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Gegenstand
der Erfindung ist die Trennung von Nukleinsäuren aus ganzen Zellen in einer
Probe. Gegenstand der Erfindung ist insbesondere die Gewinnung von
genomischer DNA aus Zellen einer Blutprobe eines Patienten.
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Geläufige Verfahren
zur Trennung von Nukleinsäuren
aus einer Probe, einschließlich
der einzelnen Schritte der Zelllyse, Kernlyse, Proteinausfällung, Rehydratisierung
der DNA und Verdauung der RNA, können
zeitaufwändig
und kostspielig sein. Einer der zahlreichen erhältlichen Kits zur Reinigung von
genomischer DNA aus beispielsweise Vollblutproben ist der Wizard® Genomic
DNA Purification Kit von Promega. Der Kit zur Reinigung von 50 × 3 ml Probe
kann sehr teuer sein und die Durchführung des Protokolls beansprucht
ca. 45 Minuten. Andere Verfahren sind zwar erhältlich, doch bezeichnenderweise
ist ihre Durchführung
zeitintensiver und sie erfordern die Verwendung von Proteinasen
oder organischen Lösungsmitteln,
oder die Verwendung von Säulen
oder Harzen zur Reinigung der Fraktionen einer Probe.
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Die
vorliegende Erfindung verbessert den Stand der Technik, ein neuartiges
Verfahren zur Reinigung von Nukleinsäuren aus ganzen Zellen in einer Probe
bereitstellend. Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird ein Verfahren zur Reinigung von Nukleinsäuren aus
ganzen Zellen in einer Probe bereitgestellt, das das Führen über die
Oberfläche
von mindestens einer porösen
Hohlfaser-Membran in einer Filtervorrichtung mit einem Probeneinlass
und einem Probenauslass, den Weg vom Einlass zum Auslass, der teilweise
durch die Membran oder Membranen okkludiert ist, und die Erzeugung
eines Transmembrandrucks umfasst.
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Das
Verfahren des Filtrierens eines Stroms durch die Oberfläche einer
Membran ist weithin als „Cross-Flow
Filtration" (siehe
beispielsweise Hood, R., 1998, New Frontiers in Screening for Microbial
Biocatalysts, 77–86;
WO 96/04067; WO 96/04068; WO 96/17673; WO 96/20402) bekannt. Der
Erfinder der vorliegenden Erfindung hat festgestellt, dass diese überraschenderweise
zur Ruptur der Zell- und Kernmembranen, um Nukleinsäuren zu
reinigen, eingesetzt werden kann. Durch nur teilweises Okkludieren des
Weges zwischen dem Einlass und dem Auslass, d.h. durch das Gewährleisten
eines Stroms um die Membran oder Membranen herum, ist es für größere Teile
der Zelldebris möglich,
eher um die Membran herumzugelangen als die Poren zu verstopfen.
Die Zellen werden nicht nur aufgebrochen, sondern die Nukleinsäuren, die
in der Zelle enthalten sind, werden auf der Oberfläche und
im Inneren der Membran abgelagert. Die Experimente (nachstehend)
haben gezeigt, dass ein sehr beträchtlicher Anteil der zellulären Nukleinsäuren durch
die Membran zurückgehalten
wird. Außerdem
haben Tests (siehe nachstehend) unter Verwendung von Molekulargewichtsmarker
als Standards zum Vergleich ebenfalls gezeigt, dass das durchschnittliche
Molekulargewicht der gewonnenen DNA sehr hoch ist, was darauf hinweist, dass,
obgleich die auf die Zellen ausgeübten Scherungskräfte zur
Ruptur der Zell- und Kernmembranen ausreichend sind, sie nicht so
groß sind,
um erhebliche Scherung der Nukleinsäuren zu verursachen.
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Dies
ist besonders für
die anschließende Testung
der gewonnenen Nukleinsäuren
wichtig, da es möglich
ist, dass beschädigte
Stränge
nicht die entsprechende Bindungsstelle (d.h. Epitop) aufweisen oder
nicht die für
die richtige PCR-Primerbindung und -Elongation ausreichende Sequenz
bereitstellen können,
um Amplifizierung auszuführen.
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Ein
minimaler Transmembrandruck von 0,25 bar ist erforderlich, um die
Zellruptur zu bewirken. Wenn der Transmembrandruck erhöht ist,
der Rupturvorgang wirkungsvoller ist, erhöht sich die Scherung der Nukleinsäuren leicht
und bei höheren
Drücken
kann Deformation der Membran auftreten. Wenn der Transmembrandruck
erhöht
ist, wird auch festgestellt, dass mehr Nukleinsäuren in den Poren/Zwischenräumen der
Filtermembran abgelagert werden, und bei hohen Transmembrandrücken ist
es möglich,
dass Nukleinsäuren,
insbesondere kürzere Stücke der
Nukleinsäuren,
gänzlich
durch die Membran gedrängt
werden und damit nicht an der Membran zurückgehalten werden können. Auf
Grund all dessen scheint ein maximaler Transmembrandruck von ca.
1,25 bar angemessen zu sein, obgleich natürlich der maximale Transmembrandruck
für eine
bestimmte Vorrichtung mittels einfacher Experimente leicht bestimmt
werden kann.
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Die
lichtmikroskopische Untersuchung der Membranen hat gezeigt, dass
ihre Oberfläche
mit Nukleinsäuren
bedeckt war und keine anderen Zellbestandteile sichtbar waren.
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Die
Entfernung von anderen Zellbestandteilen kann weiter durch die Verwendung
von Membranen mit einem Lumen (z.B. Hohlfaser-Membranen) verbessert
werden, indem das Austreten des Filtrats über das Lumen ermöglicht wird.
Zum Beispiel kann ein Ende einer Hohlfaser-Membran (oder einer Reihe von
Hohlfaser-Membranen) abgedichtet werden und das andere Ende der
Membranen) kann an ein Drosselventil für das Lumen angeschlossen werden,
um den Auslauf des Filtrats, wenn es einen ausreichend hohen Druck
zur Öffnung
des Drosselventils erreicht hat, zu ermöglichen. Zum Beispiel kann
eine Vorrichtung mit einem 0,5-bar-Drosselventil am Auslass mit einem
Lumenauslass verwendet werden, an dem sich ein 0,25-bar-Drosselventil
befindet. Alternativ kann der erforderliche Druck zur Öffnung des
Drosselventils für
das Lumen größer sein
als der für
das Auslassventil, in welchem Fall die Nukleinsäuren überwiegender an der Außenseite
der Membran, eher als in den Poren/Zwischenräumen, abgelagert werden. Ein
erforderlicher zu niedriger Druck, um die Drossel für das Lumen
zu öffnen,
kann in einem zu hohen Transmembrandruck resultieren, wiederum resultierend
in erhöhtem
Scheren der Nukleinsäuren und
Verlust an Nukleinsäuren
durch den Lumenauslass. Geeignete Werte für Drosselventile am Auslass und
für das
Lumen können
leicht vom Fachmann durch einfaches Experimentieren bestimmt werden.
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Die
Experimente (nachstehend) haben auch gezeigt, dass eine erfolgreiche
PCR-Amplifizierung direkt
an den Membranen, an die die Nukleinsäuren gebunden sind, durchgeführt werden
kann; RNA kann unter Verwendung eines Eingangsschrittes der reversen
Transkription amplifiziert werden. PCR-Verfahren sind allgemein
bekannt (PCR (Volume 1 (Band 1)): A practical approach, Eds. (Hrsg.)
M. J. McPherson, P. Quirke und G. R. Taylor, Oxford University Press,
1991) und können
leicht eingesetzt werden.
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Die
einfache Methodik der vorliegenden Erfindung bedeutet, dass das
verwendete Gerät
relativ kostengünstig
sein kann. Von Bedeutung ist, dass Nukleinsäuren, insbesondere genomische
DNA, aus einer Probe, wie zum Beispiel einer Vollblutprobe, in einer
sehr kurzen Zeitdauer gewonnen werden können – Experimente (nachstehend)
zeigen, dass Nukleinsäuren
aus 5 × 1
ml Proben in einer Gesamtzeit von ca. 2 Minuten abgetrennt werden
können.
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Natürlich ist
es wünschenswert,
die größtmögliche Menge
an Nukleinsäuren
aus einer Probe zu gewinnen und damit könnte die Membran oder könnten die
Membranen das meiste des Weges zwischen Einlass und Auslass besetzen.
Zum Beispiel kann die Membran mindestens 90% der Querschnittsfläche der
Filtervorrichtung zwischen Einlass und Auslass einnehmen. Auf diese
Art und Weise wird maximaler zellulärer Kontakt mit der Membran (und
damit Zellruptur und Nukleinsäuregewinnung) erreicht,
während
ein Strom von Zelldebris um die Membran herum ermöglicht wird,
somit gewährleistend,
dass die endgültigen
Membran-gebundenen Nukleinsäuren
im Wesentlichen frei von Verunreinigungen sind. Es kann auch wünschenswert
sein, die Filtervorrichtung z.B. mit einem geeigneten Puffer vor der
Probeneingabe zu füllen,
so dass Druck auf die gesamte Probe ausgeübt wird, wenn sie vom Einlass zum
Auslass gelangt. In ähnlicher
Weise kann ein Spülschritt
durchgeführt
werden, nachdem die Probe in die Filtervorrichtung eingegeben wurde,
um zu gewährleisten,
dass alles (das durch die Membran Zurückgehaltene ausgenommen) zum
Auslass durchgelangt.
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Die
Funktion der Poren in der Membran besteht darin, die Bildung einer
Transmembrandruckdifferenz und das Abfangen von Nukleinsäuren zu
ermöglichen.
Die Poren ermöglichen
auch kleineren Teilen der Zelldebris, leicht zum Auslass durchzugelangen.
Poren können
eine Molekulargewichtsausschlussgrenze (MWCO) von 105–107 Dalton haben, beispielsweise ca. 106 Dalton.
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Beispiele
für Membranen,
die verwendet werden können,
sind eine Polypropylen-Membran mit
einem Porendurchmesser von 0,2 μm
(zum Beispiel von AKZO NOBEL) und die Polysulfon-Membranmodelle
ULF 1 Million und ULF 750 von A/G Technologies Corp. USA, sowie
die Modelle 9002 und 9005 von Fresenius A.G. (St. Wendel, Deutschland). Die
Membranen sollten die Nukleinsäuren
nicht abstoßen
und daher könnte
es notwendig sein, sie vorzubehandeln, um zu gewährleisten, dass sie hydrophil
sind und/oder eine positive Ladung besitzen. Im Fall der Polypropylen-Membranen,
können
sie in einer 20%igen Lösung
von Tween vorgeweicht werden. Membranen mit groben Oberflächen können verwendet
werden, um die Ruptur der Zell- und Kernmembranen zu fördern. Dies
kann, falls notwendig, durch Vorbehandlung der Membranen erreicht
werden.
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Die
Membranen können
mit Agenzien behandelt werden, die bestimmte Nukleinsäuren oder Nukleinsäuresequenzen
detektieren. Zum Beispiel kann eine Membran mit einem Antikörper, der
spezifisch für
eine RNA-Sequenz ist, vorbehandelt werden. Die Bindung der RNA an
den Antikörper
kann anschließend
durch die Veränderung
in der Absorption/Fluoreszenz durch den Antikörper detektiert werden. Antikörper, ihre
Herstellung und Anwendungen sind gut bekannt (Harlow, E. und Lane,
D., „Antibodies – A Laboratory
Manual", Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, New York, 1988). Alternativ
kann ein ELISA-ähnlicher
Test durchgeführt
werden. Alternativ kann ein erster Antikörper an die an der Membran
gereinigten Nukleinsäuren
angebracht werden. Nach dem Waschen, um unspezifisch gebundenen
Antikörper
zu entfernen, kann ein zweiter Antikörper, der spezifisch für den ersten
ist, angebracht werden; der zweite Antikörper, an den ein Signalmolekül, wie zum
Beispiel Luciferase, konjugiert ist, liefert dadurch ein verstärktes Detektionssignal.
Eine Oligonukleotid-Sonde kann mit Polymerase-DNA eingesetzt werden,
die als Sonde für
Target- oder komplementäre
DNA-Sequenzen innerhalb
der Vorrichtung an immobilisierter DNA auf der Oberfläche der
Membran (zum Beispiel Mosaic Technologies Inc. Acrydite DNA-Gel)
dient.
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Im
Fall der Hohlfaser-Membranen ist es möglich, ein Reagenz oder eine
Reihe von Reagenzien im Volumen der Fasern entlangzuführen. Diese Reagenzien
können
z.B. spezifische DNA- oder RNA-Sequenzen detektieren. Die Reagenzien
können
in Kombination mit der Membran ausgewählt werden, damit sie nicht
aus der Membran heraustreten, wenn sie entlang geführt werden,
und um somit sicherzustellen, dass nur Stoffe (d.h. Nukleinsäuren), die
an die Membran gebunden sind, mit den Reagenzien in Kontakt treten.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird auch eine Filtervorrichtung mit einem Probeneinlass und
einem Probenauslass bereitgestellt, der Weg vom Einlass zum Auslass
ist teilweise durch mindestens eine poröse Hohlfaser-Membran okkludiert,
die Vorrichtung liefert bei Verwendung einen Transmembrandruck von
mindestens 0,25 bar. Die Filtervorrichtung kann bei einem Verfahren
zur Nukleinsäurereinigung
verwendet werden. Die Filtervorrichtung kann bei einem Verfahren
zur Reinigung von Nuleinsäuren gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet werden.
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Typische
Filtervorrichtungen, verwendet gemäß der vorliegenden Erfindung,
umfassen einen Einlass und einen Auslass (aus PVC hergestellt) mit einem
Innendurchmesser von 1,25 mm, der Auslass ist mit einem 0,5-bar-Drosselventil ausgerüstet. Der Einlass
und der Auslass sind senkrecht zum Hauptteil der Filtervorrichtung
und auf entgegengesetzten Seiten davon angeordnet. Die Gesamtlänge des Hauptteils
(3,25 mm Innendurchmesser) beträgt
60 mm, der Einlass und Auslass sind 30 mm voneinander entfernt.
14 Fasern des Polysulfon-Membran-Typs ULF 750 oder 1 Million, oder
9002 (Fresenius A.G., St Wendel, Deutschland) liegen entlang der Länge des
Hauptteils vor und haben eine Gesamtoberfläche von 6,28 cm2.
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Eine
alternative Vorrichtung hat dieselben technischen Abmessungen wie
vorstehend, doch ist mit 6 Fasern eines Polysulfon-Membran-Typs
ULF 750 oder 1 Million oder 9005 (Fresenius A.G.) entlang der Länge des
Hauptteils ausgestattet, die eine Gesamtmembranoberfläche von
6,28 cm2 aufweisen.
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Eine
alternative Vorrichtung hat dieselben technischen Abmessungen wie
vorstehend, doch ist entlang der Länge des Hauptteils mit 4 Polypropylen-Fasern
ausgestattet, die eine Porengröße von 0,2 μm haben und
eine Gesamtmembranoberfläche von
6,28 cm2 aufweisen.
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Membranen
mit einer größeren Porengröße (z.B.
ULF 1 Million) sind, im Vergleich zu Membranen mit einer kleineren
Porengröße (z.B.
ULF 750), zur Reinigung von Nukleinsäuren mit einer größeren Durchschnittslänge verwendbar.
Dies scheint an der Probentrübung
zu liegen – trübe Proben
(zum Beispiel Blut, das teilweise geronnen ist) erfordern mehr Kraft,
um sie durch die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung zu leiten,
als weniger trübe
Proben (z.B. frisches Blut). Umso mehr Kraft erforderlich ist, umso mehr
mechanischer Schaden tritt bei den zu reinigenden Nukleinsäuren auf,
und damit ist die Durchschnittslänge
der gereinigten Nukleinsäuren
umso kürzer.
In ähnlicher
Weise bedeutet die Ausstattung mit einer Membran mit einer kleinen
Porengröße, dass
mehr Kraft erforderlich ist, um die Teile der zu reinigenden Probe,
die keine Nukleinsäuren
darstellen, von der Membran zu entfernen, und damit größerer mechanischer
Schaden verursacht wird und kürzere
Nukleinsäurefragmente
gereinigt werden.
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Wie
vorstehend bei der Verwendung von Hohlfaser-Membranen diskutiert,
können
zusätzliche Auslässe an das
Lumen angebracht werden, um Filtrat, das im Lumen der Filtermembranen
angesammelt wurde, zu entfernen.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird auch die erfindungsgemäße Anwendung einer Filtervorrichtung
in einem erfindungsgemäßen Verfahren zur
Reinigung von Nukleinsäuren
bereitgestellt.
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Sobald
die Nukleinsäuren
unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens an der Membran zurückgehalten
wurden, können
sie nicht nur analysiert und beispielsweise sequenziert werden,
wie vorstehend beschrieben, sondern auch von der Membran eluiert
werden. Um dies zu erreichen, kann ein elektrischer Strom an eine
Lösung,
die die Membran umgibt, angelegt werden. Zum Beispiel kann ein Gleichstrom
von 0,2 Ampere bei 1000 Volt angelegt werden, der verursacht, dass
sich die an der Membran zurückgehaltenen
Nukleinsäuren
von der Membran abtrennen. Sobald die Nukleinsäuren in Lösung sind, können sie
weiter bearbeitet werden. Die genauen Kriterien des elektrischen
Stroms, der an die zurückgehaltenen
Nukleinsäuren
angelegt wird, können
natürlich
vom vorstehenden Beispiel variieren und geeignete Bedingungen werden
für den
Fachmann leicht offensichtlich sein. Zum Beispiel wurde festgestellt,
dass zwischen der Durchschnittsgröße der zu eluierenden Nukleinsäuremoleküle und der Spannung,
die zur Eluierung dieser angelegt werden muss, eine umgekehrt proportionale
Beziehung besteht, d.h. kürzere
Nukleinsäuremoleküle erfordern größere angelegte
Spannungen als längere
Nukleinsäuremoleküle. Ohne
durch eine bestimmte Folgerung beschränkt sein zu wollen, scheint
es doch, dass längere
Nukleinsäuremoleküle weniger
Kontaktstellen mit der Membran pro Einheitslänge haben als kürzere Nukleinsäuremoleküle und daher
einen niedrigeren elektrischen Strom erfordern, um von der Membran
abgetrennt zu werden.
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Die
Fähigkeit,
Nukleinsäuren,
sobald sie aus ganzen Zellen in einer Probe abgetrennt wurden, von der
Membran zu eluieren, bedeutet, dass Nukleinsäuren aus einem großen Volumen
von beispielsweise Vollblut aufgereinigt werden können und
dann als relativ kleines Flüssigkeitsvolumen
eluiert werden können,
was die anschließende
Analyse vereinfacht und erleichtert.
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Da
die verschiedenen Nukleinsäuremoleküle unterschiedliche
physikalische Eigenschaften besitzen, können bei der Eluierung von
Nukleinsäuren verschiedene
Nukleinsäuren
(beispielsweise bakterielle DNA und menschliche genomische DNA)
unter Anwendung eines geeigneten elektrischen Stroms (d.h. durch
Ausführung
von Elektrophorese) voneinander getrennt werden, beispielsweise
unter Anwendung eines Wechselstroms, der wahlweise in seiner Frequenz
variiert (siehe „Shock
Treatment", New
Scientist, 6 June 1998; „Devilish
tricks with tiny chips", New
Scientist, 1 March 1997, S. 22; und daselbst weitere Literatur).
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Der
Wechselstrom kann eine Frequenz zwischen 100 Hertz und 10 Megahertz
besitzen. Zum Beispiel wird ein entlang der Länge der Membran angelegter
Strom von 100 Kilohertz bewirken, dass sich bakterielle und menschliche
genomische DNA relativ zueinander bewegen.
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Die
erfindungsgemäßen Verfahren
und Vorrichtungen können
in Verbindung mit der Gen-Chip-Technologie verwendet werden – sobald die
Nukleinsäuren
durch Ansammlung an der Oberfläche
der Membran aufgereinigt wurden, kann diese mit einem Gen-Chip verbunden
werden; der Gen-Chip wird anschließend analysiert, um die An- oder
Abwesenheit spezifischer Nukleinsäuren unter den aufgereinigten
Nukleinsäuren
zu bestimmen.
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Alternativ
kann ein Gen-Chip auf der Oberfläche
der porösen
Membran oder Membranen angebracht werden. Nachdem die Reinigung
stattgefunden hat, können
nicht-hybridisierte
Nukleinsäuren entfernt
werden und der Gen-Chip kann analysiert werden.
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Diese
Anwendung der Gen-Chip-Technologie kann eine äußerst schnelle Analyse einer
Probe, die ganze Zellen enthält,
gewährleisten,
die Ansammlung, Reinigung und Analyse von Nukleinsäuren aus
Zellen in einer einzigen Vorrichtung und in einem äußerst kurzen
Zeitraum ermöglichend.
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Um
die Ansammlung der Nukleinsäuren
an den porösen
Membranen zu verbessern, können
die Membranen während
des Reinigungsvorgangs rotiert werden, damit eine gleichmäßige Verteilung
der gereinigten Nukleinsäuren
gewährleistet
wird und um der Anhäufung
von übermäßigen Nukleinsäuren an irgendeiner
Stelle (und dem Verlust an Effizienz, der mit einer solchen Anhäufung einhergehen
kann) vorzubeugen.
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Die
Erfindung wird weiter aus der folgenden Beschreibung ersichtlich,
mit Verweis auf mehrere Abbildungen der begleitenden Zeichnungen,
die, nur als Beispiel, eine Form der Reinigung von Nukleinsäuren zeigen.
Die Abbildungen:
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1 und 2 zeigen
verwendete erfindungsgemäße Vorrichtungen;
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3 zeigt
die Draufsicht des Schnittes I-I der 1; und
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4 und 5 zeigen
Nukleinsäuren (10),
die sich auf der Oberfläche
einer Membran (20) angesammelt haben.
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6 zeigt
eine Vorrichtung für
die erfindungsgemäße Anwendung,
die über
Mittel zum Rotieren der Membranen und zum Anlegen eines elektrischen
Stroms entlang ihrer Länge
verfügt.
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Experimentelles
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Die
folgenden Experimente beschreiben die Reinigung von DNA aus einer
Vollblutprobe vom Schaf in einer Gesamtbearbeitungszeit der Reinigung
von ca. 2 Minuten. Die Gelelektrophorese zeigte, dass die Scherung
bei der angesammelten DNA gering war und ein sehr großer Anteil
der DNA mindestens eine Länge
von 23 kb hat. Absorptionsspektroskopie zeigt, dass mindestens 60%
der in einer Probe verfügbaren
DNA gesammelt wurden. Der PCR-Test zeigte, dass die eluierte DNA
funktionsfähig
war, in der Lage eine Amplifizierung durch PCR zu erzielen. Lichtmikroskopie
zeigte, dass die durch die Membran gereinigte DNA im Wesentlichen
frei von Verunreinigungen, wie der Zelldebris, war.
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Somit
kann das nachstehend erläuterte
Verfahren für
eine schnelle und kostengünstige
Reinigung von Nukleinsäuren
aus ganzen Zellen verwendet werden.
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Filtervorrichtung
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Die
Filtervorrichtung (1) umfasst einen Hauptteil 100,
einen Einlass 110, einen Auslass 120 mit einem
0,5-bar-Drosselventil 121, das sich erst bei einem ausgeübten Mindestdruck
von 0,5 bar öffnet. Die
Filtermembranen 130 bestehen aus 4 hohlen Polypropylen-Fasern
mit einem Porendurchmesser von 0,2 μm und einer Gesamtoberfläche von
6,28 cm2. Das Filtrat gelangt durch den
Filterauslass 120 in eine Sammelkammer 140.
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Eine
alternative Filtervorrichtung (2) umfasst
einen Hauptteil 100, einen Einlass 110, einen
Auslass 120 mit einem 0,5-bar-Drosselventil 121,
4 Polypropylen-Hohlfaser-Membranen 130 mit einem
Porendurchmesser von 0,2 μm,
die an einer Seite 131 abgedichtet sind und auf der anderen
Seite mit einem Lumenauslass 150, der ein 0,25-bar-Drosselventil 151 besitzt,
verbunden sind. Kleine Partikel, die in das Lumen der Membranen 130 gelangen,
können über den
Lumenauslass 150 austreten, um beispielsweise anschließend gesammelt
oder getestet zu werden.
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Reinigung von Nucleinsäuren
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5 × 1 ml Vollblut
vom Schaf wurde durch die Filtervorrichtung (vorstehend) gegeben.
Die Gesamtdurchlaufzeit der 5 ml durch die Vorrichtung betrug 2 Minuten.
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Gelelektrophorese
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Ein
0,8%iges Agarose-Gel wurde unter Verwendung von 0,8% Agarose und
1 × TBE-Puffer (0,8 g Agarose/100
ml Puffer) hergestellt. Die Filtermembran des Reinigungsschrittes
wurde in Teile geschnitten und oben auf das Gel gegeben und eine
Geltasche wurde mit Molekulargewichtsmarker beladen. Dann wurde
an das Gel 30 Minuten eine Spannung von 125 V angelegt. Die Färbung der
DNA zeigte eine Bande bei 700 bp und eine intensive Färbung wurde
im oberen Bereich des Gels, wo die Membranteile aufgegeben wurden,
beobachtet. Dies wies darauf hin, dass DNA-Stränge mit einem hohen Molekulargewicht
durch Membranen angesammelt werden können.
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Das
Experiment wurde wiederholt, wobei das Gel 1,5 Tage bei 125 V laufen
gelassen wurde und wieder eine intensive DNA-Färbung im oberen Bereich des
Gels, wo sich die Membranteile befanden, beobachtet wurde, was die
Anwesenheit von DNA-Strängen
mit einem sehr hohen Molekulargewicht andeutet.
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Die
Membranen (die die gereinigte DNA enthielten) wurden in ein Reaktionsgefäß (Eppendorf) mit
300 μl Wasser
gegeben, das wiederum zur Eluierung der Nukleinsäuren 30 Minuten in einem Wasserbad
bei 37°C
temperiert wurde. Die Lösung
wurde dann entnommen und 30 μl
3 M Natriumacetat-Lösung
(pH 5,4) und 900 μl
Ethanol wurden zugegeben und zur Ausfällung der DNA wurde 5 Minuten
bei –80°C gekühlt. Die
gefällte
DNA wurde dann 5 Minuten bei 13 000 rpm durch Zentrifugieren pelletiert.
Der Überstand
wurde dann abgetrennt, das Pellet resuspendiert und die Suspension
auf einem 0,8%igen Agarose-Gel zusammen mit Molekulargewichtsmarkern
1 Stunde bei 125 V aufgetrennt. Nach dem Sichtbarmachen der DNA
zeigte sich, dass der Molekulargewichtsbereich größer als
23 kb im Allgemeinen verschmiert war.
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DNA-Gewinnung
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DNA
wurde wie vorstehend beschrieben aus einer Membran eluiert und die
Menge an gewonnener DNA unter Verwendung von Absorptionsspektroskopie
berechnet. Daraus ging hervor, dass mehr als 60% der gesamten DNA,
die pro ml Blutprobe vorliegt, aus der Membran wiedergewonnen wurde.
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PCR-Testung
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Die
PCR wurde mit der immobilisierten als auch der eluierten genomischen
DNA, die aus 5 ml Schafsblut erhalten wurde, durchgeführt. Die
DNA wurde wie vorstehend aus Vollblut vom Schaf aufgereinigt und
mit Wasser oder Salzlösungen
wie vorstehend eluiert. Die Bedingungen für die PCR waren Folgende: 1 × Taq-Polymerase-Puffer,
100 pmol CREB (cAMP response element binding protein), 0,625 mM
MgCl2, 0,25 mM dNTPs, 2,5 U Taq-Polymerase
und genomisches DNA-Template. Die Reaktionsmischung wurde zur Denaturierung
der DNA 5 Minuten auf 94°C
erwärmt,
gefolgt von 20 Zyklen von 2 Minuten bei 94°C, 2 Minuten bei 50°C und 2 Minuten
bei 72°C.
Die erwartete Produktgröße von CREB ist
490 bp. Die Analyse der PCR-Reaktion erfolgte auf einem 1,2%igen
Agarose-Gel, ein Fragment von 490 bp wurde für die PCR-Reaktionen sowohl
der immobilisierten als auch der eluierten genomischen DNA beobachtet.
Die negative Kontrollreaktion, die unter den gleichen Reaktionsbedingungen
wie vorstehend, doch ohne Zugabe des DNA-Templates durchgeführt wurde,
zeigte kein PCR-Produkt, wodurch die Spezifität der Primer und die Funktionalität der genomischen
DNA bestätigt
wurden.
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Lichtmikroskopie
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Die
Membranen wurden nach vorstehender Nukleinsäurereinigung aus den Filtervorrichtungen herausgenommen,
in Teile geschnitten und unter das Lichtmikroskop gelegt. Die Teile
sind in den 3 und 4 dargestellt,
wobei in beiden Abbildungen ca. 5 mm der Membran 200 gezeigt
werden, auf der lange DNA-Abschnitte 210 sichtbar sind.
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Die 6 zeigt
eine Filtervorrichtung, die ein Hauptteil 100, einen Einlass 110,
Membranen 130 und einen Auslass 120 mit einem
Drosselventil 121, der zur Sammelkammer 140 führt, umfasst.
Die Filtermembranen 130 sind an den rotierbaren Halterungen 180, 181 befestigt,
die mit einem elektrischen Motor 170 rotiert werden. Rotierbare
Halterungen ermöglichen
die Rotation der Membranen 130, während sie gleichzeitig wasserdicht
abgeschlossen sind und den Fluss eines elektrischen Stroms vom Signalgenerator 160 ermöglichen
und dadurch die Heranführung
der Nukleinsäuren
an die Membranen 130 ermöglichen.