DE68915744T2

DE68915744T2 - Kapillarelektrophorese durch Vakuuminjektion.

Info

Publication number: DE68915744T2
Application number: DE68915744T
Authority: DE
Inventors: Hermanus H Lauer; Douglass Mcmanigill
Original assignee: Hewlett Packard Co
Current assignee: Agilent Technologies Inc
Priority date: 1989-05-01
Filing date: 1989-12-04
Publication date: 1994-12-01
Anticipated expiration: 2009-12-05
Also published as: EP0395796B1; US5326445A; US5447611A; JPH02302660A; EP0395796A1; DE68915744D1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren gemäß dem ersten Teil des Patentanspruchs 1. Ein solches Verfahren ist aus der Zeitschrift Analytical Chemistry, A, Band 60, Nummer 7, April 1988, Columbus US, Seiten 642-648; Rose D. J. und andere: "Characterization and Automation of Sample Introduction Methods for Capillary Zone Electrophoresis" bekannt.
Chemische Analysen von komplexen organischen Strukturen machten beachtenswerte Fortschritte in der Biotechnologie möglich. Die Biotechnologie schaffte Techniken zur Herstellung von lebenserhaltenden Arzneimitteln und anderen Produkten, die ansonsten knapp wären, wenn man sich auf natürliche Quellen verlassen müßte. Zusätzlich sind gänzlich neue medizinische Produkte in der Entwicklung, die bisher unheilbare Krankheiten hemmen und heilen können. Die Biotechnologie verspricht neue Produkte für die Landwirtschaft, die die anwachsende Weltbevölkerung mit Nahrung versorgen werden, und die die Möglichkeit von zu Hungersnöten neigenden Ländern verbessert, sich selbst zu erhalten.
Die chemische Analyse von biologischen Proben schließt im wesentlichen die Trennung der Proben in Komponenten zur Identifikation und zum mengenmäßigen Nachweis ein. Die Kapillarzonenelektrophorese (CZE = Capillary Zone Electrophoresis) ist eines aus einer Klasse von Verfahren, bei denen die unterschiedlichen Komponenten innerhalb einer engen Kapillare mit jeweiligen und unterschiedlichen Raten derart bewegt werden, daß die Komponenten in getrennte Zonen geteilt werden. Die getrennten Zonen können innerhalb der Kapillare oder außerhalb der Kapillare durch Zulassen, daß die Komponenten aus der Kapillare zur nacheinanderfolgenden Erfassung entweichen, untersucht werden. Bei der CZE wird eine Probe an einem eingangsseitigen Ende einer sich der Länge nach erstreckenden Kapillare eingebracht, und in Richtung eines ausgangsseitigen Endes bewegt. Elektroden mit unterschiedlichen Potentialen an jedem Ende der Kapillare erzeugen die elektrischen Kräfte, die die Probenkomponenten in Richtung des ausgangsseitigen Endes der Kapillare bewegen. Diese Bewegung schließt zwei verschiedene Komponenten ein, eine aufgrund des elektro-osmotischen Flusses und die andere aufgrund der elektrophoretischen Wanderung.
Eine Anwendung der CZE ist es, die absolute Konzentration einer Probenkomponente in einer Probenlösung zu bestimmen. Die Menge einer Probenkomponente, die aus einer Trennsäule eluiert kann durch integrieren ihrer Erfassungsspitze, um die Fläche, die durch die Komponente dargestellt wird, zu bestimmen, bestimmt werden.
Die Menge der Probenlösung, von der die Komponentenmenge getrennt wurde, kann jedoch nicht leicht nachgeprüft werden. Die Probleme des Erhaltens von genauen Probenvolumeneinleitungen wurde in "Theory, Instrumentation and Applications of Capillary Zone Electrophoresis" durch Krynn DeArman Lukacs, einer Dissertation, die 1983 an der University of Carolina at Chapel Hill eingereicht wurde, studiert. Diese Dissertation untersuchte die elektrostatische Einleitung, unter Verwendung des gleiches Mechanismusses, der für die CZE zur Probentrennung verwendet wird, und folgerte, daß eine genaue Volumensteuerung aufgrund der unterschiedlichen elektrophoretischen Beweglichkeit der Abtastkomponenten nicht erreichbar ist. Verschiedene hydrostatische Einleitungen wurden durchgeführt, im wesentlichen unter Verwendung von Spritzen, aber Konvektionsstörungen und parabolische Flußprofile beeinflußten die Probenverteilung in der Säule nachteilhaft. Die Probe sollte in der Form eines kompakten zylindrischen Stöpsels an dem Säulenkopf sein. Andere Formen und Verteilungen führen zu breiteren Eluierungsbändern und folglich zu einer schlechteren Erfassungsempfindlichkeit.
Versuche, die Probenmengen durch die erfaßten Spitzen zu bestimmen, hatten begrenzten Erfolg. Es ist nicht realisierbar, eine Gesamtprobenmenge durch Integration über alle Eluierungsspitzen zu bestimmen. Es ist möglich, eine bekannte Menge einer identifizierbaren Komponente in eine Probenlösung einzubringen und die Fläche ihre Spitze zu verwenden, um das getrennte Volumen zu bestimmen. Die Einbringung der indentifizierbaren Komponente in die Probenlösung muß jedoch sorgfältig gesteuert werden, wenn nützliche Ergebnisse erhalten werden sollen. Problematischer ist die Auswahl der identifizierbaren Komponente, die eine Spitze haben muß, die auf die Abtastkomponentenspitzen keinen Einfluß hat. Oft ist ein Probedurchlauf notwendig, um die Erfassungsgebiete ohne Spitzen zu finden, um die Probe auszuwählen. Dies ist unerwünscht aufwendig.
Das Problem der vorliegenden Erfindung ist es, ein praktisches, zuverlässiges und genaues Verfahren zum Bestimmen der absoluten Konzentrationen von Probenkomponenten in einer Probenlösung zu bestimmen.
Dieses Problem wird durch das Verfahren nach Anspruch 1 gelöst.
Bei einem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird eine nachgiebige Druckdifferenz über eine Trennsäule angelegt, während ihr Einlaß in einer Probenlösung ist, derart, daß die Probenlösung in die Säule eingeführt wird. Das Profil der Druckdifferenz gegenüber der Zeit ist derart ausgewählt, daß ein erwünschtes Volumen der Probenlösung eingeführt wird. Druck und Zeit werden mit ausreichender Präzision gesteuert, um eine Wiederholbarkeit bezüglich des Volumens von 5 Prozent, und bevorzugterweise innerhalb 1 Prozent, zu liefern. Die Druckdifferenz ist ausreichend gering und die Zeitdauer ist ausreichend lang, daß ein annehmbares Geschwindigkeitsprofil erreicht werden kann. Diese und andere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung sind aus der folgenden Beschreibung mit Bezug auf die folgender Zeichnungen offensichtlich.
Fig. 1 ist ein schematisches Diagramm eines Kapillarzonenelektrophoresesystems in Übereinstimmung mit der Erfindung.
Fig. 2 ist ein schematisches Diagramm eines alternativen Probeneinführungssystems in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung.
Fig. 3 ist ein schematisches Diagramm eines weiteren alternativen Probeneinführungssystems in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Kapillarzonenelektrophoresesystem (CZE-System) 100 ein Probenreservoir 102, das eine Probenlösung 104 enthält, ein Elektrolytreservoir 106, das ein Trägerelektrolyt 108 enthält, ein Abwasserreservoir 110, das ein Abwasserelektrolyt 112 enthält, eine kapillare Trennsäule 114, einen Detektor 116, eine Leistungsversorgung 118, eine positive Elektrode 120 innerhalb des Elektrolytreservoirs 106, eine negative Elektrode 122 innerhalb des Abwasserreservoirs 110, und einen Vakuumabschnitt 124, wie in Fig. 1 gezeigt ist. Der Vakuumabschnitt 124 schließt ein Hauptrohr 126, ein Bypass- Rohr 128, ein Ventilationsrohr 130, ein Manometer 132, ein Drei-WegeVentil 134, eine Präzisionsvakuumsteuerung 136, einen Zeitgeber 138 und eine Vakuumpumpe 140 ein. Die kapillare Säule 114 schließt ein Einlaßende 142 an einem Säulenkopf 144 und ein Auslaßende 146 ein, das innerhalb des Abwasserelektrolyts 112 angeordnet ist.
Das System 100 unterscheidet sich von herkömmlichen CZE-Systemen durch seine Bereitstellung einer Vakuumeinführung einer Probenlösung 104 in die Trennsäule 114. Vor der Probeneinführung wird das Einlaßende 142 in das Elektrolytreservoir 106 derart eingeführt, daß das Trägerelektrolyt 108 verwendet werden kann, um die Trennsäule 114 zu spülen und zu füllen. Dieses Füllen und Spülen wird durch ein relativ starkes Vakuum, das durch die Vakuumpumpe 140 erzeugt wird, vereinfacht, während das Ventil 134 das Bypass-Rohr 128 mit dem Abwasserreservoir 110 koppelt.
Das Einlaßende 142 wird dann in das Probenreservoir 102 eingeführt, das an seinem oberen Ende gegenüber dem Atmosphärendruck offen ist. Die Präzisionsvakuumsteuerung 136 stellt ein vorbestimmtes, relativ schwaches Vakuum ein, das hydrodynamisch mit dem Auslaßende 146 über das Hauptrohr 126 und das abgedichtete Abwasserreservoir 110 durch Schalten des Ventils 134 gekoppelt ist. Der Zeitgeber 138 wird initialisiert, wenn das Ventil 134 geschaltet wird, um die Präzlsionsvakuumsteuerung 136 zu koppeln, und veranlaßt die Steuerung 136 dann, auf das Ventilationsrohr 130 zu schalten, nachdem eine vorbestimmte Zeit vergangen ist.
Das Koppeln des Ventilationsrohres 130 mit dem Abwasserreservoir 110 entfernt die Druckdifferenz entlang der Säule 114. Sobald die Druckdifferenz entfernt ist, wird das Einlaßende 142 in das Elektrolytreservoir 106 eingeführt und die Leistungsversorgung 118 wird derart eingeschaltet, daß das Trägerelektrolyt 108 von dem Elektrolytreservoir 106 durch die Säule 114 zu dem Abwasserreservoir 110 fließt, wobei eine Probentrennung, die in CZE-Fachkreisen bekannt ist, bewirkt wird. Der Detektor 116 erfaßt die Eluierungsspitzen, wenn sie seriell durch die Säule 114 wandern.
Die Drücke und die Zeiten, die zur Probeneinführung verwendet werden, sind ausgewählt, um sicherzustellen, daß das korrekte Volumen der Probenlösung in den Säulenkopf 144 eingeführt wird. Abhängig vom Säulendurchmesser, der zwischen 10 um bis 100um liegen kann, können Druckdifferenzen von etwa 1 cm Wassersäule bis in die Nähe von 15 m Wassersäule zur Probeneinführung verwendet werden, mit Einführungszeiten zwischen 1 Sekunde und etwa 50 Sekunden. Längere Einführungszeiten stellen flachere Geschwindigkeitsprofile über einen Durchmesser des Kopfes 144 sicher, wobei zurückgehende Rückläufe die längsten Zeiten einstellen. Folglich sind Einführungszeiten von 3 - 20 Sekunden bevorzugt.
Eine präzise Volumensteuerung ist wichtig, um die erforderte Wiederholbarkeit zu erhalten, um die absolute Konzentration einer Probe in einer Probenlösung zu bestimmen. Die durchschnittlichen Druckunterschiede sollten innerhalb 5 Prozent der Nominalpegel, und bevorzugterweise innnerhalb 1 Prozent, haltbar sein. Eine solche Steuerung ist durch Verwendung eines Veriflow BPR40 "Back Pressure Regulator" erreichbar, der für eine Vakuumanwendung modifiziert wurde. Alternativ ist ein geeigneter Präzisionsvakuumregulator von Testcom erhältlich.
Der erwünschte mittlere Druck kann durch Halten eines konstanten Druckes auf dem erwünschten Mittelpegel hergestellt werden. In diesem Fall ist es wichtig, die Übergangszeiten beim Start und beim Ende des Probeneinführungsvorganges zu minimieren. Der Übergang auf den erwünschten Druckunterschied kann durch Einschließen eines Volumens mit der Präzisionsdrucksteuerung 136 beschleunigt werden, indem ein erwünschter Druck hergestellt wird, bevor die Verbindung mit dem Abwasserrevoir 110 hergestellt wird. Das Volumen dient als Puffer, wenn der Vakuumverlust vernachlässigbar ist, wenn die Verbindung mit dem Abwasserreservoir 110 hergestellt wird. Ein schnelles Rückkehren auf Atmosphärendruck beim Ende der Probeneinführung wird wirksam durch die Umschaltung auf das Ventilationsrohr 130 gehandhabt.
Ein alternatives Trennsystem 200 schließt ein Probenreservoir 202, das eine Probenlösung 204 hält, ein Abwasserreservoir 206, das ein Abwasserelektrolyt 208 hält, eine Trennsäule 210 mit einem Detektor 212, eine Druckeinrichtung 214 und eine Steuerung 216 ein, wie in Fig. 2 gezeigt ist. Die Druckeinrichtung 214 ist mit beiden Reservoiren 202 und 206 verbunden, um eine Druckdifferenz dazwischen herzustellen. Diese Druckdifferenz kann durch unter Druck setzen des Probenreservoirs 202 durch Anlegen eines Vakuums an das Abwasserreservoir 206, oder durch andersartige Herstellung des erforderlichen Druckunterschiedes hergestellt werden. Die Steuerung 216 reguliert die Druckeinrichtung 214, um das Druckprofil gegenüber der Zeit beizubehalten, das erforderlich ist, um das erwünschte Probenvolumen einzuführen, während das Geschwindigkeitsprofil gegenüber dem Säulendurchmesser minimiert wird.
Die Beachtung der Übergangszeiten wird durch Einbeziehen des gesamten Druckprofils gegenüber der Zeit verhindert. In diesem Fall ist es nicht notwendig, schnelle Übergänge oder konstante Drücke zwischen den Übergängen sicherzustellen. Das Profil kann derart ausgewählt werden, daß das erwünschte Integral der Drücke über die Zeit den Wert hat, der für die erwünschte Volumeneinführung erforderlich ist. Tatsächlich können einige Turbulenzen durch Verwendung allmählicher Druckübergänge vermieden werden.
Ein weiteres Trennsystem 300 schließt ein Probenreservoir 302, das eine Probenlösung 304 hält, ein Abwasserreservoir 306, das ein Abwasserelektrolyt 308 hält, eine Trennsäule 310 mit einem Detektor 312, eine Anhebungseinrichturg 314 und eine Steuerung 316 ein, wie in Fig. 3 gezeigt ist. In diesem Fall wird die erwünschte hydrodynamische Einführung der Probenlösung 304 in die Säule 314 durch Anheben des Probenreservoirs 302 relativ zu dem Abwasserreservoir 306 bewirkt. Die Steuerung 316 reguliert die Höhendifferenz durch Steuerung der Anhebungseinrichtung 314, wobei das Probenreservoir 312 auf die Ebene des Abwasserreservoirs 306 zurückkehrt, sobald das erwünschte Abtastvolumen eingeführt wurde.
Die vorliegende Erfindung schafft sehr wiederholbare Trenntechniken, derart, daß absolute Komponentenkonzentrationen bestimmt werden können. Viele Änderungen und Modifikationen der offenbarten Ausführungsbeispiele sind für die vorliegende Erfindung vorgesehen, deren Umfang lediglich durch die folgenden Patentansprüche beschränkt ist.

Claims

1. Ein Verfahren zum Einfüllen einer Probe in eine Trennsäule (114), das folgende Schritte aufweist:

Einführen eines Einlaßendes (142) der Säule (114) in eine Probenlösung (104); und

Anlegen eines ersten Vakuums an ein Auslaßende (146) der Säule,

gekennzeichnet durch

Füllen der Trennsäule mit Elektrolyt unter einem zweiten, relativ starken Vakuum, bevor das Einlaßende (142) in die Probenlösung (104) eingeführt wird, und

Anlegen eines relativ schwachen ersten Vakuums an das Auslaßende (146), bis ein vorbestimmtes Volumen der Probenlösung durch das Einlaßende eingeführt ist.

2. Das Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch Eluieren der Probenlösung (104) durch die Säule (114) derart, daß Komponenten der Probenlösung getrennt werden.

3. Das Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Vakuum abgeschwächt ist, während die Komponenten getrennt werden.

4. Das Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Vakuum entfernt wird, während die Komponenten getrennt werden.

5. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein elektrisches Potential zwischen dem Einlaßende (142) und dem Auslaßende (146) angelegt wird, nachdem die Probenlösung (104) eingeführt wurde, derart, daß die Komponenten der Probenlösung getrennt werder können.

6. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem der Pegel des ersten Vakuums reguliert wird.

. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem die Säule (114) eine Kapillarröhre ist.

8. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem das erste Vakuum auf einem Pegel zwischen etwa 1 ubar (1 cm Wassersäule) und 1 bar (10 m Wassersäule) gehalten wird.

9 Das Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das erste Vakuum innerhalb von 5 Prozent eines vorbestimmten Druckdifferenzwertes zwischen dem Einlaß und dem Auslaß gehalten wird.

10. Das Verfahren nach Anspruch 9, bei dem das erste Vakuum innerhalb eines Prozents des vorbestimmten Druckdifferenzwertes gehalten wird.

11. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das erste Volumen für einen vorbestimmten Betrag an Zeit beibehalten wird, bevorzugterweise zwischen 1 und 50 Sekunden und noch bevorzugterweise zwischen 3 und 20 Sekunden.