 부상
도 38을 참조하면, 박테리아 세포는 상이한 생물학적 배지 및 토양에서 부상하고 검출될 수 있다(즉, 우태아 혈청). 이. 콜라이(E. coli)(Dh5α)의 밤새 배양액을 FBS에 희석시키고, 100 mM Gd+ 용액에서 부상시켰다. 박테리아 세포는 1시간의 부상 후 이들의 고유 부상 밴드를 형성하였다.
실시예 XXIX: 표면으로부터 박테리아 세포의 신속한 검출
도 39 및 40은 박테리아 세포가 표면으로부터 신속하게 검출될 수 있음을 입증한다. 100 μl의 액체 이. 콜라이(Dh5α) 배양액을 유리 슬라이드 위에 부은 다음 표면을 면봉으로 세정하였다. 이어서, 면봉을 PBS에서 볼텍싱하고, 30 μl의 면봉 샘플을 200 mM Gd+ 용액에서 부상시켰다. 박테리아 세포는 30분 이내에 이들의 고유 부상 밴드를 형성하였다. 따라서, 박테리아는 휴대 가능한 부상 시스템으로 표면으로부터 신속하게 검출될 수 있다.
이제 도 40을 살펴보면, 박테리아 세포는 높은 상자성 조건 하에 5분 이내에 표면으로부터 신속하게 검출될 수 있음을 보여주고 있다. 100 μl의 액체 이. 콜라이(Dh5α) 배양액을 유리 슬라이드 위에 부은 다음 표면을 면봉으로 세정하였다. 이어서, 면봉을 PBS에서 볼텍싱하고, 30 μl의 면봉 샘플을 900 mM Gd+ 용액에서 부상시켰다. 박테리아 세포는 5분 이내에 이들의 고유 부상 밴드를 형성하였다. 따라서, 박테리아는 휴대 가능한 부상 시스템으로 표면으로부터 신속하게 검출될 수 있다.
실시예 XXX: 다른 유형의 모이어티 및 세포의 부상
적절한 부상 환경 조건 하에서 다른 유형의 세포가 기재된 시스템 내에서 부상할 수 있다. 몇몇 추가 예로서, 도 41은 자기 부상 시스템에서 포자의 부상 및 검출을 도시한다(약간의 점선으로 된 밴드 참조). 마찬가지로, 도 42는 식물 박테리아 세포가 부상 시스템 내에서 부상하고 검출될 수 있음을 예시한다.
실시예 XXXI: 자기 부상을 이용한 난모세포 품질의 예측
난모세포의 품질은 체외 수정(IVF)과 같은 생식 연구에서의 응용을 위해 이들의 부상 및 밀도 프로파일에 따라 예측될 수 있다.
이제 도 43을 참조하면, 다양한 난모세포의 부상 프로파일이 예시된다. 마우스로부터 분리된 난모세포를 상이한 상자성 용액(10 mM, 15 mM 및 30 mM Gd+)에서 부상시켰다. 상이한 단계에서 난모세포의 밀도를 모니터링하고, 이들의 부상 프로파일로부터 계산하였다.
실시예 XXXII: 비감염된 대 HIV-감염된 CD4 T 세포의 부상 프로파일
자기 부상 장치는 또한 비감염된 대 HIV-감염된 CD4 T 세포의 부상 프로파일을 연구하는데 사용되었다. 100,000개의 비감염된 및 HIV-감염된 혈액 CD4 T 세포를 30 mM 상자성 용액을 지닌 포스페이트 완충된 염수 용액(PBS)에서 각각 부상시켰다. 샘플을 20분 동안 부상시키고, 부상 프로파일을 비교하였다. 도 44a 및 44b에 예시된 대로, 비감염된 및 HIV-감염된 혈액 CD4 T 세포는 자기 부상-기반 플랫폼에서 현저하게 상이한 부상 프로파일을 갖는다.
비교 목적으로, 감염된 세포에서의 자극 효과를 도 45에 예시한다. 도 45a (및 도 45b에서 정량됨)에 도시된 대로, 100,000개의 HIV-감염된 CD4 T 세포를 항-CD3/CD28/IL2 비드로 자극하고, 항-CD3/CD28/IL2 항체를 30 mM 상자성 용액을 지닌 PBS 용액에서 각각 부상시켰다. HIV-감염된 혈액 CD4 T 세포를 대조군으로서 이용하였다. 샘플을 20분 동안 부상시키고, 부상 프로파일을 비교하였다. 항-CD3/CD28/IL2 비드 및 항-CD3/CD28/IL2 항체에 의한 자극은 HIV-감염된 혈액 CD4 T 세포의 부상 프로파일을 변화시키는 것으로 나타났다.
실시예 XXXIII: 미세유체 고효율 자기 부상 플랫폼에 대한 추가적인 설계(즉, 바늘의 첨가 및 흡입)
이제 도 46을 살펴보면, 미세모세관 채널, 입구, 미세모세관 채널의 단부에 2개 이상의 바늘: a) 채널의 상부에 하나 이상의 바늘, b) 채널의 바닥에 하나 이상의 바늘, 뿐만 아니라 수집 출구를 포함하는 미세유체 부상 플랫폼(μMagLev)의 이미지가 예시되어 있다. 또한, 이러한 바늘은 채널의 3D 공간 도메인 또는 외부의 어디에도 위치할 수 있다. 샘플(즉, 비드, 암 세포, 혈액 등)을 입구에서 혼합시킨 다음 다양한 음압 및 유속을 이용하여 이들의 밀도에 따라 샘플을 회수할 수 있다. 더 낮은 밀도 또는 더 낮은 자화율을 지닌 샘플은 미세유체 펌프에 의해 바닥 바늘로 회수되고 바닥 출구 튜브에서 수집될 수 있다. 더 높은 밀도 또는 더 높은 자화율을 지닌 샘플은 바닥 바늘로 회수되고 바닥 출구 튜브에서 수집될 수 있다. 자기 플랫폼의 다른 설계 파라미터(예를 들어, 자석 강도, 자석의 기하학적 배치, 치수)는 이에 따라 신속한 처리 및 더 나은 분류가 가능하도록 추가로 변형될 수 있다.
도 46a에서, 2개의 바늘이 미세모세관 채널의 단부에 위치한다. 이어서 도 46b에서, 비드 및 세포는 유동 중에 음압에 의해 동시에 흐르고, 분류되고, 회수되고 수집될 수 있는 것으로 나타났다. 도 46c에서, 미세유체 maglev 시스템에 대한 원형 사진이 도시된다.
이제 도 47을 살펴보면, 미세유체 자기 부상 시스템 내의 세포 조작 및 수집이 예시된다. 도 47a에서, 더 낮은 밀도 또는 더 낮은 자화율을 지닌 샘플은 미세유체 펌프에 의해 상부 바늘로 회수되고 상부 출구 튜브에서 수집될 수 있다. 또한, 샘플은 상부 바늘의 흡입을 바닥 바늘의 흡입보다 높게 유지하여 상부 수집 바늘로 회수될 수 있다(흡입상부 바늘 > 흡입바닥 바늘). 부상된 샘플이 어디에서 수집될 지를 결정하기 위해 여러 흡입 포트의 유속을 상대적으로 조작할 수 있다. 도 47b에서, 더 높은 밀도 샘플이 바닥 바늘로 회수되고 바닥 수집 바늘에 연결된 출구 튜브에서 수집될 수 있다. 또한, 샘플은 상부 바늘의 흡입을 바닥 바늘의 흡입보다 낮게 유지하여 바닥 수집 바늘로 회수될 수 있다(흡입상부 바늘 < 흡입바닥 바늘).
실시예 XXXIV: 점적 분류 및 점적 시퀀싱의 결과
점적을 자기 부상 시스템 내에서 부상시켜 분석 및 진단을 위한 다양한 여러 방법을 제공할 수 있다. 점적을 상자성 용액과 함께 여러 용액 및 세제(즉, 우태아 혈청, 혈장, PBS-Tween과 함께 우태아 혈청, PBS-Tween와 함께 혈장)에 현탁시킬 수 있다. 생물학적 모이어티(즉, 세포, RNA, DNA, 바이러스, 박테리아 등)를 캡슐화하는 점적을 분류 및 분리할 수 있다. 상이한 유형의 세포를 캡슐화한 점적은 상이한 부상 프로파일을 지닐 수 있고 이후 유전체, 전사체, 단백체, 및 대사산물 분석을 위한 추가 특성화를 위해 분류 및 수집될 수 있다. 산 세포와 죽은 세포를 함유하는 세포는 상이한 부상 프로파일을 가질 수 있다. 이것은 죽은 세포 대 산 세포를 함유하는 점적을 분리하기 위해 Drop-Seq 응용에 사용될 수 있다. 이후 산 세포만을 캡슐화한 점적을 Drop-Seq에 이용할 수 있다. 이 기능은 점적-시퀀싱 방법의 비용 및 처리 시간을 크게 줄일 것이다.
먼저 도 48을 보면, 점적은 150 mM 상자성 용액(즉, 가돌리늄)을 지닌 우태아 혈청(FBS)에서 부상한다. 도 49에서, 점적은 150 mM 상자성 용액(즉, 가돌리늄)을 지닌 우태아 혈청(FBS)+ PBS-Tween 20에서 부상한다. PBS-Tween 용액은 점적을 분산시키는데 도움이 된다. 도 50에서, 점적은 150 mM 상자성 용액(즉, 가돌리늄)을 지닌 우태아 혈청(FBS)+ PBS-Tween 20에서 부상한다. 상이한 생물학적 모이어티를 캡슐화한 점적을 부상, 분류 및 분리할 수 있다. 빈 점적 대 형광 라벨링된 바이러스 입자를 함유하는 점적을 부상시키고 이미징할 수 있다. 형광 대 비-형광 점적은 부상 시스템 내에서 분류될 수 있다.
실시예 XXXV: 암 연구를 위한 데이터 수집
도 51은 화학- 및 라벨-비함유 자기 부상 칩의 특성을 규명한다. 부상 칩은 순환 종양 세포 및 순환 종양 클러스터를 동일한 장치 내에서 동시에 분리할 수 있다. 도 51a에 예시된 대로, 칼세인-라벨링된 단일 세포(CTC) 및 암 세포 응집물(CTM)의 존재를 시험하기 위해 사용될 수 있는 절차가 묘사된다. 신장암 세포의 단일 세포(CTC) 및 신장암 세포의 클러스터(CTM)를 동일한 장치 내에서 동시에 분리 및 분류할 수 있으며, WBC로 스파이킹된 실험에서, 임의의 라벨을 이용하지 않고 검출할 수 있다. 이후, 도 51b에서, 자기 청사진을 통한 혈액으로부터 암 세포의 분리 효율이 도시된다. 상이한 농도의 스파이킹된 암 세포(100개 세포/mL, 1,000개 세포/mL, 100,000개 세포/mL)에서의 효율을 분석하고, 상이한 암 세포 유형(즉, 폐, 유방 및 신장암)에 대해 비교하였다. 분리 효율은 스파이킹된 암 세포의 총 수에 대한 혈액 세포 밴드 위로 부상한 암 세포의 비로서 정의된다. (N=3 독립 실험, 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로서 표현된다).
신장암 환자로부터의 혈액 샘플을 FBS에서 1:20 비로 희석시킨 다음 자기 부상 장치에서 30 mM Gd+ 용액에서 부상시켰다. 20분의 부상 후에, CTC 및 CTC의 클러스터(파란색 원, 즉, 우측의 3개 원)는 도 51a에 묘사된 RBC 및 WBC로 구성된 밴드 위로 부상하였다, 가장 우측 이미지, 이러한 추정 CTC는 미세모세관 채널의 상부에 부상하였므로, 밀도가 매우 가벼운 것으로 관찰되었다.
도 52는 신장암(신세포 암종) 환자로부터의 혈액 샘플의 자기 부상 프로파일링을 예시한다. 혈액 샘플을 FBS에서 1:20 비로 희석시킨 다음 30 mM Gd+ 용액에서 부상시켰다. CTC의 클러스터(둘 모두의 패널에서 원으로 된 영역)는 RBC 및 WBC로 구성된 밴드 위로 부상하였다.
본 발명은 하나 이상의 바람직한 구체예와 관련하여 설명되었지만, 명시적으로 언급된 것 이외에 많은 균등물, 대안물, 변형 및 수정이 가능하고 이들은 본 발명의 범위 내에 있음이 이해되어야 한다.

Claims (45)

  1. 모이어티의 이종 집단을 분리하기 위한 부상 장치를 포함하는 자기 부상(magnetic levitation)-기반 진단 시스템으로서, 모이어티의 변동이 자화율 및/또는 고유 밀도에서의 차이에 기반하고, 장치가 자기장을 생성하는 적어도 하나의 자석을 포함하며, 자기장이 모이어티의 이종 집단을 함유하는 샘플의 수용을 위해 미세모세관 또는 미세유체 채널과 상호작용하는 크기이고;
    미세모세관 또는 미세유체 채널이 그 안에 형성된 미세모세관 또는 미세유체 채널의 부분을 갖는 복수의 층에 의해 한정되고, 복수의 층들 중 적어도 하나가 미세모세관 또는 미세유체 채널로의 입구 채널을 제공하고 복수의 층들 중 적어도 2개가 미세모세관 또는 미세유체 채널로부터의 분리된 출구를 제공하는, 자기 부상-기반 진단 시스템.
  2. 제1항에 있어서, 복수의 층이 적어도 2개의 층을 포함하며, 적어도 2개의 층 각각은 그 안에 형성된 개별 입구 및 개별 출구를 포함하는 시스템.
  3. 제1항에 있어서, 각각의 개별 층이 레이저-가공 물질로부터 형성되는 시스템.
  4. 제1항에 있어서, 박막이 상부 및 바닥 출구를 설정하기 위해 복수의 층들 중 적어도 2개 사이에 배치되는 시스템.
  5. 제1항의 시스템을 이용한 분류 방법으로서, 상기 방법이,
    모이어티의 이종 집단 및 상자성 매질을 포함하는 샘플을 적어도 하나의 입구 및 미세모세관 또는 미세유체 채널로 유동시키는 단계;
    자기장을 모이어티의 이종 집단을 포함하는 샘플에 적용시켜, 모이어티의 이종 집단의 개개 구성원과 상자성 매질 사이의 자화율 및 고유 밀도 중 적어도 하나에서의 차이에 기반하여 이종 집단을 분리하는 단계;
    그 후, 샘플의 제1 부분이 상부 출구로부터 흘러 나오고, 샘플의 제2 부분이 바닥 출구로부터 흘러 나와, 모이어티의 이종 집단의 제1 그룹을 모이어티의 이종 집단의 제2 그룹으로부터 분리시키는 단계를 포함하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 복수의 층이 상부, 중간 및 바닥 층을 포함하는 적어도 3개의 층을 포함하며, 이 때 3개의 층 각각은 그 안에 형성된 개별 입구 및 개별 출구를 포함하고, 샘플을 적어도 하나의 입구 및 미세모세관 또는 미세유체 채널로 유동시키는 단계가 모이어티의 이종 집단 및 상자성 매질을 포함하는 샘플을 바닥 입구로 도입시키고 상자성 매질을 상부 및 중간 입구로 도입시키는 것을 포함하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 샘플이 상자성 매질과 혼합된 혈액 샘플이고, 혈액 샘플이 순환 종양 세포(CTC) 또는 순환 종양 클러스터/색전(CTM)을 포함하며, CTC/CTM이 미세모세관 또는 미세유체 채널에서 자기장에 노출 후 분리되어 상부 채널로 흐르는 방법.
  8. 제5항에 있어서, 온도 및 가교 중 적어도 하나의 도움으로 모이어티의 분리된 집단을 안정화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  9. 생물학적 또는 비-생물학적 모이어티의 집단을 분리하기 위한 장치를 포함하는 시스템을 이용한 분류 방법으로서, 상기 장치가 자기장을 생성하는 적어도 하나의 자석을 포함하고, 이 때 자기장은 모이어티의 집단을 함유하는 샘플의 수용을 위해 미세모세관 또는 미세유체 채널과 상호작용하는 크기이며, 상기 방법이,
    모이어티의 집단 및 상자성 매질을 포함하는 샘플을 입구에서 미세모세관 또는 미세유체 채널을 지나 출구 쪽으로 유동시키는 단계; 및
    샘플이 미세모세관 또는 미세유체 채널에 있는 동안, 적어도 하나의 자석을 사용하여 샘플에 자기장을 적용시키는 단계로서, 자기장의 적용이 모이어티의 집단의 구성원들 중 전체가 아닌 적어도 일부가 출구를 향해 흐르는 것을 차단하여, 모이어티의 집단을 분리시키는 단계를 포함하는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 모이어티의 집단의 구성원들 중 전체가 아닌 적어도 일부의 차단이 고 자기 유도로 인해 자기장의 자기 에지에서 발생하는 방법.
  11. 제9항에 있어서, 모이어티의 집단이 혈액 샘플을 포함하고, 이 때 혈액 세포는 적어도 하나의 자석에 의해 생성된 자기장을 지나 이동하는 것이 차단되지만, 혈장은 적어도 하나의 자석에 의해 생성된 자기장을 지나 미세모세관 또는 미세유체 채널을 통해 출구로 흐를 수 있는 방법.
  12. 제9항에 있어서, 온도 및 가교 중 적어도 하나의 도움으로 모이어티의 분리된 집단을 안정화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  13. 자기장을 생성하는 적어도 하나의 자석을 포함하는 부상 장치를 포함하는 자기 부상-기반 진단 시스템을 사용하여 자기 시그니처에 기반한 다중-모이어티 어셈블리를 어셈블링하는 방법으로서, 적어도 하나의 자석이 모이어티의 집단을 함유하는 샘플의 수용을 위해 미세모세관 또는 미세유체 채널에 근접해 있고, 상기 방법이,
    모이어티의 집단 및 상자성 매질을 포함하는 샘플을 미세모세관 또는 미세유체 채널로 도입하는 단계; 및
    샘플이 미세모세관 또는 미세유체 채널에 있는 동안, 적어도 하나의 자석을 사용하여 샘플에 자기장을 적용시키는 단계로서, 자기장의 적용이 모이어티의 집단의 적어도 부분을 부상시켜 모이어티의 집단을 서로에 대해 공간적 관계에 놓으며, 이 때 모이어티의 집단은 응집하여 다중-모이어티 어셈블리를 형성하는 단계를 포함하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 다중-모이어티 어셈블리를 형성하는 모이어티의 집단의 응집이 일정 기간 동안 자발적으로 발생하고, 그 동안 모이어티의 집단이 자기장에 의해 유도된 부상에 의해 확립된 공간적 관계로 실질적으로 유지되는 방법.
  15. 제13항에 있어서, 자기장이 영구 자석에 의해 생성되는 방법.
  16. 제13항에 있어서, 자기장이 전류에 의해 유도된 코일에 의해 생성되는 방법.
  17. 제13항에 있어서, 시스템이 고효율 다중-모이어티 어셈블링이 가능한 방법.
  18. 제13항에 있어서, 모이어티가 세포인 방법.
  19. 제13항에 있어서, 모이어티가 중합체인 방법.
  20. 제13항에 있어서, 다중-모이어티 어셈블리를 형성하는 모이어티의 집단의 응집이 발생하고, 온도 및 가교 중 적어도 하나의 도움으로 안정화되는 방법.
  21. 이미징 장치와 함께 사용하기 위한 자기 부상-기반 진단 시스템으로서, 상기 시스템이,
    세포의 이종 집단을 분리하기 위한 부상 장치로서, 세포의 변동이 자화율에서의 차이에 기반하고, 장치가 자기장을 생성하는 적어도 하나의 자석을 포함하며, 적어도 하나의 자석이 세포의 이종 집단을 함유하는 샘플의 수용을 위해 미세모세관 또는 미세유체 채널에 근접해 있는, 부상 장치;
    광원; 및
    프레임으로서, 프레임은 부상 장치 및 광원을 지지하기 위한 것이고, 이미징 장치를 지지하도록 추가로 구성되며, 세포의 이종 집단의 적어도 일부에 대한 실시간 관찰을 위해 광을 부상 장치를 통해 이미징 장치로 전송하는 위치에서 광원을 지지하는 프레임을 포함하는, 자기 부상-기반 진단 시스템.
  22. 제21항에 있어서, 렌즈를 추가로 포함하고, 이 때 프레임이 렌즈를 지지하며 광원이 렌즈를 통해 광을 이미징 장치로 추가로 전송하도록 배치된 시스템.
  23. 제21항에 있어서, 이미징 장치가 스마트폰, CMOS 카메라, 및 CCD 카메라 중 하나인 시스템.
  24. 제21항에 있어서, 이미징 장치에 의해 수집된 데이터가 블루투스, 와이파이, 및 전화 네트워크 중 적어도 하나를 통해 전송되는 시스템.
  25. 제21항에 있어서, 프레임에 의해 지지되는 중성 농도 필터를 추가로 포함하고, 중성 농도 필터가 광원과 부상 장치 사이에 배치된 시스템.
  26. 제21항에 있어서, 프레임에 의해 지지되는 이미징 장치를 추가로 포함하고, 이미징 장치가 카메라를 포함하며, 프레임이 카메라가 렌즈를 통해 전송된 이미지를 수신할 수 있게 정위되는 위치에 이미징 장치를 수용하는 시스템.
  27. 제26항에 있어서, 이미징 장치가 세포의 이종 집단의 분리를 실시간으로 관찰하도록 구성되는 시스템.
  28. 제21항에 있어서, 프레임이 휴대성을 위해 프레임의 크기를 줄인 압축된 상태 및 프레임이 확장된 확장된 상태를 갖는 시스템.
  29. 제28항에 있어서, 프레임이 확장된 상태일 때, 프레임이 그 상부 표면의 리세스에 이미징 장치를 수용하도록 구성되는 시스템.
  30. 제29항에 있어서, 이미징 장치가 소형이고, 스마트폰과 같은 보호 케이스 커버에 삽입되어 이미징 장치를 이미징 경로에 연결시키고 프레임에서의 스마트폰의 위치를 설정하는 시스템.
  31. 제21항에 있어서, 이미징 장치가 프레임에 수용될 때, 이미징 장치의 카메라가 렌즈를 향하고, 이미징 장치의 디스플레이가 세포의 이종 집단을 함유하는 샘플의 관찰을 위해 계속 보기가 가능한 시스템.
  32. 제31항에 있어서, 시스템이 부상된 물체의 수를 계수하고 정량하도록 추가로 구성되는 시스템.
  33. 제21항에 있어서, 이미징 장치가 화이트 필드(white field) 및 형광 유형 이미징 둘 모두를 이미징 장치에 의해 수행할 수 있는 시스템.
  34. 자기 부상-기반 진단 시스템에서 세포의 이종 집단을 관찰하는 방법으로서, 상기 방법이,
    세포 집단의 샘플을 부상 장치의 미세모세관 또는 미세유체 채널에 배치하는 단계;
    이미징 장치를 프레임에 배치하는 단계;
    세포 집단를 부상 장치에서 분리하는 단계; 및
    세포 집단을 부상 장치에서 분리하는 동안, 이미징 장치을 이용하여 세포 집단의 분리 이미지를 수집하는 단계를 포함하는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 세포 집단의 분리 이미지의 수집이 실시간으로 발생하는 방법.
  36. 제34항에 있어서, 샘플이 혈액인 방법.
  37. 제34항에 있어서, 샘플이 타액, 소변, 혈장, 혈청, 및 대변을 포함하는 체액; 피부, 항문, 비강 및 질 면봉 또는 손잡이로부터의 환경 면봉을 포함하는 면봉; 및 눈물, 폐로부터의 라바쉬액, 유방으로부터의 사이질 조직액을 포함하는 근위 유체로부터 선택되는 방법.
  38. 제34항에 있어서, 세포 집단의 수집된 이미지로부터 세포 집단의 적어도 일부를 계수 및/또는 정량하는 단계 중 적어도 하나를 추가로 포함하는 방법.
  39. 모이어티의 이종 집단을 분리하기 위한 부상 장치를 포함하는 자기 부상-기반 시스템으로서, 모이어티의 변동이 자화율 및/또는 고유 밀도에서의 차이에 기반하고, 장치가 자기장을 생성하는 적어도 하나의 자석을 포함하며, 자기장이 모이어티의 이종 집단을 함유하는 샘플의 수용을 위해 미세모세관 또는 미세유체 채널과 상호작용하는 크기이고;
    미세모세관 또는 미세유체 채널의 입구 및/또는 출구에 있는 적어도 하나의 바늘이 미세모세관 또는 미세유체 채널로부터의 유체를 미세모세관 또는 미세유체 채널의 높이 및/또는 폭에 걸쳐 각기 소정의 위치에 도입하거나 회수하는, 자기 부상-기반 시스템.
  40. 제39항에 있어서, 입구 또는 출구에 복수의 바늘을 포함하고, 복수의 바늘 각각이 상이한 공간 위치에서 미세모세관 또는 미세유체 채널과 연통되는 자기 부상-기반 시스템.
  41. 제39항에 있어서, 입구의 첫 번째 주입 바늘이 출구의 두 번째 흡입 바늘과 상이한 높이에 있는 자기 부상-기반 시스템.
  42. 생식 의료에 사용하기 위한 개개 배아 및 난모세포의 품질을 평가하는 방법으로서, 상기 방법이,
    하나 이상의 배아 또는 난모세포를 포함하는 샘플을 부상 장치의 미세모세관 또는 미세유체 채널에 배치하는 단계;
    배아 또는 난모세포를 포함하는 샘플을 부상 장치에서 부상시키는 단계; 및
    밀도 및 부상 프로파일 중 하나 이상에 대해 배아 또는 난모세포의 품질을 등급 매기는 단계를 포함하는, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 밀도 및 부상 프로파일 중 하나 이상에 대한 배아 또는 난모세포의 품질 등급에 기반하여 배아 또는 난모세포 중 하나 이상을 선택하고, 하나 이상의 배아 또는 난모세포를 체외 수정 절차에서 적용시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  44. 점적 시퀀싱을 위해 자기 부상 시스템에서 점적으로 캡슐화된 복수의 모이어티를 부상시키는 방법으로서, 상기 방법이,
    복수의 모이어티를 복수의 점적으로 캡슐화시키고 복수의 점적을 샘플에서 현탁시키는 단계;
    복수의 점적을 함유하는 샘플을 자기 부상 시스템의 미세모세관 또는 미세유체 채널에 배치하는 단계; 및
    복수의 점적을 자기 부상 시스템에서 부상시키는 단계를 포함하는, 방법.
  45. 제44항에 있어서, 샘플이 임의의 복수의 모이어티를 캡슐화하지 않은 복수의 점적을 추가로 포함하는 방법.
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