DE4005366C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren nach dem Oberbegriff der Patentansprüche 1 und 2 und die Verwendung poröser offenporiger Körper nach Patentanspruch 11.

Die sogenannte Flüssig-Flüssig-Extraktion ist ein an sich bekanntes Verfahren zur Isolierung und Anreicherung eines Stoffes aus einem flüssigen Substanzgemisch mit Hilfe eines geeigneten Lösungsmittels. Das Grundprinzip des Verfahrens besteht darin, daß der Stoff aus seinem einen Lösungsmittel mittels eines anderen, mit dem ersten nicht oder nur begrenzt mischbaren Lösungsmittels, in welchem er eine größere Löslichkeit als in dem ersten besitzt, herausgezogen wird. Der Verfahrensablauf sieht dabei im allgemeinen so aus, daß beide Phasen vorerst miteinander in Kontakt gebracht werden, wobei insbesondere die Größe der Berührungsfläche zwischen beiden Phasen für die Schnelligkeit des Stoffübertritts in das Extraktionsmittel verantwortlich ist. Eine möglichst große Berührungsfläche wird in der Regel dadurch erzielt, daß beide Phasen durch Energieeintrag, z. B. durch Rühren, Pulsation, Zentrifugieren, so lange miteinander durchmischt werden, bis eine Phase fein verteilt in der anderen vorliegt, d. h., bis eine Suspension aus beiden Phasen hergestellt ist. Nach dem Übergang des Stoffes in das Extraktionsmittel wird dem System in entsprechenden Beruhigungsphasen oder -zonen, d. h. Phasen oder Zonen ohne oder mit nur geringem Energieeintrag, die Gelegenheit zur spontan erfolgenden Phasentrennung gegeben. Die fein suspendierten Teile verbinden sich nach und nach zu größeren Tropfen bis schließlich beide Phasen wieder in leicht voneinander trennbaren, separaten Flüssigkeitsschichten vorliegen. Nach dem Abtrennen einer der beiden Phasen kann dann der extrahierte Stoff aus dem Extraktionsmittel isoliert werden.

Ein bevorzugtes Anwendungsgebiet für das oben beschriebene Verfahren ist zum Beispiel die Aufarbeitung fermentativ her­ gestellter Bioprodukte in der Biotechnologie, insbesondere biotechnologisch erzeugter niedermolekularer Naturstoffe, wie z. B. Essigsäure oder Antibiotica, insbesondere Penicil­ lin G, Bacitracin, Erythromycin, oder Steroide, z. B. Predni­ solon, oder Chemotherapeutica, wie Dactinomycin. Diese Stoffe werden von Mikroorganismen erzeugt, die eigens zu diesem Zweck in wäßrigen Nährlösungen kultiviert werden. Der größte Teil dieser mikrobiellen Stoffwechselprodukte wird dabei von den Mikroorganismen in ihre wäßrige Umgebung aus­ geschieden. Auf diese Weise entsteht eine Fermenterbrühe, bestehend aus verbrauchter Nährlösung, Mikroorganismen und deren Stoffwechselprodukte. Da die Stoffe in der Fermenter­ brühe meist in hoher Verdünnung vorliegen, müssen diese an­ gereichert und von den vielen, oft chemisch ähnlichen Begleitstoffen isoliert werden. Die extrem hohe Verdünnung ist dabei maßgeblich dafür verantwortlich, daß für die Auf­ arbeitung und Reinigung bis zu 60% des Gesamtaufwandes zur Herstellung von biotechnischen Produkten aufgewendet werden müssen.

Die Aufarbeitung der obengenannten Bioprodukte beginnt nun in der Regel damit, daß nach dem Abtöten der Mikroorganismen vorerst die Zellmasse mittels eines Drehfilters von der Fer­ menterbrühe abgetrennt wird. Der so erhaltenen Flüssigkeit - man bezeichnet sie auch als Kulturfiltrat - wird an­ schließend ein geeignetes organisches Lösungsmittel wie z. B. Diethylether, Ethylenchlorid, Ethylacetat, Methylisobutylke­ ton (MIBK), n-Butanol, Essigsäure-Butylester (Butylacetat), Amylacetat, usw, zugegeben. Dabei hat sich ein Phasenver­ hältnis von wäßriger zu organischer Phase von 4 : 1 für die meisten der oben aufgeführten mikrobiellen Stoffwechselpro­ dukte bewährt. Die Extraktion wird üblicherweise in mehrstu­ figen Verfahren, z. B. in Extraktionskolonnen, durchgeführt.

Im Bereich der Biotechnologie kommt es hier bei der Phasen­ trennung zu Schwierigkeiten. Aus unterschiedlichsten Grün­ den, z. B. durch Zellyse, können in der wäßrigen Phase Proteine enthalten sein, die sich auf der Oberfläche eines feinen Tropfens anlagern und damit ein Vereinigen der Trop­ fen verhindern. Die Suspension bleibt stabil und die Phasen­ trennung wird verhindert.

Dieses Problem tritt z. B. auch bei der in der industriellen Praxis heutzutage im großtechnischen Maßstab durchgeführten Fermentation von Penicillin G auf. Die Extraktion der freien Penicillin-G- und V-Säuren aus dem Kulturfiltrat erfolgt in der Regel mit den organischen Lösungsmitteln Butylacetat oder Amylacetat bei pH = 2,5 bis 3,0. Bei diesem pH-Wert wird die Extraktion begünstigt, da der Schwerpunkt des Ver­ teilungsgleichgewichts praktisch vollständig auf der Seite der organischen Phase liegt. Andererseits findet im sauren Medium ein verstärkter Abbau des Penicillins statt, so daß die Verweilzeit im kritischen pH-Bereich möglichst gering gehalten werden muß. Die Säure wird daher, um die Verluste gering zu halten, üblicherweise erst unmittelbar vor dem Eintritt in den Extraktor zugegeben und die Extraktion bei 0-3°C in kontinuierlichen mehrstufigen Gegenstrom-Zen­ trifugalextraktoren bei sehr kurzen Kontaktzeiten durchge­ führt. Trotz der niedrigen Temperatur und der kurzen Kontaktzeit sind die Verluste an Penicillin G dennoch be­ trächtlich. Sie liegen bei etwa 15-20%.

Mit dem Ansäuern des Mediums geht darüber hinaus noch die Ausfällung der die Phasentrennung behindernden Proteine ein­ her. Um die Bildung einer stabilen Emulsion möglichst zu verhindern, ist man heutzutage weitgehend dazu übergegangen, das Kulturfiltrat nach dem Ansäuern für eine kurze Zeit zwischenlagern zu lassen, so daß die Ausfällung noch vor dem Eintritt in den Extraktor erfolgt. Dies hat jedoch den Nachteil, daß durch die längere Verweilzeit im sauren Medium ein noch größerer Anteil des Penicillins denaturiert wird. Auf jeden Fall ist es zur Erzielung einer sauberen organischen Phase erforderlich, das Zweiphasensystem zu zentrifugieren, womit u. a. ein hoher apparativer Aufwand wie auch ein hoher Energieverbrauch verbunden ist. Gelegentlich wird auch mit emulsionsbrechenden Mitteln gearbeitet. Diese Vorgehensweise sollte jedoch wegen ihrer nachteiligen Auswirkungen auf die Stabilität des Penicillins nur als Notlösung betrachtet werden.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine Flüssig-Flüssig-Extraktion bereitzustellen, welche auch bei Systemen, die zur Bildung stabiler Emulsionen neigen, einen schnellen Verfahrensablauf verbunden mit einer vollständigen und sauberen Phasentrennung gewährleistet. Insbesondere soll die Aufarbeitung und Reinigung fermentativ hergestellter Naturstoffe vereinfacht werden.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß mit dem in den Patentansprüchen 1 und 2 beschriebenen Verfahren gelöst. In Anspruch 11 wird die Verwendung von porösen, chemisch inerten, festen offenporigen Körpern, deren Poren eine flüssige Phase enthalten, als flüssige Phase bei der Flüssig-Flüssig-Extraktion beschrieben.

Das an sich bekannte Extraktionsverfahren wird dahingehend modifiziert, daß eine der beiden flüssigen Phasen während aller Verfahrensschritte durch Adhäsion an die Oberfläche eines festen inerten Trägermaterials gebunden wird. Vorzugsweise liegt das Trägermaterial in Form einer Vielzahl einzelner Trägerkörper mit einer großen Gesamtoberfläche vor, um, analog zur Suspension, eine möglichst feine Verteilung der einen Phase in der anderen und damit eine möglichst große Berührungsfläche zwischen beiden Phasen zu gewährlei­ sten. Eine schnelle und saubere Trennung beider Phasen wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren auch bei Systemen, die zur Bildung stabiler Emulsionen neigen, in einfacher Weise dadurch erreicht, daß die nicht gebundene Phase von den mit der gebundenen Phase beladenen Trägerkörpern abgezogen wird. Dies kann z. B. durch Absaugen über eine Filternutsche er­ folgen. Ebenso ist es möglich, die nicht gebundene Phase, z. B. unterstützt durch Anlegen eines leichten Luftstroms, aus dem Behälter mit den beladenen Trägerkörpern einfach abfließen zu lassen.

Sofern es sich bei der gebundenen Phase um das Extraktions­ mittel handelt, kann es auch empfehlenswert sein, die bela­ denen Trägerkörper im Anschluß an die Phasentrennung noch mit einer geeigneten Waschflüssigkeit nachzuwaschen, um auch noch letzte Reste der nicht gebundenen Phase abzutrennen.

Insbesondere bei der Extraktion mikrobieller Stoffwechsel­ produkte aus wäßrigen Lösungen ist es zweckmäßig, die Trä­ gerkörper mit dem Extraktionsmittel zu beladen und das Kulturfiltrat als nicht gebundene Phase einzusetzen. Da mit der Isolation des Stoffes üblicherweise auch eine Aufkonzen­ trierung einhergeht, bedeutet diese Vorgehensweise eine er­ hebliche Ersparnis an Trägermaterial.

Prinzipiell ist es jedoch auch möglich, die Trägerkörper mit der den zu extrahierenden Stoff enthaltenden Phase zu bela­ den und mit dem Extraktionsmittel zu behandeln.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann sowohl in an sich be­ kannter Weise einstufig als auch mehrstufig durchgeführt werden. Dabei werden die mit dem Extraktionsmittel beladenen Trägerkörper in die den zu extrahierenden Stoff enthaltende Phase gegeben und z. B. mittels eines Rührers intensiv mit dieser verwirbelt. Anschließend wird die nicht gebundene Phase abgesaugt und erforderlichenfalls einer weiteren Extraktionsstufe mit neuen Trägerkörpern mit frischem Extraktionsmittel zugeführt. Der extrahierte Stoff kann schließlich aus dem Extraktionsmittel in den Trägerkörpern z. B. wie bei herkömmlichen Extraktionsverfahren üblich, durch Rückextraktion in ein geeignetes Lösungsmittel oder durch Verdünnen durch Umspülen der beladenen Trägerkörper mit frischem Extraktionsmittel herausgezogen werden. Letzteres ist allerdings mit einem erheblichen Verbrauch an Extraktionsmittel verbunden.

Bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren jedoch mehrstufig mit einer Säule durchgeführt. Bei dieser Verfahrensvarianten, die sowohl im Festbett als auch im Fließbett durchgeführt werden kann, werden die beladenen Trägerkörper in eine Säule gefüllt und in der Säule mit der den zu extrahierenden Stoff enthaltenden Phase beschickt. Diese durchfließt die Säule im Idealfall so, daß alle Trägerkörper gleichmäßig umspült werden. Dabei stellt sich in Flußrichtung von Trägerkörper zu Trägerkörper kontinuierlich ein neues Verteilungsgleichgewicht ein. Vorteilhafterweise wird die in einem Verfahrensschritt auf die Säule gegebene Menge an Extraktionsgut so bemessen, daß die in den Trägerkörpern befindliche Menge an Extraktionsmittel ausreicht, um den zu extrahierenden Stoff vollständig aufzunehmen. Die Rückgewinnung des extrahierten Stoffes aus den Trägerkörpern kann dann analog zur einstufigen Extraktion erfolgen. Die Verwendung von Füllkörpern bei Extraktionsverfahren ist beispielsweise auch aus der DE-AS 123 438 441 und der DE-AS 11 81 667 bekannt. Die DE-AS 12 38 441 betrifft ein an sich bekanntes Gegenstrom-Extraktionsverfahren. Gegenstrom-Extraktionsverfahren werden überwiegend in großtechnischen Anlagen zur kontinuierlichen Stofftrennung durch Verteilung zwischen zwei Lösungsmitteln eingesetzt. Man verwendet hierzu in der Regel mit Füllkörpern beschickte Extraktionssäulen, in welche die spezifisch schwerere Phase von oben und die spezifisch leichtere Phase von unten zugeführt wird.

Der abzutrennende Stoff kann in der von oben zugeführten oder in der von unten eingebrachten Phase enthalten sein. Die leichte Phase steigt in Form von Tröpfchen in die Höhe, wenn die von oben zugeführte Phase die zusammenhängende oder äußere Phase ist, während die schwerere Phase zerteilt nach unten sinkt, wenn die leichtere Phase zusammenhängt. In jedem Fall wird die spezifisch leichtere Phase oben und die spezifisch schwerere unten abgenommen. Die günstige Wirkung der Füllkörper, die in der Regel aus Metall, keramischen oder ähnlichem Material bestehen, beruht auf der Verlängerung der Wegstrecke, die die Tröpfchen der zerteilten Phase zurücklegen müssen und damit auf der Vergrößerung der Kontaktfläche zwischen beiden Phasen.

In der DE-AS 12 38 441 wurde nun gefunden, daß sich gelöste oder in homogener Mischung befindliche Stoffe durch Verteilung zwischen einer flüssigen, hydrophoben inneren Phase und einer in einer mit Füllkörpern beschickten Zone dazu im Gegenstrom geführten flüssigen hydrophilen äußeren Phase vorteilhaft extrahieren lassen, wenn man Füllkörper mit hydrophober Oberfläche verwendet. Geeignete Körper mit hydrophober Oberfläche sind nach der DE-AS 12 38 441 z. B. Füllkörper aus Kunststoffen. Auch Füllkörper aus Metallen, Glas oder keramischen Material kommen in Betracht, wenn sie durch geeignete Maßnahmen, wie Oberflächenbehandlung, Lackieren oder Überziehen mit Kunststoffen, hydrophob gemacht wurden.

In der DE-AS 11 81 667 wird ebenfalls ein kontinuierliches Extraktionsverfahren beschrieben, bei welchem im Gegensatz zur obengenannten Druckschrift beide flüssige Phasen das aus Füllkörpern bestehende Bett einer Extraktionssäule in gleicher Richtung durchfließen. Die Oberfläche der Füllkörper ist je nach Art der Behandlungsflüssigkeit entweder hydrophil oder hydrophob ausgebildet, um aus den gleichen Gründen wie in der DE-AS 12 38 442 eine möglichst vollständige Benetzung der Füllkörper mit der Behandlungsflüssigkeit zu erzielen. Die Flüssigkeiten durchströmen das Bett als stetige Phasen, und die Behandlungsflüssigkeit verteilt sich als zusammenhängende Schicht über die von ihr bevorzugt benetzte Füllung, während die zu behandelnde Flüssigkeit im innigen Kontakt mit dieser Schicht die Lücken ausfüllt. Beide Flüssigkeiten fließen als stetige Phasen ab und sammeln sich in zwei Flüssigkeitsschichten, die voneinander getrennt abgezogen werden.

Nach der DE-AS 11 81 667 soll die üblicherweise auftretende Dispersionsbildung im Kontaktbett weitgehend vermeidbar sein, wenn hinsichtlich der Anteile bei den flüssigen Phasen bestimmte Volumenverhältnisse eingehalten werden und die Strömungsrichtung der Flüssigkeiten im Kontaktbett in Abhängigkeit vom Verhältnis der spezifischen Gewichte der beiden Flüssigkeiten zueinander gewählt wird.

Bei den aus der DE-AS 12 38 441 und DE-AS 11 81 667 bekannten Verfahren handelt es sich somit um sog. kontinuierliche Verfahren, die sich dadurch auszeichnen, daß die an der Extraktion beteiligten flüssigen Phasen in einem kontinuierlichen Fluß der Extraktionssäule zugeführt, miteinander durchmischt und im Anschluß an den Stoffaustausch wieder getrennt abgeführt werden. Beide Phasen sind also mobil, d. h. beide Phasen durchströmen in einem stetigen Fluß das Kontaktbett, wobei eine der beiden Phasen beim Durchfließen der Säule bevorzugt die Füllkörperoberfläche benetzt. Sowohl bei dem in der DE-AS 12 38 441 als auch bei dem in der DE-AS 11 81 667 beschriebenen Verfahren unterstützen die Füllkörper das Extraktionsverfahren lediglich dadurch, daß sie eine Kontaktfläche zwischen den an der Extraktion beteiligten Phasen herstellen, wobei die Benetzung der Füllkörperoberfläche mit einer der beiden flüssigen Phasen die Kontaktfläche noch vergrößern soll.

Im Gegensatz dazu ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eine Phase vollständig in Trägerkörpern gebunden - sie ist also immobil - während die andere Phase die mobile Phase darstellt. Dies hat den Vorteil, daß, wie bereits oben beschrieben ist, eine disperse Verteilung der immobilen Phase in der mobilen Phase erzwungen wird, wobei aber die bei den bekannten Verfahren auftretenden Schwierigkeiten bei der Trennung der Phasen nach dem Stoffaustausch vermieden werden.

Das Trägermaterial muß erfindungsgemäß formstabil und in bezug auf die Lösungsmittel und die darin gelösten Stoffe chemisch inert sein.

Zweckmäßigerweise wird ein poröses Material mit offenen Poren zur Aufnahme der flüssigen Phase verwendet, wobei die Porengröße so bemessen ist, daß die Flüssigkeit in den Poren durch Kapillarkräfte festgehalten wird. Für eine bestmögli­ che Ausnutzung des Trägermaterials ist es anzustreben, das gesamte offene Porenvolumen mit der flüssigen Phase zu fül­ len.

Die Größe der Poren, d. h. der Durchmesser der als im wesent­ lichen kugelförmig angenommenen Hohlräume muß so bemessen sein, daß die Kapillarkräfte groß genug sind, um die Flüs­ sigkeit insbesondere gegen die Schwerkraft oder gegen die bei Bewegung der Trägerkörper, z. B. im Fließbett, auftreten­ den Trägheits- und Fliehkräfte in den Poren zurückzuhalten. Es hat sich gezeigt, daß bei den üblicherweise in Extrak­ tionsverfahren eingesetzten wäßrigen Lösungen und organi­ schen Lösungsmitteln in Trägerkörpern mit hydrophiler bzw. hydrophober Oberfläche mit Porendurchmessern bis zu 2 mm noch eine ausreichende Bindung an das Trägermaterial gewähr­ leistet ist. Bevorzugt werden jedoch poröse Materialien mit Porendurchmessern bis zu maximal 1 mm eingesetzt, um sicher­ zustellen, daß auch nicht kleinere Mengen an gebundener Pha­ se beim Durchmischen oder Beschicken mit der nicht gebundenen Phase aus den Porenöffnungen an der Trägerober­ fläche herausgespült werden können.

Nach unten hin ist der Porengröße erst dann eine Grenze ge­ setzt, wenn Molekülabmessungen erreicht werden. Die Poren sollten groß genug sein, um die am Verfahren beteiligten Moleküle nicht in ihrer Beweglichkeit zu behindern. Für die meisten der obengenannten Naturstoffe liegen die Molekül­ größen jedoch noch im nm-Bereich.

Wegen ihrer im allgemeinen größeren Festigkeit und besseren chemischen Beständigkeit werden als Trägermaterialien anor­ ganische gegenüber organischen Materialien bevorzugt. Prin­ zipiell ist jedoch auch der Einsatz organischer Materialien denkbar, sofern sie für die spezielle Anwendung ausreichend formstabil und chemisch inert sind.

Bevorzugt werden Trägerkörper aus Keramik, Glaskeramik und insbesondere aus Glas verwendet. Unter diesen Materialien lassen sich nicht nur solche mit einer hohen chemischen Be­ ständigkeit finden, sie zeichnen sich darüber hinaus im all­ gemeinen noch durch definierte Oberflächeneigenschaften aus, was z. B. hinsichtlich einer gleichmäßigen Beladung mit Lö­ sungsmittel von Bedeutung ist.

Geeignete poröse Trägerkörper aus Glas, Keramik oder Glaske­ ramik können z. B. Sinterkörper aus diesen Materialien sein. Insbesondere für Glas sind Verfahren zur Herstellung von offenporigen Sinterkörpern mit definierter Porosität bekannt und erprobt. So wird z. B. in der DE-PS 33 05 854 C1 ein Ver­ fahren beschrieben, wonach offenporige Sinterkörper aus Glas mit einem vorbestimmten großen offenen Porenvolumen sowie mit definiert einstellbaren, ggfls. auch engen, Porengrößen­ verteilungen herstellbar sind. Bei diesem Verfahren wird ein Glaspulver mit einem inerten Material gemischt. Nach der Formgebung und dem Sintern wird der inerte Anteil ausgewa­ schen. Durch eine entsprechende Auswahl der Korngröße und des Volumenanteils können die Porengröße und das Porenvolu­ men des offenporigen Sinterglases in weiten Grenzen variiert und den jeweiligen Anforderungen gezielt angepaßt werden.

Die Verwendung von Glas als Trägermaterial hat noch den wei­ teren Vorteil, daß poröses Glas nicht kompaktierbar ist, so daß die Trägerkörper ohne weiteres auch als Säulenfüllung eingesetzt werden können.

Die Art des verwendeten Glases kann an die jeweiligen spe­ ziellen Anforderungen, z. B. an die chemische Beständigkeit, angepaßt werden. So kann die Verwendung eines preiswerten Kalk-Natron-Glases durchaus ausreichend sein. Die oben be­ schriebenen Sinterkörper können aber auch aus chemisch be­ ständigeren Borosilikatgläsern gefertigt werden.

Poröse Sinterglaskörper der obengenannten Art sind in den unterschiedlichsten Formen, z. B. als Kugel, Hohlzylinder, usw., herstellbar. Für die Verwendung im Extraktionsverfah­ ren wird jedoch wegen der besseren Raumausnutzung die Kugel­ gestalt bevorzugt.

Um einen Trägerkörper mit einer möglichst großen Menge an Lösungsmittel beladen zu können, ist ein möglichst großes offenes Porenvolumen erstrebenswert, dieses muß aber mit einer noch ausreichenden mechanischen Stabilität vereinbar sein. Besonders bevorzugt ist daher bei der Verwendung von Glas als Trägermaterial ein offenes Porenvolumen, das zwi­ schen 50 und 65% liegt. Werden die Trägerkörper mechanisch nicht zu stark belastet, z. B. bei nicht zu hohen Säulen, so sind noch offene Porenvolumina bis zu 70% möglich. Wird jedoch dieser Wert überschritten, so ist insbesondere bei Säulenfüllungen damit zu rechnen, daß die zuunterst liegen­ den Sinterkörper durch das Gewicht der darüber liegenden zerbröselt werden.

Nach unten hin ist dem offenen Porenvolumen praktisch nur eine Grenze durch die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens ge­ setzt. Je kleiner das offene Porenvolumen ist, desto mehr Trägermaterial muß zum Binden einer bestimmten Lösungsmit­ telmenge eingesetzt werden.

Der Übergang des gelösten Stoffes aus seinem Lösungsmittel in das Extraktionsmittel findet an den an der Oberfläche der Trägerkörper gelegenen Porenöffnungen statt. Nur dort kommen im allgemeinen beide Phasen miteinander in Berührung. Der Konzentrationsausgleich im Inneren eines Trägerkörpers er­ folgt dabei durch Diffusion. Es ist daher von Vorteil, Trä­ gerkörper mit einem möglichst kleinen Durchmesser zu verwenden. Mit der daraus resultierenden Vergrößerung der gesamten Trägeroberfläche geht auch eine Vergrößerung der gesamten Berührungsfläche zwischen den beiden flüssigen Pha­ sen einher, so daß ein schnellerer Stoffaustausch gewährlei­ stet ist. Zusätzlich tragen noch die kürzeren Diffusionswege zu einem beschleunigten Verfahrensablauf bei. Ein weiterer Vorteil von kleinen Durchmessern liegt in der größeren Packungsdichte bei Säulenfüllungen. Der nicht nutzbare Raum zwischen den Trägerkörpern wird vermindert. Mit Trägerkör­ pern mit einem Durchmesser kleiner oder gleich 1 mm werden gerade bei der auf einen schnellen Verfahrensablauf angewie­ senen Penicillin-Extraktion bereits gute Ergebnisse erzielt. Bevorzugt werden die kleinsten derzeit herstellbaren Sin­ terglaskörper der obengenannten Art mit Durchmessern bis zu 0,4 mm eingesetzt. Prinzipiell sind jedoch zu kleineren Durchmessern hin keine Grenzen gesetzt, so lange, z. B. bei gleichbleibender Porengröße, das offene Porenvolumen nicht über die oben angegebene Grenze hinauswächst oder bei maß­ stabsgerechter Verkleinerung der Poren diese nicht so klein werden, daß die an der Extraktion beteiligten Moleküle in ihrer Bewegung behindert werden.

Bei Verwendung der Trägerkörper als Säulenfüllung sollte der Durchmesser der Kugeln 5 mm nicht überschreiten, da es sich gezeigt hat, daß die nicht gebundene Phase bei noch größeren Kugeln in zunehmendem Maße in Kanälen durch die Säule hin­ durchfließt und ein Umspülen aller Kügelchen nicht mehr ge­ währleistet ist.

Zur Verbesserung der Bindung eines Lösungsmittels an das Trägermaterial ist es vorgesehen, dessen Oberfläche, je nach Art des Lösungsmittels, hydrophil bzw. hydrophob zu modifi­ zieren. Verfahren hierzu wie auch geeignete Substanzen sind an sich bekannt und z. B. in K. K. Unger (1979) Chemical Mo­ dification of the silica surface. In: K. K. Unger (Hrsg.) Porous Silica its Properties and use as Support in Column Liquid Chromatography (S. 83-130) Elsevier Scientific Pub­ lishing Company, Amsterdam, Oxford, New York beschrieben.

Dabei wird im Falle der porösen Sinterglaskörper die an sich durch an der Oberfläche gebundene OH-Gruppen leicht hydro­ phile Glasoberfläche mit einer sehr dünnen Schicht einer geeigneten Substanz, z. B. ein Silan, mit endständigen hydro­ philen (OH) oder hydrophoben (CH₂Cl) Gruppen überzogen.

Bezüglich geeigneter Lösungsmittel bestehen für das erfin­ dungsgemäße Verfahren die gleichen Beschränkungen wie für die bekannte Extraktion auch. Die an der Extraktion teilneh­ menden Phasen sollten nicht oder nur begrenzt miteinander mischbar sein. Vorteilhafterweise arbeitet man, wie auch im Falle der herkömmlichen Extraktionsverfahren, mit gegenein­ ander abgesättigten Lösungsmitteln, um zu verhindern, daß eine zu große Menge an Extraktionsmittel aus den Trägerkör­ pern herausgezogen wird. Brauchbare Lösungsmittel für die Extraktion aus wäßriger Phase sind z. B. noch Methylisobutyl­ keton, n-Butanol und Diethylether, welche in H₂O eine Lös­ lichkeit von weniger als 22 Gew.-% im interessierenden Temperaturbereich von 20-37°C aufweisen. Bevorzugt werden jedoch n-Butylacetat oder Chloroform mit einer Löslichkeit von weniger als einem Gew.-% in H₂O oder das in H₂O nahezu nicht lösliche Butylsulfat eingesetzt. Das erfindungsgemäße Verfahren ist jedoch keineswegs auf die genannten Lösungs­ mittel beschränkt.

Das Beladen der Trägerkörper mit einer flüssigen Phase, z. B. mit Extraktionsmittel, erfolgt in einfacher Weise dadurch, daß in einem Behälter zu den Trägerkörpern, deren Oberfläche hydrophil oder hydrophob behandelt sein kann, die flüssige Phase im Überschuß zugegeben wird. Nachdem sich die Träger­ körper vollgesaugt haben, wird die nicht absorbierte flüssi­ ge Phase wieder abgezogen und die Trägerkörper werden getrocknet. Es kann mitunter vorteilhaft sein, die Luft aus den Poren der Trägerkörper vor dem Tränken mit dem Lösungs­ mittel durch Evakuieren zu entfernen. Die Menge an gebunde­ ner Phase kann z. B. durch Differenzwägung bestimmt werden.

Methoden zum Beladen von Trägermaterial mit einer flüssigen Phase sind z. B. auch aus der Chromatographie bekannt.

Einmal beladene Trägerkörper können nach der Rückextraktion des extrahierten Stoffes zumindest für das gleiche Extrak­ tionsverfahren immer wieder eingesetzt werden, ohne erneut mit frischem Lösungsmittel beladen werden zu müssen. Inwie­ weit der Einsatz auch für die Extraktion eines anderen Stof­ fes sinnvoll ist, hängt von der Vollständigkeit der Rückextraktion ab.

Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt insbeson­ dere darin, daß das vorzugsweise bei der Extraktion mikro­ bieller Stoffwechselprodukte aus wäßrigen Phasen mittels organischer Phasen auftretende Problem der Bildung stabiler Emulsionen mit einfachen Mitteln umgangen wird. Die bei den etablierten Verfahren zur Erzielung einer sauberen Phasen­ trennung üblicherweise vorgesehenen Maßnahmen, die teils mit nachteiligen Wirkungen auf die Stoffausbeute, teils mit ei­ nem hohen energetischen und apparativen Aufwand verbunden sind, können vollständig entfallen, was das erfindungsgemäße Verfahren gerade für diese Anwendungen, insbesondere, da es auch als kontinuierlicher Prozeß im Großbetrieb eingesetzt werden kann, besonders geeignet macht.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist jedoch keineswegs auf diese Anwendungen beschränkt. Das Prinzip der trägergebunde­ nen Extraktion läßt sich z. B. auch ohne weiteres auf die Reaktivextraktion übertragen, wobei der Stoffaustausch zwi­ schen beiden Phasen nicht durch das Nernst′sche Verteilungs­ gleichgewicht, sondern durch eine chemische Reaktion bestimmt wird.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand der Ausführungsbei­ spiele näher erläutert:

1. Extraktion von Penicillin G mittels Essigsäure-Butyl­ ester (Butylacetat) 1.1. Einstufige Extraktion

Als Trägerkörper wurden poröse Sinterglaskugeln aus Kalk- Natron-Glas mit einem Durchmesser von 1-2 mm, einer Poren­ größe von 60-300µm und einem offenen Porenvolumen von 55- 60% mit hydrophobisierter Oberfläche verwendet.

62 g dieser Kugeln wurden in einen Erlenmeyerkolben eingewo­ gen und Butylacetat im Überschuß zugegeben. Nach ca. 5 min wurde das nicht absorbierte Lösungsmittel mit Hilfe einer Filternutsche abgesaugt. Die Menge des absorbierten Lösungs­ mittels wurde durch Differenzwägung bestimmt. Es wurden 27,1 g (=30,8 ml) Butylacetat absorbiert. Die Löslichkeit von Penicillin G in Butylacetat beträgt 60 g/l. Die maximale Aufnahmekapazität des absorbierten Butylacetats liegt bei 1,85 g Penicillin G.

Die Fermentationsbrühe wurde mit Hilfe eines Drehzellenfil­ ters von der Zellmasse befreit. Der Penicillin-G-Gehalt wur­ de mittels HPLC-Analyse bestimmt. Er betrug etwa 1 Vol-%.

Die Aufkonzentrierung erfolgte durch Extraktion in die or­ ganische Phase (Butylacetat) nach vorhergehender pH-Absen­ kung. (Bei pH 2 liegt das Verteilungsgleichgewicht praktisch quantitativ auf der Seite der organischen Phase). Der pH- Wert wurde durch Zugabe von 20 ml H₂SO₄ eingestellt. Ein Nachteil des Ansäuerns ist, daß bei pH 2 lösliche Proteine ausfallen, welche durch Konglomeratbildung die Extraktion üblicherweise behindern.

Die vorbereiteten, mit Butylacetat beladenen porösen Glas­ kugeln wurden mit 200 ml Kulturfiltrat (+20 ml H₂SO₄) versetzt und ca. 5 min im Erlenmeyerkolben geschüttelt. Aus dem Überstand wurde eine HPLC-Probe genommen. Nach Absaugen des Kulturfiltrats über eine Filternutsche und Waschen mit 400 ml 1%-iger H₂SO₄ wurde das Penicillin durch Verdünnen mit frischem Butylacetat aus den beladenen Trägerkörpern herausgezogen. Dies erfolgte durch 3-maliges Ausschütteln mit (110 ml, 120 ml, 20 ml) Butylacetat. Von der organi­ schen Phase wurde anschließend ebenfalls eine HPLC-Probe genommen.

Die HPLC-Analysen ergaben:
2,394 g Penicillin lagen absolut im Kulturfiltrat vor. Die Aufnahmekapazität des absorbierten Butylacetats für Pe­ nicillin G betrug 1,85 g. Davon konnten 1,15 g mit Bu­ tylacetat extrahiert werden. Die Wiederfindungsrate lag also bei 62%. 0,794 g Penicillin lagen weiterhin in der wäßrigen Phase vor. Bei der etablierten Penicillin-Extraktion liegt die Wiederfindungsrate in der organischen Phase bei 98%.

Das Versuchsergebnis kann wie folgt interpretiert werden: Vermutlich behinderten die koagulierten Proteine den Übergang des Penicillins in die organische Phase durch Ver­ stopfen der Poren in den Trägerkörpern.

1.2. Mehrstufige Extraktion über eine Säule

In eine Säule mit einem Durchmesser von 26 mm und einer Schütthöhe von 490 mm wurden 176,18 g poröse Sinterglasku­ geln aus Kalk-Natron-Glas mit hydrophober Oberfläche ge­ füllt. Der Durchmesser der Kugeln betrug 0,4-1 mm, die Porengröße war < 120 µm und das offene Porenvolumen lag bei 55-60%.

Zum Beladen der Trägerkörper wurde Butylacetat im Überschuß auf die Säule gegeben. Das nicht absorbierte Lösungsmittel wurde anschließend durch Anlegen eines leichten Luftstroms aus der Säule verdrängt und aufgefangen. Die Differenzwägung ergab 97 ml in den Trägerkörpern absorbiertes Lösungsmit­ tel.

Bei der großtechnischen mehrstufigen Extraktion hat sich ein Verhältnis von Butylacetat zu Kulturfiltrat (KF = von der Zellmasse befreite Fermentationsbrühe) von 1 : 4 bewährt. Es wurden daher 388 ml KF mit 8,33 ml 20,8%-iger H₂SO₄ auf pH 2,0 eingestellt (Zeitbedarf: ca. 10-15 s; resultierendes Gesamtvolumen (KF + H₂SO₄): 396,33 ml) und über die Säule geschickt. Die aufgefangene Brühe wurde noch zwei weitere Male über die Säule geschickt. Nach jedem Durchgang wurde eine Probe zur HPLC-Analyse gezogen (Proben A1, A2, A3). Anschließend wurde die Säule mit 550 ml angesäuertem H₂O nachgewaschen. Das Waschwasser wurde aufgefangen und eine Probe zur HPLC-Analyse genommen.

Mit 300 ml Butylacetat wurde das Penicillin durch Verdünnen aus den Trägern herausgezogen, das Lösungsmittel wurde auf­ gefangen und analysiert (A_ABA). Die Ergebnisse der HPLC-Ana­ lysen sind zusammen mit den Ergebnissen des nachfolgenden Ausführungsbeispiels in Tabelle 1 dargestellt.

1.3. Einstufige Extraktion bei simultaner pH-Einstellung

In einem weiteren Ausführungsbeispiel wurden 176,6 g poröse Sinterglaskugeln der in 1.2. genannten Art durch Zugabe von Butylacetat und Absaugen des überschüssigen Lösungsmittels über eine Filternutsche beladen. Die Differenzwägung ergab 118 ml Butylacetat in den Trägerkörpern. Anschließend wurde die 4-fache Menge an Kulturfiltrat (472 ml) zugegeben. Mit Hilfe eines Laborrührers wurde das Trägermaterial im Ver­ suchsansatz intensiv verwirbelt. Durch Zugabe von 10,25 ml H₂SO₄ wurde der pH auf 2,0 eingestellt. Anschließend wurde das Kulturfiltrat über eine Filternutsche abgesaugt und eine HPLC-Probe des Filtrats (B₁) genommen. Mit 750 ml ange­ säuertem H₂O wurde nachgewaschen und eine HPLC-Analyse des Waschwassers (B_w) vorgenommen.

Die Extraktion des Penicillin G aus den Trägerkörpern er­ folgte durch 3-maliges Auswaschen mit je 138 ml Butylacetat. Der Penicillin G-Gehalt im Butylacetat wurde mittels HPLC (B_ABA) bestimmt.

Tabelle 1

Penicillinkonzentration im Kulturfiltrat: 8557 mg/l

Ausführungsbeispiel 1.2

In den Proben A1, A2, A3 und Aw sind lediglich 1,5% des eingesetzten Penicillingehaltes nachweisbar. Dies zeigt daß die eingesetzte Penicillinmenge fast quantitativ in den Trägern aufgenommen wurde. Offensichtlich war der Auswasch­ vorgang mit Butylacetat jedoch nicht sehr effektiv, denn die Wiederfindungsrate beträgt hier nur 62%.

Durch eine vielfache Menge an Butylacetat könnte die Wieder­ findungsrate wohl erheblich gesteigert werden, dies würde jedoch zu einer zu großen Verdünnung führen. Als wesentlich effektiver würde sich in diesem Fall wohl eine Rückextrak­ tion in die wäßrige Phase (Na₂CO₃ bzw. K₂CO₃ -Lösung) erwei­ sen.

Ausführungsbeispiel 1.3

Auch hier war die eingesetzte Menge an Penicillin G nahezu quantitativ im Träger absorbiert (Verlust betrug 3,7%).

Die gegenüber Versuch A erhöhte Wiederfindungsrate könnte durch die etwas größere Menge an Butylacetat beim Auswaschen erklärt werden.

Außerdem wurde durch die pH-Einstellung im vorgelegten Zwei­ phasensystem eine Desaktivierung des Penicillins minimiert.

2. Extraktion von Essigsäure mit Methylisobutylketon (MIBK)

79 g poröse Sinterglaskugeln aus Kalk-Natron-Glas mit 0,15 m²/g Oberfläche, Kugeldurchmessern von 2-3 mm, einer Porengröße von 60-300 µm und einem offenen Porenvolumen von 55% wurden in ein geschlossenes Gefäß eingewogen, 108 g MIBK zugesetzt und 30 min lang leicht geschüttelt. Nach Ab­ dekantieren wurde das Abtropfgewicht bestimmt. Daraus wurde die Belastung des feuchten Trägers mit MIBK berechnet. Es wurden ca. 35,6 g MIBK in den Trägerkörpern gebunden.

Zur Gegenüberstellung der Ergebnisse wurde die Extraktion mit und ohne Träger durchgeführt. Extrahiert wurden jeweils 100 ml Essigsäure in Wasser (20 g/l, 1/3 M, pH 3,05) mit jeweils 35,7 g MIBK. Die Menge an Essigsäure vor und nach der Extraktion wurde in der wäßrigen Phase durch potentiome­ trische Titration mit 0,1 M NaOH bestimmt.

Tabelle 2 zeigt die Kinetik der Extraktion für MIBK mit und ohne Träger:

Tabelle 2

Das Verteilungsgleichgewicht stellt sich relativ schnell ein. Bei der Berechnung der Verteilungskoeffizienten wurde die Dissoziation der Essigsäure bei pH 3,05 nicht berück­ sichtigt, das bedeutet, daß die Werte mit einem konstanten, noch zu berechnenden Korrekturfaktor multipliziert werden mußten. Außerdem wurde die Temperatur nicht exakt konstant gehalten.

Aus den berechneten Werten wird aber folgendes deutlich:

• 1. Das Gleichgewicht stellt sich auch mit Träger rasch ein.
• 2. Die Lage des Gleichgewichts wird durch den Träger nicht meßbar beeinflußt.

Claims (11)

1. Extraktionsverfahren mit zwei nicht oder nur begrenzt miteinander mischbaren flüssigen Phasen, der den zu extrahierenden Stoff enthaltenden Phase und dem Extraktionsmittel, insbesondere zur Isolierung und Anreicherung mikrobieller Stoffwechselprodukte aus wäßrigen Phasen mittels organischer Phasen, dadurch gekennzeichnet, daß Trägerkörper aus einem porösen offenporigen, chemisch inerten, festen Material mit der den zu extrahierenden Stoff enthaltenden flüssigen Phase beladen werden, so daß die flüssige Phase sich in den Poren der Trägerkörper befindet, und daß alle an sich bekannten Verfahrensschritte der Extraktion mit den mit der den zu extrahierenden Stoff enthaltenden flüssigen Phase beladenen Trägerkörpern als "flüssige Phase" durchgeführt werden.

2. Extraktionsverfahren mit zwei nicht oder nur begrenzt miteinander mischbaren flüssigen Phasen, der den zu extrahierenden Stoff enthaltenden Phase und dem Extraktionsmittel, insbesondere zur Isolierung und Anreicherung mikrobieller Stoffwechselprodukte aus wäßrigen Phasen mittels organischer Phasen, dadurch gekennzeichnet, daß Trägerkörper aus einem porösen offenporigen, chemisch inerten, festen Material mit dem Extraktionsmittel beladen werden, so daß das Extraktionsmittel sich in den Poren der Trägerkörper befindet, und daß alle an sich bekannten Verfahrensschritte der Extraktion mit den mit dem Extraktionsmittel beladenen Trägerkörpern als "flüssige Phase" durchgeführt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion in einem mehrstufigen Verfahren mit einer Säule durchgeführt wird, wobei die mit dem Extraktionsmittel beladenen Trägerkörper sich in der Säule befinden und mit dem Extraktionsgut beschickt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß der extrahierte Stoff durch Rückextraktion mit einem geeigneten Lösungsmittel oder durch Verdünnen mit ungebundenem Extraktionsmittel aus den beladenen Trägerkörpern wieder herausgezogen wird.

5. Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß der Durchmesser der Poren <1 mm beträgt.

6. Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß poröse Trägerkörper aus einem anorganischen Material verwendet werden.

7. Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß als Trägerkörper poröse offenporige Sinterglaskugeln verwendet werden.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das offene Porenvolumen der Sinterglaskugeln 50-65% beträgt.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche der Sinterglaskugeln hydrophob oder hydrophil modifiziert ist.

10. Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 7-9, dadurch gekennzeichnet, daß der Durchmesser der Sinterglaskugeln <5 mm beträgt.

11. Verwendung von porösen, chemisch inerten, festen offenporigen Körpern, deren Poren eine flüssige Phase enthalten, als flüssige Phase bei einem Flüssig-Flüssig-Extraktionsverfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 1-10.