KR20120131974A - 종양세포 검출장치 및 종양세포 검출방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 본 발명은 종양세포 검출 칩을 포함하는 종양세포 검출 장치 및 종양세포 검출방법을 제공한다. 본 발명의 종양세포 검출방법은 종양세포를 단시간에 간편한 검출을 가능하게 하여 종양세포의 전이 발생 이전의 치료 및 암환자의 임상 관리 및 진단을 용이하게 할 수 있다. 또한 검출된 종양세포를 그대로 배양하여 유전자 분석에 이용할 수 있게 한다.

Description

종양세포 검출장치 및 종양세포 검출방법{DEVICE FOR DETECTION OF TUMOR CELLS AND DETECTING METHOD TUMOR CELLS}

본 발명은 종양세포를 검출하는 장치 및 방법에 관한 것이다.

암의 확산은 몸 안에서 기원된 종양이 발생 장소에서 다른 장소로 이동하는 것이다. 이들 종양 세포 중 일부는 말초 혈액을 통해 기원된 종양이 발생한 그 장소에서 해부학적으로 멀리 떨어진 장소로 전이한다. 전이된 세포와 같은 희박한 각각의 세포들은 염색된 생물 조직학 슬라이드와 같은 현미경 검사 등 보편적인 조사의 표준 방법에서는 발견되지 않을 수 있다. 종양세포를 검출하고 특성화시키는 것은 전이 발생 이전의 치료뿐만 아니라 암환자의 임상적 관리와 진단에 있어서 유망하므로, 종양세포의 검출방법 개발이 필요하였다.

순환종양세포(Circulating tumor cells: 이하 “CTC”)는 기원된 종양세포에서 떨어져 나와 종양세포가 전이될 수 있는 세포 구조 변화인 중간엽상피 전환(Mesenchymal to Epithelial Transitions: MET) 과정을 거쳐 혈류나 생체 유동에 의해 혈관이나 림프관을 돌아다니다가 특이한 관의 벽(염증이 있거나 상처가 발생한 표면)에 부딪혀 내피 세포 사이를 파고든다. 이 때 다시 상피중간엽 전환(Epithelial to Mesenchymal Transitions: EMT) 과정을 거친다. EMT 과정은 세포가 상피(epithelial)성 세포 표현형을 상실하고 이동성이 높은 중간엽(mesenchymal)성 세포 표현형으로 전환하는 과정으로 악성 종양의 전이에 관여한다고 알려져 있다. CTC는 EMT 과정을 거친 후 새로운 종양으로 전이되어서 다른 조직에서 암으로 자리 잡게 된다. 따라서, CTC 를 검출하고 특성화시키는 방법을 개발하면 전이 발생 이전의 치료뿐만 아니라 암환자의 임상적 관리와 진단에 있어서 유용하다. 그러나, CTC는 혈액 1ml 당 100개 내외의 수로 존재하며, 검출하기가 쉽지 않은 문제가 있었다.

본 발명은 상기 문제점을 해결하게 하기 위해, 단시간에 간편하게 종양세포를 검출하는 장치 및 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예는 시료 중의 종양세포를 검출하는 종양세포 검출 장치로서, 상기 종양세포 검출장치는 종양세포 검출 칩을 포함하고, 상기 종양세포 검출 칩은 한 면에 항체가 고정된 기판; 및 상기 기판을 수용하는 챔버를 포함하는 것을 특징으로 하는 종양세포 검출 장치를 제공한다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서 상기 종양세포 검출 칩은 상기 챔버에 형성된 시료 투입구 및 시료 배출구를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서 상기 기판은 비특이적 반응 억제를 위한 물질로 표면 처리된 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 비특이적 반응 억제를 위한 물질은 소혈청 알부민(Bovine serum albumin: BSA) 또는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol: PEG)일 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서 상기 종양세포 검출 장치는, 상기 종양세포 검출 칩에 원심력을 가하는 장치를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서 상기 종양세포 검출 칩은 원심력이 가해지는 방향으로 항체가 고정된 기판을 위치시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서 상기 종양세포 검출 장치는, 상기 시료 투입구를 통하여 챔버 내부로 기체를 주입하여 미반응 세포를 시료 배출구로 배출시키는 기체주입기를 더 포함할 수 있다.

한, 본 발명의 일 실시예에서 상기 챔버의 용량은 1~8 ml일 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예는 시료 중의 종양세포를 검출하는 방법으로서, 종양세포를 포함하는 시료를 상기 종양세포와 특이적으로 결합하는 항체에 가한 후 원심력을 가하여 종양세포와 항체를 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 종양세포 검출 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서 상기 원심력은 0.6~10 G일 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서 상기 원심력은 1~10 분간 가할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서 상기 시료의 양은 1~8 ml일 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서 상기 종양세포는 순환종양세포(Circulating tumor cells: CTC)일 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서 상기 종양세포와 항체를 반응시키는 단계 이후에, 상기 시료에 기체를 가하여 미반응 세포를 배출시키는 워싱 단계를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서 상기 기체의 유량은 3~10 ml/hr일 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서 상기 기체의 유량은, 시료 내의 세포 갯수를 알 경우 종양세포의 포집율에서 비종양세포의 포집율의 차이가 최대가 되는 유량이고, 상기 포집율은 하기 [수학식 1]로 나타낼 수 있다.

[수학식 1]

또한, 본 발명의 일 실시예에서 상기 기체는 상기 기체는 공기(air), 질소 또는 비활성기체일 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서 상기 워싱 단계 이후에, 포집된 종양세포를 포집 상태 그대로 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서 상기 배양은 3일 이상, 구체적으로 5일 이상일 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예는 상기 종양세포 검출 장치를 이용하는 종양세포 검출방법을 제공한다.

본 발명의 종양세포 검출장치 및 검출방법은 종양세포를 단시간에 간편한 검출을 가능하게 하여 종양세포의 전이 발생 이전의 치료 및 암환자의 임상 관리 및 진단을 용이하게 할 수 있다. 또한 검출된 종양세포를 그대로 배양하여 유전자 분석에 이용할 수 있게 한다.

도 1은 종양세포 검출 칩(10)을 나타낸 것이다.
도 2는 종양세포 검출 칩(10)에 원심력을 적용시키기 위한 회전 장치를 나타낸 것이다.
도 3은 종양세포 검출 방법을 나타낸 모식도이다.
도 4는 종양세포 확인을 위한 세포 면역-형광 염색을 나타낸 것이다. 도 (a) ~ (C)는 NSCLC 세포이며, (d) ~ (e)는 Jurkat 세포이다.
도 5는 세포에 대한 원심력의 영향을 나타낸 것이다.
도 6은 종양세포 검출 장치에서의 공기 계면 분리를 나타낸 것이다.
도 7은 종양세포의 포획 산출과 검출율을 나타낸 것이다.
도 8은 순수 혈액에서 종양세포 검출 비율을 나타낸 것이다.
도 9는 포집 세포를 배양하였을 때, 배양된 세포들의 증식을 나타낸 것이다.
도 10은 NSLCL 세포 검출율과 종양세포 검출 칩 크기와의 관계를 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 상기 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체일 수 있다. 상기 항체는 고체 기판(기질)(106)에 고정될 수 있는데, 여기서, "기판"은 비생물학적이고, 합성되고, 평면, 평편한 표면의 물질을 포함하는 혼합물 수단으로, 하이브리다이제이션 또는 효소 인식 부위 또는 수많은 다른 인식 부위를 포함할 수 있다. 상기 기판은 예를 들면, 반도체, (유기)합성 메탈, 합성 반도체, 인슐레이터 또는 도판트일 수 있고, 금속, 합금, 원소, 화합물 또는 미네랄일 수 있으며, 합성되거나, 에칭되거나, 리소그라프되거나, 프린트되거나 마이크로패브리케이트된 슬라이드일 수 있고, 폴리머, 플라스틱, 멤브레인, 실리콘, 실리케이트, PMMA, PDMS, 유리, 금속 또는 세라믹일 수 있으며, 나무, 종이, 하드보드, 면, 울, 천, 직조되거나 비직조된 섬유 또는 패브릭일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 종양세포 검출 칩(10)에서 상기 챔버(108)는 상기 항체가 고정된 기판(106)을 수용한다. 여기서 수용이라 함은 상기 기판(106)이 챔버(108)의 한 면을 형성하고, 기판(106)의 항체가 고정된 면이 챔버(108) 내부를 향하는 것일 수 있다(도 1(a)). 또는 상기 챔버(108)가 기판(106)의 항체가 고정된 면을 둘러싸는 형태로 구성될 수도 있다(도 1(b)).

상기 챔버(108)상에는 시료 투입구(102) 및 시료 배출구(104)가 형성될 수 있고, 상기 시료 투입구(102)와 시료 배출구(104)는 예를 들어, 도 1(a)처럼 챔버(108) 상에서 일직선상으로 반대 방향으로 형성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 챔버(108)의 용량은 1~8 ml일 수 있다. 또한, 검출에 사용되는 시료의 양도 1~8 ml일 수 있다. 이 수치 범위는 시료를 한 번에 주입하여 단시간에 종양세포를 검출할 수 있는 부피이다.

극미량이 들어있는 CTC를 정확하게 검출하기 위해서는 ml 단위의 샘플이 요구된다. 그러나 미세유체 칩에서는 한정된 공간에 의해 모든 세포들의 반응 시간이 오래 소요된다. 게다가 항체의 반응을 이용한 구조에선 속도에 의한 전단력 발생으로 세포들이 항체가 코팅된 표면으로부터 떨어지기 때문에 더욱 느린 유량이 필요해진다. 그러나, 본 발명의 종양세포 검출 칩은 미세유체 환경이 적용되지 않으므로 유속을 높여서 검출시간을 단축할 수 있다. 본 발명의 종양세포 검출 칩은 1 ml 이상의 샘플을 한 번에 주입할 수 있으며, 원심력을 이용해 샘플 전체를 항체가 코팅된 표면에 빠르게 반응시킬 수 있다. 또한 미세구조와 같은 어렵고 복잡한 제작 방법이 필요 없으며, 마그네틱 비드와 같은 첨가물도 필요하지 않아서 제작이 용이하다.

상기 기판(106)의 면적은 사용되는 시료 내에 포함된 세포 수에 따라 조절할 수 있다. 왜냐하면 한 번에 모든 샘플을 칩에 주입하므로 세포들이 차례로 항체와 반응하지 않고 동시에 달라붙기 때문이다. 즉 도 10(b)에서 볼 수 있듯이, 검출 칩에서의 검출율을 올리기 위해서는 장치의 반응 기판의 면적을 넓히거나 시료의 세포 수를 줄여야 한다. 또한 샘플 속의 세포들이 잘 분포되어 있어야 한다. 세포들이 뭉쳐 있으면 항체가 코팅된 표면에 한꺼번에 붙으려 하기 때문에 검출될 확률이 적어진다. 그 이유는 세포들이 모두 칩 표면에 붙는 것이 아니고 세포들끼리 붙어서 항체와 반응하지 않기 때문이다.

상기 기판(106)은 비특이적 결합을 방지하기 위한 생화학물질로 표면 처리할 수 있고, 상기 비특이적 반응 억제를 위한 물질은 소혈청 알부민(Bovine serum albumin: BSA) 또는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol: PEG)일 수 있다. 상기 표면 처리 방법은 코팅일 수 있다. 상기 BSA나 PEG는 희석하여 사용할 수 있다. BSA는 기판(106)에서 원치 않는 항원 항체 반응이 일어나는 등의 비특이적 결합(nonspecific binding)을 막아주기도 하고, 포집된 종양세포를 배양할 때 단백질(효소) 농도를 보완하거나 세포 영양분으로 쓰이기도 한다.

상기 시료는 종양세포를 포함하는 혈액 시료이다.

상기 종양세포는 순환종양세포(Circulating tumor cells: CTC)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 종양세포 검출 칩(10)은 원심력이 가해지는 방향에 항체가 고정된 기판(106)을 위치시킬 수 있다.

상기 종양세포 검출 칩(10)에 원심력을 가하는 장치는 도 2에 나타나 있다. 도 2를 보면, 상기 장치는 고정 수단(30)와 회전판(40)을 수직으로 연결하는 지지수단(50)를 포함하고, 회전판(40)에는 고정수단(60)이 수평으로 고정되어 있고, 고정수단(60)의 양 끝에 수직방향으로 종양세포 검출 칩(10)을 고정시키는 챔버 형태의 지그(zig)(20)를 포함할 수 있다.

상기 종양세포 검출 장치는, 상기 시료 투입구(102)를 통하여 챔버(108) 내부로 기체를 주입하고, 항체와 반응하지 않은 미반응 세포를 시료 배출구(104)로 배출시키는 기체주입기를 더 포함할 수 있다. 기체 주입기는 예를 들어, 시린지(syringe) 펌프일 수 있다.

상기 미반응 세포는 항체와 반응하지 않은 세포를 말하고, 비종양세포일 수 있다. 상기 비종양세포는 예를 들어, 적혈구, 백혈구, 림프구 등이 있다.

상기 기체는 공기, 질소 또는 비활성기체일 수 있다.

본 발명은 종양세포를 포함하는 시료를 상기 종양세포와 특이적으로 결합하는 항체에 가한 후 원심력을 가하여 종양세포와 항체를 반응시키는 단계를 포함하는 종양세포 검출 방법을 제공한다.

본 발명자들은 CTC를 검출하기 위해 종양세포의 세포막에 작용하는 특정 항체를 사용하였다. 그리고 이 항체와 종양세포의 세포막과의 점착을 증대시키기 위해 원심력을 이용해 큰 압력을 발생시켜 종양세포와 항체가 잘 붙도록 하였다. 도 3(b)를 보면 원심력을 가한 후 시료 안의 모든 세포가 원심력이 가해진 방향으로 향하게 되므로 원심력이 가해지는 방향에 위치한 항체에 종양세포가 더 잘 결합되는 것을 알 수 있다. 본 발명은 항체와 종양세포의 세포막과의 점착력 증대를 위해 종래의 미세 구조를 사용한 방법에 비하여 항체와 종양세포 세포막과의 점착력을 10배 가까이 증가시켰다.

일반적으로 CTC는 희박하기 때문에 검출하기 위해 많은 량의 샘플이 요구된다. 이때 대량의 샘플을 빠르게 처리하기 위해 본 발명은 대량의 시료를 한 번에 주입하는 방법을 사용하였다. 종래의 종양세포의 검출을 위한 방법들은 아직 문제점들이 많다. 우선 가장 많이 쓰이는 방법으로 항체/항원 반응을 이용한 검출을 살펴보면: 미세 장치의 구조에서 미세 유동을 이용해 세포의 점착력과 세포 주위의 유체 전단력을 이용한 방법과 자와 비드가 붙여진 항체를 세포에 붙여서 전자석을 이용해 분리시키는 방법이 있으며, 항원/항체반응에 특별한 단백질을 추가로 사용한 방법이 있다. 그러나 이 방법들은 몇 가지 문제점들이 있다. 우선 미세장치나 구조를 이용한 방법들은 낮은 유동 속도에 의해 샘플의 처리 시간이 오래 걸린다(1 ml 기준 2시간 이상). 또한 종양세포들을 항체가 코팅된 미세 구조에 충돌시키는 힘도 작다. 이 힘이 커져 버리면 유동이 빨라져야 하는데 그러면 점착된 종양세포마저 떨어지게 된다. 미세 유동을 사용하지 않는 마그네틱 비드를 이용한 방법도 자화된 비드가 필요하며 항체와의 결함을 위해 인큐베이딩 시간이 필요하다. 게다가 후속 실험에서도 이 자화된 비드가 붙어있어 영향을 준다.

종래의 종양세포의 검출방법 중 항체를 쓰지 않는 방법으로는 종양세포의 크기를 이용한 필터링 방법과 세포막의 점착 특성을 이용해 장치 내 특수한 표면 구조를 이용한 방법이 있다. 그리고, 항체/항원 대신 압타모를 이용한 점착방법이 있다. 마지막으로 종양세포 세포막의 전기적 특성을 이용해 종양세포를 구별하는 방법도 있다. 하지만 이 방법들도 여전히 문제는 남아있다. 먼저 필터링 방법은 종양세포가 일반적으로 백혈구에 비해 큰 것을 이용하나 종양 세포들의 다양한 크기로 인해 순수도가 낮아질 수 있다. 즉 일반 혈액 세포와의 분리가 쉽지 않다. 표면구조를 이용한 방법은 낮은 속도의 미세유동을 사용하기 때문에 검출 시간이 오래 걸리며, 장치 제작이 복잡해진다. 압타모를 이용한 방법은 사용할 수 있는 압타모의 종류가 희박하며, 압타모와 종양세포 세포막의 반응 시간이 소요되어서 검출 시간이 길어진다. 마지막으로 종양세포 세포막의 전기적 성질을 이용한 방법은 세포를 변화시키거나 손상을 가하므로 후속 실험에서 온전한 세포를 쓸 수가 없다.

본원발명의 검출방법은 상기 필터링 방법에서의 순수도가 낮아지는 문제, 검출시간이 오래 걸리거나 장치 제작이 복잡해지는 문제, 세포가 손상되는 문제를 모두 해결한 방법이다.

본원발명에서 원심력을 사용한 것은 종양세포막과 항체의 점착에 좀 더 도움을 주며, 공기를 이용한 혈액 세포 분리는 검출 시간을 줄이는 장점이 있다.

종양세포와 항체와의 반응을 높이기 위해 종래 방법에서는 세포가 유동하는 표면에 미세 구조를 배치하고 그 표면에 항체를 코팅하였다. 이때 미세 유동 자체에서는 샘플의 유동 속도가 작아 점착에 도움을 주는 압력이 작게 되는 문제가 있다. 그러나 본원발명의 방법에서, 항체가 고정된 기판이 위치한 방향으로 원심력을 작용시키면 압력이 크게 증가하여 세포가 원심력이 가해지는 방향으로 더 쉽게 이동할 수 있는 효과가 있다. 즉, 세포의 포획방법에 있어서, 항체와 더불어 물리적인 압력이 도움을 줄 수가 있다. 이는 도 5(a)에서처럼 단순한 중력과의 비교에서도 알 수 있다. 실제 혈관 속에서의 높은 유속에 노출되는 CTC도 혈관 벽에 점착될 때 혈액의 유동 압력을 받을 것이다.

본 발명에서, 상기 원심력은 0.6 ~ 10G 일 수 있다. 0.6G 미만일 경우는 원심력이 약해 세포들이 빨리 이동하지 못하고, 10G를 초과하면 세포의 상태가 좋지 않아 포집된 종양세포의 순수도가 떨어진다.

상기 원심력은 1~10분간 가할 수 있다. 1분 미만이면 원심력을 가한 효과가 거의 없고, 10분 초과로 가하면 효과의 차이가 거의 없다.

상기 종양세포와 항체를 반응시키는 단계 이후에, 상기 시료에 기체를 가하여 미반응 세포를 배출시키는 워싱 단계를 더 포함할 수 있다. 도 3(c)를 보면, 기체 워싱에 의해 항체와 반응하지 않은 미반응 세포가 배출되는 것을 볼 수 있다. 상기 항체와 반응하지 않은 미반응 세포는, 비종양세포일 수 있다. 상기 비종양세포는 예를 들어, 적혈구, 백혈구, 림프구 등이 있다.

상기 종양세포 검출 방법에서 워싱 단계는 상기 종양세포 검출 장치를 이용하는 경우에는 시료 주입구(102)로 기체를 주입할 수 있다. 항체와 반응하지 않은 미반응 세포는 시료 배출구(104)로 배출될 수 있다.

상기 기체는 공기, 질소 또는 비활성기체일 수 있다.

공기의 유동을 이용한 계면장력과 전단력을 이용한 에어 워싱 방법은 세포에는 아무런 손상을 주지 않는 효과가 있다. 세포가 떨어져는 원인은 유체의 전단력뿐만 아니라 두 유체(샘플 액체, 공기 기체) 사이에서의 계면 장력도 관여할 것이다. 이때 물과 같은 동일한 성질의 유체인 액체로 워싱할 경우 계면 장력이 발생하지 않아 워싱의 효과가 거의 없다. 액체가 차 있는 용기의 벽면에 같은 액체가 아닌 기체를 흘리면 두 유체 사이에 계면 장력이 발생한다. 도 3(b)와 (c)에서 볼 수 있듯이, 벽면에 붙어 있는 세포 중 항체 효과에 의해 붙어 있지 않은 세포들은 이 계면장력에 의해 떨어지게 된다.　

낮은 속도에서는 세포가 떨어지지 않으므로 유체의 전단력이 더 많은 영향을 줄 것이다. 세포가 공기에 장기간 노출되면 세포가 죽거나 상태가 변하여 세포막과 항체 사이에서의 점착율이 떨어질 수 있으나 단기간 노출에서는 문제가 없었다.

만약, 원심력을 가한 방향과 반대 방향으로 회전시켜서 원심력을 가한다면, 이 힘이 면에 대해 전단력을 발생시킬 수 없다. 그러므로, 반대방향의 원심력으로 세포를 떼어내는 것은 매우 어려우며, 항체와 반응하지 않은 미반응 세포들을 선택적으로 제거하는 것이 불가능하다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 기체의 유량은 3 ~ 10 ml/hr 일 수 있다.

적용된 유량이 3 ml/hr 보다 낮으면 비종양세포가 잘 제거되지 않으며, 10 ml/hr 보다 높으면 종양세포도 제거되는 비율이 커진다. 도 6(c)를 보면 2ml/hr일 경우 종양세포의 예로 실험한 NSCLC 세포의 포집율이 90%정도이고, 비종양세포의 예로 실험한 저켓(Jurkat) 세포의 포집율이 20%가 넘는 것을 알 수 있다. 실제 혈액에서, 예를 들어, 혈액 시료 1ml의 경우 종양 세포인 CTC는 100개 미만으로 존재하고, 비종양세포들은 백만 개 이상으로 존재하므로, 비종양세포의 포집율이 20% 일 경우 현실적으로 CTC의 검출이 어려워진다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 기체의 유량은 시료 내의 세포 갯수를 알 경우 종양세포의 포집율에서 비종양세포의 포집율의 차이가 최대가 되는 유량이고, 상기 포집율은 하기 [수학식 1]로 나타낼 수 있다.

상기 비종양세포는 항체와 반응하지 않은 세포를 의미하고, 예를 들어, 적혈구, 백혈구, 림프구 등이 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 워싱 단계 이후에, 포집된 종양세포를 포집상태 그대로 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 종양세포 검출 칩(10)을 이용하여 종양세포를 포집한 경우, 종양 세포의 배양이 가능하다.

상기 종양세포의 배양은 3일 이상, 구체적으로는 5일 이상 배양할 수 있다. 3일 이상 배양하면 검출 칩(10)에 주입된 종양 세포의 수보다 더 많이 증식이 되었고, 5일 이상 배양하면 배지를 갈아줄 때마다 일반 혈액 세포가 제거되어 기판(106)에 순수한 종양세포만 남아있게 되기 때문이다.

포집된 종양세포를 배양해야 되는 이유는 이 세포의 숫자가 매우 적어서 PCR 검사와 같은 유전자 분석을 대량으로 못하기 때문이다. 종래의 종양세포를 검출한 칩에서 유전자 검사까지 할 수 있는 방법은 문제가 있다. 예를 들어, CTC의 경우 혈관을 통해 다른 기관으로 전이될 때 세포의 특성이 변한다. 그래서 이 특성을 유전자 분석을 통해 알아내야 한다. 또한 이러한 CTC는 기원 종양에서 나올 때 각 세포마다 다른 특성을 가지고 있어서 단일 세포 단위로 분석을 해야 한다. 하지만 기존의 종양세포 방법을 통해 검출된 세포의 양이 너무 적어서 단일 세포에서 대량의 PCR 검사를 할 수가 없는 문제점이 있다. 그래서 종양세포를 포획한 다음 단일 세포 각각을 복제 증식하여 분석해야 한다. 따라서, 본 발명은 칩에서 검출된 암 세포를 수거하지 않고 바로 배양할 수 있다. 희박하게 검출된 암세포라도 검출 칩에서 수거하지 않고 배양시키면 일반적인 종양세포처럼 매우 빠르게 증식된다. 이렇게 증식시킨 종양세포를 이용하여 좀 더 다양한 연구를 진행할 수 있다. 또한 이렇게 분석된 세포는 암 환자의 진단과 치료 방법에 많은 도움을 줄 것이다.

이하, 본 발명의 실험예를 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다. 이들은 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위해 예시적으로 제시한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이 실험예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가지는 자에 있어서 자명할 것이다.

[실험예 1] 종양세포 검출 칩 디자인과 표면 처리

실험에 사용된 종양세포 검출 칩(10)은 일반적으로 쓰이는 슬라이드 글라스 (3mm * 70mm)을 기판(106)으로 사용하고 샘플 챔버(108)는 PDMS로 제작하였다 (도 1). 이 챔버의 내부 크기는 1cm×6cm×0.5cm (W, L, H) 이며, 부피는 3ml이다. 챔버(108)의 높이는 사용될 샘플의 양에 따라 조절된다. 칩의 양쪽에 직경 2mm의 구멍을 뚫어 시료 주입구(102)와 시료 배출구(104)를 형성시켰다. 이 칩(10)의 특징은 샘플 전체를 한 번에 검출 표면에 반응시키는 것이다. 그래서 항체가 코팅될 기판(106)의 표면적은 최대 1.9×10⁶개의 세포 면적으로 제한된다. 이 숫자는 적혈구를 제외한 1ml 샘플 용액에 들어있는 모든 세포의 수를 충분히 수용할 수 있다. 항체가 코팅될 기판(106)의 표면은 SAM(S-Adenosyl-L Methionine) 처리를 하였다.

먼저 APTES(AminoPropylTriEthoxySilane)를 에탄올(ethanol)에 1% 농도로 희석을 시킨 용액에 30분간 반응시켰다. 그 다음 르 샤틀리에(Le Chatelier) 반응을 시키기 위해 80℃ 핫플레이트에 1시간 노출시켜 에탄올을 증발시켰다. 이렇게 처리된 기판(106)의 표면을 Glutaraldehyde를 D.W.(Distilled Water) 에 3% 비율로 희석된 용액에 1시간 동안 넣어두어 표면에 단백질이 붙을 수 있게 하였다. 다음으로 1X PBS(Phosphate Buffered Saline)와 D.W 에 세척하였다. 이렇게 만들어진 기판(106)의 표면에 항체 EpCAM(epithelial cell adhesion molecule)을 PDMS에 10ug/ml 비율로 희석하여 30분 동안 코팅하였다. 마지막으로 1% BSA에 1시간 동안 넣어두었다. 마지막으로 1X PBS로 세척하였다.

항체 EpCAM 은 CTC 에 특이적으로 반응하는 항체이다. 또한, 인간 종양세포인 NSCLC(Non-small-cell lung carcinoma)세포에도 특이적으로 반응하는 항체이다. 본 실험에서는 CTC로서 NSCLC 세포를 사용하였다.

[실험예 2] 세포 배양 및 샘플 준비

종양세포인 인간 NSCLC 셀 라인 NCI-H1650을 습기 하에서, 5% CO₂, 37 ℃에서 10% 우태아혈청, 1.5mM L-glutamine 을 함유하는 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. 바람직한 세포 농도를 PBS로 세포 현탁액을 연속으로 희석하여 준비하였다. 세포 생존력을 살아있음/죽음 생존력 분석으로 결정하였다. 이 분석은 살아 있는 세포의 세포 내 에스테라제 활성과 죽은 세포의 원형질막 통합에 기초한 것이다. 요약하자면, 포집된 CTCs를 PBS에서 준비된 2 mM calcein FITC 및 4 mM PI (Proliferation Index) 의 용액에서 30분 동안 실내온도에서 배양하였다. 배양 후에, 칩을 1X PBS 1 ml 로 워싱하였고, 현미경하에서 관찰하였다. 염색된 세포는 전혈에서 표시되었다.

혈액 샘플은 IRB-승인 프로토콜 하에서 한국과학기술연구원에서, 종양이 없고, 동의를 얻은 건강한 공여자로부터 얻었다. 모든 혈액 시료는 항응고제 EDTA를 포함한 vacutainer 튜브로 수집되었고, 24시간 이내에 진행되었다. 샘플을 수집하고 나서, 샘플을 처리하는 동안에, 전혈 표본에서 세포가 침전되는 것을 막기 위해 4 ℃의 락킹 플랫폼에 저장하였다.

[실험예 3] CTCs를 검출하기 위한 면역형광 염색

장치 내에서 20분 후에, 포집된 세포를 PBS에서 4% PFA 1ml를 흘려서 고정시켰다. 연속적으로 칩을 PBS 에서 30 min 동안 0.2% Triton X-100 1 ml 용액으로 워싱하고 나서 세포내 투과를 유도하고 세포 내 염색을 하였다. 어떠한 결합된 비종양세포인 Jurkat 세포나 림프구를 동정하기 위해, 1 ml의 anti-CD45FITC stock solution (1 ml의 PBS 에서 50 ml의 antibody stock solution)를 칩에 2시간 동안 통과시키고 나서, 항체를 제거하기 위해 PBS로 세척하였다(도 4e). 상피세포를 동정하기 위해, 1 ml의 anti-cytokeratinPE stock solution (1 ml의 PBS에서 50 ml의 antibody stock solution)를 칩에 2시간 동안 통과시키고 나서, 항체를 제거하기 위해 PBS로 세척하였다(도 4b). 마지막으로, 세포핵의 동정을 위해 1ml 의 DAPI solution (1 ml의 탈이온수에 4 ml의 DAPI 시약)을 칩에 5분간 통과시키고 나서, PBS로 세척하였다(도 4a, d). 칩을 매니폴드로부터 제거하여 닦아서 유체 포트 근처에서 건조시키고 이미징하기 전까지 빛이 없는 곳에서 저장하였다. Biotinylated mouse anti-human anti-EpCAM를 R&D 시스템에서 얻었다. 인간 NSCLC(Non-small-cell lung cancer) 셀 라인 NCI-H1755A, prostate 셀 라인 Jurkat clone E6-1 셀 라인은 한국 셀 라인 은행에서 구입하였고, RPMI-1640 성장 배지는 Invotrogen에서 구입하였다. Jurkat 세포는 급성 백혈병의 T림프구 세포의 immortalized line으로서, 종양세포를 포집하기 위하여 본 실험에서 사용한 항체인 EpCAM 와 반응하지 않으므로, 비종양세포의 예로서 사용하였다. anti-cytokeratin PE(CAM 5.2, conjugated with phycoerythrin), CD45 FITC, 형광 핵산 염색 시약 49,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) 는 BD Biosciences에서 구입하였다.

상기 면역 형광 염색 결과는 도 4에 나타내었다. 도 (a) ~ (C)는 NSCLC 세포이며, (d) ~ (e)는 Jurkat 세포이다. (a)와 (d)는 DAPI로 염색한 세포의 모습이며, (b)는 CytokeratinPE로 염색한 모습이고, (e)는 CD45FITC로 염색한 모습이다. 도 (c)는 (a)와 (b)를 중첩한 세포 사진이고, (f)는 (d)와 (e)를 중첩한 세포 사진이다. 형광현미경의 배율은 모두 20X이다.

[실험예 4] 세포 포집을 위한 원심력 분석과 에어 계면(interfacial) 워싱

1. 방법

검출 칩에 원심력을 적용시키기 위해 전용 장치를 만들었다 (도 2). 이 장치는 50 ~ 650 RPM까지 가속을 할 수 있으며, 회전판 (r=55mm)(40) 위에는 칩(10)을 고정시킬 수 있는 챔버 형태의 지그(20)를 장착하였다. 원심력에 의해 세포가 표면 처리된 기판으로 움직이는 원리는 도 3에서 보여주고 있다. (a)는 종양세포 검출 칩(10)에 시료가 주입되었을 때의 모습이고, (b)는 원심력을 가했을 때 세포가 원심력이 가해지는 방향으로 이동했을 때의 모습이다. (c)는 워싱 단계에서 항체와 반응하지 않은 세포가 제거되는 모습을 나타낸 것이다.

RPMI-1640 성장 배지에 종양세포인 NSCLC 세포와 비종양세포인 Jurkat 세포를 동일한 양으로 종양세포 검출 칩(10) 내에 주입하고, 검출 칩(10)을 원심력 장치의 지그(zig)(20)안에 넣었다. 그 후 원심력을 가하여 검출 칩(10)이 회전되면 모든 세포는 원심력 방향으로 이동한다. 이렇게 세포들이 원심력 방향으로 이동하여 항체가 코팅된 기판(106) 위에 위치되면 NSCLC 세포는 항원/항체 반응에 의해서 기판에 점착하게 되며(도 3(b)), 항체과 반응하지 않은 Jurkat세포는 공기 세척에 의해 검출 칩의 시료 배출구로 배출되게 된다(도 3(c), 도 6(a)). 이러한 세척 방법은 일반적인 점착성 세포 배양 때도 오래된 배지를 갈아주기 위해 흡입을 할 때도 공기에 노출되기 때문에 세포의 생존에는 거의 영향을 주지 않는다. 공기를 주입하기 위해 실린지 펌프를 사용하였다. 이 실험에서 원심력에 의한 세포의 이동과 관련하여 중력의 영향에서 세포의 이동을 비교하였다. 결정된 원심력의 크기는 중력 실험에서 세포가 모두 침강할 정도이다. 또한 원심력의 세기에 의한 세포의 생존율도 테스트하였다. 상기 실험 결과는 도 5에 나타내었다.

2. 세포에 대한 원심력의 영향력

샘플 내 모든 세포가 검출 면으로 이동되는지 확인하기 위해 중력과 비교하였다. 동일한 양의 NSCLC 세포와 Jurkat 세포를 원심력과 중력 환경에서 테스트하였다. 도 5(a)는 각각 중력과 원심력의 환경 하에서 세포의 포획 정도를 나타낸 것이다. 모두 종양세포 검출 칩(10)에서 실험하였으며 워싱하기 전에 세포의 수를 세었다. 먼저 중력(1G) 의 경우 30분이 경과되어야 모든 세포가 검출 면으로 이동하였으나 300RPM (5.5G) 크기의 원심력 하에서는 10분 만에 세포들이 이동하였다 (도 5a). 중력 하에서 세포의 침강 속도보다 원심력을 이용한 세포의 이동이 좀 더 빠르다. 100RPM (0.6G)에서는 원심력이 약해 세포들이 빨리 이동하지 못하며, 600RPM (22.1G) 까지 올리면 세포들의 상태가 안 좋아진다. 도 5(b)는 원심력과 항체(EpCAM) 에 따른 세포들의 포획 정도를 나타낸 것이다. 원심력의 세기에 대한 세포의 검출율은 회전 속도와 비례하였으며, 항체가 코팅된 검출 면과 코팅하지 않은 면을 비교하면 NSCLC 세포의 검출율에서 차이가 났다 (도 5b). 즉, 항체가 코팅된 면에서 NSCLC 세포만 상대적으로 많이 검출되었다. Jurkat 세포는 항체에 관계없이 검출율이 낮았다. 도 5(c)에서는 실험 전과 원심력을 가한 후의 세포 생존율을 보여준다. 도 5(d)는 원심력에 노출되는 시간에 따른 세포의 포획 정도를 나타낸 것이다.중력의 10배 이상 (10G) 넘어서면 세포의 상태가 급격히 나빠지기 시작한다. 원심력의 적용시간은 10분 이상에서는 차이가 많이 나지 않았다(도 5d).

3. 에어 워싱

검출면인 항체가 고정된 기판(106)으로 이동한 세포 중에서 항체와 반응하지 않은 세포를 제거하기 위해 공기 세척을 하였다. 도 6(a)는 종양세포 검출 칩으로 검출되지 않은 세포를 배출하여 제거 할 때 기체를 사용하는 방법의 모식도이다. 청색 화살표가 가리키는 공간은 공기이며, 적색 화살표는 샘플이다. 그리고 청색 삼각형의 세포는 표면 항체에 붙어있는 NSCLC 세포이며, 적색 삼각형의 세포는 공기에 의해 제거되는 Jurkat 세포이다. 공기의 진행 방향은 오른쪽에서 왼쪽으로 흐른다. 도 6(b)는 공기의 주입 유량에 따른 칩 내부의 유체 속도를 나타낸 것이다. 공기의 유량에 따라 칩 내부의 속도도 증가하여 검출 면에 전단력을 발생시킨다. 여기에서는 사용된 공기의 유량은 4ml/hr이다. 이때 칩 내의 속도는 0.03m/s이다. 적용된 유량이 낮으면 Jurkat 세포가 잘 제거되지 않으며, 높으면 NSCLC 세포도 제거되는 율이 커진다. 도 6(c)는 공기의 유량에 따른 세포의 포획 정도를 나타낸 것이다. 상기 실험 결과 기판(106)의 표면 위에는 종양세포만 남게 된다.

[실험예 5] CTCs의 검출

1. CTCs의 포집율, 검출 비율 및 순수도

도 7(a)은 사용된 시료에서 주입된 NSCLC 세포에 대해 검출된 세포의 숫자를 나타낸 것이다. 실제 혈액 1ml 내에 CTC는 100개 미만으로 존재하므로 칩에 NSCLC 세포를 100~100000개를 주입하여 실험하였다. 그리고 Jurkat 세포는 모두 백만 개씩 주입하였다. 주입했을 때 포획된 세포의 숫자는 비교적 선형으로 집계되었다. 도 7(b)는 샘플에 희석된 NSCLC 세포의 포획 정도를 Jurkat 세포의 포획율과 비교하여 나타낸 것이다. 사용된 세포의 수는 NSCLC 세포는 10² ~ 10⁵개, Jurkat 세포는 10⁶개이다. 그러나 각각 주입된 세포에서 검출율은 35% ~ 75%로 차이가 났다(도 7(b)). 이렇게 결과가 나온 이유는 한정된 검출 면에서 많은 숫자의 NSCLC 세포가 골고루 퍼지지 못하기 때문이라 생각한다. 즉, 검출면이 무한정 넓어져도 세포들이 붙어 있으면 검출율이 안 좋아진다. 그러나 세포 수가 적으면 잘 모이지 않는다. 그러나 실제 암 환자에서 발견되는 세포 수의 범위에서는 70% 이상의 검출율을 보였다. 그리고 도 7(b)를 보면 Jurkat 세포는 모두 백만 개씩 주입하였으나 검출율은 1%를 넘지 못하였다. 이 테스트에서 순수도는 60%이다.

2. 전혈(Whole blood)에서의 CTC 검출 비율

마지막 실험으로 건강한 사람의 혈액에 임의로 CTC 대신 종양세포 NSCLC 세포를 섞어서 종양세포 검출 비율을 테스트해 보았다. 이 실험에서 혈액 속의 적혈구를 제거하지 않고 순수 혈액을 그대로 사용하였다. 임상 시험에서 채취한 샘플을 특별한 처리 없이 바로 적용할 수 있는 점도 본 발명의 종양세포 검출 칩의 장점이다. 이 혈액에 임의로 종양세포를 100개씩 섞은 후 검출 실험을 하였다. 도 8(a)는 1ml의 전체 혈액에 100개의 NSLCL 세포를 희석하였을 때 포획된 NSCLC 세포의 수를 나타낸 것이다. 그 결과, 45% 정도의 검출율을 보였다. 전혈을 희석해 사용하거나 적혈구를 제거하면 더 높은 검출 효과가 나올 것이다. 도 8(b)는 검출된 세포를 형광현미경으로 촬영한 것이다. 종양세포인 NSCLC 세포는 염색 시약인 cytokeratinPE와 반응하여 붉게 나왔고, 백혈구는 염색 시약 CD45FITC와 반응하여 녹색으로, 그리고 적혈구는 염색되지 않았다. 그리고 적혈구를 제외한 모든 세포는 DAPI에 의해 청색으로 염색되었다.전혈에 희석 용액을 섞으면 세척 단계에서 시간이 더 걸릴 것이다. 그러나 그 시간은 기존의 검출방법보다 덜 소요된다.

[실험예 6] 검출된 CTCs의 배양

1. 방법

항체와 원심력에 의해서 포획되고 공기 세척으로 분리된 종양세포를 본 발명의 검출 칩 내에서 바로 배양할 수 있는지 평가하였다. 대조군으로는 종래의 종양세포의 배양법과 비교하였다. 대조군은 종래의 일반적인 배양 용기에서 점착되어 자라고, 본 발명의 종양세포 검출 칩에서 포획된 종양세포는 슬라이드 글라스 위에 코팅된 항체 (EpCam)와 1% BSA 위에서 붙어서 자란다. 배지는 RPMI-1640 성장 배지를 사용하였다. 1일, 3일, 5일째 되는 날 각각 배양 상태를 확인하여 염색하고 세포 수를 세었다. 사용된 배지는 2일에 한번 갈아 주었다.

2. 칩에서 배양된 CTCs의 증식과 순수도 평가

도 9(a)는 일반적인 배양 용기에서 5일 동안 증식된 종양세포의 현미경 사진을 나타낸 것이다. 도 9(b)는 종양세포 검출 칩에서 5일 동안 배양된 종양세포의 점착된 영상이다. 검출 칩에서 배양된 포획된 종양세포는 5일이 지나도 잘 증식되었다. 세포들은 항체와 BSA에 코팅된 유리판 위에서 증식되어도 아무런 영향을 받지 않았다. 일반적인 배양 용기에서 붙어서 자란 종양세포와 비교했을 때 증식되는 속도는 50% 정도 느렸다. 도 9(C)와 도 9(d)는 검출된 NSLCL 세포와 Jurkat 세포를 1일에서 5일 동안 배양 후 각각 세포들의 검출 수와 NSLCL 세포의 순수도를 나타낸 그래프이다. 여기에 사용된 NSLCL 세포와 Jurkat 세포의 수는 각각 100개와 백만 개이다. 3일째부터는 검출 칩에 주입된 종양 세포의 수보다 더 많이 증식이 되었다. 그러나 일반 혈액 세포는 유리판 위에 계속 붙어 있지 못하고 배지를 갈아줄 때마다 떨어져서 그 수가 급격히 감소되었다. 그래서 5일 정도 배양시키면 혈액 세포는 거의 모두 떨어진다. 이로써 칩에는 순수한 종양세포만 남아있게 되었다. 도 9(e)와 도 9(f)는 NSLCL 세포가 100개 들어있는 혈액에서 포획하고 배양된 세포의 수에 대한 그래프이다. 도 9(a)와 도 9(b)에서 붉은 색의 크기 바(bar)는 50um이다.

도 10(a)는 칩의 검출 면에서 검출된 세포들이 차지하는 면적을 나타낸 것이다. 점착되는 세포들이 차지하는 면적이 검출 면보다 크지 않을 때의 이상적인 형태이다. 도 10(b)는 다양한 크기의 검출면적에 대해 세포들이 붙을 수 있는 수의 한계와 실제 포획된 세포의 검출율이다. 검출에 사용된 세포의 수는 백 만개이다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

10 : 종양세포 검출 칩
20 : 종양세포 검출 칩을 고정시키는 지그
30: 고정 수단
40: 회전판
50: 지지 수단
60: 고정 수단
102 : 시료 주입구
104 : 시료 배출구
106 : 표면에 항체가 고정된 기판
108 : 챔버

Claims (21)

1. 시료 중의 종양세포를 검출하는 종양세포 검출 장치로서,
   상기 종양세포 검출장치는 종양세포 검출 칩을 포함하고,
   상기 종양세포 검출 칩은 한 면에 항체가 고정된 기판; 및 상기 기판을 수용하는 챔버를 포함하는 것을 특징으로 하는 종양세포 검출 장치.
2. 제1항에 있어서,
   상기 종양세포 검출 칩은 상기 챔버에 형성된 시료 투입구 및 시료 배출구를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 종양세포 검출 장치.
3. 제1항에 있어서,
   상기 기판은 비특이적 반응 억제를 위한 물질로 표면 처리된 것을 특징으로 하는 종양세포 검출 장치.
4. 제3항에 있어서,
   상기 비특이적 반응 억제를 위한 물질은 소혈청 알부민(Bovine serum albumin: BSA) 또는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol: PEG)인 것을 특징으로 하는 종양세포 검출 장치.
5. 제1항에 있어서,
   상기 종양세포 검출 장치는,
   상기 종양세포 검출 칩에 원심력을 가하는 장치를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 종양세포 검출 장치.
6. 제5항에 있어서,
   상기 종양세포 검출 칩은 원심력이 가해지는 방향으로 항체가 고정된 기판을 위치시키는 것을 특징으로 하는 종양세포 검출 장치.
7. 제2항에 있어서,
   상기 종양세포 검출 장치는,
   상기 시료 투입구를 통하여 챔버 내부로 기체를 주입하여 미반응 세포를 시료 배출구로 배출시키는 기체주입기를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 종양세포 검출 장치.
8. 제1항에 있어서,
   상기 챔버의 용량은 1~8 ml인 것을 특징으로 하는 종양세포 검출 장치.
9. 시료 중의 종양세포를 검출하는 방법으로서,
   종양세포를 포함하는 시료를 상기 종양세포와 특이적으로 결합하는 항체에 가한 후 원심력을 가하여 종양세포와 항체를 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 종양세포 검출 방법.
10. 제9항에 있어서,
    상기 원심력은 0.6~10 G인 것을 특징으로 하는 종양세포 검출 방법.
11. 제9항에 있어서,
    상기 원심력은 1~10분간 가하는 것을 특징으로 하는 종양세포 검출 방법.
12. 제9항에 있어서,
    상기 시료의 양은 1~8 ml인 것을 특징으로 하는 종양세포 검출방법.
13. 제9항에 있어서,
    상기 종양세포는 순환종양세포(Circulating tumor cells: CTC)인 것을 특징으로 하는 종양세포 검출방법.
14. 제9항에 있어서,
    상기 종양세포와 항체를 반응시키는 단계 이후에,
    상기 시료에 기체를 가하여 미반응 세포를 배출시키는 워싱 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 종양세포 검출방법.
15. 제14항에 있어서,
    상기 기체의 유량은 3~10 ml/hr 인 것을 특징으로 하는 종양세포 검출방법.
16. 제14항에 있어서,
    상기 기체의 유량은, 시료 내의 세포 갯수를 알 경우 종양세포의 포집율에서 비종양세포의 포집율의 차이가 최대가 되는 유량이고, 상기 포집율은 하기 [수학식 1]로 나타내는 것을 특징으로 하는 종양세포 검출방법.
    [수학식 1]
    

    
17. 제14항에 있어서,
    상기 기체는 공기, 질소 또는 비활성기체인 것을 특징으로 하는 종양세포 검출방법.
18. 제14항에 있어서,
    상기 워싱 단계 이후에,
    포집된 종양세포를 포집 상태 그대로 배양하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 종양세포 검출방법.
19. 제18항에 있어서,
    상기 배양은 3일 이상인 것을 특징으로 하는 종양세포 검출방법.
20. 제18항에 있어서,
    상기 배양은 5일 이상인 것을 특징으로 하는 종양세포 검출방법.
21. 제1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 종양세포 검출 장치를 이용하는 것을 특징으로 하는 종양세포 검출방법.

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