DE202005010007U1

DE202005010007U1 - Trenneinrichtung für die Trennung von unlöslichen Inhaltsstoffen aus einer biologischen Probenflüssigkeit

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Publication number: DE202005010007U1
Application number: DE200520010007
Authority: DE
Original assignee: Macherey Nagel GmbH and Co Handelsgesellschaft
Current assignee: Macherey Nagel GmbH and Co Handelsgesellschaft
Priority date: 2005-06-23
Filing date: 2005-06-23
Publication date: 2006-08-03
Anticipated expiration: 2015-06-24

Abstract

Trenneinrichtung (1, 2, 3) für die Trennung von unlöslichen Inhaltsstoffen aus einer biologischen Probenflüssigkeit in Form eines Lysats mit einem säulenartigen Außengefäß (4), das obenseitig eine Einfüllöffnung (5) aufweist, und mit einem darin eingesetzten Filterelement (12, 13, 14), das einen Filterboden (15, 19, 20) und einen davon hochgehenden Filtermantel (16, 17, 21) aufweist, wobei Filterboden (15, 19, 20) und Filtermantel (16, 17, 21) zumindest teilweise aus einem Filtermaterial bestehen, dadurch gekennzeichnet, daß das Filtermaterial derart ausgebildet ist, daß es auf die Inhaltsstoffe als Tiefenfilter wirkt.

Description

Die Erfindung betrifft eine Trenneinrichtung für die Trennung von unlöslichen Inhaltsstoffen aus einer biologischen Probenflüssigkeit in Form eines Lysats, mit einem säulenartigen Außengefäß, das obenseitig eine Einfüllöffnung aufweist, und mit einem darin eingesetzten Filterelement, das einen Filterboden und einen davon hochgehenden Filtermantel aufweist, wobei Filterboden und Filtermantel zumindest teilweise aus einem Filtermaterial bestehen.
Die Isolierung von Nucleinsäuren aus biologischem Material erfordert eine Lyse der Zellwände und -membranen. Ein häufig angewendetes Standardverfahren ist die alkalische Lyse, bei der die Zellwände und -membranen zerstört und Nucleinsäuren und Proteine weitgehend denaturiert werden. Das so entstandene Lysat wird von unlöslichen Inhaltsstoffen, wie Zelltrümmer, genomische DNA und Proteine, in einem ersten Trennschritt befreit, so daß eine im wesentlichen nur noch die Nucleinsäuren enthaltende Lösung (klares Lysat) erhalten wird. Danach findet die eigentli che Reinigung der Nucleinsäuren an einem Trennelement, beispielsweise an einem Anionenaustauscher, statt.
Für die Reinigung des Lysats werden neben der herkömmlichen Zentrifugationsmethode Trenneinrichtungen verwendet, bei denen das Lysat in einer Trennsäule gefiltert wird (vgl. WO 93/11218). Zusätzlich wird in dieser Druckschrift vorgeschlagen, mehrere Trennsäulen übereinander kaskadenartig anzuordnen. In diesem Fall wird das Lysat in der ersten Trennsäule gereinigt. Das die Nucleinsäuren enthaltende Lysat gelangt dann unmittelbar in die zweite Trennsäule, die mit einem Trennelement zur Isolierung der Nucleinsäuren versehen ist.
Eine Weiterentwicklung dieser Trenneinrichtung ist der DE 299 18 876 U1 zu entnehmen. Bei dieser Trenneinrichtung ist die erste Trennsäule nahezu vollständig in die zweite Trennsäule eingesetzt. In beiden Fällen sind Filter- und Trennelemente im unteren Bereich der Trennsäulen angeordnet, wodurch deren wirksame Fläche beschränkt ist. Hierdurch besteht die Gefahr der Verstopfung. Außerdem ist der apparative Aufwand nicht unerheblich.
Zur Beseitigung dieser Nachteile ist in der DE 102 01 858 U1 vorgeschlagen, die erste Trennsäule durch ein im Vertikalschnitt U-förmiges Filterelement zu ersetzen, das aus einem Filterboden und einem davon hochgehenden, zylindrischen Filtermantel besteht und das die Innenfläche der zweiten Trennsäule fast vollständig oder vollständig bedeckt. Das Filterelement besteht vollständig aus einem Filtermaterial, wobei als Filtermaterial ein gegebenenfalls gefaltetes Filterpapier angegeben wird. Hierdurch wird dem in die Trenneinrichtung eingefüllten Lysat eine wesentlich vergrößerte Oberfläche angeboten. Gleichwohl ist die Filterleistung dieser Trenneinrichtung gering, da der Papierfilter für die bei der Lysatreinigung abzufilternden Inhaltsstoffe als Oberflächenfilter mit der Folge wirkt, daß sich der abgetrennte Rückstand als Filterkuchen auf der anströmseitigen Oberfläche des Filtermaterials sammelt und hierdurch schnell ein hoher Filterwiderstand entsteht. Dies hat einen Einbruch der Durchflußgeschwindigkeit zur Folge. Eine Gravitationsfiltration ist deshalb mit dieser Trenneinrichtung sehr zeitraubend. Es muß entweder mit der Aufprägung von Unterdruck auf der Filtratseite oder von Überdruck auf der Anströmseite gearbeitet werden, um brauchbare Durchflußraten zu erzielen.
Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, eine Trenneinrichtung der vorbeschriebenen Art so auszubilden, daß die Verstopfungsgefahr bei der Filtrierung des Lysats wesentlich verringert wird und damit auch eine wirksame Gravitationsfiltration möglich ist.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß das Filtermaterial derart ausgebildet ist, daß es auf die Inhaltsstoffe des Lysats als Tiefenfilter wirkt, und zwar vorzugsweise derart, daß das Filtermaterial aus einem regelosen Fasergeflecht besteht. Grundgedanke der Erfindung ist es also, ein Filterelement bereitzustellen, bei dem der Rückstand aus dem Lysat innerhalb des Filtermaterials über längere Zeit adsorbiert wird, mit der Folge, daß sich auf der zuflußseitigen Oberfläche kein Filterkuchen bildet, sich vielmehr ein sekundäres Filterbett aufbaut, so daß Teilchen immer kleinerer Durchmesser zurückgehalten werden können, ohne das Filterelement komplett zu verstopfen. Die Filtrierleistung nimmt deshalb nur sehr langsam ab. Es findet keine scharfe Siebung statt. Die Partikel werden vielmehr in einem breiten Spektrum erfaßt.
Die erfindungsgemäße Trenneinrichtung eignet sich für die verstopfungsfreie Abtrennung selbst großer Mengen an Feststoff. Aufgrund der Verstopfungsresistenz hat das erfindungsgemäße Filterelement einen geringen Filterwiderstand, so daß die Durchflußgeschwindigkeit deutlich besser ist als bei den bekannten Trenneinrichtungen. Die Filterleistung ist sogar so gut, daß es nicht – wie bei der Trenneinrichtung nach der DE 102 01 858 A1 – erforderlich ist, daß sich das Filterelement über die gesamte Höhe des Außengefäßes erstreckt. Hinzu kommt, daß die Filtratausbeute sehr hoch ist, weil das Filterelement offenbar aufgrund seiner Kapillarwirkung die Flüssigkeit aus dem Rückstand absaugt.
Damit die erfindungsgemäß vorgesehene Tiefenfiltrationswirkung bezüglich der abzutrennenden Inhaltsstoffe wirksam ist, sollte das Filtermaterial zu Beginn der Filtration Inhaltsstoffe zurückhalten, deren Teilchengröße größer als 5 μm, vorzugsweise größer als 8 μm ist. Später, d.h. nach Aufbau eines sekundären Filterbettes werden auch Teilchen kleinerer Durchmesser zurückgehalten.
Das Fasergeflecht des Filtermaterials kann beispielsweise aus Cellulose-, Glas-, Kunststoff- und/oder Metallfasern hergestellt sein. Es versteht sich, daß auch andere Materialien in Frage kommen, die sich für einen Tiefenfilter eignen.
Um eine für den vorgenannten Zweck ausreichende Filterkapazität zur Verfügung zu stellen, sollte das Filtermaterial eine Dicke von mindestens 1 mm haben. Es versteht sich, daß die Dicke des Filtermaterials auch größer sein kann, wenn entsprechende Kapazitätsanforderungen bestehen.
Wie bei der Trenneinrichtung nach der DE 102 01 858 A1 sollte der Filtermantel zumindest in dem eingesteckten Bereich aus Filtermaterial bestehen. Vorzuziehen ist es jedoch, wenn das Filterelement vollständig aus dem Filtermaterial besteht. In diesem Fall ist es zweckmäßig, daß das Filterelement Eigenstabilität hat, so daß es in einem radialen Abstand zur Innenseite des Außengefäßes angeordnet werden kann. Auf diese Weise wird der Durchfluß des Lysats durch die Innenwandung des Außengefäßes nicht behindert.
Die Formgebung des Filtermantels ist nicht kritisch. Es bietet sich an, dem Filtermantel einen zylindrischen oder sich nach oben öffnenden kegelförmigen Mantelabschnitt zu geben. Darüber hinaus ist es zweckmäßig, daß der Filtermantel einen über das Außengefäß vorstehenden Kragen aufweist, der gegenüber dem Außengefäß erweitert ist. Der Kragen sollte einen Randsteg ausbilden, der auf dem oberen Öffnungsrad des Außengefäßes aufliegt.
Die erfindungsgemäße Trenneinrichtung eignet sich für die isolierte Reinigung des Lysats, wenn das Außengefäß untenseitig geschlossen ist, es also die Funktion eines Auffanggefäßes hat. Dies hat allerdings den Nachteil, daß das klare Lysat (Filtrat) anschließend in eine weitere Trennvorrichtung übertragen werden muß, in der dann die Isolierung der Nucleinsäuren über ein entsprechendes Trennelement erfolgt. Um diesen Schritt zu vermeiden, empfiehlt es sich, das Außengefäß als Trennsäule mit einer untenseitigen Ausflußöffnung auszubilden, wobei zwischen dieser und dem Filterelement ein Trennelement angeordnet ist. Sofern die erfindungsgemäße Trenneinrichtung zur Isolierung von Nucleinsäuren verwendet wird, sollte das Trennelement derart ausgebildet sein, daß mit dessen Hilfe Nucleinsäuren, die das Filterelement passiert haben, aufreinigbar, d.h. isolierbar sind. Das Trennelement kann auf dem Prinzip des Anionenaustauschers, der Silicamebrantechnologie und anderen aus dem Stand der Technik bekannten Prinzipien basieren.
In der Zeichnung ist die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher veranschaulicht. Es zeigen:
1 eine erste Ausführungsform der erfindungsgemäßen Trenneinrichtung im Vertikalschnitt;
2 eine zweite Ausführungsform der erfindungsgemäßen Trenneinrichtung im Vertikalschnitt;
3 eine dritte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Trenneinrichtung im Vertikalschnitt und
4 eine Graphik zur Darstellung von Vergleichsversuchen.
Den in den 1 bis 3 dargestellten Ausführungsbeispielen ist gemeinsam, daß sie jeweils eine Trenneinrichtung 1, 2, 3 ausbilden, die sich bis auf das eingesetzte Filterelement gleichen. So weisen die Trenneinrichtungen 1, 2, 3 eine Trennsäule 4 zylindrischen Querschnitts auf, die eine obenseitige Öffnung 5 hat. Untenseitig bildet die Trennsäule 4 einen ringförmigen Absatz 6 aus. Auf dem Absatz 6 ruht eine dreischichtige Kombination aus einem Trennelement 7 und dieses beidseitig einschließenden Fritten 8, 9, welche für eine Fixierung des Trennelements 7 sorgen. Das Trennelement 7 ist als Anionenaustauscher ausgebildet, so daß bei Einsatz der Trenneinrichtungen 1, 2, 3 zur Isolierung von Nucleinsäuren diese direkt an dem Trennelement 7 binden können. An den Absatz 6 schließt sich eine Auslauftülle 10 an, die in einer Auslauföffnung 11 endet.
In die Trenneinrichtungen 1, 2, 3 sind über die obere Öffnung 5 jeweils ein Filterelement 12, 13, 14 eingesetzt. Die Filterelemente 12, 13, 14 bestehen vollständig aus Filtermaterial mit Tiefenfilterwirkung. Das in 1 dargestellte Filterelement 12 hat einen U-förmigen Querschnitt mit einem gerundeten Filterboden 15, an den sich nach oben hin ein zylindrischer Filtermantel 16 anschließt. Der obere Rand des Filtermantels 16 schließt bündig mit der Öffnung 5 ab.
Das in 2 dargestellte Filterelement 13 unterscheidet sich von dem Filterelement 12 dadurch, daß der Filtermantel 17 mit seinem oberen Rand 18 über die Öffnung 5 der Trennsäule 4 vorsteht und dort einen radial nach außen gehenden Randsteg 18 ausbildet, der auf der oberen Stirnseite der Trennsäule 4 aufliegt und somit das Filterelement 13 festlegt. Untenseitig geht der Filtermantel 17 in gleicher Weise wie bei dem Filterelement 12 in einen gerundeten Filterboden 19 über.
Das Filterelement 14 weist – wie bei den vorangehenden Ausführungsformen – einen gerundeten Filterboden 20 und einen sich daran anschließenden, nach oben gehenden Filtermantel 21 auf. Der Filtermantel 21 hat einen zylindrischen Mantelabschnitt 22, der sich bis zur Öffnung 5 der Trennsäule 4 nach oben hin erstreckt. Dann weitet sich der Filtermantel 21 in einen kegelstumpfförmigen Mantelabschnitt 23 auf.
Die Höhe der Filtermäntel 16, 17, 21 und damit die gesamte filterwirksame Fläche der Filterelemente 12, 13, 14 kann den jeweiligen Anforderungen angepaßt werden. Bei den gezeigten Ausführungsbeispielen haben die Filtermäntel 16, 17, 21 eine mittlere Höhe. Durch Ausdehnung der Filtermäntel nach unten in Richtung auf das Trennelement 7 kann die wirksame Filterfläche und damit die Filterkapazität vergrößert werden.
In der Graphik gemäß 4 sind fünf Balkengruppen 31, 32, 33, 34, 35 nebeneinander auf einer Abzisse dargestellt. Jede Balkengruppe 31 bis 35 besteht aus einem linken Balken – beispielhaft mit 36 bezeichnet –, einem mittleren Balken – beispielhaft mit 37 bezeichnet – und einem rechten Balken – beispielhaft mit 38 bezeichnet –, wobei der linke Balken 36 das gefilterte Lysatvolumen in ml (Filtrat), der mittlere Balken 37 die Trennzeit in min und der rechte Balken 38 die Flußrate in ml/min anzeigen. Die Skala neben der Ordinate gibt die jeweiligen Zahlenwerte an.
Die Balkengruppe 31 beschreibt die werte bei Anwendung einer Zentrifuge (Hermle Z383, 5000 rpm bei 4°C). Die Säulengruppe 32 gibt die entsprechenden werte für einen Faltenfilter mit Durchmesser 15 cm an. Die Säulengruppe 33 bezieht sich auf eine Trenneinrichtung gemäß der WO 93/11218 (QIAFilter Cartridge), während die Balkengruppe 34 Werte anzeigt, die mit einer Trenneinrichtung gemäß DE 102 01 858 A1 erzielt worden sind. Die letzte Balkengruppe 35 zeigt die Werte an, die bei Anwendung der erfindungsgemäßen Trenneinrichtung 1 gemäß 1 erzielt worden sind. Deren Filterelement 12 besteht aus Cellulosefasern, das in Wasser aufgeschwemmt und durch Unterdruck angesaugt auf einem Sieb abgeschieden worden ist, wobei die Form des Siebes die innere Form des Filterelements 12 bestimmt hat. Über die Eintauchdauer und den angelegten Unterdruck kann die Dicke des Filterelements 12 und damit auch gezielt dessen Schmutzaufnahmekapazität eingestellt werden. Im vorliegenden Fall lag die Dicke des Filterelements 12 zwischen 1 bis 2 mm.
Bei den Versuchen wurde wie folgt vorgegangen. Gemäß bekannter mikrobiologischer Verfahren wurde eine pUC18 enthaltende E. coli-Kultur über Nacht in LB Medium kultiviert und mit einer OD von 6 durch Zentrifugation geerntet. Ein Zellpellet einer 50 ml Kultur wurde in 7 ml eines 50 mM Tris/HCl Puffers (pH 8.0) mit 10 mM EDTA und 100 μg/ml RNase A resuspendiert. Die Zellyse erfolgte durch Zugabe von 7 ml einer 200 mM NaOH Lösung mit 1% SDS. Durch 7 ml 2.8 M Kaliumacetat (pH 5.1) wurde die Probe nach 5 Minuten neutralisiert und wurden Proteine sowie genomische DNA präzipitiert. Es ergab sich ein dicker, flockiger weißer Niederschlag, der nun von der die Nucleinsäure enthaltenen Lösung abgetrennt werden mußte.
Für den direkten Leistungsvergleich wurden mehrere ungeklärte Lysate hergestellt und mittels der vorbeschriebenen Methoden geklärt. Die Trennung wurde als beendet bewertet, wenn zwischen zwei Filtrattropfen mehr als 10 Sekunden verstrichen waren.
Wie den Balkengruppen 31 bis 35 zu entnehmen ist, stellt die Zentrifugenklärung gemäß Balkengruppe 31 den Goldstandard dar, was die Lysatausbeute (Lysatvolumen) betrifft. An zweiter Stelle rangiert schon die erfindungsgemäße Trenneinrichtung 1, 2, 3, bedingt durch die saugende Eigenschaft der Filterelemente 12, 13, 14, die nur wenig Flüssigkeit zurückläßt. Dagegen wirkt bei den anderen Methoden nur der hydrostatische Druck. Dieser ist schnell zu gering, um die Flüssigkeit möglichst vollständig gegen den Filterwiderstand durchzudrücken.
Bei den durch die mittleren Balken 37 dargestellten Trennzeiten zeigt die erfindungsgemäße Trenneinrichtung 1, 2, 3 ihre klare Überlegenheit gegenüber den im Stand der Technik bekannten Methoden und Einrichtungen. Mit einer Trennzeit von ca. 2,5 Minuten ist sie zwölfmal schneller als die schnell verstopfende Trenneinrichtung gemäß der DE 102 01 858 A1 .
Eine Wiederholung der Versuche mit 100 ml und 150 ml Kulturvolumen ergab nur geringe Unterschiede zur 50 ml Kultur. Erneut lieferte nur die Zentrifugation Mengen geklärten Lysats, die größer waren als die bei der erfindungsgemäßen Trenneinrichtung 1, 2, 3. Trotz der Überladung mit Kulturvolumen kam es bei dieser Trenneinrichtung 1, 2, 3 nicht zu einer Verstopfung. Die Trennzeit lag immer noch bei nur 50% der Trennzeit, die mit der zweitschnellsten Trenneinrichtung gemäß Balkengruppe 33 erzielt werden konnte.
Die Plasmid-DNA in dem geklärten Lysat wurde dann über das Trennelement 7 der Trennsäule 4 weiter auf gereinigt. Das Trennelement 7 bestand aus einem Anionenaustauscher auf Silicabasis. Dazu wurde das Filterelement 12, 13, 14 aus der Trennsäule 4 entfernt und die Trennsäule 4 gemäß NucleoBond PC 500 Protokoll (MACHEREY-NAGEL) gewaschen und das Plasmid eluiert. Es konnten aus 50 ml E. coli-Kultur 218 μg pUC18 Plasmid-DNA isoliert werden. Die Quotienten A260/A280 und A260/A230 betrugen 1.955 bzw. 2.082.

Claims

Trenneinrichtung (1, 2, 3) für die Trennung von unlöslichen Inhaltsstoffen aus einer biologischen Probenflüssigkeit in Form eines Lysats mit einem säulenartigen Außengefäß (4), das obenseitig eine Einfüllöffnung (5) aufweist, und mit einem darin eingesetzten Filterelement (12, 13, 14), das einen Filterboden (15, 19, 20) und einen davon hochgehenden Filtermantel (16, 17, 21) aufweist, wobei Filterboden (15, 19, 20) und Filtermantel (16, 17, 21) zumindest teilweise aus einem Filtermaterial bestehen, dadurch gekennzeichnet, daß das Filtermaterial derart ausgebildet ist, daß es auf die Inhaltsstoffe als Tiefenfilter wirkt.
Trenneinrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Filtermaterial anfangs Inhaltsstoffe zurückhält, deren Teilchengröße größer als 5 μm ist.
Trenneinrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Filtermaterial aus einem regelosen Fasergeflecht besteht.
Trenneinrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Fasergeflecht aus Cellulose-, Glas-, Kunststoff- und/oder Metallfasern hergestellt ist.
Trenneinrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Filtermaterial eine Dicke von wenigstens 1 mm hat.
Trenneinrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Filtermantel (16, 17, 21) zumindest in dem eingesetzten Bereich aus Filtermaterial besteht.
Trenneinrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Filterelement (12, 13, 14) vollständig aus Filtermaterial besteht.
Trenneinrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Filterelement (12, 13, 14) Eigenstabilität hat.
Trenneinrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Filterelement (12, 13, 14) radialen Abstand zum Außengefäß (4) hat.
Trenneinrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Filtermantel (16, 17, 21) einen zylindrischen Mantelabschnitt (22) hat.
Trenneinrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Filterelement (12, 13, 14) einen sich über die Einfüllöffnung (5) hinaus erweiternden Mantelabschnitt (23) hat.
Trenneinrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Filtermantel (17, 21) einen über das Außengefäß (4) vorstehenden Kragen (18, 23) aufweist, der gegenüber dem Außengefäß (4) erweitert ist.
Trenneinrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Kragen (18, 23) einen Randsteg (18) ausbildet, der auf dem oberen Öffnungsrand des Außengefäßes (4) aufliegt.
Trenneinrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Außengefäß als Trennsäule (4) mit einer untenseitigen Ausflußöffnung (11) ausgebildet ist, wobei zwischen dieser und dem Filterelement (12, 13, 14) ein Trennelement (7) angeordnet ist.
Trenneinrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Trennelement (7) derart ausgebildet ist, daß mit dessen Hilfe Nucleinsäuren, die das Filterelement (12, 13, 14) passiert haben, aufreinigbar sind.