DE2551923A1

DE2551923A1 - Elutionszentrifuge und verfahren zur durchfuehrung einer gegenstromchromatographie unter verwendung der elutionszentrifuge

Info

Publication number: DE2551923A1
Application number: DE19752551923
Authority: DE
Inventors: Yoichiro Ito
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1975-07-22
Filing date: 1975-11-19
Publication date: 1977-02-10
Also published as: JPS5215393A; US3994805A; JPS5855454B2

Description

MÜLLER-BORE · GROENING · BEUFEL · SCHÖN · HERTEL

PATENTAIfWlLTE

DR. WOLFGANG MÜLLER-BORi HANS W. GROENING, D1PU.-ING. DR. PAUU DEUFEU. D1PL.-CHEM. DR. ALFRED SCHÖN. DIPU.-CHEM. WERNER HERTEU, DIPU.-PHYS.

J 1298

19. NOV. 1975

Anmelder: Yoichiro ITO, 6003 Melvern Drive, Bethesda, Maryland

Elutionszentrifuge und Verfahren zur Durchführung einer Gegenstromcb.romatograph.ie unter Verwendung der Elutions-

zentrifuge

Die Erfindung betrifft die Trennung von Proben und insbesondere eine Durchlauf-Spiralen-Planetenzentrifuge sowie ein Gegenstromchromatographieverfahren, das unter Verwendung einer solchen Zentrifuge durchgeführt wird; die Erfindung betrifft insbesondere eine Zentrifuge, die eine spiralförmige Säule, die um einen Winkel gegenüber der Vertikalen geneigt ist, um die Zentrifugenachse umlauf en läßt und dabei dennoch die Säule in einer festen Orientierung hält, während sie sich um sich selbst dreht.

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SMÜNCHEST 80 · SIEBERTSTR. 4 · POSTFACH 86 0720 -KABEL·: HÜEBOPAT · TEL. {OSO) 4710 79 'TJBI₁HS 5-22 GSB

Trennverfahren, bei denen zwei nicht miteinander mischbare oder teilweise lösliche flüssige Phasen miteinander in Eontakt gebracht werden für die Übertragung einer oder mehrerer Komponenten werden als Flüssig-flüssig-Extraktion oder Lösungsmittelextraktion bezeichnet. In dem einfachsten F_alle werden dann, wenn zwei miteinander nicht mischbare Lösungsmittel, die einen gelösten Stoff enthalten, in einem Scheidetrichter geschüttelt und dann voneinander getrennt werden, die gelösten Stoffe zwischen den beiden Phasen verteilt. Bas Verhältnis zwischen der Konzentration des gelösten Stoffes in der oberen Phase und der Konzentration des gelösten Stoffes in der unteren Phase wird als Verteilungskoeffizient bezeichnet. Wenn der Verteilungskoeffizient der beiden Substanzen stark verschieden ist, ist zur Durchführung der Trennung nur ein 1—Stufen-Verfahren erforderlich. Wenn sich die Eigenschaften der Substanzen einander nähern (ähnlicher werden) _% nimmt der Unterschied zwischen ihren Verteilungskoeffizienten ab, so daß eine Mehrstufenextraktion oder -trennung erforderlich ist. Wenn diese im G-egenstrom durchgeführt wird, wird diese Methode als "Gegenstromverteilungsmethode" bezeichnet.

Eine andere Extraktionsmethode ist unter der Bezeichnung "Verteilungschromatographie" bekannt. Dieses Verfahren umfaßt einen kontinuierlichen Verteilungsprozeß zwischen sich bewegenden und stationären Phasen. Es sind bereits die verschiedensten Verfahren für die Verteilungschromatographie entwickelt worden, bei denen feste Träger, wie z.B. Cellulose, Siliciumdioxid, Aluminiumoxid oder Glas, verwendet werden, um eine Phase stationär · zu halten. Die körnige und poröse Hatur des festen Trägers ergibt eine enorme spezifische Oberfläche im Verhältnis zu dem Flüssigkeitsvolumen und unterteilt den freien Raum in Tausende von "Böden (plates)". In Jedem "Boden (plate)" ist der Verteilungsprozeß theoretisch beendet, so daß man einen Wirkungsgrad von bis zu Tausenden von "theoretischen Böden^li erhält. Die Affinität der festen Träger gegenüber dem gelösten Stoff kann Jedoch zu einem unerwünschten Adsorptionseffekt

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führen, der sich in dem Abfall der Elutionskurven der gelösten Stoffe zeigt. Wenn man mit einer sehr kleinen Menge von biologischen Eomponenten arbeitet, kann die Adsorption zu einem beträchtlichen Verlust oder zu einer Denaturierung der Eroben neüsen der Verunreinigung durch Fremdmaterialien, die aus dem Träger eluiert werden, führen.

Es wurde auch ein anderes Flüssig-Flüssig-Extraktionsverfahren entwickelt, das unter der Bezeichnung "Gegenstromehromatographie" bekannt ist. Dieses System ähnelt dem Gegenstromvertei— lungsverfahren insofern, als die beiden nicht miteinander mischbaren Phasen in einem rohrförmigen Raum aneinander vorbeigeführt werden. Es umfaßt jedoch einen kontinuierlichen ÜTicht-Gleichgewichts-Verteilungsprozeß, der mit der Chromatographie vergleichbar ist. Es wurde entwickelt, um eine hochwirksame Chromatographie Trennung sowohl im präparativen als auch im analytischen Maßstabe in Abwesenheit von festen Trägern zu erzielen. Durch Weglassen des festen Trägers treten jedoch eine Reihe von Problemen auf, die nachfolgend aufgezählt werden:

1.) die stationäre Phase muß in der Säule festgehalten werden, während die bewegliche Phase ständig eluiert wird; 2.) der Säulenhohlraum muß in zahlreiche Verteilungseinheiten unterteilt werden und die laminare Strömung, die von den Probestreifen ausgeht, muß vermindert werden; 3.) die Größe der Grenzfläche muß erhöht werden; 4-.) jede Phase muß durchgemischt werden, um den Massenüber— tragungswiderstand herabzusetzen.

Es sind bereits verschiedene Anordnungen für die Gegenstrom— Chromatographie entwickelt worden. In jedem System ist eine rohrförmige Säule so ausgebildet, daß sie eine Vielzahl von Abscheidern (Auffangeinrichtungen) bildet, welche die stationäre Phase in einem in Abschnitte unterteilten Muster festhält, während eine Gravitations- oder Zentrifugalkraft

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die Zwei-Phasen-Zustände aufrechterhält. Die relative spezifische Grenzflächengröße wird erhöht durch Verkleinerung des Rohrdurchmessers und/oder Erhöhung der Anzahl der Phasen— segmente pro Einheitslänge der Säule. In einigen Fällen wird ein wirksames Durchmischen durch eine Rotations— oder Kreiselbewegung der Säule erzielt, während die Grenzfläche durch die Gravitations- oder Zentrifugalkraft stabil gehalten wird.

Verschiedene Gegenstromchromatographie-Verfahr en sind in dem Artikel von Ito und Bowman in "Journal of Chromatographie Science", Band 8, Seiten 315 - 323, Juni 1970, beschrieben. Zu diesen Verfahren gehören die Helix-Gegenstromchromatographie, die Tropf chen-Gegenstromchromatograp hie und die Rotations- und Kreisel-Fächer-Gegenstromchromatographie.

Bei der Helix-Gegenstromchromatographie wird ein horizontales spiralförmiges Rohr mit einer Phase eines Zwei-Phasen-Flüssig— keitssystems gefüllt. Die andere Phase wird in ein Ende der Helix eingeführt und durch die erste Phase hindurchgeführt entsprechend der vertikalen Strömungsrichtung, was zu alternierenden Segmenten der beiden Phasen führt. Der ständige Strom führt zu einer Verdrängung der zweiten Phase nur im Hinblick auf- die stationäre erste Phase. Auf diese Weise stellt sich ein chromatographisches Flüssig-Flüssig-Verteilungssystem ein. Die in eine der Phasen eingeführten gelösten Stoffe werden entsprechend ihren relativen Verteilungskoeffizienten auf analoge Weise wie bei der konventionellen Flüssigchromatographie, jedoch in Abwesenheit eines festen Trägers, aufgetrennt. Die Gravitationskraft hält die untere Phase stationär, während die obere Phase hindurchgedrückt wird. Um den Gegenstromprozeß im Innern eines Rohres mit einem sehr kleinen Durchmesser und mit - einem Maximum an Windungen zu ermöglichen, ist eine Verstärkung des Gravitationsfeldes erforderlich. Dies wird durchVerwendung einer Zentrifuge erzielt.

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In einem Artikel von Ito et al in "Analytical Chemistry", Band 4-1, Seiten 1579-1584, Oktober-1969, ist ein solches Helix—Gegenstrom-Chromatographieverfahren beschrieben, in dem eine Spiral-Planetenzentrifuge verwendet wird. Diese Vorrichtung erteilt einem spiralförmigen Rohr eine planetarische Bewegung, so daß die Rotation des spiralförmigen Rohres extrem langsam ist im Vergleich zu doa Umlauf (revolution) In einem solchen System wird das Strömen (Fließen) jedoch schwierig wegen des Bedarfs an Rotationsdichtungen; deshalb wird die Trennung in der Regel innerhalb eines geschlossenen spiralförmigen Rohres durchgeführt. Probleme der Einführung der Probe und der Fraktionierung (Unterteilung) begrenzen jedoch die praktische Anwendung dieses Verfahrens.

Kürzlich sind zwei verbesserte Gegenstrom-Chromatographie-Verfahren vorgeschlagen worden, wobei in beiden Fällen ein gewundenes Rohr in einem Zentrifugalfeld verwendet wird.

Das eine ist die Durchlauf-Spiralplanetenzentrifuge mit einem vertikalen Rotor, wie es in der US-Patentschrift 3 775 beschrieben ist, und das andere ist die Elutionszentrifuge mit einem horizontalen Rotor, die in der US-Patentschrift 3 856 beschrieben ist. Versuche mit verschiedenen Zwei-Phasen-Lösungsmittelsysteme haben die spezifischen Merkmale gezeigt, die jedem dieser Systeme eigen sind. Der Vorteil des vertikalen Rotors besteht darin, daß innerhalb einer kurzen Trennzeit eine hochwirksame Verteilung erzielt wird durch Erzeugung einer starken Phasendurchmisehung. Er hat jedoch den Nachteil, daß er die stationäre Phase einiger Phasensysteme mit niedriger Grenzflächenspannung, wie z.B. einiger Polymerphasensysteme, wegen der intensiven Emulgierung nicht aufrechterhält. Andererseits ergibt der horizontale Rotor ein stabiles Zentrifugalkraftfeld, welches Polymerphasensysteme aufrechterhält, es ist jedoch wegen des erhöhten Massenübertragungswiderstandes im allgemeinen eine längere Trennzeit erforderlich.

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Ziel der vorliegenden Erfindung ist es daher, die vorstehend geschilderten Nachteile der bekannten Verfahren und Systeme zu überwinden. Ziel der Erfindung ist es ferner, eine verbesserte Trennung des einen Materials von einem anderen Material zu erzielen. Ziel der Erfindung ist es insbesondere, ein verbessertes Verfahren zur chromatographischen Gegenstromtrennung anzugeben. Ziel der Erfindung ist es ferner, eine verbesserte Elutionszentrifuge anzugeben, die auf den verschiedensten Gebieten einschließlich der Gegenstromchromatographie eingesetzt werden kann.

Weitere Ziele, Merkmale und Vorteile der Erfindung gehen aus der folgenden Beschreibung hervor. Hauptmerkmal der vorliegenden Erfindung ist ein chromatographisches Gegenstromsystem, in dem ein Rotor verwendet wird, der eine gewundene Helix— säule in einem Winkel zwischen 10 und 45° gegenüber der Vertikalen festhält. Aufgrund der Vorteile und Fachteile der beiden bekannten verbesserten chromatographischen Gegenstromsysteme gemäß den US-Patentschriften 5 775 309 und 3 856 669 kam man zu der Überlegung, daß die verschiedenen Merkmale dieser beiden bekannten Systeme offensichtlich von dem unterschiedlichen Rotorwinkel bei beiden Systemen herrühren und daß demzufolge ein optimaler Rotorwinkel zwischen der vertikalen und der horizontalen Anordnung existieren muß, der eine universelle Anwendung der Lösungsmittel systeme unter Erzielung eines hohen Verteilungswirkungsgrades erlaubt.

Die beiliegende Zeichnung ist eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Elutions zentrifuge, teilweise in Form eines Aufrisses und teilweise in Form eines vertikalen Querschnittes.

Zum besseren Verständnis der Erfindung wird nachfolgend eine mögliche Ausführungsform der Erfindung unter Bezugnahme auf die beiliegende Zeichnung näher beschrieben, wobei die folgende

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detaillierte Beschreibung selbstverständlich nur beispielhaft ist und die Erfindung in keiner Weise beschränken soll.

In dem Bestreben, ein System mit den bestmöglichen Merkmalen zu entwickeln, wurden Versuche durchgeführt, um den optimalen Rotorwinkel zu ermitteln, mit dem die Möglichkeiten des Terfahrens in bezug auf Trennungen unter Verwendung der verschiedensten Zwei-Phasen-Lösungsmittelsysteme mit verschiedenen physikalischen Eigenschaften in bezug auf die Grenzflächenspannung, die Viskosität und den Dichteunterschied zwischen beiden Phasen demonstriert werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wurde ein Rotor konzipiert wie bei den bekannten Systemen gemäß den US-Patentschriften 3 775 309 und 3 856 669 zur Erzeugung einer Gegenrotation des Säulenhalters, um ein kontinuierliches Durchlaufsystem ohne sich drehende Dichtungen zu entwickeln. Diese Vorrichtung wies einen Rotor in einem festen Winkel von 45 auf und war wie folgt aufgebaut: ein zylindrischer hohler Aluminiumsäulenhalter wurde getragen von einem Paar Aluminiumblöcken, die mit Lagern ausgestattet waren, die sandwichartig von einem Paar Aluminiumseitenplatten eingeschlossen waren, um den Säulen— halter bei 45° mit einer genauen Lagerausrichtung zu unterstützen. Um eine Verdrehung (Verdrallung) der Strömungsrohre zu verhindern, wurde eine Gegendrehung des Halters erzeugt durch Befestigen eines Paares von mit Zähnen versehenen Gleitrollen mit gleichem Durchmesser, von denen die eine an dem mittleren Abschnitt des Halters und die andere an dem Motorgehäuse im Zentrum des Zentrifugenantriebs befestigt war. Ein Paar Spannrollen, die an der Bodenplatte des Rotors befestigt waren, diente der Richtungsänderung des laufenden Bandes um 45°. Der Rotor war mit einer Blindmusterseite versehen, die ähnlich der operativen Seite war, um ein genaues Auswuchten des Rotors zu erleichtern. Die Umlaufgeschwindigkeit wurde kontinuierlich reguliert von 400 bis 1500 UpM bei einem mittleren Umlauf radius von 20 cm.

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Abgesehen von konstruktiven Details arbeitete die vorstehend beschriebene Vorrichtung unter Erzielung einer zufriedenstellenden Phasenretention bei den Polymerphasensystemen bei gleichzeitiger Verbesserung der Trenngeschwindigkeit im Vergleich zu dem System mit horizontalem Rotor gemäß US-Patentschrift 3 856 669. Es wurde demzufolge festgestellt, daß der beste Eotorwinkel für die Phasenretention zwischen 0° und 4-5 gegenüber der Vertikalen liegen muß. Dementsprechend wurde eine zweite Vorrichtung aufgebaut, mit deren Hilfe es möglich war, den Eotorwinkel durch einfache ,Justierung . zwischen 10° und 30 gegenüber der Vertikalen einzustellen.

Die beiliegende Zeichnung zeigt den Aufbau einer solchen Eotoreinrichtung 10 mit einstellbarem Winkel, die auf einer Zentrifuge 11 in der Stellung 30° dargestellt ist. Ein Paar von Lagerblöcken 12, die einen Säulenhalter 14 festhalten, vorzugsweise aus Aluminium, ist auf jeder Seite des Eotors 10 sandwichartig von einem Paar rechteckiger Platten 16 umgeben, die ebenfalls vorzugsweise aus Aluminium oder dgl. bestehen. Jede der Platten 16 ist in der Mitte mit einem Zapfen 18 versehen, der in das in einer Seitenplatte 20, die sich entlang der vertikalen Achse CL der Zentrifuge 11 und des Eotors 10 erstreckt, vorgesehene Zapfenloch paßt. Diese Anordnung ermöglicht die Drehung der Säulenhalterblocke 12 um die Zapfen 18 herum, ohne daß dadurch die Lagerausrichtung (-einstellung) gestört wird, die dann an der Seitenplatte 20 in einem vorher festgelegten Winkel mittels eines Bolzens befestigt werden können. Der Grundaufbau der Zentrifuge 11 ist konventionell mit Ausnahme der hier beschriebenen Abänderungen; so kann beispielsweise eine konventionelle gekühlte Zentrifuge, wie MSE, Modell LR-6, verwendet werden.

Auf dem Säulenhalter 14 ist eine mit Zähnen versehene Gleitrolle 22 befestigt und mit einer stationären Gleitrolle 24-gleichen Durchmessers, die um die Achse CL der Zentrifuge 11

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herum befestigt ist, gekoppelt. Die Kopplung der festen Gleitrolle 24 an die mit Zähnen versehene Gleitrolle 22 erfolgt durch ein mit Zähnen versehenes Band 26 und mit Hilfe eines Paares von Spannrollen 28, die auf einer Bodenplatte 30 des Rotors befestigt sind. Biese Kopplung erzeugt eine Gegenrotation des Säulenhalters 14, um ein Verdrehen der spiralförmig gewundenen Durchflußrohre 32 und 32', durch welche die Fluids (Flüssigkeiten) passieren, zu verhindern. Die Position der Gleitrolle 22 auf dem Säulenhalter 14 und die Spannrollen 28 sind ebenfalls auf Jeden Winkel einstellbar, um dem laufenden Band 26 eine ausreichende Spannung zu verleihen.

Unter Berücksichtigung der Versuchsergebnisse, die bei Verwendung des zuerst entwickelten 45°-Winkelrötors erhalten wurden, wurden verschiedene Aufbaumerkmale verbessert. Es wurden richtig abgedichtete Kugellager 34 (Moffatt Bearing Co., Cat., Nr. 209-SZZ) verwendet, die das Schmiermittel viel langer zurückhalten können und eine leichte Schmierung mit einer zwischen den Innenring des Lagers und die Kunststoffdichtung eingesetzten Spritzennadel erlauben. Zwischen dem Säulenhalter 14 und der inneren Laufbahn jedes Lagers war ein Stück eines isolierenden Rohres 36, beispielsweise aus Bakelit, dicht angebracht, um die Wärmeleitung minimal zu halten und auch um eine Verdrehung des Säulenhalters 14 gegenüber den Lagern 34 zu verhindern. Um die Säule zu kühlen, waren in dem oberen Abschnitt und im Boden des Säulenhalters 14 mehrere seitliche Locher 38 vorgesehen, welche das Einströmen von Luft in das Innere des Halters während des Betriebs erlaubten. Ein zylindrischer Säulenträger 40, der vorzugsweise aus Delrin-Kunst— stoff bestand, für die spiralförmig gewundenen Strömungsrohre 32 und 32* war an dem oberen Abschnitt und an dem Boden des Halters 14 befestigt, um eine Vibration während des Betriebs zu verhindern.

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Es können zwei Typen von Säulenkonfigurationen angewendet v/erden. Eine gerade Helix-Säule (nicht dargestellt) wird hergestellt durch Aufwickeln eines Rohrs, vorzugsweise aus einem inerten Kunststoff, wie Teflon, auf einen starren Kunststoff stab zur Herstellung der Säuleneinheit. Mehrere Säuleneinheiten werden in Reihe miteinander verbunden und parallel zueinander fest auf dem Säulenträger montiert. Eine gewundene Helix-Säule (wie in der Fig. dargestellt) wird hergestellt durch Aufwickeln des Rohrs 32 und 32', z.B. aus Teflon, auf einen flexiblen Kern, der seinerseits dicht auf den Säulenträger 40 aufgewickelt ist. Um Jeden nachteiligen Einfluß der Coriolis-Kraft minimal zu halten, werden diese Säulen vorzugsweise innerhalb von 1,3 cm von der Mittelachse des Säulenhalters 14 mit einem mittleren Umlaufradius von 21 cm angeordnet. Beide Beschickungs- und Rückführungsrohre 32 und 32' werden durch ein zentrales Loch 4-2 des Säulenträgers 40 geführt und dann in der Mitte des oberen Elements der Zentrifuge festgehalten. Die Strömungsrohre können, wie gefunden wurde, in einem mehrmonatigen Betrieb verwendet werden, wenn sie an jedem aufliegenden Ende mit einem Stück gefettetem Siliconkautschukrohr geschützt sind.

Es wurde das Leistungsvermögen der Vorrichtung bei Umlaufgeschwindigkeiten innerhalb des Bereiches von 500 bis 1300 UpM während einer Versuchsdauer von 6 Monaten geprüft. Das mechanische Leistungsvermögen der Vorrichtung war gut und die Vorrichtung zeigte ihre vielseitige Verwendbarkeit für Trennungen von biologischen Verbindungen mit hohen Wirkungsgraden bei Verwendung der verschiedensten Zwei-Phas en-Lö sungsmi ttelsysteme, wie nachfolgend näher beschrieben wird. Die Bestimmung des optimalen Rotorwinkels erfolgte wie nachfolgend angegeben:

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Beispiel A

Für die Durchführung der Versuche wurden sowohl gerade als auch gewundene Helix-Säulen aus zwei verschieden großen Teflonrohren (Zeus Industrial Products, Inc., Earit'an, K.J./ USA) mit einem Innendurchmesser von 0,55 nm und 0,3 mm hergestellt.

Hauptsächlich wurde ein Polymerphasensystem, "bestehend aus 4 % Polyäthylenglykol 6000, 5 % Dextran T 500 und 0,01 M Efatriumphosphat (pH 7)> verwendet, für die Untersuchung wurden aber auch zwei andere Phasensysteme, nämlich sec.-BuOH/wäßrige Dichloressigsäure und n-BuOH/0,01 M NaGl, enthaltend 1 % Cetylpyridiniumchlorid (CPCl)^ verwendet wegen ihrer spezifischen physikalischen Eigenschaften. Das sec.-BuOH-System weist eine niedrige Grenzflächenspannung (Oberflächenspannung) auf, es kann Jedoch in einer gewundenen 60°-Helixsäulenkonfiguration mit vertikalem Rotor zurückgehalten werden. Das n-BuOH/wäßriges CPCl-System hat eine hohe Emulgierneigung und eine vollständige Phasentrennung dauert in einem Scheidetrichter einige Stunden, ^ie Polymerphasensysteme weisen eine" extrem niedrige . Grenzflächenspannung, eine hohe Viskosität und geringe Dichteunterschiede zwischen beiden Phasen auf. Wegen dieser Eigenschaften konnte der in der US-Patentschrift 3 775 309 beschriebene vertikale Rotor die beiden zuletzt genannten Phasensysteme selbst mit der flach gewundenen 60°— Helixsäulenkonfiguration nicht zurückhalten (festhalten).

In jedem Beispiel wurde die Säule mit der stationären Phase gefüllt und die bewegliche Phase wurde mit verschiedenen Strömungsgeschwindigkeiten bei mit konstanter Geschwindigkeit laufendem Rotor und bei 25⁰C eingeführt, bis die bewegliche Phase durch die Säule eluiert wurde. Der Prozentsatz des innerhalb der Säule zurückgehaltenen (festgehaltenen) Volumens der stationären Phase wurde aus der aus der Säule eluierten stati—

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onären Phase und der Kapazität der Säule sowie dem vorher geeichten Totraum, errechnet.

Die Phasenretention für jedes Phasensystem wurde bei den verschiedenen Rotorwinkeln von 10°, 20°, 30° und 45° "bei 1200 und 1500 UpM "bei maximalen Strömungsgeschwindigkeiten von 2,5 ml/Stunde für die Säulen mit einem Innendurchmesser von 0,55 mm und von 1,0 ml/Stunde für die Säulen mit einem Innendurchmesser von 0,3 mm untersucht. Bei 10 zeigten alle Phasensysteme eine schlechte Phasenretention von weniger als 30 %„ Bei 20° ergab das sec.-BuOH-System eine ausreichende Phasenretention, während die anderen zwei Phasensysteme ein starkes Mitreißen aufwiesen, was zu einer schlechten Phasenretention führte. Bei 30° und 45° ergaben jedoch alle Phasensysteme eine ausreichende Phasenretention innerhalb des Bereiches von 30 bis 50 % in beiden Säulenkonfigurationen. Die gerade Helix—Säule hielt eine größere Menge der stationären Phase bei einer gegebenen Strömungsgeschwindigkeit und JBm=-— Umlauf geschwindigkeit zurück (fest), während die gewundene Helix-Säule einen höheren Yerteilungswirkungsgrad ergab, was durch die Verteilung von Einderinsulin und sec.-BuOH/wäßrige Dichloressigsäure-Systeme demonstriert wurde.

Beispiel B

Das Leistungsvermögen des 30°-Winkelrotors in bezug auf Trennungen von biologischen Materialien mit den verschiedensten Zwei-Phasen-Lösungsmittelsysteme mit verschiedenen physikalischen Eigenschaften wurde untersucht. Zur Demonstration des analytischen Potentials des Verfahrens wurde durchweg, wenn nichts anderes angegeben ist, eine feine gewundene Helix-Säule mit· einem Innendurchmesser von 0,3 mm, einer Länge von 40 m und einem Helixdurchmesser von 1,2 mm verwendet. Bei jeder Trennung wurde die Säule mit der stationären Phase gefüllt und durch das Beschickungsrohr wurde eine Probelösung eingeführt, dann wurde mit der beweglichen Phase unter Ver-

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Wendung eines Spritzenantriebs (Harvard-Apparatur) "bei der angegebenen Strömungsgeschwindigkeit eluiert, während der Eotor mit der angegebenen Umdrehungsgeschwindigkeit lief. Die Trennungen wurden, wenn nichts anderes angegeben ist, bei 25 G durchgeführt. Das Eluat wurde durch einen UV-Monitor (IEB Uvicord II) entweder bei 276 nm oder bei 254- nm überwacht mit Ausnahme des Polymerphasensystems. Bei der Trennung des Kolorie-Stimulierungsfaktors mit dem Polymerphasensystem wurden eluierte Fraktionen einer menschlichen Knochenmarkszellenkultur für die Koloniezählung zugesetzt, während der Gesamtproteingehalt durch Trübungsmessung bei 3OO nm in einer 1M Perchlorsäurelösung ermittelt wurde.

Beispiel B-1

Chloroform/Essigsäure/0,1 η HGl (2/2/1) [W. Hausmann, J.R. Weisiger und L.G. Graig (1955), "J- Amer. Chem. Soc", 77, 7233: dieses Phasensystem weist eine mäßig niedrige Grenzflächenspannung, eine niedrige Viskosität und einen großen Dichteunterschied zwischen zwei Phasen auf, der für die Gegenstromchromatographie ideal ist. Bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,5 ml/Stunde bei 5OO UpM wurden bei Verwendung der oberen wäßrigen Phase als der beweglichen Phase neun DNP-Aminosäuren erhalten. Das Probenvolumen betrug 10 nl, es enthielt jede Komponente in der unteren Phase in einer Menge von etwa 1 %·, wo die Löslichkeit dies erlaubte. Alle Komponenten wurden innerhalb von 17 Stunden eluiert. Bei einer höheren Strömungsgeschwindigkeit von 1,5 ml/Stunde bei 1000 UpM wurde ein ähnliches Ghromatogramm erhalten und diese Trennung war innerhalb von 6 Stunden beendet, ohne daß ein starker Verlust an Auflösung auftrat.

Beispiel B-2

Ithylacetat/10 % Essigsäure, 5 % NaGl (1/1) [E.E. Hurst und

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X. Ito (1972), "Clinical Chemistry", ;18, 814]: dieses Phasensystem hat eine -hohe Grenzflächenspannung und eine niedrige Viskosität und neigt zur Bildung eines Strompfropfens in der Säule mit einer feinen Bohrung in dem vertikalen Rotor· Durch das erfindungsgemäße Verfahren wurde jedoch das Verstopfungsproblem überwunden und fünf Brenzkatechinaminmeta— bolite wurden gut voneinander getrennt und innerhalb von 13 Stunden eluiert. Das verwendete Probenvolumen betrug 20 ill und es enthielt jede Komponente in einer Menge von 0,5 g % in der unteren Phase. Die untere Phase wurde als bewegliche Phase bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml/Stunde bei 1200 UpM verwendet.

Das gleiche Lösungsmittelsystem wurde zum !Nachweis von Urinbrenzkatechinaminmetabolitenbei einem Patienten verwendet. Jede Urinprobe wurde vorbehandelt durch Zugabe von NaCl (5 %~) und Essigsäure (10 %) entsprechend der Phasenzusammensetzung und es wurden 100 nl eingeführt, während die reine Probe in der unteren Phase in einer Menge von 0,5 g% für jede Komponente gelöst und in einer Menge von 20 ill eingeführt wurde. In 100 ul Urin wurden abnormale Werte von VMA (4~Hydroxy-3-methoxymande!säure) und HVA (4~Hydroxy-3-methoxyphenylessig— säure) nachgewiesen. VMA wurde zusammen mit verschiedenen anderen Verbindungen chromatographiert, es trat jedoch keine Störung (Überlagerung) mit irgendeinem der kolorimetrischen Nachweise für VMA auf. HVA wurde von den anderen Verbindungen vollständig abgetrennt.

Beispiel B-3

n-BuOH/wäßrige Systeme: die Zwei-Phasen-Systeme haben' eine mittlere Grenzflächenspannung und eine verhältnismäßig hohe Viskosität und eignen sich außerordentlich gut für die Verteilung verschiedener biologischer Verbindungen. Ein Chromatogramm von Purinen und Pyrimidinen auf einer Zwei-Phasen-System- Verbindung · von n-BuOH/iM Kaliumphosphat (pH 6,5) bei einem Volumenverhältnis von 1:1 CJ.S¹. Tinker und G.B.

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Brown (1948), "J. Biol. Ghem.", 123, 5853, wurde bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,5 ml/Stunde und "bei 1200 UpM erhalten. Die Probe wurde hergestellt durch Auflösen jeder Komponente in der oberen Phase in einer Menge von 0,1 g% und es wurden 10 nl eingeführt. Da die Verteilungskoeffizienten dieser Verbindungen die untere Phase begünstigen, wurde die obere organische Phase als bewegliche Phase verwendet zur Erzielung einer besseren Auflösung der Maxima. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die Auswahl der beweglichen Phase in Abhängigkeit von den Verteilungskoeffizienten der interessierenden gelösten Stoffe.

Außerdem wurde ein Chromatogramm einer Gruppe von Dipeptiden unter Anwendung eines Gradientenelutionsverfahrens erhalten. Es wurde ein linearer Gradient zwischen 1 % und 0 % Dichloressigsäure auf der Basis von n-Bu0H und 0,1M Ammoniumformiat bei einem Volumenverhältnis von 1:1 CY. Ito und R.L. Bowman O973), "J· Cnromatogr. Sei.", 11., 284] unter Verwendung der unteren Phase als der beweglichen Phase angewendet. Die Größe der Probe betrug 100/il und sie enthielt jede Komponente in einer Menge von 0,2 g% in der unteren Phase. Alle Komponenten wurden voneinander getrennt und innerhalb von 6 Stunden bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml/Stunde bei 1200 XTpM eluiert. Bei diesem Verfahren wurden zwei Isomerenpaare, nämlich L-Valyl-L- .tyrosin und L-Tyrosyl-L-valin sowie L-Leucyl-Irtyrosin und L- Tyrosyl-L-leucin, vollständig voneinander getrennt.

Beispiel Βτ4·

sec.-BuOBV^ %ige wäßrige Dichloressigsäure (1/1) CY. Ito, E.E. Hurst, R.ü. Bowman und E.K. Achter (1974-), "Separation and Purification Methods", 3, (1), ^331'· dieses Zwei-Phasen-System ist charakterisiert durch eine niedrige Grenzflächenspannung und eine hohe Viskosität mit einer hohen Emulgierneigung. Es wurde ein Gegenstromchromatogramm von Rinder insulin

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im Vergleich zu den Verteilungsdaten nach dem Gegenstromverteilungsverfahren -in einem ähnlichen Phasensystem, beschrieben von Harfenist und Craig (1952) in "J.A.C.S.", £4, 3083, erhalten. Das CCD zeigte eine zweite Komponente, die als desaminierte Form von Insulin identifiziert xrarde, die weder durch Elektrophorese noch durch Ultrazentrifugierung abtrennbar war. Durch die Gegenstromehromatographie wurde die zweite Komponente von dem Hauptmaximum vollständig getrennt. Die angewendete Größe der Probe betrug 1 mg, gelöst in 5OyU-I der unteren Phase, und die Trennung wurde bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml/Stunde bei 1200 UpM durchgeführt .

Beispiel B-5

Polymerphasensystem [P.A. Albertsson (197Ό» "Partition of Cell Particles and Macromolecules", 2. Auflage, Wiley-Interscience, New York, und G. Johansson, A. Hartman und P.A. Albertsson (1973), "Eur. J. Biochem.", ^, 3793: im allgemeinen weisen Polymerphasensysteme eine extrem niedrige Grenzflächenspannung, eine hohe Viskosität und einen geringen Dichteunterschied zwischen den Phasen auf und für die Phasentrennung ist eine beträchtliche Zeit erforderlich. Wegen der wäßrigen/wäßrigen Phasenzusammensetzung war die Verwendung bei der konventionellen Chromatographie schwierig und deshalb beruhte die Verteilung auf einem zeitraubenden Gegenstromverteilungsverfahren. ITm die Verwendbarkeit von Polymerphasensystemen in dem erfindungs gemäß en Verfahren zu demonstrieren wurden Voruntersuchungen in bezug auf die Abtrennung des Kolonie-Stimulierungsfaktors (SCP) [D. Metcalf und M.A.S. Moor (1971) in "Haemopoietic Cells" (Herausgeber A. Heuberger und E.L. Tatum), Seite 383, liorth-Holland Publishing Company, Amsterdam? von der menschlichen Embry.o-Nierenflüssigkeit durchgeführt unter Verwendung eines zugeführten Poly(äthylenglykol)-Phasensystems (vgl. Johansson et al, supra], bestehend aus 6 % Trimethylaminopolyäthylenglykol, 6 % Dextran T 500 und 0,05 M

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Natriumphosphat. Bei den. Testrohrversuchen wurde der für die "Verteilung von CSP geeignete pH-Wertbereich des Polymerphasensystems bestimmt und die Toxizität der oberen Phase und der unteren Phase wurde an Hand einer Knochenmarkszellenkultur ermittelt. Danach wurde die Trennung durchgeführt unter Anwendung einer exponentiellen Gradientenelution zwischen dem Ausgangsmedium (pH 4,4-) und dem Endmedium (pH 6,3), wobei die obere Phase als bewegliche Phase verwendet wurde. 2 ml menschliche Embryonierenflüssigkeit (Abbott Laboratories) wurden lyophilisiert und in 2 ml der oberen Phase des Ausgangsmediums gelost. Zuerst wurde eine gewundene Helix-Trennsäule mit einem Innendurchmesser von 0,55 mm, einer Länge von 18 ι und einer Kapazität von 4- ml mit der unteren Phase des Ausgangsmediums gefüllt und dann wurden 1,2 ml der obigen Probenlösung mit einer Geschwindigkeit von 0,6 ml/ Std. bei 1300 UpM eingeführt, dann wurde eine Gradientenelution 15 Stunden lang bei 18°C durchgeführt. Während des Versuchs wurden 30 Fraktionen von jeweils 0,3 ml erhalten und dann wurden 10 Fraktionen aus der Säule gesammelt. Diese Fraktionen wurden einer menschlichen Knochenmarkszellenkultur zugesetzt, um die CSF-Aktivität durch Kolonie-Zählung zu bestimmen, während der Gesamtproteingehalt durch die Trübung in einer 1M Perchlor säur elö sung bei 300 nm mittels eines Beckman-Spektrophotometers ermittelt wurde. Das CSF> wurde ziemlich gut von dem Rest der Proteine getrennt. Die CSF-Aktivität bei dem Maximum betrug mehr als das Doppelte derjenigen der ursprünglichen Probenlösung.

Vorstehend wurde die vielseitige Verwendbarkeit des 30°-Winkelrotors bei Trennungen unter Verwendung der verschiedensten Zwei-Phasen-Systeme einschließlich eines Äthylacetatsystems mit einer hohen Grenzflächenspannung und eines Polymerphasensystems mit einer niedrigen Grenzflächenspannung demonstriert. Diese Trennungen wurden mit einer einzigen Säulenkonfiguration aus einer gewundenen Helix durchgeführt, die leicht aus

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einem Stück Teflonrohr hergestellt werden kann.,und die Säule kann viele Wochen lang verwendet werden, ohne daß sie dabei beschädigt wird. Wenn einmal ein geeignetes Phasensystem gefunden ist, können die geeigneten Betriebsbedingungen leicht ermittelt werden durch Einstellen der Strömungsgeschwindigkeit und der Umdrehungsgeschwindigkeit, da dieses Verfahren die verschiedensten Anwendungsmöglichkeiten für die Phasenretention und Verteilung des gelösten Stoffes eröffnet. . Obgleich eine Peintrennung in der Hegel bei einer niedrigen Strömungsgeschwindigkeit mittels eines über Facht laufenden Versuches erzielt wird, kann innerhalb mehrerer Stunden bei einer höheren Strömungsgeschwindigkeit und Umdrehungsgeschwindigkeit eine verhältnismäßig hohe Auflösung erzielt werden. Der Verteilungswirkungsgrad kann noch weiter erhöht werden durch Verwendung eines engeren und/oder längeren Rohres, während eine Vergrößerung des Maßstabes durch Ver- . Wendung einer weiteren (dickeren) Säule erzielt werden kann.

Die Erfindung wurde zwar vorstehend unter Bezugnahme auf bevorzugte Ausführungsformen näher erläutert, es ist jedoch für den Fachmann selbstverständlich, daß sie darauf keineswegs beschränkt ist, sondern daß diese in vielerlei Hinsicht abgeändert und modifiziert werden können, ohne daß dadurch der Rahmen der vorliegenden Erfindung verlassen wird.

Patentansprüche:

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Claims

Patentansprüche

1. Elutionszentrifuge, "bestehend aus einer Zentrifugiereinrichtung mit einer Hauptachse, einer auf der Zentrifugiereinrichtung befestigten Trennsäule, deren Achse von der Hauptumlaufadse der Zentrifugiereinrichtung verschieden ist, einem Besehickungsrohr für die Einführung von Fluids bzw. Flüssigkeiten in die Trennsäule,einem Rückführungsrohr für den Austrag der Fluids bzw. Flüssigkeiten aus der Trennsäule, wobei die Zentrifugiereinrichtung eine Einrichtung aufweist, mit deren Hilfe es möglich ist, die Trennsäule um die Hauptumlauf .achse der Zentrifugiereinrichtung umlauf en zu lassen und gleichzeitig die Trennsäule um ihre eigene Achse mit der gleichen Winkelgeschwindigkeit und in entgegengesetzter Richtung zu drehen, um eine Verdrallung des Beschickungsrohres und des Rückführungsrohres zu verhindern, dadurch gekennzeichnet, daß die Achse der Trennsäule gegenüber der Haupt umlauf achse um einen Winkel von 10 bis 45° geneigt ist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Neigungswinkel 30 bis 4-5° beträgt.

3β Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Einrichtung zur Einstellung des Neigungswinkels auf einen Wert zwischen 10 und 45° aufweist.

4. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennsäule ein spiralförmiges Rohr (Helix-Rohr) ist, wobei das Besehickungsrohr (32) und das Rückführungsrohr (32¹) mit den Enden dieses spiralförmigen Rohres verbunden sind.

5. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zentrifugiereinrichtung (11) besteht aus einer vertikalen Antriebswelle in der Umlauf achse, einem Rohrhalter (14) für

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die Aufnahme der Trennsäule, einer Einrichtung zum Verbinden des Rohrhalters (14) mit der Antriebswelle und zum Halten des Rohrhalters (14) in einem -vorgegebenen Abstand von der Antriebswelle, so daß der Rohrhalter (14) um seine eigene Achse frei drehbar ist, einer ersten, zu der Antriebswelle konzentrischen Gleitrolle (22), die an der Antriebswelle befestigt ist, einer zweiten Gleitrolle (24), die an dem Rohrhalter (14) befestigt ist, einer Bandeinrichtung (26), welche die erste Gleitrolle (22) und die zweite Gleitrolle (24) miteinander verbindet, und einer Spannrolleneinrichtung (28) zur Änderung der Richtung der Bandeinrichtung (26).

6. Verfahren zur Durchführung der Gegenstromchromatographie unter Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man

durch das Beschickungsrohr ein erstes Lösungsmittel in die Trennsäule, deren Drehachse gegenüber der Vertikalen um 10° bis 45° geneigt ist, einfüllt,

die gefüllte Trennsäule durch Umlaufenlas sen um die vertikale Achse der Zentrifuge zentrifuiert, während man gleichzeitig die Trennsäule um ihre eigene geneigte Achse dreht, wobei die Winkelgeschwindigkeit des Umlaufs und die Winkelgeschwindigkeit der Rotation gleich und entgegengesetzt zueinander sind,

eine Probe des zu trennenden gelösten Stoffes in die sich bewegende Trennsäule einführt,

ein mit dem ersten Lösungsmittel nicht mischbares zweites Lösungsmittel in die sich bewegende Trennsäule einpumpt' und die getrennten Fraktionen des gelösten Stoffes, die in der Trennsäule zurückbleiben, gewinnt.

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