JP3154294B2

JP3154294B2 - 核酸回収方法および核酸回収装置

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Publication number: JP3154294B2
Application number: JP23312195A
Authority: JP
Inventors: 準二有澤; 主幸木村; 正勝佐野; 信夫勝浦; 治五十嵐; 敦中山
Original assignee: Nix Inc
Current assignee: Nix Inc
Priority date: 1995-05-19
Filing date: 1995-09-11
Publication date: 2001-04-09
Anticipated expiration: 2015-09-11
Also published as: US5891694A; JPH0937763A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、微生物を含む溶液から
核酸を回収する方法及びその装置に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】医療産業における遺伝子組み替え技術の
発達により、生物製剤の製造は遺伝子組み替えにより行
われつつある。例えば、ヒトインシュリンや肝炎の治療
に普及しつつあるインターフェロン、または抗癌剤とし
て期待されているインターロイキン等、多くのタンパク
液性因子が難治疾患の治療薬として使用されている。こ
れらタンパク質因子は、人の遺伝子を大腸菌等に組み込
み、菌にこれらを産生させその後、目的物を菌体の外に
放出する遺伝子を別に組み込むか、または菌体を別の酵
素で溶かし内容物を回収する方法により製造されてい
る。

【０００３】しかし、これらの方法は、数回の操作段階
を必要とするため、連続的にタンパク質を回収できない
という問題点がある。

【０００４】そこで、特開平７−６８２６８号公報に記
載されているように、一回の操作によってタンパク質お
よび各種ホルモンの回収を可能とし、連続的にタンパク
質および各種ホルモンを回収できるタンパク質回収方法
およびその装置が提供されている。また、この公報に
は、短時間の通電で所望の殺菌性能が得られる除菌方法
およびその装置や、さらに殺菌後の菌体を除去できる除
去方法およびその装置が開示されている。

【０００５】また、近年では、遺伝子工学の急速な発展
により、組み替えた細菌から目的の遺伝子やタンパク質
を取り出すことが日常化しているが、この取り出し方法
としては、酵素で菌体を溶かすか、超音波等で菌体を物
理的に破壊する方法が行われている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら前記公報
に記載の従来例は、微生物を含む溶液からタンパク質お
よび各種ホルモンを効率よく回収したり、除菌を行うこ
とはできるが、核酸を回収することは、なんら考慮され
ていない。

【０００７】また、酵素で菌体を溶かすか、超音波等で
菌体を物理的に破壊して、細菌から目的のタンパク質や
遺伝子を取り出す場合は、一旦培養を停止する必要があ
るため、タンパク質や遺伝子の取り出しを効率よく行う
ことができないという問題がある。

【０００８】本発明は、このような従来の問題点を解決
することを課題とするものであり、一回の簡単な操作に
よって核酸の回収を可能とすることで、連続的に核酸を
回収できる核酸回収方法を提供することを目的とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
に、本発明は、核酸増幅用試料として利用可能な核酸を
微生物から回収する方法であって、微生物を含む溶液を
多孔質樹脂に導電性金属が被覆され、前記溶液中の溶液
を吸引した際に微生物の蓄積層を前記多孔質樹脂表面に
形成するための電極に接触させ、前記電極に前記微生物
の細胞膜を誘電破壊させる程度の通電を行い前記吸引溶
液中の前記微生物からの核酸を回収するに際して、前記
容器中の溶液を吸引し、前記多孔質樹脂に前記微生物を
蓄積させた後、回収される核酸の２６０ｎｍにおける吸
光度（Ａ２６０）と２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２８
０）の比（Ａ２６０／Ａ２８０）が、前記微生物から
酵素を用いて核酸を回収した場合の当該比より大きくな
り、さらに、前記通電により得られた核酸に標準遺伝子
と比較して核酸の泳動パターンに核酸に損傷が生じるこ
とによる変化が無い電流を前記電極に通電するようにし
た核酸回収方法である。

【００１０】

【００１１】

【００１２】

【００１３】また、前記通電は、パルス波あるいは直流
電流を使用してもよい。前記導電性金属を中空糸膜に化
学的に結合させることもできる。

【００１４】

【発明の実施の形態】次に、本発明に係る実施の形態に
ついて説明する。

【００１５】本発明者が核酸回収方法について鋭意検討
したところ、微生物を含む溶液に通電を行うことで、こ
の溶液から連続的に核酸を回収できるとの知見を得た。
すなわち、微生物を通電するとその細胞膜は部分的に誘
電破壊され、細胞内原形質が流出する。この細胞内原形
質には、核酸が含まれていることから、この細胞内原形
質を回収することにより回収目的物である核酸を回収す
ることができる。ここでいう通電には、直流電流、交流
電流、パルス波およびインパルス波の通電が含まれる。

【００１６】また、特に本発明者らが検討した結果、パ
ルス波または直流電流を通電することにより、より効率
良く核酸を回収できるとの結果に至った。

【００１７】そしてまた、本発明に係る回収方法は、核
酸およびタンパク質の両者を回収することができる。

【００１８】この方法は、例えば、微生物を含む溶液が
供給される容器と、前記溶液に通電するための電極と、
この電極に通電する通電装置と、核酸を分離する手段
と、を備える核酸回収装置を使用して行うことができ
る。この核酸回収装置は、パルス波を発振するまたは直
流電流を発生する通電装置を備えることができる。ま
た、この核酸回収装置は、導電性金属が被覆された中空
糸膜からなる電極を備えることができる。

【００１９】中空糸膜への導電性金属の被覆方法として
は、従来のメッキ法、蒸着法、スパッタリング法等公知
の方法が挙げられる。特に、本願出願人が先に提案した
ように（特願平３ー５９３５７号）、導電性金属を中空
糸膜に化学的に結合させる方法によることが望ましい。
この方法によれば、導電性金属の被覆量が多く導電性に
優れ、その結果良好な殺菌性能を得ることができるから
である。本発明において、金属は、導電性であれば特に
限定されない。そして、銀のように殺菌性のある金属で
あればより好ましい。

【００２０】中空糸膜に導電性金属を化学的に結合させ
るには、中空糸膜をエッチングして金属塩の溶液で処理
することが挙げられる。このようにすることで、導電性
金属が中空糸膜を形成する多孔質樹脂に化学的に結合し
て接着強度が高い金属層を形成でき、この結果十分な量
の金属の被覆が可能になる。

【００２１】すなわち、好ましくは高濃度のエッチング
処理を樹脂について行うと、樹脂の脱水素化、樹脂の酸
化、樹脂の開裂および加水分解等により、樹脂側に炭素
ラジカル，カルボキシル基（−ＣＯＯＨ），カルボニル
基（−Ｃ＝Ｏ），水酸基（−ＯＨ），スルホン基（−Ｓ
Ｏ₃Ｈ）、ニトリル基（−ＣＮ）等、金属と化学結合可
能な官能基を生じる。これらの官能基が、金属原子又は
金属イオン（Ｍ）と結合することにより、例えば、−Ｃ
Ｍ，−ＣＯＯＭ，−ＣＯＭ，−ＯＭ，−ＳＯ₃Ｍ，−Ｃ
ＭＮを形成して金属が樹脂に化学的に結合する。ここ
で、例えば高濃度のクロム酸・硫酸混合液を使用してポ
リプロピレンをエッチングした場合の考えられる機構に
ついて説明する。高濃度クロム酸・硫酸溶液では、次に
示す化１の反応式のように、発生期の酸素が生ずる。

【００２２】

【化１】

【００２３】そして、次に示す化２の反応式のように、
この発生期の酸素はポリプロピレンの三級炭素を酸化し
て、これを水酸基にする。この水酸基は、アンモニア水
中でアンモニウムイオン（ＮＨ⁴⁺）とイオン結合を形成
し、次いで、金属原子又は金属イオンと反応すると、金
属（Ｍ）はアンモニウムイオンと置換し、金属が配位又
は電気的に酸素原子に結合する。したがって、−ＣＯＭ
の化学結合が生じ、この結果、樹脂に金属が化学的に結
合することになる。

【００２４】

【化２】

【００２５】クロム酸・硫酸濃度がさらに高くなった
り、反応温度が高くなった場合等エッチング条件がより
厳しいものになると、次の化３の反応式のようにポリプ
ロピレンが開裂して、カルボキシル基が発生する。この
場合でも、化２の反応と同様の機構により、カルボキシ
ル基に金属原子又は金属イオンが配位又は電気的に結合
して、−ＣＯＯＭが生じることにより樹脂に金属が化学
的に結合する。したがって、金属層と樹脂との境界では
樹脂−金属の化学的な結合が生じているために、樹脂に
金属を確実に被覆することができるとともに、金属層の
接着強度を従来技術に比較して格段に大きくできる。

【００２６】

【化３】

【００２７】エッチング処理液としては、樹脂に金属と
化学結合可能な官能基を形成できるものであり、高濃度
のクロム酸・硫酸溶液、高濃度の硫酸・硝酸混合液、高
濃度の水酸化ナトリウム，水酸化カリウム等の強塩基、
フッ化水素アンモニウム・硝酸等が挙げられる。エッチ
ング処理液は樹脂に前記官能基を形成する必要から、高
濃度であることが好ましく、具体的には、クロム酸濃度
が２０〜５０％で硫酸濃度が１０〜４０％のクロム酸・
硫酸溶液、１０〜４０％の強アルカリ、１０〜３０％硫
酸と１０〜３０％硝酸とからなる硫酸・硝酸混液、１０
〜４０％フッ化水素アンモンと４０〜７０％の硝酸とか
らなるフッ化水素アンモン・硝酸混液が挙げられる。

【００２８】また、樹脂はエッチング処理液により金属
と化学結合可能な官能基を形成できる反応領域を有する
ことが望ましく、特に、三級炭素を有するポリプロピレ
ン、不飽和結合を有するＡＢＳ、スルホニル結合（Ｏ＝
Ｓ＝Ｏ）を有するポリスルフォン，ポリエーテルスルフ
ォン、(−Ｏ−Ｓｉ(ＣＨ₃)₂−Ｏ−)_n を有するシリコー
ン系樹脂、（−Ｃ−Ｏ−Ｃ−)_nのエーテル結合を有する
ポリエーテルイミド、ポリエーテルスルフォン、エーテ
ル基及びＯＨ基を有するフェノキシ樹脂およびセルロー
ス樹脂、−ＣＮ基を有するポリアクリロニトリルである
ことが望ましい。そして、高濃度アルカリエッチングで
加水分解されてカルボキシル基を生じるポリアリレート
等のエステル樹脂、ポリアミド系樹脂、ポリアミドイミ
ド系樹脂、アクリルウレタン等のポリウレタン系樹脂、
ポリエーテルイミド系樹脂も望ましい。

【００２９】もっとも、ポリエチレン等のようにこれら
の反応領域を有しない樹脂であっても、エッチング条件
をより厳しくすることにより炭素−炭素結合が開裂した
り、炭素が酸化される等により、前記官能基を発生する
ものでもよい。

【００３０】以上のように、いかなるエッチング処理液
が使用されるかは、樹脂の種類に応じて決定される。な
お、予め金属と化学結合可能な前記各種の官能基を有す
る樹脂（例えば、ニトリル基を有するポリアクリルロト
リル）では、エッチング工程を省略しても金属を樹脂に
結合することができる。

【００３１】金属を樹脂に化学的に結合するためには、
無電解処理によることが好ましい。この時、金属の還元
反応を促進する触媒を介在させてこの金属を化学的に結
合することが望ましく、特に、無電解処理の触媒となる
Ｐｄ又はＰｄ，Ｓｎのような触媒金属を介在させること
が望ましい。この場合、樹脂に一旦触媒金属が結合す
る。

【００３２】前記エッチング処理を多孔質樹脂について
行うと、多孔質樹脂の金属の溶液に対する濡れ性が向上
して触媒金属の溶液が多孔質内に浸透し、かつ前記化１
および化２に示す反応式により触媒金属が樹脂と化学的
に結合する。このような触媒金属が結合した樹脂を金属
イオン、錯形成剤、及び還元剤を含有する金属の溶液で
処理すると、触媒金属表面で金属イオンの還元反応が生
じ、他の金属が触媒金属に結合する等の理由により、触
媒金属を核にして金属層が均一に形成される。

【００３３】触媒金属は多孔質樹脂に化学的に結合して
いるために、触媒金属量も多くなり、この結果、金属層
の無電解処理層の量を大きくすることができる。金属の
結合量は、エッチング処理液の濃度、エッチング処理時
間、金属原子または金属イオンの量を変更することによ
って制御することが可能である。

【００３４】無電解処理に際して金属イオンを発生させ
るための金属塩としては、硫酸塩，塩化物，硝酸塩の如
く水溶性のものであれば良く特に限定されない。無電解
処理されて中空糸膜に被覆される導電性金属としては、
例えば、Ｎｉ，Ｃｏ，Ｆｅ，Ｍｏ，Ｗ，Ｃｕ，Ｒｅ，Ａ
ｕ，Ａｇ，Ｐｔの少なくとも一種が挙げられる。この金
属の析出量は、金属イオン濃度，温度，反応時間を変え
ることによって制御可能である。樹脂膜に被覆する金属
の合計量の下限は、通電を可能にするために必要な導電
性を付与する観点から決定され、そして、その上限は、
樹脂膜の空孔を必要以上に閉塞しない観点から制限され
ることが望ましい。還元剤としては、次亜リン酸ナトリ
ウム等のリン化合物、ホウ素化水素等のボロン化合物の
他、ホルマリン、ブドウ糖等公知のものが使用される。
また、錯化剤としては、金属イオンと安定した錯体を形
成できるものであるなら良くアンモニア、クエン酸、酒
石酸、シュウ酸等公知のものが挙げられる。

【００３５】本発明によれば、処理液が中空糸膜の開孔
内に進入しながら、金属が樹脂に化学的に結合し、金属
が樹脂の表面ばかりでなく内部にまで進入する。したが
って、金属層の厚さを樹脂の肉厚に対して１０〜１００
％にもでき、金属層の被覆量を、２．２×１０^-3〜１
５．０×１０^-3モル／ｍ程度まで増大することもでき
る。金属層の量が多いと、中空糸膜の剛性を向上するこ
とができ、必要とされる耐圧性能を向上できる。そし
て、金属の量が多いことにより、導電性を向上すること
ができる。

【００３６】このような導電性を有するようになった中
空糸膜は、さらに電解処理が可能となり、前記金属層
（無電解処理金属層）上に電解処理される金属、例え
ば、Ｃｒ，Ｚｎ，Ａｇ，Ａｕ，Ｐｔ，Ａｌ，Ｍｎ，Ｂ
ｉ，Ｓｅ，Ｔｅ，Ｃｄ，Ｉｒ，ＴｉおよびＮｉを被覆す
ることができる。

【００３７】樹脂に金属層が化学的に結合すると十分な
量の金属層が確実に形成できることから、中空糸膜同志
および中空糸膜と金属とのハンダ付けが可能となる。そ
して、中空糸膜と金属層との結合力が強いために、中空
糸膜とハンダとの界面における剥離を防止することがで
き、中空糸膜の固定をより完全かつ確実なものにでき
る。このことは、多数の中空糸膜をモジュール化し、処
理量が大きい核酸回収装置を提供することを意味する。

【００３８】本発明によれば、十分な量の金属を中空糸
膜に確実に被覆できるから、中空糸膜の導電性を一層向
上できることは、先に述べた通りである。本発明により
比抵抗が１〜２０Ω／ｃｍの極めて導電性が良好な中空
糸膜が得られる。そして、結合力が十分高く、かつ十分
な量の金属層を中空糸膜に被覆できることは、中空糸膜
の耐熱性を向上することにもなる。耐熱温度が低い中空
糸膜（特に、オレフィン系）でも、本発明のような金属
層を形成できることにより、耐熱温度を大幅に向上でき
る。したがって、通電による殺菌と熱処理による殺菌と
を併用することができるようになる。例えば、金属層が
形成されていない未処理の膜の耐熱温度が７０℃程度で
あると仮定した場合、金属層を形成することにより耐熱
温度をさらに５０℃以上に高めることができる。

【００３９】本発明において、中空糸膜の内径は例えば
２０〜３０００μｍ、好ましくは５〜１０００μｍであ
る。膜厚は例えば５〜１０００μｍ、空孔率は３〜１５
％、好ましくは、５〜７％である。

【００４０】次に、さらに具体的な実施の形態について
説明する。

【００４１】図１は本発明に係わる核酸回収装置のモデ
ル構成を示すものである。この核酸回収装置は、溶液５
８を収容する容器１２と、一端が封止されかつ容器１２
内に配設された金属被覆中空糸膜５０と、この金属被覆
中空糸膜５０に装着された二つのターミナル５２および
５４と、を備えた本体１００と、金属被覆中空糸膜５０
の上端に装着され、金属被覆中空糸膜５０内部にある溶
液５８を吸引するマイクロポンプ５６と、これらのター
ミナル５２および５４に接続され、金属被覆中空糸膜５
０にパルス波を発振するパルス発振装置２０と、を備え
ている。なお、符号２４はパルス電流計を示し、符号２
６はパルス電圧計を示すものであり、殺菌処理の過程で
パルス電流およびパルス電圧の値を監視して投入電流、
電圧の値を制御することができる。

【００４２】金属被覆中空糸膜５０は、中空糸膜に金属
Ｎｉを被覆した構成を備えている。ここで、中空糸膜へ
の金属Ｎｉ層の形成について説明する。

【００４３】内径１ｍｍ，空孔率６％の多孔質ポリプロ
ピレン製中空糸膜（アクゾ社製）を、クロム酸（ＣｒＯ
₃）２０〜５０％、硫酸１０〜４０％の混合液（液温５
０〜７５℃）に数分間浸漬することにより中空糸膜をエ
ッチング処理した。次いで、市販の触媒付与剤（奥野製
薬（株）製、キャタリストＣ）に数分間浸漬してＰｄを
中空糸膜に化学的に結合させた。次いで、塩酸の弱酸溶
液でＰｄを活性化した後、市販の無電解ニッケルめっき
液（奥野製薬（株）製、ＴＭＰ化学ニッケル）にて中空
糸膜上に金属Ｎｉ層を形成した。次に、これを水洗した
後、市販の無電解メッキ液（奥野製薬（株）製、ＯＰＣ
無電ゴールド）に浸漬して、Ｎｉ層上にＡｕを被覆し
た。この被抵抗を測定したところ平均０．５〜１Ω・ｃ
ｍであった。

【００４４】なお、本実施の形態では、二つのターミナ
ル５２、５４を介して金属被覆中空糸膜５０に直接通電
するようにしている。

【００４５】この核酸回収装置は、図２に示すように、
マイクロポンプ５６にフラクションコレクタ１０１が接
続されており、回収した溶液を回収装置１０２内に配設
された所定の試験管に順次回収するように構成されてい
る。この試験管に回収された溶液は、後に詳細するが、
吸光光度計１０３にて核酸およびタンパク質の回収量が
測定される。

【００４６】次に、本装置を使用した核酸回収方法につ
いて説明する。

【００４７】微生物として直径２〜７μｍ、短径１〜２
μｍ程度のグラム陰性桿菌である大腸菌（ＡＨＵ１７１
９株）を前培養したものを８本、１２本、１６本（但
し、１本当たり約１０⁹個体）分をそれぞれ生理食塩水
で全体が５０ｍｌとなるように希釈する。なお、前記８
本分を生理食塩水で希釈したものをサンプルＡ、１２本
分を生理食塩水で希釈したものをサンプルＢ、１６本分
を生理食塩水で希釈したものをサンプルＣとする。

【００４８】次に、この希釈した各々３種類の溶液５８
（サンプルＡ、ＢおよびＣ）を容器１２内に入れ、この
溶液５８内に前記マイクロポンプ５６が装着された金属
被覆中空糸膜５０を浸す。次いで、パルス発振器２０か
らターミナル５２および５４を介して２００ｍＡのパル
ス電流を金属被覆中空糸膜５０に通電し、それと同時に
マイクロポンプ５６によって金属被覆中空糸膜５０内の
溶液を吸引する。この吸引された溶液は、フラクション
コレクタ１０１を介して連続的に１００滴（約３ｍｌ）
ずつ順次試験管に回収する。サンプルＡから回収したも
のを経時順に、試験管No.Ａ−１〜No.Ａ−５、サンプル
Ｂから回収したものを経時順に、試験管No.Ｂ−１〜No.
Ｂ−９、サンプルＣから回収したものを経時順に、試験
管No.Ｃ−１〜No.Ｃ−７とする。

【００４９】次に、市販の吸光度計を使用し、この試験
管No.Ａ−１〜No.Ａ−５、No.Ｂ−１〜No.Ｂ−９、No.
Ｃ−１〜Ｃ−７に含有されている核酸量およびタンパク
質量を測定する。なお、核酸は吸光度２６０ｎｍ、タン
パク質は吸光度２８０ｎｍにて測定した。試験管No.Ａ
−１〜No.Ａ−５と吸光度との関係を図３に、試験管No.
Ｂ−１〜No.Ｂ−９と吸光度との関係を図４に、試験管N
o.Ｃ−１〜No.Ｃ−７と吸光度との関係を図５に示す。

【００５０】図３ないし図５より、吸引総量が増えるに
したがって、核酸およびタンパク質ともに回収量が増加
していることがわかる。これは、吸引総量が増えるにし
たがって、金属被覆中空糸膜５０の表面に大腸菌の蓄積
層が形成されるからである。このように、タンパク質お
よび核酸野両方を回収することができることが確認され
た。さらに、タンパク質より核酸の方が良好に回収でき
ることも確認された。

【００５１】なお、この回収溶液に含有されているタン
パク質および核酸は、例えば、液クロマトグラフィーや
薄層クロマトグラフィー等を使用することにより分離す
ることができる。

【００５２】また、前記回収した溶液に大腸菌が含まれ
ているか否かを検査したところ、大腸菌が含まれていな
いことが判明した。このことから、大腸菌を含む溶液に
パルス波を通電し、その後中空糸膜を通過させると、大
腸菌を連続的に分解しながら核酸を回収できることが判
る。

【００５３】なお、マイクロポンプ５６によって吸引し
た溶液を、核酸を分画する装置、例えば、高速液体クロ
マトグラフに接続することにより、核酸を連続的に分画
することもできる。

【００５４】次に、前記サンプルＡを前記と同様に試験
管に回収し、これらを経時順に試験管No.１〜No.６とす
る。次いで、金属被覆中空糸膜５０に５００ｍＡの直流
を通電する以外は前記と同様の方法で、試験管No.１〜N
o.６に含有されている核酸量およびタンパク質量を測定
する。この結果を図６に示す。

【００５５】図６から、最初の１〜３本までは大きな回
収率は得られないが、吸引総量が増えるにしたがって、
金属被覆中空糸膜５０に大腸菌の蓄積層が形成され、試
験管No.６では１本当たりの回収効率が特に上昇したこ
とが判る。また、図３ないし図５に示す結果と同様に、
タンパク質より核酸の方が良好に回収できることも確認
された。

【００５６】以上のように、従来複数の操作によって核
酸を回収していたのに対し、本実施の形態によれば大腸
菌を殺菌した直後に核酸を効率よく回収できるので、核
酸の連続回収が可能となる。なお、本実施の形態におい
ては、大腸菌を含む溶液にパルス波または直流を通電し
たが、これに限定する必要はなく、例えばインパルス波
または交流電流を通電してもよい。また、本実施の形態
においては大腸菌を含む溶液を使用したが、これに限定
する必要はなく、遺伝子組換えの宿主となる他の微生
物、例えば、枯草菌、人培養細胞、ＨｅＬａ細胞（ヒト
子宮頚部癌由来細胞）、ＦＬ細胞（ヒト胎児羊膜細胞組
織由来細胞）およびＶｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル
腎臓細胞由来細胞）を使用してもよい。

【００５７】なお、本実施の形態では、電極として導電
性金属が被覆された中空糸膜を使用したが、これに限ら
ず、電極は、微生物を含む溶液に通電することが可能で
あれば、他の構成を備えていてもよい。

【００５８】また、本実施の形態では、電極に通電を行
う通電装置として、パルス発振装置を使用したが、これ
に限らず、電極に通電可能な装置であれば、例えば、直
流電源、インパルス発生装置等、他の通電装置を使用し
てもよい。

【００５９】次に、本発明に係る他の実施の形態につい
て説明する。この実施の形態では、図１に示す核酸回収
装置のパルス発振装置２０を直流電源に代え、パルス電
流計を直流電流計に、パルス電圧計を直流電圧計に代え
た装置を使用し、以下に示す方法で核酸の回収を行っ
た。

【００６０】微生物としてＦＬ細胞を使用し、これを５
ｍｌの培養ボトルで培養する。次に、この培養した細胞
をトリプシンＥＤＴＡ溶液で剥離し、細胞を分散した
後、Ｈａｎｋ'ｓＢＳＳで洗浄し、一定濃度の細胞浮遊
液を得る。次いで、この細胞浮遊液を、容量が１．５ｍ
ｌのエッペンドルフ遠心管に移し、この中にアルコール
置換した導電性中空糸膜を浸して、直流１００ｍＡを通
電しながら吸引する。

【００６１】次に、吸引・回収した核酸の純度を、Ａ28
0，Ａ260およびＡ235の吸収波長で測定した値から検討
した。吸光度の測定は、石英セルを用い、日立株式会社
製のスペクトロフォトメータで測定した。この結果を図
７に示す。

【００６２】次に、核酸回収効率を比較するため、ＢＩ
Ｏ−ＲＡＤ社製のInstaGenematrix（インスタジーン・
マトリクス）を使用し、核酸を精製・回収し、前記と同
様の方法で、回収した核酸の純度を検討した。この結果
を図８に示す。

【００６３】なお、インスタジーン・マトリクスを使用
した核酸の回収過程は以下の通りである。

【００６４】先ず、試料としてＦＬ細胞を用い、これを
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄・濃縮した後、これ
を蒸留水に再浮遊させる。次に、試料にインスタジーン
を加えて５６℃で３０分間インキュベートする。この段
階で、細胞の酵素破壊と核酸（遺伝子）の凝集をインス
タジーンによって発生させる。次いで、これを１００℃
で８分間加熱処理を行い、酵素や他のタンパク質の熱変
性と核酸の凝集を行う。その後、これを十分に混合して
遺伝子増幅（ＰＣＲ）用の試料とした。

【００６５】図７および図８から、本実施の形態に係る
金属被覆中空膜（導電性中空膜）を使用して核酸を回収
した場合も、市販の化学薬品を用いて核酸を回収した場
合も、ほぼ同一の回収パターンを示すことが判る。な
お、図７および図８において、縦軸の吸光度が異なるの
は、試料とした細胞の濃度が異なるためで、同じ細胞濃
度の試料を用いた場合には、ほぼ同量の核酸が回収でき
た。また、本実施の形態において、金属被覆中空膜に通
電を行わずに前記吸引・回収した場合には、図８にcont
rolで示すパターンと同様のパターンを示した。

【００６６】また、ここに示した結果は、回収した試料
の純度を検討するために吸光度２３０ｎｍから３２０ｎ
ｍまで、ほぼ１０ｎｍおきに測定吸光度を変えて測定し
たものを示している。この結果から、本実施の形態に係
る金属被覆中空膜を使用した場合も、インスタジーン・
マトリクスを使用した場合も、２６０ｎｍの核酸に対応
する吸光度に明確なピークを示すとともに、多糖体の吸
収波長帯である２３０ｎｍにも高いピークを示したこと
が判る。これは、試料の純度から考えると、侠雑物質が
混入していることを示しているが、核酸の増幅用試料と
して使用するうえでは問題ない。

【００６７】次に、タンパク質の混入に関して検討した
ところ、本実施の形態に係る金属被覆中空糸膜を使用
し、１００ｍＡの直流電流を通電しながら吸引した際の
吸引液中のＡ260／Ａ280の比率は、約２．０００であっ
た。一方、インスタジーン・マトリクスを使用した場合
には、Ａ260／Ａ280の比率は、約１．６００であった。

【００６８】ここで、一般に、細胞を破壊してここから
核酸を回収した場合は、混入するタンパク量が多いと侠
雑するタンパク酵素が多いことを示しており、この場
合、回収した核酸がこれらの酵素により分解される可能
性がある。そのため、核酸の回収には回収試料の中に含
まれるタンパク量と核酸量との比率が問題となる。この
値は前述したように、得られた試料の吸光度をＡ260お
よびＡ280の吸収波長で測定し、その比を取ることによ
って得られる。この比が１．４００以上であれば、タン
パク質の混入をある程度制御しているといえる。

【００６９】本実施の形態では、このＡ260／Ａ280の比
率は、基準値（１．４００）よりも十分に大きい値を示
し、また、インスタジーン・マトリクスを使用した場合
よりもさらによい値が得られた。この結果、本実施の形
態に係る金属被覆中空糸は、細胞からの核酸回収デバイ
スとして適していることが立証された。

【００７０】次に、本実施の形態に係る回収液を、アガ
ーロースゲル電気泳動法とパルスフィールドゲル電気泳
動法により解析した。また、回収される核酸が金属被覆
中空糸膜を通過する際に物理的に損傷を受けるか否かを
検討するため、比較としてLambda phage DNAの標準遺伝
子を同様の方法で吸引・回収し、これを同様にアガーロ
ースゲル電気泳動法とパルスフィールドゲル電気泳動法
により解析した。この結果、得られた泳動パターンを図
９に示す。図９から、本実施の形態に係る金属被覆中空
糸膜を介して吸引すると、核酸の量的な減少はあるもの
の、比較のバンド（native DNA)と同様の泳動パターン
を示すことが判る。この結果、本実施の形態に係る金属
被覆中空糸膜を用いて通電処理を行いながら細胞を吸引
してもその際に回収される核酸に物理的な損傷がないこ
とが立証された。また、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞に
関しても同様の結果が得られた。なお、図９の右端に記
載の２１Ｋ、５Ｋ、４Ｋ等の数値は、試料中の塩基対配
列数を示すものであり、例えば、２１Ｋは、２１０００
塩基対配列（B.P.S.）のことである。

【００７１】また、金属被覆中空糸膜に通電を行わずに
前記試料を吸引・回収した場合、回収した試料中の核酸
の量は、通電した場合よりも少なかった。これは、通電
により、核酸が金属被覆中空糸膜内に吸着されることが
減少されるためである。このことからも、本実施の形態
に係る金属被覆中空糸膜は、核酸回収デバイスとして優
れていることが判る。

【００７２】

【発明の効果】以上説明したように本発明によれば、微
生物を含む溶液に通電することにより、単一な操作で、
かつ連続に核酸を回収することができる。また、通電し
た溶液の微生物をろ過し、そのろ過した溶液を吸引する
ことにより、容易に核酸のみを回収することができる。

【００７３】また、本発明によれば、微生物を含む溶液
に通電することにより、単一な操作で、かつ連続に核酸
とタンパク質の両方を回収することができる。

【００７４】そしてまた、前記微生物を含む溶液に、パ
ルス波または直流電流を通電することにより、より効率
良く核酸を回収することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施の形態に係る核酸回収装置の構成
図である。

【図２】本発明の実施の形態に係る核酸回収装置および
その周辺機器の構成を示す概略図である。

【図３】本発明の実施の形態に係る試験管No.Ａ−１〜N
o.Ａ−５と吸光度との関係を示す図である。

【図４】本発明の実施の形態に係る試験管No.Ｂ−１〜N
o.Ｂ−９と吸光度との関係を示す図である。

【図５】本発明の実施の形態に係る試験管No.Ｃ−１〜N
o.Ｃ−７と吸光度との関係を示す図である。

【図６】本発明の実施の形態に係る試験管No.１〜No.６
と吸光度との関係を示す図である。

【図７】本発明の他の実施の形態に係る回収液の波長と
吸光度との関係を示す図である。

【図８】本発明の他の実施の形態に係る比較用の回収液
の波長と吸光度との関係を示す図である。

【図９】本発明の他の実施の形態に係る回収液の泳動パ
ターンを示す図である。

【符号の説明】

１金属Ｎｉ層１０微生物が含有された溶液１２容器１８電極２０パルス発振装置５０金属被覆中空糸膜

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者佐野正勝神奈川県相模原市西橋本２丁目23番３号日幸工業株式会社Ｒ＆Ｄセンター内 (72)発明者勝浦信夫神奈川県相模原市西橋本２丁目23番３号日幸工業株式会社Ｒ＆Ｄセンター内 (72)発明者五十嵐治神奈川県相模原市西橋本２丁目23番３号日幸工業株式会社Ｒ＆Ｄセンター内 (72)発明者中山敦神奈川県相模原市西橋本２丁目23番３号日幸工業株式会社Ｒ＆Ｄセンター内 (56)参考文献特開平７−68268（ＪＰ，Ａ) 特開平７−322899（ＪＰ，Ａ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】核酸増幅用試料として利用可能な核酸を
微生物から回収する方法であって、微生物を含む溶液を
多孔質樹脂に導電性金属が被覆され、前記溶液中の溶液
を吸引した際に微生物の蓄積層を前記多孔質樹脂表面に
形成するための電極に接触させ、前記電極に前記微生物
の細胞膜を誘電破壊させる程度の通電を行い前記吸引溶
液中の前記微生物からの核酸を回収するに際して、前記
容器中の溶液を吸引し、前記多孔質樹脂に前記微生物を
蓄積させた後、回収される核酸の２６０ｎｍにおける吸
光度（Ａ２６０）と２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２８
０）の比（Ａ２６０／Ａ２８０）が、前記微生物から
酵素を用いて核酸を回収した場合の当該比より大きくな
り、さらに、前記通電により得られた核酸に標準遺伝子
と比較して核酸の泳動パターンに核酸に損傷が生じるこ
とによる変化が無い電流を前記電極に通電するようにし
た核酸回収方法。
【請求項２】前記電極に直流電流又はパルス波を供給
することによる請求項１記載の核酸回収方法。
【請求項３】前記導電性金属は、前記樹脂に化学結合
している請求項１又は２記載の核酸回収方法。
【請求項４】前記多孔質樹脂は中空糸である請求項１
乃至３のいずれか１項記載の核酸回収方法。